ES2696836T3 - Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina - Google Patents

Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina Download PDF

Info

Publication number
ES2696836T3
ES2696836T3 ES15754422T ES15754422T ES2696836T3 ES 2696836 T3 ES2696836 T3 ES 2696836T3 ES 15754422 T ES15754422 T ES 15754422T ES 15754422 T ES15754422 T ES 15754422T ES 2696836 T3 ES2696836 T3 ES 2696836T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
reagent
urine sample
surfactant
iodide
analysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15754422T
Other languages
English (en)
Inventor
Akinori Kawai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2696836T3 publication Critical patent/ES2696836T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Un método para analizar una muestra de orina, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando la muestra de orina y un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3- dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxacianina (DiOC4(3)) y yoduro de 3,3- dipentiloxacarbocianina (DiOC5 (3)), y detectar al menos los cilindros y los eritrocitos como partículas urinarias contenidas en la muestra de medición obtenida en la etapa de preparación.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para analizar muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina, que sirven para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias. El alcance de la protección está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Técnica anterior
En enfermedades tales como las enfermedades infecciosas, las lesiones inflamatorias, las lesiones degenerativas, las enfermedades por cálculos, los tumores y similares en los sistemas néfrico y urinario, aparece una variedad de partículas en la orina dependiendo de las enfermedades individuales. Las partículas pueden incluir eritrocitos, cilindros, leucocitos, células epiteliales, levaduras como hongos, espermatozoides y similares. El análisis de estas partículas en la orina es importante para estimar la enfermedad y el sitio de la anomalía en los sistemas néfrico y urinario. Por ejemplo, los eritrocitos son partículas urinarias útiles para determinar la presencia o ausencia de sangrado en la ruta desde el glomérulo del riñón hasta la uretra.
Un cilindro es una partícula sólida que tiene un precipitado de coagulación compuesto por mucoproteína de Tamm-Horsfall y proteína plasmática urinaria (principalmente albúmina) como componente básico. El cilindro se forma principalmente en el túbulo renal distal y el túbulo colector. Mientras que el cilindro compuesto exclusivamente por el componente básico se denomina cilindro hialino, varios componentes, tales como células, pueden estar incluidos en el cilindro hialino dependiendo de la afección del riñón o del túbulo renal, con el resultado de que podría formarse un cilindro más degenerado. Por lo tanto, los cilindros son partículas urinarias útiles para percibir la afección de enfermedad y el grado del trastorno del riñón y el túbulo renal.
En el análisis de las partículas urinarias, tales como los cilindros y los eritrocitos, se realiza una inspección visual observando el precipitado (partículas) obtenido mediante la separación centrífuga de la orina bajo un microscopio. En los últimos años, se ha desarrollado un método de análisis automatizado que utiliza un citómetro de flujo. Por ejemplo, los Documentos relacionados con Patentes 1 a 4 describen un método para analizar partículas urinarias con un citómetro de flujo mediante la medición de una muestra de orina tratada con un reactivo de dilución y un reactivo de tinción que contiene un colorante con una base de cianina, yoduro de 3,3'-dihexil-2,2'-oxacarbocianina (DiOC6(3)) para teñir partículas urinarias.
Sin embargo, la orina también contiene partículas que tienen una forma muy parecida a los cilindros, tales como hebras de moco y agregados de bacterias o sales. Dado que el número de cilindros en una muestra de orina es una información clínicamente importante, es importante para la detección de los cilindros discriminar los cilindros de las partículas que se parecen a los cilindros, tales como las hebras de moco. El documento EP 0 708 334 describe métodos y reactivos para análisis de orina.
Lista de referencias
Documentos relacionados con patentes
Documento relacionado con patentes 1: Publicación de patente Japonesa no examinada núm. HEI 11(1999)-23446
Documento relacionado con patentes 2: Publicación de patente Japonesa no examinada núm. HEI 9(1997)-329596
Documento relacionado con patentes 3: Publicación de patente Japonesa no examinada núm. HEI 8(1996)-240520
Documento relacionado con patentes 4: Publicación de patente Japonesa no examinada núm. HEI 8(1996)-170960
Compendio de la invención
Problemas a resolver por la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para analizar una muestra de orina que permita la detección precisa de eritrocitos sin causar hemólisis y la detección precisa de cilindros de una manera que los discrimine de las impurezas, tales como hebras de moco, en comparación con la técnica anterior. Adicionalmente, un objeto de la presente invención es proporcionar los usos de un reactivo y un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina que se utilizan adecuadamente para el método.
Solución a los problemas
Como resultado de esfuerzos perseverantes, los autores de la presente invención han encontrado que al utilizar un colorante fluorescente con una base de cianina específico como colorante para teñir las partículas de la orina, se pueden detectar los eritrocitos sin dañarlos sustancialmente, y se pueden detectar los cilindros de una manera que los discrimine de los hebras de moco, logrando de ese modo la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para analizar una muestra de orina, que comprende las etapas de preparar una muestra de medición mezclando la muestra de orina y un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3-dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxacianina (DiOC4(3)) y 3,3-dipentiloxacarbocianina (DiOC5(3)), y detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias contenidas en la muestra de medición obtenida en la etapa de preparación.
La presente invención también proporciona el uso de un reactivo para el análisis de la muestra de orina para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias, que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3).
Adicionalmente, la presente invención proporciona el uso de un kit de reactivos para el análisis de la muestra de orina para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias, que comprende un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3), y un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante.
Efectos de la invención
La presente invención permite la detección de eritrocitos sin dañarlos sustancialmente y la detección precisa de cilindros y eritrocitos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un ejemplo de un reactivo para el análisis de una muestra de orina.
La Fig. 2 muestra un ejemplo de un kit de reactivos para el análisis de la muestra de orina.
Realizaciones de la invención
[Método para analizar la muestra de orina]
Un método para analizar una muestra de orina (en lo sucesivo, también denominado simplemente "método") de la presente realización está destinado a analizar eritrocitos, cilindros, componentes cristalinos y hebras de moco entre las partículas urinarias, y es particularmente preferido para analizar cilindros y eritrocitos.
Se conocen varios tipos de cilindros, por ejemplo, cilindros hialinos que se componen exclusivamente del componente básico descrito anteriormente, cilindros epiteliales en los que se encierran células epiteliales tubulares renales, cilindros de glóbulos rojos en los que se encierran eritrocitos, cilindros de glóbulos blancos en los que están encerrados leucocitos, cilindros grasos en los que se encierran gránulos grasos, cilindros granulares en los que se encierran componentes granulares (principalmente las células epiteliales degeneradas), y cilindros céreos en los que la totalidad o una parte de los cilindros son uniformes y se degeneran en forma de cera. En la presente realización, el tipo de cilindros no está particularmente limitado.
