CN110208224B - 基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪 - Google Patents

基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：它由捕获光源1‑1，问询光源1‑2，标准单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，功率计6，同轴双波导光纤7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，光纤耦合器13，滤光片14‑1、14‑2，拉曼光谱仪15，平衡光电探测器16，带有FFT档的示波器17，侧抛耦合器18和微操手19组成。本发明可用于单细胞捕获、单细胞拉曼光谱、单细胞荧光光谱和单细胞质谱的获取，可广泛用于单细胞操作及谱分析技术领域。

Description

基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪
技术领域
本发明涉及的是一种基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，可用于单细胞捕获、质谱测量、拉曼光谱测量以及荧光光谱测量，属于单细胞操纵、测量及分析技术领域。
背景技术
细胞是组成生命体的基本单元，了解一个细胞中发生的生命活动对于我们认识生命过程有具有十分重要的价值。单细胞技术是当前生物学技术的前沿，可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以检验过去经典方法的结论，还可以发现许多新的规律。传统的细胞生物学依据细胞的来源组织、自身外在形态，以及分泌物等特征对细胞群体进行分类和研究。这些技术和分析手段在疾病诊断和细胞与细胞间的相互作用等领域取得了显著的研究成果。然而，随着细胞分析技术的不断提高，人们越来越发现细胞之间具有个体差异性。即使是在相同条件下培养的同源细胞，其形态及其特性仍旧存在一定的差异。这些差异的来源是细胞内随时发生的化学反应的随机性。在细胞内所发生的随机过程可能会导致细胞的某些参数的结果存在多个稳定态，而传统的群体细胞检测技术只能给出这些稳态的平均结果。因此，为了了解不同细胞个体之间随机性导致的各种差异，单细胞分析技术的发展就显得尤为重要。
正是由于不同的细胞个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，就必须从单细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。但是单细胞分析研究却由于细胞的极小体积、极多的物质种类、极少的物质含量以及不同物质间显著的浓度差异而一度受阻。
光镊是利用光强度分布的梯度力和散射力捕获和操纵微小粒子的工具。该技术在微小粒子的捕获和搬运、皮牛级力的测量、微机械与微器件的组装等领域得到广泛的应用。特别在生命科学领域，光镊技术以其非接触式、无损探测的本质特性显示了其无与伦比的优势，对于推动生命科学的发展和微生命体的操纵发挥了巨大的作用。光镊捕获的粒子尺度可以从几纳米到几十微米，而这刚好是单个细胞所处的尺度范围之内，因此其能够对单个细胞个体进行有效的捕获及操作。
结合光镊技术对细胞的运动控制，可以快速原位地测量单细胞的拉曼光谱和荧光光谱。拉曼光谱和荧光光谱在单细胞生物技术中被广泛应用，这是因为这两种谱技术能够在一定程度上反映单细胞内部的物质组成和含量。拉曼光谱则是在分子水平上对物质进行检测和区分，具备有“分子指纹”的特性。荧光相关光谱测量所获得的关于细胞内结构的一些拟合参数能够反映细胞内微环境的高度异质性。通过对细胞内微环境的异质性的了解,以及单细胞水平检测分子特性，将会对了解生物学过程起巨大的促进作用。
质谱也是一种很适合于单细胞分析的检测方法，它具有无需标记、极高的灵敏度以及多物质同时检测的能力，能如实地反映细胞内各物质成分种类和含量。目前而言，所发展出的单细胞质谱仪均是基于多种离子化方法，这些方法能够对不同类型的样品进行解吸附/离子化，主要包括电喷雾/纳喷雾离子化(electrospray/nano-electrosprayionization,ESI/Nano-ESI)、激光剥蚀/激光解吸附离子化(laser ablation/laserdesorption ionization，LA/LDI)以及二次离子电离(secondary ionization massspectrometry,SIMS)等。被离子化后的物质具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。
