CN112964626A - 基于全光纤光路的流式细胞仪 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基于全光纤光路的流式细胞仪。其特征是：它由流体控制系统、光源、流动池、激发光传输光纤、光纤固定块、密封胶圈、散射光接收光纤、光纤波分复用器、光电探测器组成。所述系统中：流体控制系统将样品注入流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光接收光纤收集，输入到光电探测器，侧向散射光由侧向散射光接收光纤收集传输，经过光纤波分复用器，将不同波长的信号光分开后分别传输至不同的光电探测器检测。本发明可用于细胞的自动检测和分析。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于全光纤光路的流式细胞仪，可用于细胞自动分析，属于细胞检测及分析技术领域。
(二)背景技术
流式细胞术是一种细胞分析技术，它在20世纪50年代首次被用于测量细胞体积，可在细胞随快速流动的流体直线通过观察孔时进行检测。在流式细胞仪中，溶液中的细胞以每秒10,000个细胞(或更多)的速度通过仪器的激光束，进而对细胞进行检测。如今的流式细胞仪具有更多的可检测荧光参数(从1或2 至最多30个左右)，可同时测量同一个细胞上的所有这些参数。流式细胞术速度快且具有单细胞水平检测能力，可为细胞生物学家提供统计学功能，能够快速分析和表征数百万个细胞。
流式细胞仪主要由流体系统、光学系统和光电处理系统三个部分组成。流体系统是流式细胞仪的命脉。它负责将核心流中的细胞以单列的形式对齐，并将其传递到检测点以进行数据收集。如果样品进样不一致和细胞对齐不正确，则会导致很大的数据扩散，从而降低数据的可信度。传统的流体系统主要采用喷嘴 (也叫流体室)喷射出由鞘液和样品流一起组成的单细胞流，然后空间激光照射在单细胞流上，通过对前向散射光、侧向散射光的收集和分光，再经由光电探测系统处理分析，得到细胞的统计学数据。
传统的流式细胞仪采用空间光路，其对光路的稳定性要求高，需要对光路进行精密调节，并且光学元件受震动、温度、湿度等外界环境的干扰大。并且，这些空间光学元件的体积大，组装方式不够灵活。更为重要的是，传统的空间光路系统采用的是显微物镜作为收光介质，物镜的体积较大，这限制了物镜的使用数量和光路集成。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种基于全光纤光路的流式细胞仪。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于全光纤光路的流式细胞仪。如图1，它由流体控制系统1、光源3、流动池2、激发光传输光纤4、光纤固定块5、密封胶圈6、散射光接收光纤 7-1/7-2、光纤波分复用器9、光电探测器8-1/8-2/8-3组成。所述系统中：(1)光纤固定块5的中间有微孔，流动池2可穿过微孔；(2)光纤固定块的四周有微孔，用于固定激发光传输光纤和散射光接收光纤，并且所固定光纤的纤端均正对于流动池的中心；(3)密封胶圈6用于密封光纤固定块5与流动池2间的间隙，保证间隙内干燥，防止光纤端霉化；(4)散射光接收光纤包含前向散射光接收光纤7-1和侧向散射光接收光纤7-2，前向散射光接收光纤7-1和激发光传输光纤4共线固定于光纤固定块5上，侧向散射光接收光纤7-2和激发光传输光纤4呈90度固定于光纤固定块5上；(5)流体控制系统1将样品注入流动池，形成单细胞流 10，激发光传输光纤4将光束从光源3引出，传输并照射于单细胞流10上，前向散射光由前向散射光接收光纤7-1收集，输入到光电探测器8-1，侧向散射光由侧向散射光接收光纤7-2收集传输，经过光纤波分复用器9，将不同波长的信号光分开后分别传输至不同的光电探测器8-2/8-3检测。
如图3所示，为了实现光源能量高效耦合进光纤，在激发光传输光纤4 的输入端可以使用自聚焦透镜12实现模场匹配。
如图4所示，为了实现光源能量高效耦合进光纤，也可以通过热扩散技术在光纤端直接制备光纤内的模场转换透镜4-1，实现光源3输出向激发光传输光纤4内的高效耦合。
为了使激发光束和流动池2内的单细胞流10有效相互作用，需要对激发光传输光纤4输出的光束进行整形，使输出的光束为准直的椭圆光束。整形的方法可以有两种：
(1)所述的激发光传输光纤4的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流 10上。该光纤端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束整形透镜13，再通过自聚焦透镜14准直，输出准直的椭圆光束，如图5。