En la presente realización, el tipo de eritrocitos no está particularmente limitado, y puede incluir eritrocitos normales y eritrocitos anormales.
En el método de la presente realización, primero se lleva a cabo una etapa de preparación de una muestra de medición mezclando una muestra de orina y un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3-dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxiananina (DiOC4(3)) y yoduro de 3,3-dipentiloxacarbocianina (DiOC5(3)).
En la presente realización, la muestra de orina no está particularmente limitada con tal que sea una muestra líquida que contenga las partículas urinarias, y es preferiblemente orina recogida de un sujeto. En el caso de utilizar la orina recogida del sujeto como muestra, se desea utilizar la muestra de orina para el método de la presente realización en el plazo de 24 horas, particularmente en el plazo de 3 a 12 horas después de la extracción, ya que las partículas urinarias se pueden deteriorar con el tiempo.
El primer reactivo utilizado en el método de la presente realización es un reactivo para teñir partículas urinarias que contienen al menos cilindros y eritrocitos. Los colorantes fluorescentes DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3) que se pueden utilizar en el primer reactivo también se conocen como NK-85, NK-2605, NK-5587 y NK-2453, respectivamente, y están disponibles en HAYASHIBARA CO., LTD. En los métodos de análisis convencionales, se utiliza un reactivo de tinción que contiene yoduro de 3,3'-dihexil-2,2'-oxacarbocianina (DiOC6(3)) que es un colorante con una base de cianina para la tinción de partículas urinarias. Los autores de la presente invención han encontrado que la forma de los eritrocitos en la muestra se puede mantener más favorablemente y que los eritrocitos se pueden detectar con mayor precisión al tratar la muestra de orina con un reactivo de tinción que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3) en lugar de tratar la muestra de orina con un reactivo de tinción que contiene DiOC6(3). En el método de la presente realización, los componentes de membrana de los eritrocitos y los cilindros se tiñen favorablemente con estos colorantes, mientras que las hebras de moco están poco teñidas. La fórmula estructural de estos colorantes se muestra a continuación.
[Fórmula química 1]
DiOC2(3}
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
El primer reactivo puede contener un colorante fluorescente o dos o más colorantes fluorescentes. La concentración del colorante fluorescente en el primer reactivo se establece de manera deseable de modo que el colorante fluorescente esté contenido a una concentración final capaz de teñir apropiadamente al menos los cilindros y eritrocitos en la muestra de medición preparada. La concentración final en la muestra de medición se puede ajustar de manera apropiada dependiendo del tipo de colorante fluorescente. Por ejemplo, cuando se utiliza DiOC3(3) como colorante fluorescente, la concentración final en la muestra de medición es mayor o igual a 0,1 pg/mL y menor o igual a 200 pg/mL, preferiblemente mayor o igual a 1 pg/mL y menor o igual a 20 pg/mL.
El primer reactivo se puede obtener disolviendo el colorante fluorescente mencionado anteriormente en un disolvente apropiado. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que sea un disolvente acuoso capaz de disolver el colorante fluorescente y sus ejemplos incluyen agua, un disolvente orgánico soluble en agua y una mezcla de los mismos. Entre estos, es particularmente preferible un disolvente orgánico soluble en agua. Los ejemplos del disolvente orgánico soluble en agua incluyen alcoholes inferiores que tienen de 1 a 3 átomos de carbono, etilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO) y similares.
En la presente realización, se puede mezclar adicionalmente un reactivo de dilución para diluir la muestra de orina según sea necesario en la etapa de preparación. Como tal reactivo de dilución, se prefiere agua o una solución tampón. La solución tampón no está particularmente limitada en la medida en que sea una solución acuosa de un tampón que tenga una acción tamponadora en el intervalo de pH superior o igual a 5 e inferior o igual a 9, preferiblemente en el intervalo superior o igual a 6,5 e inferior o igual a 8,6, y más preferiblemente en el intervalo superior o igual a 7,0 e inferior o igual a 7,8. Los ejemplos del tampón incluyen tampones de Good, tales como Tris, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricina, Bicina, TAPS y similares.
En la presente realización, se prefiere mezclar adicionalmente un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante en la etapa de preparación. Al mezclar adicionalmente semejante segundo reactivo, los agregados de las impurezas, tales como las bacterias o sales que inhiben la detección precisa de los cilindros, se pueden dispersar y eliminar.
El segundo reactivo se puede obtener disolviendo un tensioactivo en un disolvente apropiado. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que puede disolver el tensioactivo y puede incluir, por ejemplo, agua, un disolvente orgánico soluble en agua y una mezcla de los mismos. Los ejemplos del disolvente orgánico soluble en agua incluyen alcoholes inferiores que tienen de 1 a 3 átomos de carbono, etilenglicol y DMSO. En la presente realización, el agua es particularmente preferida. El segundo reactivo se puede preparar disolviendo un tensioactivo en el reactivo de dilución mencionado anteriormente.
El tipo de tensioactivo usado en el segundo reactivo no está particularmente limitado, y se puede seleccionar apropiadamente entre tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos y tensioactivos anfóteros. El primer reactivo puede contener un tensioactivo o dos o más tensioactivos. Cuando están contenidos dos o más tensioactivos, la combinación de los mismos se puede seleccionar opcionalmente.
En la presente realización, como tensioactivo catiónico, se puede utilizar al menos uno seleccionado entre tensioactivos de tipo sal de amonio cuaternario y tensioactivos de tipo sal de piridinio. El tensioactivo de tipo sal de amonio cuaternario puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos que tienen de 9 a 30 átomos de carbono en total representados por la siguiente fórmula (I).
[Fórmula química 2]
Figure imgf000006_0001
En la fórmula anterior (I), Ri es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono; R2 y R3 son iguales o diferentes entre sí y son respectivamente un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; R4 es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o un grupo bencilo; y X- es un ion halogeno
En la fórmula (I) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo o un grupo alquenilo que tiene 6, 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono y es particularmente preferiblemente un grupo alquilo lineal. Más específicamente, R1 puede incluir un grupo octilo, un grupo decilo y un grupo dodecilo. R2 y R3 son preferiblemente un grupo metilo, un grupo etilo y un grupo propilo. R4 es preferiblemente un grupo metilo, un grupo etilo y un grupo propilo.
El tensioactivo de tipo sal de piridinio puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (II).
[Fórmula química 3]
Figure imgf000006_0002
En la fórmula (II) anterior, R1 es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono; y X- es un ion halógeno.
En la fórmula (II) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene 6 , 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono y es particularmente preferiblemente un grupo alquilo lineal. Más específicamente, R1 incluye un grupo octilo, un grupo decilo y un grupo dodecilo.
