JP4013868B2 - 蛍光検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、化学、工業、臨床、バイオ分野などの分野で使用される分析装置に関し、特に試料を特定の波長の励起光で励起し、発生した蛍光を測定する蛍光測定装置に関するものである。

スライドガラス、ゲル又は膜上に保持され、蛍光物質にてラベル化されたタンパク質などの対象物を含む微小領域（数μｍ〜数十μｍ）の蛍光を検出するには、測定しようとする領域に励起光を照射し、その励起光により励起されて対象物から発生する蛍光を検出する。そのような測定では、励起光として主にレーザ光が用いられている。

一例として、レーザ光源から発したレーザ光を試料に照射し、そのレーザ光の照射により励起された試料から発した蛍光を、共焦点光学系を通して結像させ、分光して検出するようにしたレーザ顕微鏡がある。そこでは励起光学系は光束を小さくするためのピンホールや、集光して試料上に照射するための集光レンズを用いて構成されている。

そのようなレーザ顕微鏡として、異なる波長を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源と、このレーザ光源から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段と、このレーザ光選択手段により選択されたレーザ光を走査して試料に照射する手段と、この照射手段により照射されたレーザ光により励起された試料が発した蛍光を通過させる如く試料の面と共役な位置に設置され蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホールと、この共焦点ピンホールの開口径を蛍光の波長にあわせて切換え制御する制御装置とを備えた走査型レーザ顕微鏡が提案されている（特許文献１参照。）。

そのような蛍光測定装置では、必要な波長ごとにレーザ光源が設置され、それらは共通した光学系により試料に集光されて照射されるように構成されている。
特開平１１−２７１６３６号公報

励起光としてレーザ光を使用し、光学系としてレンズを使用した光学系を使用した従来の装置では、次のような問題がある。
（１）励起波長が限られるため、使用する蛍光物質が制限される。また、必要な励起波長が複数である場合には、使用する波長ごとにレーザ装置が必要になる。
（２）複数のレーザを用いる場合、共通したレンズ系を通るため色収差が生じる。
（３）また、上記（２）の色収差により、１つの波長で焦点をあわせると、他の波長では焦点がボケる。そのためため蛍光検出の解像度が劣る。
（４）また、上記（２）の色収差により、１つの波長で焦点をあわせると、他の波長では焦点がボケ、検出しようとする微小領域以外のところにも強い励起光が照射されることになる。その結果、蛍光物質の褪色が生じ、正確な蛍光定量ができない。

一方、励起光としてレーザ光に替えて白色光を用いることが考えられる。白色光からはいろいろな波長が得られるが、波長あたりの光量が少ないので、単に光源を白色光源に替えただけでは、十分な検出感度を確保することはできない。
また、多波長を扱う場合、共通のレンズ系を使用すれば色収差に起因する問題は依然として残る。

そこで、本発明は、励起波長選択の自由度を大きくするとともに、検出感度を上げ、色収差に起因する問題を解決することのできる蛍光検出装置を提供することを目的とするものである。

本発明の蛍光検出装置は、白色光源と、白色光源から出た光を分光する励起側分光手段と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備えている。

励起光学系と蛍光光学系は共通の結像光学系を備えたものとすることができる。
その際、励起光学系と蛍光光学系とは一部の光路を共通にしており、その共通の光路とそれぞれの光路との分岐位置に励起光と蛍光を分離するハーフミラー又はダイクロイックミラーを備えて励起光と蛍光を分離する光学系とすることができる。

励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものとすることができる。その際、その励起光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。

蛍光光学系も試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものとすることができる。その際、蛍光光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。

また、励起光学系と蛍光光学系は試料面上に一方の焦点を共通にもつ共焦点光学系を構成しており、かつ試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点を共通の焦点としているものとすることができる。その際、共通の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。

励起光学系は光源からの白色光又は分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備えることができ、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系とすることができる。
その第２の光学系は分光に影響のない小さい角度で光を射出するように配置するのが好ましい。

本発明において、「焦点」の語は、結像光学系に光軸に平行な光線が入射したとき光線が収斂あるいはそこから光線が発散していくように見える点であると定義される狭義の焦点に限らず、光軸に対し傾斜した角度で結像光学系に光線が入射し結像している場合には、その結像点も含めて焦点と呼ぶ。
結像光学系として、シュワルツ鏡のほか、ウォルタ鏡や楕円面鏡、放物面鏡などを用いることができる。