(2)所述的激发光传输光纤的输出端输出的光束垂直照射与单细胞流上。该光纤端连接微柱透镜17和自聚焦透镜14，输出的光束为准直的椭圆光束，如图6。
为了获得更丰富的光学信息，所述的光源可以是不同波段的荧光激发光源3-1/3-2。不同波长的激发光通过光纤波分复用器9合束，耦合进激发光传输光纤4后传输至流动池2的样品上，如图9。
为了提高散射光的收集效率，所述的散射光接收光纤7的接收端具有高数值孔径的微透镜，如图7。该高数值孔径的微透镜可以是通过精密研磨的方法在光纤端制备锥体微透镜18。
为了使光纤端免受尘埃污染，也为了避免高湿度环境使得光纤端霉化，在光纤固定块5上使用密封胶圈6来隔离光纤端与外界环境(如图1)。所述的密封胶圈6可以是可拆卸的密封胶圈，也可以是通过环氧胶固定的不可拆卸的密封圈。
传统的空间光路的流式细胞仪具有激发光路、前向散射光收集光路以及侧向散射光收集光路。前向散射光收集光路主要用于细胞大小检测和计数，侧向散射光包含瑞利散射信号和荧光信号，收到的两种信号通过分光棱镜分光后传输到不同的探测器检测。与此相对比，本发明所述的光纤固定块5可有3个光纤固定孔5-1/5-2/5-3，如图8(a)所示，分别固定激发光传输光纤、前向散光收集光纤和90度的侧向散射光接收光纤，每根散射光接收光纤的纤端制备有微透镜来提高收光的数值孔径。
当然，由于光纤直径在百微米量级，较传统空间光学的物镜小很多，因此光纤的散射光接收光纤的数量可以不限于3根。如图8(b-d)所示，光纤固定块可以是有圆周分布的多个光纤固定孔，用于固定激发光传输光纤和散射光接收光纤。其中包含一根激发光传输光纤、一根前向散射光接收光纤、一根侧向散射光接收光纤和其他角度的散射光接收光纤。由于荧光信号光没有方向性，因此增加的其他角度的散射光接收光纤数量可以更有效地收集荧光信号。
光纤的体积小巧，因此所述的全光纤光路可以是并行的几套光路，如图 11所示，分布于流动池轴向上的不同位置，可以增加更多的荧光信号通道数量。
为了区分和检测不同波长的散射光信号，包括瑞利散射荧光信号，本发明可采用3种分光探测方案：
(1)如图1所示，可以通过光纤波分复用器9，将不同波长的信号光分路，传输至不同的探测器8-2/8-3检测。
(2)如图2所示，为了区分和检测不同波长的荧光信号，所述的光电探测器11的芯片前固定有不同波段的带通滤光片11-1，每个探测器用于接收检测不同的荧光信号，每根散射光接收光纤通过光纤适配器的方式与光电探测器连接，对应的光电探测器前的滤光片11-1可滤除其他波长的荧光，只通过该通道探测荧光信号。
(3)如图5所示，每根散射光接收光纤的末端通过光纤适配器22和光电探测器连接，与方案2不同的是，本方案采用直接在光纤端通过镀制不同厚度介质膜的方法，制备滤光膜23，实现滤光目的。
相比于传统的流式细胞仪，本发明具有以下几点显著的优点：
(1)本发明采用全光纤光路，相比较于传统的空间光路而言，光路传输稳，不惧空气中的微小尘埃。
(2)采用光纤替代传统的空间光路，免去了替换器件时的空间光路的精细调整。整个系统的稳定性强，受温度、震动等外界环境影响小。
(3)光纤具有极好的柔韧性，可任意弯曲，这对系统的集成和小型化是极其有利的。
(4)空间光路中暴露于空气中的各种镜片在湿度较大的环境中会有结露、霉变等问题，本发明采用密封技术，避免了霉化问题。
(四)附图说明
图1是基于全光纤光路的流式细胞仪的原理图。
图2是集成有带通滤光片11-1的光电探测器11。
图3是通过光纤端连接自聚焦透镜12的方法提高光源3和激发光传输光纤4的耦合效率的示意图。
图4是通过热扩散方法在光纤端制备集成的模场转换透镜4-1结构示意图，可用于提高光源输出的耦合效率。
图5是激发光传输光纤4输出端的结构。该光纤端通过研磨制备了楔状的微透镜13，然后连接一个自聚焦准直透镜14，整个结构封装于外壳15中。该结构能将圆形的光束16-1整形为椭圆的光束16-2输出。(a)为整形前光束形状， (b)为光纤端光束整形结构，(c)为整形后的椭圆光束。
图6是激发光传输光纤4输出端的另一种可用结构。该光纤端集成了一个微型柱透镜17和一个自聚焦准直透镜14，整个结构封装于外壳15中。该结构能将圆形的光束16-1整形为椭圆的光束16-2输出。(a)为整形前光束形状，(b) 为光纤端光束整形结构，(c)为整形后的椭圆光束。
图7是散射光接收光纤7的接收端的微透镜结构。该结构是通过精密研磨的方法制备的具有大数值孔径的锥体微透镜18，能提高散射光的收集效率。