Los ejemplos específicos del agente tensioactivo catiónico incluyen bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de deciltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de octiltrimetilamonio, cloruro de octiltrimetilamonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, cloruro de miristiltrimetilamonio, cloruro de dodecilpiridinio y similares. Entre estos, el bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB) es particularmente preferido.
En la presente realización, como tensioactivo no iónico, se utilizan preferiblemente los tensioactivos no iónicos con una base de polioxietileno representados por la siguiente fórmula (III).
R1-R2-(CH2CH2O)n-H (III)
En la fórmula (III) anterior, R1 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene 8 a 25 átomos de carbono; R2 es -O-, -COO- o
[Fórmula química 4]
Figure imgf000006_0003
; y n representa un número entero de 10 a 50.
Los ejemplos específicos del agente tensioactivo no iónico incluyen polioxietilen alquil éter, polioxietilen esterol, polioxietilen ricino, éster de ácido graso y polioxietilen sorbitán, polioxietilen alquil amina, polioxietilen polioxipropilen alquil éter y similares.
En la presente realización, como tensioactivo aniónico, se puede utilizar al menos un tipo seleccionado entre los tensioactivos de tipo carboxilato, los tensioactivos de tipo sulfonato y los tensioactivos de tipo sal de éster de ácido sulfúrico. El tensioactivo de tipo carboxilato incluye, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (IV).
Rr COO-Y+ (IV)
En la fórmula (IV) anterior, Ri es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene 8 a 25 átomos de carbono; e Y+ es un ion de metal alcalino.
En la fórmula (IV) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene 12 a 18 átomos de carbono. Los tensioactivos de tipo carboxilato se conocen como jabón en la técnica y sus ejemplos incluyen laurato de sodio, estearato de sodio, oleato de sodio y similares.
El tensioactivo de tipo sulfonato puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (V).
[Fórmula química 5]
Figure imgf000007_0001
En la fórmula (V) anterior, m y n son un número entero de 0 o más, la suma de m y n es de 8 a 25; e Y+ es un ion de metal alcalino.
Preferiblemente, la suma de m y n en la fórmula (V) es de 9 a 18. Los tensioactivos de tipo sulfonato representados por la fórmula (V) anterior se conocen como alquilbenceno sulfonatos en la técnica y los ejemplos de los mismos incluyen decilbenceno sulfato de sodio lineal, undecilbenceno sulfato de sodio lineal, dodecilbenceno sulfato de sodio lineal, tridecilbenceno sulfato de sodio lineal, tetradecilbenceno sulfato de sodio lineal y similares.
Además, como tensioactivo de tipo sulfonato, se puede utilizar una mezcla de tensioactivos representada respectivamente por las siguientes fórmulas (VI) y (VII).
CHs(CH2)j-CH=CH-(CH2)k-SO3-Y+ (VI)
En la fórmula (VI) anterior, j y k son un número entero de 0 o más, la suma de j y k es un número entero de 10 a 25; e Y+ es un ion de metal alcalino.
CH3(CH2)m-CH(-OH)-(CH2)n-SO3-Y+ (VII)
En la fórmula (VII) anterior, m y n son un número entero de 0 o más, la suma de m y n es un número entero de 10 a 25; e Y+ es un ion de metal alcalino.
Preferiblemente, la suma de j y k en la fórmula (VI) anterior es un número entero de 11 a 15, y la suma de m y n en la fórmula (VII) anterior es un número entero de 12 a 16. Los tensioactivos representados respectivamente por las fórmulas (VI) y (VII) anteriores también se conocen como a-olefina sulfonatos en la técnica y sus ejemplos incluyen 1-tetradeceno sulfonato de sodio, hexadeceno sulfonato de sodio, 3-hidroxihexadecil-1-sulfonato de sodio, octadeceno-1-sulfonato de sodio, 3-hidroxi-1-octadecano sulfonato de sodio y similares.
El tensioactivo de tipo sal de ácido sulfúrico puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (VIII).
R1-O-SO3Y+ (VIII)
En la fórmula (VIII) anterior, R1 representa un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene 10 a 25 átomos de carbono; e Y+ representa un ion de metal alcalino.
En la fórmula (VIII) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene de 10 a 18 átomos de carbono, y es particularmente preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene 12 átomos de carbono. Los tensioactivos de tipo sal de éster de ácido sulfúrico representados por la fórmula (VIII) anterior se conocen como sales sulfato de alcohol superior en la técnica y entre los ejemplos de los mismos se incluyen decil sulfato de sodio, undecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de sodio, tridecilsulfato de sodio, tetradecilsulfato de sodio y similares.
Además, como tensioactivo del tipo sal de ácido sulfúrico, se pueden utilizar los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (IX).
R1-O-(CH2CH2O)n-SOs-Y+ (IX) En la fórmula (IX) anterior, R1 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene de 10 a 25 átomos de carbono; n es un número entero de 1 a 8; e Y+ es un ion de metal alcalino o un ion de amonio.
En la fórmula (IX) anterior, R1 es preferiblemente un alquilo lineal que tiene 12 a 18 átomos de carbono, y es particularmente preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene 12 átomos de carbono. Los tensioactivos de tipo sal de ácido sulfúrico representados por la fórmula (IX) anterior se conocen como sal de éster de ácido alquilsulfúrico de polioxietileno en la técnica y los ejemplos de los mismos incluyen éster de ácido dodecil éter sulfúrico de sodio y similares.
Como agente tensioactivo de tipo sal de ácido sulfúrico, se puede utilizar un agente tensioactivo representado por la siguiente fórmula (X).
R1-CH (-SOs-)-COOCHsY+ (X) En la fórmula (X) anterior, R1 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene 8 a 25 átomos de carbono; e Y+ es un ion de metal alcalino.
En la fórmula (X) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene de 10 a 18 átomos de carbono, y es particularmente preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene 12 átomos de carbono. Los tensioactivos de tipo sal de éster de ácido sulfúrico representados por la fórmula (X) anterior se conocen como ésteres de ácido a-sulfo graso en la técnica y sus ejemplos incluyen sal de sodio de 1-metiléster de ácido 2-sulfotetradecanoico, sal de sodio de 1-metiléster de ácido 2-sulfohexadecanoico y similares.
En la presente realización, como tensioactivo anfótero, se puede utilizar al menos un tipo seleccionado entre tensioactivos anfóteros de tipo aminoácido y tensioactivos anfóteros de tipo betaína. El tensioactivo anfótero de tipo aminoácido puede incluir, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (XI).
R1-N+H2-CH2CH2COO- (XI)
En la fórmula (XI) anterior, R1 es un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo que tiene 8 a 25 átomos de carbono.
