CN112147044A - 用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。其特征是：它由流体控制系统、光源、光纤光路支架、激发光传输光纤、前向散射光收集传输光纤、侧向散射光收集传输光纤、光电倍增管以及废液收集系统组成。所述系统中：流体控制系统将样品注入插入光纤光路支架中的流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集传输光纤收集，并输入到光电倍增管检测，侧向散射光由侧向散射光收集传输光纤收集传输至光电倍增管检测。本发明可用于细胞的检测和分析。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，可用于细胞自动分析，属于细胞检测及分析技术领域。
(二)背景技术
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。它在20世纪50年代首次被用于测量细胞体积，可在细胞随快速流动的流体直线通过观察孔时进行检测。在流式细胞仪中，溶液中的细胞以每秒10,000个细胞(或更多)的速度通过仪器的激光束，进而对细胞进行检测。如今的流式细胞仪具有更多的可检测荧光参数(从1或2至最多30个左右)，可同时测量同一个细胞上的所有这些参数。
流式细胞数具有如下几个特点：(1)单细胞分析：流式细胞分析的对象是单个细胞或颗粒样物质，各种标本用于流式分析前需经过适当的处理以制备成单细胞悬液；(2)多参数分析：流式细胞分析除了可以获得细胞或颗粒样物质的物理参数外，还可以通过荧光素标记技术对细胞的DNA含量、抗原表达、酶活性等进行分析；(3)高通量：流式细胞数每秒钟可以对成千上万个细胞进行理化特性的分析，最终待测标本中被分析的细胞总数可以达百万个，因此对细胞的特性识别及计数更加准确；(4)分选功能：可以将具有特定性状或功能的细胞从细胞混合群中分离出来。细胞分选尤其是单细胞分选对研究细胞的结构和功能具有重要的价值。
流式细胞仪(Flow cytometer)是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。专利CN103091821A公布了一种使用透镜的作为光收集方案的流式细胞仪，该流式细胞仪的光收集系统采用了4组6片镜头，使用了五种不同的玻璃，其收光系统所占的空间非常大，对光路的整体性的要求也相当高。专利CN110687034A公布了一种激光照射式流失细胞仪，该流失细胞仪为保证其稳定性和各模块独立性，其光路和空间结构及其复杂，制造成本也比较高昂。专利CN111024592A公开了一种流式细胞仪的光路装置，其光路体积较大，收光结构也较为复杂。
传统的流式细胞仪采用空间光路，其对光路的空间性和稳定性要求高，需要对光路进行精密调节，并且光学元件受震动、温度、湿度等外界环境的干扰大。并且，这些空间光学元件的体积大，组装方式不够灵活。更为重要的是，传统的空间光路系统采用的是显微物镜作为收光介质，物镜的体积较大，这限制了物镜的使用数量和光路集成。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。
本发明的目的是这样实现的：
用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。如图1，它由光纤光路支架1、流体控制系统2、光源3、激发光传输光纤4、侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6、光电倍增管6-1～6-7、前向散射光收集传输光纤7、废液收集系统8组成。所述系统中：(1)光纤光路支架1的中间有微孔1-1～1-10，激发光传输光纤4与前向散射光收集传输光纤7可以分别插入到微孔1-1以及1-2中；(2)光纤光路支架1的构型为正八边柱体，其每个侧面都有微孔，其中两微孔1-3/1-4用于固定流体控制系统2的流动池，其余微孔1-5～1-10被用于侧向散射收集传输光纤5-1～5-6的接入，进行侧向散射光的收集和传输；(3)可以用密封胶圈对光纤光路支架1与流动池、其他光纤间的间隙，保证间隙内干燥，防止光纤端以及其他装置霉化；(4)激发光传输光纤4与流动池呈90度，前向散射光收集传输7光纤与激发光传输光纤4在同一直线上，侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6分别位于正八边柱体的其他六个面，分别收集和传输不同角度的侧向散射光；(5)流体控制系统2将样品注入流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤4将光束从光源3引出、传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集传输光纤7收集，输入到光电倍增管6-7，侧向散射光由侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6收集传输至不同的光电倍增管检测6-1～6-6。
如图3所示，在激发光传输光纤4的输入端使用自聚焦透镜9实现模场的匹配，可以实现光源能量高效耦合进激发光传输光纤。
