CN112229781A - 一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。其特征是：它由流体控制系统、光源、光路支架、激发光传输光纤、前向散射光收集光纤、侧向散射光收集光纤束、光电探测系统以及废液收集系统组成。所述系统中：流体控制系统将样品注入插入光路支架中的流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集光纤收集，并传输到光电探测系统中，侧向散射光由侧向散射光收集光纤束收集并传输至光电探测系统中。本发明可用于细胞的检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，可用于细胞自动分析，属于细胞检测及分析技术领域。
(二)背景技术
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。它在20世纪50年代首次被用于测量细胞体积，可在细胞随快速流动的流体直线通过观察孔时进行检测。在流式细胞仪中，溶液中的细胞以每秒10,000个细胞(或更多)的速度通过仪器的激光束，进而对细胞进行检测。如今的流式细胞仪具有更多的可检测荧光参数(从1或2至最多 30个左右)，可同时测量同一个细胞上的所有参数。
流式细胞数具有如下几个特点：(1)单细胞分析：流式细胞分析的对象是单个细胞或颗粒样物质，各种标本用于流式分析前需经过适当的处理以制备成单细胞悬液；(2)多参数分析：流式细胞分析除了可以获得细胞或颗粒样物质的物理参数外，还可以通过荧光素标记技术对细胞的DNA含量、抗原表达、酶活性等进行分析；(3)高通量：流式细胞数每秒钟可以对成千上万个细胞进行理化特性的分析，最总待测标本中被分析的细胞总数可以达百万个，因此对细胞的特性识别及计数更加准确；(4)分选功能：可以将具有特定性状或功能的细胞从细胞混合群中分离出来。细胞分选尤其是单细胞分选对研究细胞的结构和功能具有重要的价值。
流式细胞仪(Flow cytometer)是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。专利CN103091821A公布了一种使用透镜的作为光收集方案的流式细胞仪，该流式细胞仪的光收集系统采用了4组6片镜头，使用了五种不同的玻璃，其收光系统所占的空间非常大，对光路的整体性的要求也相当高。专利CN110687034A公布了一种激光照射式流失细胞仪，该流失细胞仪为保证其稳定性和各模块独立性，其光路和空间结构及其复杂，制造成本也比较高昂。专利CN111024592A公开了一种流式细胞仪的光路装置，其光路体积较大，收光结构也较为复杂。
传统的流式细胞仪采用空间光路，其对光路的空间性和稳定性要求高，需要对光路进行精密调节，并且光学元件受震动、温度、湿度等外界环境的干扰大。并且，这些空间光学元件的体积大，组装方式不够灵活。更为重要的是，传统的空间光路系统采用的是显微物镜作为收光介质，物镜的体积较大，这限制了物镜的使用数量和光路集成。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。
本发明的目的是这样实现的：
一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置。如图1，它由光路支架1、流体控制系统3、光源4、激发光传输光纤5、侧向散射光收集光纤束
插入孔1-1～1-6、光电探测系统8，前向散射光收集光纤7，废液收集系统6组成。所述系统中：(1)光路支架1的中间有微孔，激发光传输光纤5与前向散射光收集光纤7可以分别插入到微孔中，激发光传输光纤与前向散射光收集光纤在同一直线上；(2)光路支架1的构型为正八边柱体，其每个侧面都有微孔，其中两微孔用于固定流体控制系统中的流动池2，其余微孔1-1～1-6被用于侧向散射收集光纤束的接入，进行侧向散射光的收集和传输，侧向散射光收集光纤束是由7根同心光纤所组成的；(3)可以用密封胶圈对光路支架1与流动池、其他光纤间的间隙，保证间隙内干燥，防止光纤端以及其他装置霉化；(4)激发光传输光纤5与流动池2呈90度，前向散射光收集光纤7与激发光传输光纤5 在同一直线上，也与流动池2呈90度，侧向散射光收集光纤束别位于正八边柱体的其他六个面的微孔1-1～1-6中，收集和传输不同角度的侧向散射光；(5)流体控制系统3将样品注入流动池2，形成单细胞流，激发光传输光纤5将光束从光源4引出、传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集光纤7收集，输入到光电探测系统8，侧向散射光由侧向散射光收集光纤束收集传输至光电探测系统。
如图3所示，在激发光传输光纤5的输入端使用自聚焦透镜9实现模场的匹配，可以实现光源能量高效耦合进激发光传输光纤。
对激发光传输光纤5输出的光束进行改变，使输出的光束为准直的椭圆光束，其目的是为了使激发光束对流动池内的单细胞流照射更加有效，使散射光能更加全面的反应细胞的相关性质。其具体方法如下：