En la fórmula (XI) anterior, R1 es preferiblemente un grupo alquilo lineal que tiene 12 a 18 átomos de carbono. El tensioactivo anfótero de tipo aminoácido anterior puede incluir, por ejemplo, ácido 3-(dodecilamino)propanoico, ácido 3-(tetradeca-1-ilamino)propanoico y similares.
El tensioactivo anfótero de tipo betaína incluye, por ejemplo, los tensioactivos representados por la siguiente fórmula (XII).
[Fórmula química 6]
Figure imgf000008_0001
En la fórmula (XII) anterior, R1 es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono; R2 es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; R3 es un grupo alquilo o alquenilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o un grupo bencilo; y n es 1 ó 2.
El tensioactivo anfótero de tipo betaína puede incluir, por ejemplo, betaína de ácido dodecildimetilaminoacético, betaína de ácido estearildimetilacético y similares.
La concentración del tensioactivo en el segundo reactivo se establece de manera deseable de modo que el tensioactivo esté contenido a una concentración final tal que los eritrocitos no sean hemolizados y los agregados de impurezas se puedan dispersar en la muestra de medición preparada de la manera descrita anteriormente. La concentración final del tensioactivo en la muestra de medición se puede establecer de manera apropiada, y es preferiblemente mayor o igual a 3 ppm y menor o igual a 30 ppm.
En la presente realización, para prevenir la hemólisis de eritrocitos debida a un cambio en el pH, el pH del segundo reactivo se puede ajustar en un intervalo mayor o igual a 5 e inferior o igual a 9, preferiblemente en un intervalo mayor o igual a 6,5 y menor o igual a 8,6, y más preferiblemente en un intervalo mayor o igual a 7,0 y menor o igual a 7,8. Por lo tanto, para mantener el pH constante, el segundo reactivo puede contener un tampón. Semejante tampón puede ser el mismo que el utilizado en el reactivo de dilución anterior.
Algunas muestras de orina contienen sales amorfas tales como fosfato de amonio, fosfato de magnesio y carbonato de calcio. En la presente realización, el segundo reactivo puede contener un agente quelante para reducir la influencia de estas sales amorfas. El agente quelante no está particularmente limitado en la medida en que es un agente quelante capaz de eliminar sales amorfas, y se puede seleccionar apropiadamente entre agentes de eliminación de calcio y agentes de eliminación de magnesio que se conocen en la técnica. Los ejemplos específicos incluyen etilendiaminotetraacetato (sal EDTA), CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, metil-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EdDpO y similares, y de estos, la sal de EDTA es particularmente preferible.
La concentración del agente quelante en el segundo reactivo se establece de manera deseable de modo que el agente quelante esté contenido a una concentración final tal que pueda reducir la influencia de las sales amorfas en la muestra de medición preparada de la manera descrita anteriormente. La concentración final en la muestra de medición se puede establecer de manera apropiada dependiendo del tipo de agente quelante. Por ejemplo, cuando se utiliza EDTA 2 potásico (EDTA-2K) como agente quelante, la concentración final en la muestra de medición es mayor o igual a 0,1 mM y menor o igual a 500 mM, preferiblemente mayor o igual a 1 mM y menor o igual a 100 mM. Se sabe que en el caso en el que están presentes en la orina levaduras como hongos y eritrocitos, el fraccionamiento entre las levaduras como hongos y los eritrocitos a veces no es bueno para el análisis por medio de un citómetro de flujo. Por lo tanto, el segundo reactivo puede contener una sustancia que dañe las membranas celulares de las levaduras como hongos. Los ejemplos de tal sustancia incluyen 2-fenoxi etanol, alcohol bencílico, alcohol fenetílico, 1-fenoxi-2-propanol, fenol, acetato de fenilo, benzotiazol y similares, y entre estos, el 2-fenoxi etanol es particularmente preferible. Al utilizar el segundo reactivo que contiene semejante sustancia, la capacidad de tinción de las levaduras como hongos cambia, y mejora el fraccionamiento entre los eritrocitos y las levaduras como hongos.
Se sabe que la presión osmótica de la orina se distribuye en un amplio intervalo de 50 a 1300 mOsm/kg. Cuando la presión osmótica es demasiado baja o demasiado alta en la muestra de medición, existe el temor de que los eritrocitos resulten dañados. Una presión osmótica apropiada en la muestra de medición es mayor o igual a 100 mOsm/kg y menor o igual a 600 mOsm/kg, preferiblemente mayor o igual a 150 mOsm/kg y menor o igual a 500 mOsm/kg. Cuando la presión osmótica de la orina es demasiado alta, la presión osmótica se puede ajustar adecuadamente diluyendo la orina con un reactivo de dilución o el segundo reactivo. Por otro lado, cuando la presión osmótica de la orina es demasiado baja, el segundo reactivo puede contener un agente compensador de la presión osmótica. El agente de compensación de la presión osmótica puede incluir sales inorgánicas, sales orgánicas, sacáridos y similares. Los ejemplos de las sales inorgánicas incluyen cloruro de sodio, bromuro de sodio y similares. Los ejemplos de las sales orgánicas incluyen propionato de sodio, propionato de potasio, propionato-oxalato de amonio y similares. Los ejemplos de los sacáridos incluyen sorbitol, glucosa, manitol y similares.
En la presente realización, la muestra de orina, el primer reactivo y el segundo reactivo se pueden mezclar en cualquier orden sin limitación, y se pueden mezclar al mismo tiempo. Preferiblemente, la muestra de orina y el segundo reactivo se mezclan previamente, y después el primer reactivo se mezcla adicionalmente. Alternativamente, el primer reactivo y el segundo reactivo se pueden mezclar previamente, y a continuación se puede mezclar adicionalmente la muestra de orina.
En la presente realización, la proporción de mezcla de la muestra de orina, el primer reactivo y el segundo reactivo no está particularmente limitada, y se puede determinar de manera apropiada dependiendo de las concentraciones de componentes contenidas en los reactivos respectivos. Por ejemplo, la proporción de mezcla entre la muestra de orina y el primer reactivo se puede determinar dentro del intervalo de proporción en volumen de 1:0,01 a 10. La proporción de mezcla entre la muestra de orina y el segundo reactivo se puede determinar dentro del intervalo de proporción en volumen de 1:0,5 a 1. La cantidad de la muestra de orina se puede determinar de manera apropiada dependiendo del primer reactivo y el segundo reactivo. La cantidad de la muestra de orina es preferiblemente menor o igual a 1000 pL, por lo que el tiempo de medición no es demasiado largo. Una cantidad suficiente de muestra de orina utilizada para la medición es de aproximadamente 10 a 1000 pL.