对激发光传输光纤4输出的光束进行改变，使输出的光束为准直的椭圆光束，其目的是为了使激发光束对流动池内的单细胞流照射更加有效，使散射光能更加全面的反应细胞的相关性质。其具体方法如下：
为了使激发光传输光纤4的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上。激发光传输光纤的输出端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束变形透镜10，再通过自聚焦透镜11准直，最后输出准直的椭圆光束，如图4。
为了获得丰富与可靠的光学信息，所述的光源可以单一波段的荧光激发光源也可以是不同波段的荧光激发光源3-1/3-2。不同波长的激发光通过光纤波分复用器12合束，耦合进激发光传输光纤4后传输至流动池内的样品上，如图5。
为了提高散射光的收集效率，所述的散射光接收光纤5-1～5-6的接收端具有高数值孔径的微透镜，如图6。该高数值孔径的微透镜可以是通过精密研磨的方法在光纤端制备锥体微透镜13。
为了使光纤端免受尘埃污染，也为了避免高湿度环境使得光纤端霉化，在光纤光路支架1用密封胶圈14来隔离光纤端与外界环境如图7。所述的密封胶圈可以是可拆卸的密封胶圈，也可以是通过环氧胶固定的不可拆卸的密封圈。
传统的空间光路的流式细胞仪具有激发光路、前向散射光收集光路以及侧向散射光收集光路。前向散射光收集光路主要用于细胞大小检测和计数，侧向散射光包含瑞利散射信号和荧光信号，收到的两种信号通过分光棱镜分光后传输到不同的探测器检测。与此相对比，本发明所述的光纤固定块1共有8个光纤固定孔，如图2示，分别固定激发光传输光纤4、前向散射光收集传输光纤7以及6根侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6，每根散射光接收光纤的纤端制备有微透镜来提高收光的数值孔径。
为了区分和检测不同波长的散射光信号，包括瑞利散射荧光信号，本发明可采用以下分光探测方案：
(1)如图8a所示，可以通过光纤波分复用器进行分光，传输至不同的光电倍增管。
(2)如图8b所示，为了区分和检测不同波长的荧光信号，所述的光电倍增管的芯片17前固定有不同波段的带通滤光片，每个探测器用于接收检测不同的荧光信号，每根散射收集传输光纤通过光纤适配器的方式与光电倍增管连接，对应的光电倍增管前的滤光片可滤除其他波长的荧光，只通过该通道探测荧光信号。
(3)如图9所示：前向散射光收集传输光纤7与侧向散射光收集传输光纤4的输出端通过精密镀膜技术镀制有不同参数的滤光膜16，对应输出不同的荧光波段再与光电倍增管连接，进行相应的放大探测。
相比于传统的流式细胞仪，本发明具有以下几点显著的优点：
(1)本发明采用全光纤光路，相比较于传统的空间光路而言，光路传输稳，不惧空气中的微小尘埃。
(2)采用光纤替代传统的空间光路，免去了替换器件时的空间光路的精细调整。整个系统的稳定性强，受温度、震动等外界环境影响小。
(3)光纤具有极好的柔韧性，可任意弯曲，这对系统的集成和小型化是极其有利的。
(4)空间光路中暴露于空气中的各种镜片在湿度较大的环境中会有结露、霉变等问题，本发明采用密封技术，避免了霉化问题。
(四)附图说明
图1是用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置示意图。
图2光纤光路支架结构示意图。
图3是通过光纤端连接自聚焦透镜9的方法提高光源3和激发光传输光纤4的耦合效率的示意图。
图4是激发光传输光纤4的输出端微结构示意图。该光纤端集成了一个微型柱透镜10和一个自聚焦准直透镜11，整个结构封装于外壳17中。该结构能将圆形的光束整形为椭圆的光束输出，(a)为整形前光束形状18，(b)为光纤端光束整形结构，(c)为整形后的椭圆光束19。
图5是光源的合波复用示意图。
图6是通过精密研磨的方法在光纤端制备锥体高数值孔径微的透镜的示意图。该结构可以提高散射光的收集效率。
图7是光纤光纤光路支架所用密封胶圈来隔离光纤端与外界环境示意图。
图8是分光探测方案一示意图。使用波分复用器将不同波段的激发光分光，再传输至光电倍增管进行探测如图8a。光点倍增管的芯片前都具有不同的带通滤波片，能针对不同波段的光波进行特异性探测如图8b。
图9分光探测方案二示意图。在侧向散射光纤输出端镀有不同性质的滤光膜，再与光电倍增管相连接，进行相应的探测。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：
激光器光源的波长为635nm，细胞的标记荧光素选择APC，该荧光素在635nm波长激光的激发下，发出波长为655-685nm的绿色荧光。如图1所示，流体控制系统2控制细胞的进样，让鞘液和细胞流注入流动池。流动池通过光纤光路支架1的1-3、1-4微孔，在光线光路支架1上总固定有8根光纤，分别为激发光传输光纤4、前向散射光收集传输光纤7和侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6。激发光传输光纤4将635nm的光束从光源3引出，垂直于流动池中的单细胞流输出，激发光束和细胞相互作用，散射光分别由前向散射光收集传输光纤7和侧向散射光收集传输光纤5-1～5-6接收，分别传输至不同的光电倍增管6-1～6-7接收。采用方案二的分光策略，在接与光纤光路支架1-5～1-7微孔的侧向散射光收集传输光纤镀上透光范围为655-685nm的滤光膜用以收集激发荧光，在前向散射光接受传输光纤与其余的侧向散射光收集传输光纤镀上波长小于650nm的短波通滤光膜。