本发明提出的一种基于同轴双波导光纤的单细胞多功能谱仪除了实现单细胞捕获、拉曼光谱和荧光光谱的测量外，还能实现单细胞质谱的测量。其对单细胞质谱测量的实现原理与现存的基于物质离子化的质谱仪不同，它是依靠周期性变化的光动力来对细胞内不同结构和物质成分进行扫频式扭转激励谐振，不同质量的结构和物质具备有不同的谐振频率，因此通过对激励谐振频率的扫描，使得这些结构和物质逐个种类谐振响应，再通过收集散射信号光并解调的方法，便能实现细胞质谱的测量。
本发明能够实现对单细胞的实时、原位、多功能谱检测功能，能够快速获得单细胞的拉曼光谱、荧光光谱和质谱，具备有十分重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，用于单细胞质谱、拉曼光谱和荧光光谱的获得。
本发明的目的是这样实现的：
一种基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，它由捕获光源1-1，问询光源1-2，标准单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，功率计6，同轴双波导光纤7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，光纤耦合器13，第一滤光片14-1、第二滤光片14-2，拉曼光谱仪15，平衡光电探测器16，带有FFT档的示波器17，侧抛耦合器18和微操手19组成。所述系统中：(1)捕获光束由标准单模光纤2从捕获光源1-1引出，经由光强度调制器4、隔离器5和光纤耦合器13后分为两路，其中一路接入功率计进行功率监控，另一路通过侧抛耦合器18输入同轴双波导光纤7的环形芯内传输；(2)同轴双波导光纤7的纤端制备有旋转对称的锥台结构，能够对环形芯内传输的光束进行反射会聚，实现单细胞捕获、拉曼光谱激发和质谱的激发的功能；(3)问询光源1-2输出的细胞谐振问询光束经过隔离器和光纤耦合器后分为两路，其中一路接入功率计6，另一路也通过侧抛耦合器18输入同轴双波导光纤7的环形芯内传输；(4)后向散射的拉曼信号光经由同轴双波导光纤7的中间芯收集并反向传输，经过光纤耦合器13和第一滤光片14-1后，由拉曼光谱仪15接收，进行拉曼光谱分析；(5)后向散射的谐振质谱信号光，经由同轴双波导光纤7的中间芯收集并反向传输，经过光纤耦合器13和第二滤光片14-2后，由平衡光电探测器16接收，进行光电转换，再经过信号处理后由带有FFT档的示波器17显示其质谱信息；(6)微操手19用于同轴双波导光纤探针的精密位移操作，照明光源8、显微物镜10、CCD11和计算机12组成成像模块，用于细胞操纵的实时成像。
所采用的同轴双波导光纤7具备有一个中间芯和一个同轴分布的环形芯，在环形芯的周围具有一层掺氟的低折射率层，或者在中间芯的周围分布有一圈微孔，用于增加中间芯的数值孔径。
所采用的同轴双波导光纤的纤端制备有精细研磨而成的旋转对称的反射锥台结构，用于环形芯内传输光束的反射会聚，形成光捕获势阱。为了满足全内反射汇聚，锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2),n1为细胞所处液态环境折射率，n2为环形芯折射率。
可以采用侧抛耦合的方法实现捕获光束21(激发光束)和问询光束22从单模光纤2向同轴双波导光纤7的环形芯内耦合，如此便可以保证同轴双波导光纤7的两个波导独立工作。
该仪器能用于单细胞质谱检测，方法为：(1)函数发生器控制光强度调制器，使得捕获光束强度周期性改变，并且其调制频率能够从1Hz到1GH的范围内连续扫描，导致被捕获单细胞的表面及其内部的辐射压力随着光强的周期性扫频式变化而变化，由于细胞及其内部结构的质量不同，各个结构将会随着频率扫描发生逐个谐振响应；(2)用连续的问询探测光进行谐振问询，当有谐振子被激励谐振时，后向散射的问询光强会在时域上变化，因此后向散射问询光包含有不同的谐振信号；(3)平衡光电探测器接收到后向散射的问询光信号，去除交流并发大交流，再做FFT变换至频域，得到细胞的谐振频谱，即对应于细胞的质谱。
该仪器也能用于单细胞的荧光光谱的测量，方法为：将捕获光源1-1采用多波段、可用于荧光激发的光源模块，拉曼光谱仪替换为荧光谱仪，则可以实现单细胞的多波段荧光光谱的激发与测量。
本发明至少具备有以下的明显优点：
(1)提出一种单细胞质谱分析方法。相比较于传统的单细胞质谱分析方法，本发明提出的质谱分析方法具有无创、实时、原位和提供动态质谱检测的特点。
(2)本发明将单细胞捕获技术、质谱技术、拉曼光谱技术和荧光光谱技术集成在同一根同轴双波导光纤当中，能提供丰富的细胞结构和化学组成信息。因此本发明能够全方位、多功能地实现单细胞的分析。