Las condiciones de temperatura en la etapa de preparación son de 10 a 60°C, preferiblemente de 35 a 45°C. Cada reactivo se puede calentar previamente a la temperatura anterior. Después de mezclar la muestra de orina, el primer reactivo y/o el segundo reactivo, la mezcla se puede incubar durante 1 segundo a 5 minutos, preferiblemente 5 a 60 segundos.
En el método de la presente realización, se lleva a cabo la etapa de detección de al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias contenidas en la muestra de medición obtenida en la etapa de preparación anterior.
En la muestra de medición obtenida, las partículas urinarias, particularmente los cilindros y los eritrocitos se tiñen con el colorante fluorescente mencionado anteriormente. Por lo tanto, estas partículas se pueden detectar observando las formas y los grados de tinción de las partículas en la muestra de medición bajo un microscopio de fluorescencia.
En una realización preferida, antes de la etapa de detección, se realiza adicionalmente una etapa de obtención de información óptica irradiando partículas de orina contenidas en la muestra de medición con luz. La etapa de obtención de información óptica se realiza deseablemente mediante un citómetro de flujo. En la medición con un citómetro de flujo, al irradiar partículas urinarias teñidas con luz cuando las partículas pasan a través de una celda de flujo, se puede obtener información óptica en forma de señales emitidas por las partículas. Como tal información óptica, se prefieren la información de luz dispersada y la información de fluorescencia.
La información de luz dispersada no está particularmente limitada en la medida en que es la información de la luz dispersada la que se puede medir en un citómetro de flujo convencional disponible comercialmente. La información de luz dispersada puede incluir, por ejemplo, información de intensidad y forma de la onda de la luz dispersada, tal como luz dispersada hacia adelante (p.ej., ángulo de recepción de luz de aproximadamente 0 a 20 grados) y luz dispersada lateralmente (ángulo de recepción de luz de aproximadamente 90 grados). Más específicamente, la información de luz dispersada incluye una intensidad de luz dispersada, un ancho de pulso de luz dispersada, un valor integral de luz dispersada y similares. Se sabe en la técnica que la luz dispersada lateral refleja la información interna de las células, tales como los núcleos y los gránulos, y la luz dispersada hacia adelante refleja la información del tamaño de las células. En la realización, se prefiere utilizar la información de luz dispersada hacia adelante. La información de la fluorescencia no está particularmente limitada en cuanto a la información obtenida irradiando las partículas urinarias teñidas con luz de excitación que tiene una longitud de onda apropiada y midiendo la fluorescencia excitada. La información de fluorescencia puede incluir, por ejemplo, la intensidad y la forma de onda de la fluorescencia. Más específicamente, la información de fluorescencia incluye una intensidad de fluorescencia, un ancho de pulso de fluorescencia, un valor integral de fluorescencia y similares. La fluorescencia es emitida a partir del ácido nucleico o similares en las partículas teñidas con el colorante fluorescente contenido en el primer reactivo. La longitud de onda de recepción se puede seleccionar de manera apropiada dependiendo del colorante fluorescente contenido en el primer reactivo.
En la presente realización, la fuente de luz del citómetro de flujo no está particularmente limitada, y se puede seleccionar apropiadamente una fuente de luz que tenga una longitud de onda adecuada para la excitación del colorante fluorescente. Por ejemplo, se puede utilizar un láser semiconductor rojo, un láser semiconductor azul, un láser de argón, un láser de He-Ne, una lámpara de arco de mercurio o similares. En particular, es adecuado un láser semiconductor porque tiene un coste muy bajo en comparación con un láser de gas.
En el método de la presente realización, cuando se lleva a cabo la etapa de obtención mencionada anteriormente, al menos los cilindros y eritrocitos se detectan como partículas urinarias en la etapa de detección, basándose en la información óptica obtenida en la etapa de obtención. El término "detección" abarca no solo el descubrimiento de la existencia de partículas urinarias en la muestra de medición, sino también la clasificación y el recuento de las partículas urinarias.
En la presente realización, la detección de las partículas urinarias se realiza preferiblemente preparando un diagrama de dispersión que tiene dos ejes de información de luz dispersada e información de fluorescencia, y analizando el diagrama de dispersión obtenido utilizando el soporte lógico de análisis apropiado. Por ejemplo, cuando se prepara un diagrama de dispersión con una intensidad fluorescente en el eje X y una intensidad de luz dispersada hacia adelante en el eje Y, aparecen grupos (agrupaciones) respectivos en el diagrama de dispersión de acuerdo con el tamaño de partícula y la capacidad de tinción (contenido de ácido nucleico) de las respectivas partículas urinarias. En el método de la presente realización, al menos los cilindros y los eritrocitos se pueden detectar como dos grupos que aparecen en diferentes áreas. Un soporte lógico de análisis proporciona ventanas que encierran los grupos respectivos en el diagrama de dispersión y permite contar el número de partículas en cada ventana.
[Reactivo para análisis de muestra de orina]
Un reactivo 11 para el análisis de la muestra de orina de la presente realización (en lo sucesivo, denominado simplemente "reactivo") es un reactivo para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas en una muestra de orina. El reactivo de la presente realización contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3). Los detalles del reactivo de la presente realización son los mismos que los descritos para el primer reactivo utilizado en el método para analizar la muestra de orina de la presente realización.
El alcance de la presente invención también abarca el uso de un reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3), para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas en una muestra de orina. La Fig. 1 muestra un ejemplo del reactivo 11 de la presente realización.
[Kit de reactivos para análisis de muestra de orina]
Un kit de reactivos para el análisis de la muestra de orina de la presente realización (en lo sucesivo, denominado simplemente "kit de reactivos") es un kit de reactivos para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas en una muestra de orina. Este kit de reactivos comprende un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3), y un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante.
Los detalles del primer reactivo y el segundo reactivo incluidos en el kit de reactivos son los mismos que los descritos para el primer reactivo y el segundo reactivo utilizados en el método para analizar la muestra de orina de la presente realización.
En la presente realización, es preferible almacenar el primer reactivo y el segundo reactivo en recipientes separados para proporcionar un kit de reactivos del tipo de dos reactivos que comprende estos reactivos. La Fig. 2 muestra un ejemplo de un kit de reactivos de la presente realización que incluye un primer reactivo 22 almacenado en un recipiente, y un segundo reactivo 33 almacenado en un recipiente.
El alcance de la presente invención también abarca el uso de un kit de reactivos que incluye un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre DiOC2(3), DiOC3(3), DiOC4(3) y DiOC5(3), y un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante, para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas en una muestra de orina.