如图3所示，为了提高光源3输出光束和激发光传输光纤4的耦合效率，在激发光传输光纤4和光源3中间连接一个自聚焦透镜12。
为了使光束和每个通过的细胞充分相互作用，需要对照射在流动池中的激发光束的形状进行整形，使光束的截面是椭圆形的。优选地，椭圆形光束的短轴和长轴分别为10微米和100微米。有两种方案可以对激发光传输光纤的输出光场进行整形：
如图4所示，将输入光纤的端面研磨成楔状透镜结构10，楔状透镜结构10对圆形的输出光束进行压缩整形，然后结合一个自聚焦透镜11对光束进行准直，得到准直的椭圆的输出光束。楔状光纤端和自聚焦透镜被封装在一个柱形的封装壳17内。最后整个封装好的光纤端插入光纤光路支架1的1-1微孔，点胶固定。
如图6所示，为了增大散射光接收光纤的数值孔径，以增加收光效率。在散射光收集传输光纤的纤端制备锥形的微透镜13。
实施例2：
由于荧光没有方向性，理论上来说从位于细胞的各个方向上的散射光收集传输光纤均能收到荧光信号。但是传统的流式细胞仪采用空间光路系统，物镜的体积大，不适合从多个方向收集荧光信号，所以采用侧向散射光的方法收集所有的荧光，再通过滤光镜分光，将不同的荧光信号分到探测器检测。这样一套收集系统其实降低了荧光的收集效率。光纤具有小体积的优势，本发明中所述的光纤光路支架立方体可以是更多侧面的多边立方体。在光纤光路支架的多个光纤固定孔位中，有一个是用于固定激发光传输光纤，其相对位置的孔位用于固定前向散射光收集传输光纤，其余位置的孔位用于固定侧向散射光收集传输光纤。
如图5所示的光源波合复用装置，激发光源为两种不同波长的光源，分别为488nm和635nm。两种光源所对应的荧光激发素分别位PE和APC。激发光传输光纤4将合光的激发光引入、照射到位于流动池的带测细胞中，针对不同的荧光素收集不同的散射光，再进行如图8所示的分光方案一，前向散射光经由波分复用器将两种不同光源的前向散射光分离，再在所对应的光电倍增管上镀上不同的带通滤波片，最后进行相应的探测和研究。侧向散射光的最终分光与探测与前向散射光相类似，侧向散射光经由侧向散射光收集传输光纤收集后，传输到波分复用器上，再由波分复用器进行分光，传输给相对应的光电倍增管，相应的光电倍增管上镀有相对应的带通滤波片，之后再对收集到的侧向散射光进行研究。
以上实施例为该发明专利的补充与拓展，可知以上实施例并不用于限制与限定本发明专利。
Claims (5)
1.用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：它由流体控制系统、光源、光纤光路支架、激发光传输光纤、前向散射光收集传输光纤、侧向散射光收集传输光纤、光电倍增管以及废液收集系统组成，所述系统中：(1)光纤光路支架的构型为正八边柱体，其每个侧面都有微孔，其中两微孔用于固定流体控制系统的流动池，其余微孔被用于侧向散射光收集传输光纤的接入，进行侧向散射光的收集和传输；(2)用密封胶圈对光纤光路支架与流动池、其他光纤间的间隙进行密封，保证间隙内干燥，防止光纤端以及其他装置霉化；(3)流体控制系统将样品注入流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集传输光纤收集并输入到光电倍增管，侧向散射光由侧向散射光收集传输至光电倍增管检测。
2.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的前向散射光收集传输光纤与侧向散射光收集传输光纤是具有大数值孔径、大芯径的光纤，可以是纯石英芯掺氟包层光纤。
3.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的激发光传输光纤的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上，该光纤端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束整形透镜，再通过自聚焦透镜准直，输出准直的椭圆光束。
4.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的光源可以是不同波段的荧光激发光源，由光源光纤引出，再通过光纤波分复用器合束，经激发光传输光纤传输照射在流动池内的样品上。
5.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的前向散射光收集传输光纤与侧向散射光收集传输光纤的输出端镀制有不同参数的滤光膜，对应输出不同的荧光波段再与光电倍增管连接，进行相应的放大探测。
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