为了使激发光传输光纤5的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上。激发光传输光纤的输出端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束变形透镜 10，再通过自聚焦透镜11准直，最后输出准直的椭圆光束20，如图4。
为了获得丰富与可靠的光学信息，所述的光源可以单一波段的荧光激发光源也可以是不同波段的荧光激发光源4-1/4-2。不同波长的激发光通过光纤波分复用器12合束，耦合进激发光传输光纤5后传输至流动池内的样品上，如图 5。
为了提高散射光的收集效率，所述的散射光接收光纤束的每根光纤接收端具有高数值孔径的微透镜，如图6。该高数值孔径的微透镜可以是通过精密研磨的方法在光纤端制备锥体微透镜13。
为了使光纤端免受尘埃污染，也为了避免高湿度环境使得光纤端霉化，在光纤光路支架1用密封胶圈14来隔离光纤端与外界环境如图7。所述的密封胶圈可以是可拆卸的密封胶圈，也可以是通过环氧胶固定的不可拆卸的密封圈。
传统的空间光路的流式细胞仪具有激发光路、前向散射光收集光路以及侧向散射光收集光路。前向散射光收集光路主要用于细胞大小检测和计数，侧向散射光包含瑞利散射信号和荧光信号，收到的两种信号通过分光棱镜分光后传输到不同的探测器检测。与此相对比，本发明所述的光纤固定块1其正反两面上各有各有一个微孔分别用于激发光传输光纤5与前向散射光收集光纤7的接入，其侧面上有用于固定流动池2的两个微孔，其余每个侧面都有七个微孔，用于固定侧向散射光收集光纤束，如图1示。前向散射收集光纤与侧向散射光收集光纤束的每根光纤的输入端都制备有微透镜来提高收光的数值孔径。
光电探测系统中，包含一个1×64的光开关15与一个单光子探测器16，其中单光子探测器可以替换为其他的光电探测器，例如：雪崩光电二极管、光电倍增管等类似其他光电探测器。一根前向散射光收集光纤与侧向散射光收集光纤束中的42根光纤都与1×64通道的光开关相连，通过光开关将收集到的散射光传递到单光子探测器，进行相应的探测、分析如图8所示。
为了区分和检测不同波长的散射光信号，包括瑞利散射荧光信号，本发明可采用如下分光探测方案：
如图9所示：前向散射光收集光纤7与侧向散射光收集光纤束1-1～1-6 的每一根光纤的输出端都通过精密镀膜技术镀制有不同参数的滤光膜17，对应输出不同的荧光波段再与光电倍增管连接，进行相应的放大探测。
相比于传统的流式细胞仪，本发明具有以下几点显著的优点：
(1)本发明采用全光纤光路，相比较于传统的空间光路而言，光路传输稳，不惧空气中的微小尘埃。
(2)采用光纤替代传统的空间光路，免去了替换器件时的空间光路的精细调整。整个系统的稳定性强，受温度、震动等外界环境影响小。
(3)光纤具有极好的柔韧性，可任意弯曲，这对系统的集成和小型化是极其有利的。
(4)空间光路中暴露于空气中的各种镜片在湿度较大的环境中会有结露、霉变等问题，本发明采用密封技术，避免了霉化问题。
(5)本发明的探测系统采用了一个光开关和一个单光子探测器的组合与其他多光电探测器或光谱仪式的探测方式相比在节约成本上有非常大的提升和进步。
(四)附图说明
图1是一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置示意图。
图2光纤束的结构示意图。
图3是通过光纤端连接自聚焦透镜9的方法提高光源4和激发光传输光纤5的耦合效率的示意图。
图4是激发光传输光纤5的输出端微结构示意图。该光纤端集成了一个微型柱透镜10和一个自聚焦准直透镜11，整个结构封装于外壳12中。该结构能将圆形的光束整形为椭圆的光束输出。(a)为整形前光束形状19，(b)为光纤端光束整形结构，(c)为整形后的椭圆光束20。
图5是光源的波分复用示意图。
图6是以前向散射光收集光纤为例，通过精密研磨的方法在光纤端制备锥体高数值孔径微的透镜的示意图。该结构可以提高散射光的收集效率。
图7是光路支架所用密封胶圈来隔离光纤端与外界0环境示意图。
图8是光电探测系统示意图。前向散射光收集光纤与侧向散射光收集光 纤束与光开关的连接示意图分别如8a与8b所示。
图9是分光探测方案示意图。在侧向散射光纤束的光纤输出端镀有不同性质的滤光膜，再与光电倍增管相连接，进行相应的探测。
图10前向散射光分光探测方案
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：
激光器光源的波长为635nm，细胞的标记荧光素选择APC，该荧光素在 635nm波长激光的激发下，发出波长为655-685nm的绿色荧光。如图1所示，流体控制系统3控制细胞的进样，让鞘液和细胞流注入流动池2。流动池2通过光路支架1的两微孔与废液收集系统相连接，在光路支架1上总固定有44根光纤，分别为激发光传输光纤5、前向散射光收集光纤7和侧向散射光收集光纤束中的 42根光纤。激发光传输光纤5将635nm的光束从光源4引出，垂直于流动池中的单细胞流输出，激发光束和细胞相互作用，散射光分别由前向散射光收集光纤 7和侧向散射光收集光纤束接收，同时传输到光电探测系统中的1×64通道的光开关中。采用以下的分光、滤光策略，在接于光路支架上的侧向散射光收集光纤束中的所有光纤上的输出端镀上透光范围为655-685nm的滤光膜用以收集激发荧光，在前向散射光接受光纤7与其余的侧向散射光收集传输光纤镀上波长小于 650nm的短波通滤光膜。