La presente invención se describe adicionalmente en detalle a continuación a modo de ejemplos que no limitan la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
En el Ejemplo 1, se realizó una búsqueda de un colorante capaz de teñir los cilindros, y capaz de discriminar los cilindros de las hebras de moco de acuerdo con la diferencia en la tinción. La discriminación entre los cilindros y las hebras de moco se realizó mediante la observación de una muestra bajo un microscopio de fluorescencia. Además, se realizó la medición mediante un citómetro de flujo.
(1) Muestra de orina
La muestra de orina utilizada fue una orina que contenía cilindros y hebras de moco.
(2) Reactivo
• Reactivo de tinción
Como reactivo de tinción, se prepararon las soluciones de tinción 1 a 29, respectivamente, que contenían los colorantes enumerados en la Tabla 1. Cualquiera de estas soluciones de tinción se preparó disolviendo un colorante en etilenglicol (NACALAI TESQUE, INC.) de modo que la concentración de colorante fuera de 1 mg/mL.
[Tabla 1]
Solución de tinción Nombre del colorante Estructura básica Fuente de suministro 1 DioC2(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 2 DioC3(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 3 DioC4(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 4 DioC5(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 5 DioC6(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 6 DioC7(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 7 DioC18(3) Cianina HAYASHIBARA CO., LTD. 8 SYTO Cianina Life Technologies
9 YO-PRO Cianina Life Technologies
10 NK-359 Estirilo HAYASHIBARA CO., LTD. 11 NK-361 Estirilo HAYASHIBARA CO., LTD. 12 FM4-64 Estirilo Life Technologies
13 FITC Xanteno Life Technologies
14 Calceína Xanteno HAYASHIBARA CO., LTD. 15 Diacetato de fluoresceína Xanteno HAYASHIBARA CO., LTD. 16 Fluoresceína Xanteno HAYASHIBARA CO., LTD. 17 BCECF-AM Xanteno HAYASHIBARA CO., LTD. 18 Rodamina 123 Xanteno HAYASHIBARA CO., LTD. 19 Rojo ácido 97 Azo HAYASHIBARA CO., LTD. 20 Naranja ácido 8 Azo HAYASHIBARA CO., LTD. 21 Croceína naranja G Azo HAYASHIBARA CO., LTD. 22 NBD-Cl Benzoxadiazol HAYASHIBARA CO., LTD. 23 Naranja G de astrazona Metino HAYASHIBARA CO., LTD. 24 Naranja R de astrazona Metino HAYASHIBARA CO., LTD. 25 Rodulina naranja Acridina HAYASHIBARA CO., LTD. 26 AY Acridina HAYASHIBARA CO., LTD. 27 Hidrocloruro de acriflavina Acridina HAYASHIBARA CO., LTD. 28 Cloruro de 3,6-diamino-10-metil-acridinio HAYASHIBARA CO., LTD. 29 Eucrisina 2GNX Acridina HAYASHIBARA CO., LTD.
• Reactivo de dilución
El reactivo de dilución utilizado fue HEPES-OH (100 mM, pH 7) (Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Como disolvente, se utilizó agua filtrada a través de una membrana de ósmosis inversa.
(3) Observación bajo microscopio de fluorescencia y resultado.
La muestra de orina (200 ji L), el reactivo de dilución (580 ji L) y cada solución de tinción (20 ji L) se mezclaron y se dejaron reaccionar a 40°C durante 1 minuto para preparar una muestra de medición. A continuación, se observaron los cilindros y las hebras de moco en la muestra de medición obtenida bajo un microscopio de fluorescencia BX51 (Olympus Corporation). Como resultado de la observación, de los 29 tipos de colorantes anteriores, se encontró que solo seis tipos de colorantes, DioC2(3), DioC3(3), DioC4(3), DioC5(3), DioC6(3) y DioC7(3) eran colorantes capaces de teñir cilindros, y capaces de discriminar cilindros de hebras de moco de acuerdo con la diferencia en la tinción. Cuando se utilizaron estos colorantes, los cilindros se tiñeron favorablemente en comparación con las hebras de moco, y como resultado, los cilindros y las hebras de moco se distinguieron entre sí.
(4) Medición por medio de citómetro de flujo y resultado
En asociación con el resultado de la observación bajo el microscopio de fluorescencia, para las muestras teñidas respectivamente con las soluciones de tinción 1 a 6, se examinó también mediante un citómetro de flujo si los cilindros y las hebras de moco eran discriminables entre sí. Las muestras se midieron utilizando un citómetro de flujo UF-1000i (Sysmex Corporation). Las etapas específicas de medición por este citómetro de flujo son las siguientes. En primer lugar, se mezclaron la muestra de orina (200 j L), el reactivo de dilución (580 j L) y cada solución de tinción (20 j L) y se dejaron reaccionar a 40°C durante 60 segundos para preparar las muestras de medición. A continuación, la muestra de medición se irradió con luz, y se obtuvieron la intensidad de luz dispersada hacia adelante, la intensidad de luz dispersada lateral, la intensidad de fluorescencia y el valor integral de la fluorescencia. El citómetro de flujo tenía una fuente de luz de un láser semiconductor que tenía una longitud de onda de excitación de 488 nm. A partir de la intensidad de fluorescencia y el valor integral de la fluorescencia, se calcularon una proporción de intensidad de fluorescencia y una proporción de fluorescencia acumulada de cilindros para las hebras de moco. El resultado se muestra en la Tabla 2.
[Tabla 2]
Solución de porción de fluorescencia acumulada Proporción de intensidad de fluorescencia tinción Colorante Pro
(cilindros/hebras de moco) (cilindros/hebras de moco)
1 DioC2(3) 3,4 4,3
2 DioC3(3) 3,2 4,9
3 DioC4(3) 5,3 5,9
4 DioC5(3) 3,5 4,4
5 DioC6(3) 1,2 1,2
6 DioC7(3) 1,3 1,3
Como se muestra en la Tabla 2, tanto la proporción de intensidad de fluorescencia como la proporción de fluorescencia acumulada fueron mayores o iguales a 1,2 en cualquiera de los casos en los que se utilizaron las soluciones de tinción 1 a 6. En particular, se reveló que la proporción de intensidad de fluorescencia y la proporción de fluorescencia acumulada fueron altas cuando se utilizaron las soluciones de tinción 1 a 4. Este resultado reveló que DioC2(3), DioC3(3), DioC4(3) y DioC5(3) son adecuados para la discriminación entre cilindros y hebras de moco por un citómetro de flujo.
Ejemplo 2
En el Ejemplo 2, se examinó la influencia sobre los eritrocitos (hemólisis) por DioC2(3), DioC3(3), DioC4(3), DioC5(3), DioC6(3) y DioC7(3). La influencia sobre los eritrocitos se evaluó de acuerdo con el número de eritrocitos en la muestra de medición.