(3)本发明所提出的光纤探针将多个单细胞分析功能集成于一根光纤之内，而光纤探针具备有集成度高、操作灵活性高的特点，能够实现活体单细胞的在体快速分析。
附图说明
图1是单细胞多层级谐振子模型图。
图2是基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪的系统图。
图3是同轴双波导光纤的结构和折射率分布示意图。
图4是可采取的多种优化的同轴双波导光纤结构及折射率分布示意图。
图5是单模光纤和同轴双波导光纤的环形芯内光束的侧抛耦合示意图。
图6是侧抛耦合器制备及封装示意图。
图7是同轴双波导光纤纤端的旋转对称结构示意图。
图8是基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪用于质谱获取示意图。
图9是基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪用于拉曼光谱获取示意图。
具体实施方式
在具体阐述本发明的工作原理之前，先结合附图说明一种新颖的质谱测量方法。
(1)如图1所示，将被捕获单细胞20当作多层级的谐振子，可以等效于带有阻尼的弹簧式谐振子模型，具体描述为：细胞整体为第一层谐振子，里面的各个细胞器为第二层谐振子，大分子和其他纳米结构为第三层谐振子。由于细胞和细胞器以及内部的大分子的质量各不相同，其各自的谐振频率不同，并且具备一一对应关系；
(2)当捕获光束以不同频率进行强度调制扫描时，捕获光束对细胞的辐射压力会随之扫频式改变，不同质量的谐振子会依次谐振响应；
(3)用连续的问询探测光进行谐振问询，当有谐振子被激励谐振时，后向散射的问询光强会在时域上变化，因此后向散射问询光包含有不同的谐振信号；
(4)平衡光电探测器接收到后向散射的问询光信号，去除交流并发大交流，再做FFT变换至频域，得到细胞的谐振频谱，即对应于细胞的质谱。
对于上述的多层级的带有阻尼的弹簧式谐振子模型，应该利用动力矩阵的形式来描述其运动状态。建立起多层级的带有阻尼的弹簧式谐振子模型，用于这种质谱获取方法的一般解释。考虑阻尼作用和周期性的激振力，其运动方程可以描述为：
Figure GDA0003120649110000041
令
Figure GDA0003120649110000042
为细胞结构的质量矩阵，
Figure GDA0003120649110000043
为阻尼矩阵，
Figure GDA0003120649110000044
为刚度矩阵，
Figure GDA0003120649110000045
为细胞器所受的激振力矩阵。即上式可写作：
MX”(t)+CX'(t)+KX(t)＝F(t)
(2)
利用傅里叶变换将方程变换到频域形式，有：
(-ω2M+iωC+K)X(ω)＝F(ω) (3)
定义阻抗矩阵:
Figure GDA0003120649110000051
因此运动方程可以写作：
Figure GDA0003120649110000052
阻抗矩阵D描述了各个细胞器的所有固有特性，包括其质量，固有频率与模态振型。由上述方程可以看出，通过施加变频扫描的光动力作为激振力矩阵
Figure GDA0003120649110000053
并通过测得问询光束的反射信号的强度变化，来得到位移响应矩阵
Figure GDA0003120649110000054
这样就可以反演得到包含有细胞质量分布和结构信息的阻抗矩阵D。
下面结合附图和具体的实施例来进一步阐述本发明。
图2所示的是基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪的系统图，系统包含有：捕获光源1-1，问询光源1-2，标准单模光纤2，函数发生器3，光强度调制器4，隔离器5，功率计6，同轴双波导光纤7，照明光源8，载物台9，显微物镜10，CCD11，计算机12，光纤耦合器13，滤光片14-1、14-2，拉曼光谱仪15，平衡光电探测器16，带有FFT档的示波器17，侧抛耦合器18和微操手19。其中：(1)捕获光束由标准单模光纤2从捕获光源1-1引出，经由光强度调制器4、隔离器5和光纤耦合器13后分为两路，其中一路接入功率计进行功率监控，另一路通过侧抛耦合器18输入同轴双波导光纤7的环形芯内传输；(2)同轴双波导光纤7的纤端制备有旋转对称的锥台结构，能够对环形芯内传输的光束进行反射会聚，实现单细胞捕获、拉曼光谱激发和质谱的激发的功能；(3)问询光源1-2输出的细胞谐振问询光束经过隔离器和光纤耦合器后分为两路，其中一路接入功率计6，另一路也通过侧抛耦合器18输入同轴双波导光纤7的环形芯内传输；(4)后向散射的拉曼信号光经由同轴双波导光纤7的中间芯收集并反向传输，经过耦合器13和滤光片14-1后，由拉曼光谱仪15接收，进行拉曼光谱分析；(5)后向散射的谐振质谱信号光，经由同轴双波导光纤7的中间芯收集并反向传输，经过光纤耦合器13和滤光片14-2后，由平衡光电探测器16接收，进行光电转换，再经过信号处理后由带有FFT档的示波器17显示其质谱信息；(6)微操手19用于同轴双波导光纤探针的精密位移操作，照明光源8、显微物镜10、CCD11和计算机12组成成像模块，用于细胞操纵的实时成像。