シュワルツ鏡は、図２に示されるように、大きな凹面主鏡２６と小さな凸面副鏡２８を対向させたものであり、凹面主鏡２６の中央には凸面副鏡２８で反射された光束が通る孔が開けられている。これは双曲面と楕円鏡との組合わせからなり、それぞれの焦点の一方ａ（又はｂ）を光源、他方ｂ（又はａ）を集光点とするものである。シュワルツ鏡は像を縮小したり拡大したりすることができ、また平行光（完全な平行光のみならず、平行光に近い擬似平行光も含む。以下の記述においても同じ。）も出すことができる。

ウォルタ鏡は双曲面鏡と楕円面鏡とを組み合わせたミラーである。双曲面鏡の右側焦点から出た発散光は双曲面鏡を反射後、左側焦点から出た発散光のように振る舞う。一方、楕円面鏡では左側焦点から出た発散光は楕円面鏡を反射した後、右側焦点に集光する。したがって、双曲面鏡の左側焦点と楕円面鏡の左側焦点を一致させることにより、双曲面鏡の右側焦点から出た発散光は双曲面鏡、楕円面鏡と反射した後、楕円面鏡の右側焦点に集光する。（なお、ここで、右側、左側というのは説明の便宜上定めているだけで、左右を入れ替えても同じである。）
楕円面鏡は楕円面の一方の焦点から出た発散光を他方の焦点に集光させるように作用する。
放物面鏡は平行光を一点に集光したり、逆に一点から出た発散光を平行光に変換するように作用する。

白色光源は紫外から赤外に及ぶ波長範囲内の光を発生ものである。白色光源としては、キセノンランプのほか、水銀キセノンランプ、ハロゲンランプなどを用いることができる。
励起側分光手段はグレーティング、プリズム及び分光フィルターのうちのいずれかである。

蛍光側分光手段もグレーティング、プリズム及び分光フィルターのうちのいずれかである。
励起光学系は励起側分光手段により分光された光を集光して光束密度をあげるために鏡を組み合わせてなる結像光学系をさらに備えることができる。

本発明の蛍光検出装置では、光源として白色光源を使用し、励起光を試料に照射する励起光学系にも試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系にも、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を備えた。そのため、白色光を分光することによりどの波長でも選択できるようになる。励起光学系も蛍光光学系もレンズを使用しないので色収差をなくするか抑えることができ、解像度が劣ることがなく、また色収差がなくなるか抑えられることにより波長ごとに焦点を調整するような機構が不要で光学系が小型で簡単なものになる。

励起光学系と蛍光光学系が共通の結像光学系を備えたものとすれば、光学系が簡単になる。
励起光学系と蛍光光学系の一方又は両方が試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものととすれば、光学系が簡単になる。
励起光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置すれば、そのピンホールにより、試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されて蛍光物質の褪色が生じるのを防ぐことができるので、正確な蛍光測定を行なうのに好都合である。

蛍光光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置すれば、そのピンホールにより、試料の所定領域のみの蛍光を検出するようにすることができるので、蛍光測定の解像度を向上させるのに好都合である。

励起光学系が光源からの光を試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備えた場合には、励起光密度を高めることができる。
その第２の光学系が分光に影響のない小さい角度で光を射出するように配置すれば、結像光学系の数を少なくすることができる。

次に、図面を参照して実施例について詳細に説明する。
図１（Ａ）は第１の実施例の光学系を概略的に表したものである。
２は白色光源としてのキセノンランプである。光源２からの光を励起側分光器４に集めるために、光源２に関し分光器４とは反対側に凹面ミラー６が配置されている。

分光器４で分光されて所定の波長とされた励起光の光量を多く利用するために、レンズを用いず鏡を組み合わせてなる結像光学系としてのシュワルツ鏡８が配置され、励起光はそのシュワルツ鏡８により集光され、位置２４に結像する。

位置２４の励起光の像を一方の焦点とし、試料面上に他方の焦点を結ぶ励起光学系としての共焦点光学系を構成するために、レンズを用いず鏡を組み合わせてなる結像光学系としてのシュワルツ鏡１０，１４が配置されている。シュワルツ鏡１０，１４の間の光路上には光路を９０°折り曲げるハーフミラー１２が配置されている。シュワルツ鏡１０は焦点２４からの励起光を平行光として射出し、シュワルツ鏡１４はシュワルツ鏡１０からの平行光とされた射出光をハーフミラー１２を介して受光し、試料面１６の所定の領域の焦点に集光して照射する。