如图2所示，为了提高光源4输出光束和激发光传输光纤5的耦合效率，在激发光传输光纤5和光源4中间连接一个自聚焦透镜9。
为了使光束和每个通过的细胞充分相互作用，需要对照射在流动池中的激发光束的形状进行整形，使光束的截面是椭圆形的。优选地，椭圆形光束20 的短轴和长轴分别为10微米和100微米。有两种方案可以对激发光传输光纤的输出光场进行整形：
如图3所示，将输入光纤的端面研磨成楔状透镜结构10，楔状透镜结构 10对圆形的输出光束进行压缩整形，然后结合一个自聚焦透镜11对光束进行准直，得到准直的椭圆的输出光束。楔状光纤端和自聚焦透镜被封装在一个柱形的封装壳12内。最后整个封装好的光纤端插入光路支架1的微孔，点胶固定。
如图5所示，为了增大散射光接收光纤的数值孔径，以增加收光效率。在散射光收集传输光纤的纤端制备锥形的微透镜13。
实施例2：
由于荧光没有方向性，理论上来说从位于细胞的各个方向上的散射光收集传输光纤均能收到荧光信号。但是传统的流式细胞仪采用空间光路系统，物镜的体积大，不适合从多个方向收集荧光信号，所以采用侧向散射光的方法收集所有的荧光，再通过滤光镜分光，将不同的荧光信号分到探测器检测。这样一套收集系统其实降低了荧光的收集效率。光纤具有小体积的优势，本发明中所述的光路支架立方体可以是更多侧面的多边立方体。在光路支架的多个光纤固定孔位中，有一个是用于固定激发光传输光纤，其相对位置的孔位用于固定前向散射光收集传输光纤，其余位置的孔位用于固定侧向散射光收集传输光纤。
如图4所示的光源波分复用装置，激发光源为两种不同波长的光源4-1 与4-2，分别为488nm和635nm。两种光源所对应的荧光激发素分别位PE和 APC。激发光传输光纤5将合光的激发光引入、照射到位于流动池的带测细胞中，针对不同的荧光素收集不同的散射光，可以针对特定的光纤束中的光纤进行镀膜处理，因为整个光纤束所处的所有侧面关于前向散射光收集光纤7成中心对称，因此对插入微孔1-1～1-3的光纤束的所有光纤的输出端镀655-685nm的滤光膜用于收集APC的被激发荧光，在插入微孔1-4～1-6的光纤束的所有光纤的输出端镀510-550nm的滤光膜用于收集PE的被激发荧光，光纤束中的光纤再与光电探测系统中的光开关相连接。前向散射光经由波分复用器18之后再与光开关相连接，如图9所示，此时光开关为适应多波段激发变为1×64路通道光开关。
以上实施例为该发明专利的补充与拓展，可知以上实施例并不用于限制与限定本发明专利。
Claims (7)
1.一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：它由流体控制系统、光源、光路支架、激发光传输光纤、前向散射光收集光纤、侧向散射光收集光纤束、光电探测系统以及废液收集系统组成，所述系统中：(1)光路支架的构型为正八边柱体，其每个侧面都有微孔，其中两微孔用于固定流体控制系统的流动池，其余侧面的微孔被用于侧向散射光收集光纤束的接入，激发光传输光纤与前向散射光收集光纤分别接到光路的支架的前后面；(2)使用密封胶圈对光路支架与流动池、其他光纤间的间隙进行密封，保证间隙内干燥，防止光纤端以及其他装置霉化；(3)流体控制系统将样品注入流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光收集光纤收集并输入到光电探测系统，侧向散射光由侧向散射光收集光纤束收集传输至光电探测系统检测。
2.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的光电探测系统由一个1×64路光开光与一个单光子探测器组成。单光子探测器亦可以由其他的光电探测器替换：如光电倍增管、雪崩光电二极管。
3.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的光纤束由7跟光纤插入到毛细管制得。
4.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的激发光传输光纤的输入端与光源连接，该光纤端可以通过自聚焦透镜实现光源输出与激发光传输光纤的高效耦合。
5.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的激发光传输光纤的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上，该光纤端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束整形透镜，再通过自聚焦透镜准直，输出准直的椭圆光束。
6.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的前向散射光收集光纤与侧向散射光收集光纤束是具有大数值孔径、大芯径的纯石英芯掺氟包层光纤。
7.根据权利要求1所述的一种改进的流式细胞仪的光谱细分式光纤集散探测装置，其特征是：所述的前向散射光收集光纤与侧向散射光收集光纤束的输出端镀制有不同参数的滤光膜，对应输出不同的荧光波段再与光电探测系统连接，进行相应的放大探测。
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