本发明采用的同轴双波导光纤如图3所示，图3(a)为这种光纤的结构，图3(b)为其折射率分布。该光纤具备有一个中间纤芯和一个同轴分布的环形纤芯。其中环形芯波导用于传输捕获光束(激发光束)和问询光束，中间芯通道则是用于收集和传输后向散射的谐振信号光，拉曼信号光和荧光信号光。
由于后向散射光的强度较弱，为了增加后向散射光的收集效率，可以对这种光纤的结构进行优化设计。如图4所示，对同轴双波导光纤的结构优化方案有3种：(1)增大中间纤芯的直径(图4(a))，从而增大后向散射光的收集效率；(2)增大中间纤芯的直径的同时，在中间芯周围制备有一层掺氟的低折射率层，以增加中间纤芯的数值孔径(图4(b))，提高后向散射光的收集效率；(3)增大中间纤芯的直径的同时，在中间芯周围制备有一圈空气微孔(图4(c))，同样能够增大中间纤芯的数值孔径。
如图5所示，可以采用侧抛耦合的方法实现捕获光束21(激发光束)和问询光束22从单模光纤2向同轴双波导光纤7的环形芯内耦合，如此便可以保证同轴双波导光纤7的两个波导独立工作，中间芯能稳定低损耗传输拉曼信号光23和谐振信号光24。
该侧抛耦合器18可使用图6的制备方法制备，制得的侧抛耦合器具有较好的长期稳定性。制备步骤为：
(1)制备V槽：根据单模光纤和同轴双波导光纤的参数，确定侧抛量，根据侧抛量分别制备合适深度和形状的V型石英槽；
(2)固定光纤并抛磨：将剥去一段涂覆层的光纤放置在槽内，使用稳定性好的紫外固化胶固定，将两种光纤固定在各自参数的V槽内，将光纤抛磨至V槽的上平面并抛光；
(3)调节耦合并点胶封装：使用通光实时功率监控的方法，在特制的封装器件内，对侧抛耦合器进行耦合对准调节和点胶封装。
为了实现对单细胞的稳定捕获，拉曼光谱的高效激发和单细胞质谱的谐振激励，在同轴双波导光纤7的纤端制备有旋转对称的圆台结构，如图7所示。该圆台结构能够对同轴双波导光纤的环形芯内传输的光束全内反射聚焦，从而一方面实现较深的捕获势阱，用于单细胞捕获，另一方面聚焦的光束具备有较强的能量密度，能实现被捕获单细胞拉曼的激发。
为了实现环形芯内光束的全内反射，圆锥台的锥台底角α需满足：α≥arcsin(n1/n2),n1为细胞所处的液态环境折射率，n2为同轴双波导光纤环形芯的折射率。
实施例1：单细胞质谱的获取：
捕获光束21的波长采用980nm，问询光束22波长采用1310nm，两束光共同通入同轴双波导光纤7的环形芯，如图8(a)所示。通入的980nm捕获光束21，捕获光束20在圆锥台处全内反射，在离光纤端面一段距离处汇聚，实现较深的捕获势阱，单细胞20被捕获。接着，通过函数发生器3，给一个频率在1Hz到1GHz连续可调的余弦信号至光强度调制器4，使得捕获光束21在准静态捕获光强Itrap的基础上具备有一个余弦的交流调制，如图8(b)左图所示。余弦调制的光强不仅能够对单细胞20实现准静态的捕获，还能周期性改变单细胞20表面及其内部结构所受到的辐射压力的大小，这个辐射压力作为一个外源的周期性驱动力。当函数发生器调制余弦信号，使其进行频率在1Hz-1GHz间扫描，那么辐射压力周期性变化的频率也实现1Hz-1GHz间扫描，单细胞20及其内部的结构和大分子逐一谐振响应。问询光束22采用图8(b)右图所示的恒定光强的弱光束，当谐振发生时，后向散射的谐振信号光24的强度会发生改变。由此，平衡光电探测器16所接收到的谐振信号光24包含了单细胞20的谐振信息。对探测到的谐振信号光24进行去除直流并放大交流操作，带有FFT档的示波器17对处理后的信号进行傅立叶变换，得到频域上的图谱，该图谱对应于单细胞20的质谱分布。
实施例2：单细胞拉曼光谱的获取：
如图9所示，拉曼激发光束和单细胞捕获光束21为同一光束，采用980nm的捕获光源。该光束耦合进同轴双波导光纤7的环形芯内，光强度调制器4控制光强恒定不变，如图9(b)左图所示。捕获光束21经过圆锥台的反射汇聚，不仅能够实现单细胞20捕获，由于汇聚的捕获光束21具备有较高的能量密度，还能够实现被捕获单细胞20拉曼光谱的激发。后向散射的拉曼信号光23经过同轴双波导光纤7的中间芯收集并传输，经过滤光片14-1滤除瑞利散射光后，输入拉曼光谱仪15进行分析，得到其拉曼光谱如图9(b)右所示。