(1) Muestra de eritrocitos
La sangre humana extraída de un voluntario sano se diluyó 1000 veces en una solución salina (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) para preparar las muestras de eritrocitos.
(2) Reactivo
Como reactivo de tinción, se utilizaron soluciones de tinción 1 a 6 idénticas a las del Ejemplo 1. Como reactivo de dilución, se utilizó una solución tampón idéntica a la del Ejemplo 1.
(3) Medición y resultado
Las muestras se midieron utilizando un citómetro de flujo UF-1000i (Sysmex Corporation). La muestra de medición se preparó de la misma manera que en el Ejemplo 1. A continuación, la muestra de medición se irradió con luz, y se adquirieron una intensidad de fluorescencia y una intensidad de luz dispersada hacia adelante. El citómetro de flujo tenía una fuente de luz de un láser semiconductor que tenía una longitud de onda de excitación de 488 nm. Basándose en estos valores de medición, se contó el número de eritrocitos en la muestra de medición. El resultado se muestra en la Tabla 3.
[Tabla 3]
Solución de tinción Colorante Número total de eritrocitos Número de eritrocitos (células/jL)
1 DioC2(3) 16591 2127
2 DioC3(3) 15934 2043
3 DioC4(3) 16185 2075
4 DioC5(3) 14058 1802
5 DioC6(3) 44 6
6 DioC7(3) 39 5 Como se desprende de la Tabla 3, cuando se utilizaron las soluciones de tinción 5 y 6, el número de eritrocitos en la muestra de medición disminuyó significativamente en comparación con los casos en los que se utilizaron las soluciones de tinción 1 a 4. Esto revela que los eritrocitos son hemolizados por la influencia de DioC6(3) y DioC7(3) en el reactivo de tinción. Por lo tanto, en los casos en los que se utilizan DioC6(3) y DioC7(3) para teñir una muestra de orina, es difícil contar con precisión el número de eritrocitos en la muestra. En contraste, se puede encontrar que la influencia de DioC2(3), DioC3(3), DioC4(3) y DioC5(3) en eritrocitos es muy pequeña en comparación con las de DioC6(3) y DioC7(3), y por lo tanto, son adecuados para medir eritrocitos en una muestra de orina.
Ejemplo 3
En el Ejemplo 3, se evaluó el rendimiento clínico del método para analizar la muestra de orina utilizando un citómetro de flujo de acuerdo con la presente realización en comparación con el resultado de la observación visual.
(1) Muestra de orina
Las muestras de orina utilizadas fueron muestras de orina negativas (42 muestras) en las que no se observó la presencia de cilindros mediante observación bajo un microscopio.
(2) Reactivo
• Reactivo de tinción
Como reactivo de tinción, se utilizó la solución de tinción 2 (que contenía DioC3(3)) idéntica a la del Ejemplo 1.
• Reactivo de dilución
Como agentes de dilución, se prepararon los diluyentes 1 y 2 que tenían las siguientes composiciones. Para los diluyentes 1 y 2, se utilizó agua filtrada a través de una membrana de ósmosis inversa como disolvente.
Diluyente 1: HEPES-OH (100 mM, pH 7) y EDTA-2K (25 mM) (Chubu Chelest Co., Ltd.)
Diluyente 2: HEPES-OH (100 mM, pH 7), EDTA-2K (25 mM) y DTAB (10 ppm) (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.)
(3) Medición y resultado
Las muestras se midieron utilizando un citómetro de flujo UF-1000i (Sysmex Corporation). Las etapas específicas de medición por medio de este citómetro de flujo son los siguientes. Primero, se mezclaron la muestra (200 j L), el reactivo de dilución (580 j L) y el reactivo de tinción (20 j L) y se dejaron reaccionar a 40°C durante 10 segundos para preparar las muestras de medición. A continuación, las muestras de medición obtenidas se irradiaron con luz, y se obtuvieron la intensidad de luz dispersada hacia adelante, la intensidad de luz dispersada lateral y la intensidad de fluorescencia. El citómetro de flujo tenía una fuente de luz de un láser semiconductor que tenía una longitud de onda de excitación de 488 nm. Basándose en estos valores de medición, se calculó el número de cilindros en las muestras de medición y se determinó el número de muestras que se decidió que eran negativas por el citómetro de flujo (FCM). También se determinó la especificidad del análisis de cilindros por el FCM refiriéndose al número de muestras negativas por observación visual (observación microscópica). El resultado se muestra en la Tabla 4.
[Tabla 4]
Diluyente 1 Diluyente 2
Número de muestras negativas por observación visual. 42 42
Número de muestras negativas por FCM 30 36
Especificidad (%) 71,4 85,7
La Tabla 4 revela que al tratar una muestra de orina con el reactivo de tinción que contiene DioC3(3) y el diluyente, y al medir la muestra obtenida mediante FCM, la muestra de orina se puede analizar con una especificidad superior a 70%. Además, al tratar una muestra de orina con un diluyente que contiene DTAB que es un tensioactivo catiónico como dispersante, mejoró la especificidad. Esto es atribuible al hecho de que las impurezas que se asemejan a los cilindros se redujeron por la acción de DTAB.
La presente solicitud se refiere a la Solicitud de Patente Japonesa Núm. 2014-39281 presentada el 28 de Febrero de 2014.
LISTA DE SIGNOS DE REFERENCIA
11:
Reactivo para análisis de muestra de orina.
22:
Primer reactivo
33:
Segundo reactivo

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar una muestra de orina, que comprende las etapas de:
preparar una muestra de medición mezclando la muestra de orina y un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3-dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxacianina (DiOC4(3)) y yoduro de 3,3-dipentiloxacarbocianina (DiOC5 (3)), y
detectar al menos los cilindros y los eritrocitos como partículas urinarias contenidas en la muestra de medición obtenida en la etapa de preparación.
2. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la etapa de preparación, se mezcla adicionalmente un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante.
3. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tensioactivo es al menos uno seleccionado entre un tensioactivo catiónico, un tensioactivo aniónico, un tensioactivo anfótero y un tensioactivo no iónico.
4. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tensioactivo es bromuro de dodeciltrimetilamonio.
5. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el segundo reactivo comprende además un agente quelante.
6. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el agente quelante es etilendiaminotetraacetato (sal EDTA).
7. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende adicionalmente una etapa para obtener información óptica irradiando con luz las partículas urinarias contenidas en la muestra de medición,
en donde la etapa de detección es una etapa de detección de al menos los cilindros y los eritrocitos como partículas urinarias, basándose en la información óptica obtenida.
8. El método para analizar la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la información óptica es información de luz dispersada e información de fluorescencia.