图8是不同结构的光纤固定块。这些光纤固定块可固定多根光纤，用于更多方向的散射光的收集，提供更丰富的光学信息。(a)图所示的光纤固定块5 有3个光纤固定孔5-1/5-2/5-3，(b)-(d)依次为4孔、5孔、8孔光纤固定块。
图9是具有7路散射光收集的全光纤流式细胞仪系统，该系统内具有两种激发波长。
图10(a)是散射光接收光纤的输出端的结构示意图。该光纤的输出端接有光纤适配器22，可直接与装有光纤法兰盘的探测器连接。光纤端镀有带通滤光用的介质膜23。(b)、(c)所示的是滤光的效果示意图。
图11是具有多个并行激发光路的全光纤流式细胞仪系统结构示意图。
图12对应图9中的系统所采用的荧光标记物及所对应的探测器信息。
图13对应图11中的系统所采用的荧光标记物及所对应的探测器信息。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：
激光器的波长为488nm，细胞的标记荧光素选择PE，该荧光束在488nm 波长激光的激发下，发出波长为510-550nm的绿色荧光。如图1所示，流体控制系统1控制细胞的进样，让鞘液和细胞流注入流动池2。流动池2通过光纤固定块5的中心，在光纤固定块5的四周固定有三根光纤，分别为激发光传输光纤4、前向散射光接收光纤7-1和侧向散射光接收光纤7-2。激发光传输光纤4将488nm 的光束从光源3引出，垂直于流动池2中的单细胞流10输出，激发光束和细胞相互作用，散射光分别由前向散射光接收光纤7-1和侧向散射光接收光纤7-2接收，分别传输至不同的探测器8-1/8-2/8-3接收。侧向散射光接收光纤通过一个光纤波分复用器分束9，将侧向散射光分为488nm和510-550nm的两束光，分别传输至探测器8-2/8-3检测。
如图3所示，为了提高光源3输出光束和激发光传输光纤4的耦合效率，在激发光传输光纤4和光源3中间连接一个自聚焦透镜12。
当然，如图4所示，也可以采用热扩散的方式，使激发光传输光纤4纤端内部的掺杂物质扩散，改变光纤内部的折射分布，形成内部集成的一个模场转换透镜4-1，以提高光源输出光的耦合效率。
为了使光束和每个通过的细胞充分相互作用，需要对照射在流动池中的激发光束的形状进行整形，使光束的截面是椭圆形的。优选地，椭圆形光束的短轴和长轴分别为10微米和100微米。有两种方案可以对激发光传输光纤的输出光场进行整形：
方案1：如图5所示，将输入光纤的端面研磨成楔状透镜结构13，楔状透镜结构13对圆形的输出光束16-1进行压缩整形，然后结合一个自聚焦透镜14 对光束进行准直，得到准直的椭圆的输出光束16-2。楔状光纤端和自聚焦透镜被封装在一个柱形的封装壳15内。最后整个封装好的光纤端插入光纤固定块5，点胶固定。
方案2：如图6所示，将输入光纤端切平，前端依次集成一个柱透镜17 和一个自聚焦透镜14，将圆形的光束16-1整形为准值的椭圆光束16-2输出。光纤端、柱透镜17和自聚焦透镜14被封装在一个柱形的封装壳15内。
如图8所示，为了增大散射光接收光纤的数值孔径，以增加收光效率。在散射光接收光纤7的纤端制备锥形的微透镜18。
实施例2：
由于荧光没有方向性，理论上来说从细胞的各个方向上均能收到荧光信号。但是传统的流式细胞仪采用空间光路系统，物镜的体积大，不适合从多个方向收集荧光信号，所以采用侧向散射光的方法收集所有的荧光，再通过滤光镜分光，将不同的荧光信号分到探测器检测。这其实降低了荧光的收集效率。光纤具有小体积的优势，本发明中所述的光纤固定块固定光纤的孔位可以是多个，如图 8所示。这些光纤固定块的多个光纤固定孔位中，有一个是用于固定激发光传输光纤，其相对位置的孔位用于固定前向散射光接收光纤，其90度位置的孔位用于固定侧向散射光接收光纤，其余孔位用于固定不同角度的多根包含荧光散射信号的收集光纤。
如图9所示的光纤流式细胞仪系统。该系统采用两种波长的激发光，分别为488nm和405nm。这两路激光所作用的荧光物质以及其发射的荧光波长如图 12所示。
两路光源3-1/3-2通过光纤波分复用分器9合束，通过激发光传输光纤4 传输至流动室2的单细胞流10上，其不同方向的散射光经过七根散射光接收光纤 (7-1-至7-7)收集，传输至不同的探测器(8-1至8-7)检测。与实施例1不同的是，本实施例的滤光系统采用的是在散射光接收光纤的输出端镀制介质膜的方式，如图10(a)所示，散射光接收光纤的尾端有光纤适配器22，在每根不同光纤的端面处镀制了不同参数的介质膜23，起到所探测荧光波段带通的作用，如图10b、 c所示。每根散射光接收光纤的端面所通过的波段如图12所示。
实施例3：
有的时候，两种不同的荧光标记物的激发波长不同，但是发射波长相同。为了区分这两种不同的荧光标记物，就需要使用两种不同波长的激光在不同的时间激发同一个细胞。并行的激发光路就能解决这个问题。