实施例3：单细胞多波段荧光光谱的获取：
本实施例和拉曼光谱获取的区别在于，需要将激发光束的波长更换，采用多组不同波长的光源实现单细胞捕获和荧光激发，并将拉曼光谱仪更换为荧光光谱仪。同样的，荧光信号通过同轴双波导光纤7的中间芯收集传输，经过不同参数的滤光片，输入荧光光谱仪进行分析。

Claims (5)

1.一种基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：它由捕获光源(1-1)，问询光源(1-2)，标准单模光纤(2)，函数发生器(3)，光强度调制器(4)，隔离器(5)，功率计(6)，同轴双波导光纤(7)，照明光源(8)，载物台(9)，显微物镜(10)，CCD(11)，计算机(12)，光纤耦合器(13)，第一滤光片(14-1)、第二滤光片(14-2)，拉曼光谱仪(15)，平衡光电探测器(16)，带有FFT档的示波器(17)，侧抛耦合器(18)和微操手(19)组成，所述活体单细胞多功能谱仪中：(1)捕获光束由标准单模光纤(2)从捕获光源(1-1)引出，经由光强度调制器(4)、隔离器(5)和光纤耦合器(13)后分为两路，其中一路接入功率计进行功率监控，另一路通过侧抛耦合器(18)输入同轴双波导光纤(7)的环形芯内传输；(2)同轴双波导光纤(7)的纤端制备有旋转对称的锥台结构，能够对环形芯内传输的光束进行反射会聚，实现单细胞捕获、拉曼光谱激发和质谱的激发的功能；(3)问询光源(1-2)输出的细胞谐振问询光束经过隔离器(5)和光纤耦合器(13)后分为两路，其中一路接入功率计(6)，另一路也通过侧抛耦合器(18)输入同轴双波导光纤(7)的环形芯内传输；(4)后向散射的拉曼信号光经由同轴双波导光纤(7)的中间芯收集并反向传输，经过光纤耦合器(13)和第一滤光片(14-1)后，由拉曼光谱仪(15)接收，进行拉曼光谱分析；(5)后向散射的谐振质谱信号光，经由同轴双波导光纤(7)的中间芯收集并反向传输，经过光纤耦合器(13)和第二滤光片(14-2)后，由平衡光电探测器(16)接收，进行光电转换，再经过信号处理后由带有FFT档的示波器(17)显示其质谱信息；(6)微操手(19)用于同轴双波导光纤探针的精密位移操作，照明光源(8)、显微物镜(10)、CCD(11)和计算机(12)组成成像模块，用于细胞操纵的实时成像。
2.根据权利要求1所述的基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：所采用的同轴双波导光纤具备有一个中间芯和一个同轴分布的环形芯，在环形芯的周围具有一层掺氟的低折射率层，或者在中间芯的周围分布有一圈微孔，用于增加中间芯的数值孔径。
3.根据权利要求1所述的基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：捕获光束和问询光束是通过侧抛耦合的方法使得光耦合进同轴双波导光纤的环形芯内。
4.根据权利要求1所述的基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：该活体单细胞多功能谱仪能用于单细胞质谱检测，方法为：(1)函数发生器控制光强度调制器，使得捕获光束强度周期性改变，并且其调制频率能够从1Hz到1GHz的范围内连续扫描，导致被捕获单细胞的表面及其内部的辐射压力随着光强的周期性扫频式变化而变化，由于细胞及其内部结构的质量不同，各个结构将会随着频率扫描发生逐个谐振响应；(2)用连续的问询探测光进行谐振问询，当有谐振子被激励谐振时，后向散射的问询光强会在时域上变化，因此后向散射问询光包含有不同的谐振信号；(3)平衡光电探测器接收到后向散射的问询光信号，去除交流并发大交流，再做FFT变换至频域，得到细胞的谐振频谱，即对应于细胞的质谱。
5.根据权利要求1所述的基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，其特征是：捕获光源(1-1)采用多波段、可用于荧光激发的光源模块，拉曼光谱仪替换为荧光谱仪，则可以实现单细胞的多波段荧光光谱的激发与测量。
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Denomination of invention: In vivo single cell multifunctional spectrometer based on coaxial dual waveguide fiber

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