9. El uso de un reactivo para el análisis de la muestra de orina para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias, en donde el reactivo contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3-dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxiananina (DiOC4(3)) y yoduro de 3,3-dipentiloxacarbocianina (DiOC5(3)).
10. El uso de un kit de reactivos para el análisis de la muestra de orina para detectar al menos cilindros y eritrocitos como partículas urinarias, en donde el kit de reactivos comprende
un primer reactivo que contiene al menos un colorante fluorescente seleccionado entre yoduro de 3,3'-dietiloxacarbocianina (DiOC2(3)), yoduro de 3,3-dipropiloxacarbocianina (DiOC3(3)), yoduro de 3,3'-dibutiloxacianina (DiOC4(3) ) y yoduro de 3,3-dipentiloxacarbocianina (DiOC5(3)), y
un segundo reactivo que contiene un tensioactivo como dispersante.
11. El uso del kit de reactivos para el análisis de una muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tensioactivo es al menos uno seleccionado entre un tensioactivo catiónico, un tensioactivo aniónico, un tensioactivo anfótero y un tensioactivo no iónico.
12. El uso del kit de reactivos para el análisis de la muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tensioactivo es bromuro de dodeciltrimetilamonio.
13. El uso del kit de reactivos para el análisis de muestras de orina de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el segundo reactivo comprende además un agente quelante.
14. El uso del kit de reactivos para el análisis de una muestra de orina de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el agente quelante es etilendiaminotetraacetato (sal EDTA).
ES15754422T 2014-02-28 2015-02-27 Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina Active ES2696836T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014039281 2014-02-28
PCT/JP2015/055897 WO2015129869A1 (ja) 2014-02-28 2015-02-27 尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2696836T3 true ES2696836T3 (es) 2019-01-18

Family

ID=54009182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15754422T Active ES2696836T3 (es) 2014-02-28 2015-02-27 Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10502685B2 (es)
EP (1) EP3112862B1 (es)
JP (1) JP6316934B2 (es)
KR (2) KR102024497B1 (es)
CN (1) CN106062556B (es)
ES (1) ES2696836T3 (es)
HU (1) HUE041665T2 (es)
SG (1) SG11201607146RA (es)
WO (1) WO2015129869A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201607145VA (en) 2014-02-28 2016-10-28 Sysmex Corp Method for urine sample analysis, reagent for urine sample analysis, and reagent kit for urine sample analysis
WO2022091418A1 (ja) * 2020-11-02 2022-05-05 株式会社ヘルスケアシステムズ 尿検体を保存するための試薬、キット及び方法
CN115791717B (zh) * 2022-09-22 2024-07-26 四川大学华西医院 基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测方法及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3070968B2 (ja) 1991-05-14 2000-07-31 シスメックス株式会社 尿中の細胞分析用試薬及び方法
JP3580615B2 (ja) * 1994-10-20 2004-10-27 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた有形成分分析方法
AU701948B2 (en) * 1994-10-20 1999-02-11 Sysmex Corporation Reagent for analyzing solid components in urine and method for analyzing solid components by employing the same
JP3467340B2 (ja) 1995-03-06 2003-11-17 シスメックス株式会社 尿中赤血球の鑑別装置
JP3739482B2 (ja) 1996-05-23 2006-01-25 シスメックス株式会社 尿中の有形成分分析方法および試薬
JP3642658B2 (ja) 1997-06-30 2005-04-27 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置および分析方法
JP2002090365A (ja) * 2000-02-08 2002-03-27 Internatl Reagents Corp 腎障害の検査手段
CN1276255C (zh) 2000-07-13 2006-09-20 希森美康株式会社 肾病检查试剂以及检查肾病及其组分的方法
US7309581B2 (en) * 2000-11-01 2007-12-18 Sysmex Corporation Method of staining, detection and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain
JP4413120B2 (ja) 2004-09-30 2010-02-10 シスメックス株式会社 検体中粒子分析方法及び分析装置
JP4759438B2 (ja) 2006-05-17 2011-08-31 シスメックス株式会社 尿中有形成分分析装置
CN101246158B (zh) * 2008-03-21 2012-04-18 王亚东 测定血细胞中白细胞的溶血剂
CN102226804B (zh) * 2011-03-28 2013-07-03 中国人民解放军总医院 一种用于血液白细胞五分类计数的溶血剂及其用途
CN105026928B (zh) * 2013-02-28 2018-11-06 希森美康株式会社 尿样本分析装置及尿样本分析方法
JP6189686B2 (ja) 2013-09-10 2017-08-30 独立行政法人国立高等専門学校機構 光線による避難誘導システム

Also Published As

Publication number Publication date
CN106062556B (zh) 2019-07-12
EP3112862A1 (en) 2017-01-04
EP3112862A4 (en) 2017-09-27
WO2015129869A1 (ja) 2015-09-03
KR102024497B1 (ko) 2019-09-23
EP3112862B1 (en) 2018-10-24
JP6316934B2 (ja) 2018-04-25
US20160363535A1 (en) 2016-12-15
KR20160126066A (ko) 2016-11-01
SG11201607146RA (en) 2016-10-28
CN106062556A (zh) 2016-10-26
US10502685B2 (en) 2019-12-10
KR20180088529A (ko) 2018-08-03
HUE041665T2 (hu) 2019-05-28
JPWO2015129869A1 (ja) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2278566T3 (es) Reactivo y metodo para analizar componentes solidos en la orina.
JP4976038B2 (ja) 血液学的試料の測定方法
JP4324552B2 (ja) 白血球の分類計数方法
CN1755348B (zh) 检体中粒子分析方法、分析装置及分析试剂
ES2895391T3 (es) Análisis celular de fluidos corporales
ES2684695T3 (es) Reactivo y kit de reactivos para el análisis de leucocitos primitivos
ES2490865T3 (es) Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras
ES2869919T3 (es) Sistema de análisis de glóbulos blancos
ES2696836T3 (es) Método para el análisis de muestras de orina, la utilización de un reactivo para el análisis de muestras de orina y la utilización de un kit de reactivos para el análisis de muestras de orina
CN101042397B (zh) 尿液分析用试剂及尿液分析方法
WO2021240914A1 (ja) 尿沈渣用染色液
JP5214603B2 (ja) 幼若白血球の分析用試薬及び分析用試薬キット
JP3580615B2 (ja) 尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた有形成分分析方法
US10794809B2 (en) Method for urine sample analysis, reagent for urine sample analysis, and reagent kit for urine sample analysis
ES2535004T3 (es) Método de análisis de plaquetas
JP3888876B2 (ja) 細菌の染色方法、細菌の分類・計数方法及び細菌染色用希釈液
JPH1183849A (ja) 尿中有形成分の分析方法及びその分析試薬
JP2006208401A (ja) 赤芽球の分類計数方法