例如，PE-AF647的激发波长是488nm，APC的激发波长是633nm，而两种染料的发射波长均在680nm。如图11所示，该系统具有两个并行固定的光纤固定块5-1/5-2。其中两套独立的激发、探测光路与实施例1中的相同，激发光源的波长分别为488nm和633nm。当然，每套独立系统的探测器前的滤光片的参数也不同，系统所采用的荧光标记物及所对应的探测器信息如图13所示。这样，相同细胞上的PE-AF647染料和APC染料的荧光信号就能被区分。
Claims (10)
1.一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：它由流体控制系统、光源、流动池、激发光传输光纤、光纤固定块、密封胶圈、散射光接收光纤、光纤波分复用器、光电探测器组成。所述系统中：(1)光纤固定块的中间有微孔，流动池可穿过微孔；(2)光纤固定块的四周有微孔，用于固定激发光传输光纤和散射光接收光纤，并且所固定光纤的纤端均正对于流动池的中心；(3)密封胶圈用于密封光纤固定块与流动池间的间隙，保证间隙内干燥，防止光纤端霉化；(4)散射光接收光纤包含前向散射光接收光纤和侧向散射光接收光纤，前向散射光接收光纤和激发光传输光纤共线相对固定于光纤固定块上，侧向散射光接收光纤和激发光传输光纤呈90度固定于光纤固定块上；(5)流体控制系统将样品注入流动池，形成单细胞流，激发光传输光纤将光束从光源引出，传输并照射于单细胞流上，前向散射光由前向散射光接收光纤收集，输入到光电探测器，侧向散射光由侧向散射光接收光纤收集传输，经过光纤波分复用器，将不同波长的信号光分开后分别传输至不同的光电探测器检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的激发光传输光纤的输入端与光源连接，该光纤端可以通过自聚焦透镜实现光源输出与激发光传输光纤的高效耦合，也可以通过热扩散技术在光纤端制备模场转换透镜，实现光源输出和激发光传输光纤的高效耦合。
3.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的激发光传输光纤的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上，该光纤端连接微柱透镜和自聚焦透镜，输出的光束为准直的椭圆光束。
4.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的激发光传输光纤的输出端输出的光束垂直照射于单细胞流上，该光纤端通过光纤精密研磨技术，制备了楔状的光束整形透镜，再通过自聚焦透镜准直，输出准直的椭圆光束。
5.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的光源可以是不同波段的荧光激发光源，由光纤引出，再通过光纤波分复用器合束，经激发光传输光纤传输至流动池内的样品上。
6.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的光电探测器的芯片前固定有不同波段的带通滤光片，每个探测器用于接收检测不同的荧光信号。
7.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的散射光接收光纤的接收端具有高数值孔径的微透镜。
8.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的密封胶圈可以是可拆卸的密封胶圈，也可以是通过环氧胶固定的不可拆卸的密封圈。
9.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的光纤固定块可以是固定有三根光纤，分别为激发光传输光纤、前向散光收集光纤和侧向散射光接收光纤；也可以是固定有圆周分布的多根光纤，其中包含一根激发光传输光纤、一根前向散射光接收光纤、一根侧向散射光接收光纤和其他角度的散射光接收光纤。
10.根据权利要求1所述的一种基于全光纤光路的流式细胞仪，其特征是：所述的全光纤光路可以是并行的几套光路，分布于流动池轴向上的不同位置。
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2020
- 2020-08-04 CN CN202010769940.2A patent/CN112964626A/zh active Pending
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