シュワルツ鏡１４は試料面１６が励起光の照射により励起されて発生する蛍光を集光し平行光にして射出する役目も果たしている。シュワルツ鏡１４とともに蛍光光学系としての共焦点光学系を構成するために、ハーフミラー１２を挟んでシュワルツ鏡１８が配置されている。ハーフミラー１２は励起光を反射するとともに、シュワルツ鏡１４から射出した蛍光を透過させる。シュワルツ鏡１８は蛍光側分光器２０の入口に焦点１９をもち、分光器２０の入口に蛍光を集光して入射させる。
２２はＰＭＴ（光電子増倍管）又はシリコンフォトダイオードなどの検出器である。

この実施例では、光源２からの白色光は凹面ミラー６により励起側分光器４に集められ、分光器４で分光されて所定の波長の励起光となる。その励起光はシュワルツ鏡８により集光され、位置２４に結像される。結像された励起光はシュワルツ鏡１０に集光され平行光としてハーフミラー１２に射出される。励起光はハーフミラー１２で反射されてシュワルツ鏡１４に入射し、シュワルツ鏡１４によって試料面１６の所定の領域に集光されて照射される。励起光により励起されて試料面１６から発生した蛍光は、同じシュワルツ鏡１４により集光され、平行光とされてハーフミラー１２を透過し、シュワルツ鏡１８により集光されて蛍光側分光器２０に入射する。蛍光は分光器２０で分光され、検出器２２で検出される。

後の実施例においても同様であるが、ハーフミラー１２に替えてダイクロイックミラーを使用していもよい。ダイクロイックミラーは、励起光波長成分を反射し、それよりも長波長の蛍光を透過させる特性をもったものを使用する。

図１（Ｂ）は図１（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた実施例を表わす。９はウォルタ鏡又は楕円面鏡でシュワルツ鏡８に替わるもの、１１，１５及び１９は放物面鏡でシュワルツ鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図１（Ｂ）の実施例の動作は図１（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図３（Ａ）は第２の実施例を表わしたものであり、図１（Ａ）の実施例において、励起光学系の焦点２４の位置にピンホール３４を配置し、蛍光光学系の焦点１９の位置にピンホール３６を配置したものである。

共焦点光学系をなす励起光学系において、焦点２４は試料面１６上の焦点と共役な関係にあるので、その焦点２４の位置にピンホール３４を配置することにより、試料面１６に照射される励起光スポットの大きさを制限することができ、試料面１６において検出しようとする微小領域以外の部分が励起光で照射されるのを防ぐことができる。

一方、共焦点光学系をなす蛍光光学系においても、焦点１９は試料面１６上の焦点と共役な関係にあるので、その焦点１９の位置にピンホール３６を配置することにより、試料面１６上の所定の微小領域以外からの蛍光が分光器２０に入射するの排除して所定領域のみの蛍光を検出することができ、その結果として蛍光検出の解像度を向上させることができる。

図３（Ｂ）は図３（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９はシュワルツ鏡８に替わるもの、放物面鏡１１，１５及び１９はシュワルツ鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図３（Ｂ）の実施例の動作は図３（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図４（Ａ）は第３の実施例を表わす。図１（Ａ）の実施例と比較すると、シュワルツ鏡１０はシュワルツ鏡８で集光された励起光の像からの光を受光し、分光（ハーフミラー１２に替えてダイクロイックミラーを使用した場合の分光特性）に影響のない小さい角度で射出し、ハーフミラー１２の手前の位置に結像２４ａを結ぶように配置されている。また、シュワルツ鏡１４はシュワルツ鏡１０から射出された励起光をハーフミラー１２での反射を介して集光し、試料面１６に像を結ぶように配置されている。シュワルツ鏡１４は試料面１６から発生する蛍光を集光して分光に影響のない小さい角度で射出し、ハーフミラー１２を透過して分光器２０の入口付近に像１９を結ぶ。この実施例では、位置２４ａ，試料面１６上の点及び位置１９は結像点であり、狭義の焦点ではないが、これらの点も焦点と呼ぶ。

この実施例ではシュワルツ鏡１４は励起光学系と蛍光光学系に共通の共焦点光学系を構成している。焦点２４ａは励起光学系における試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点であり、焦点１９は蛍光光学系における試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点である。

図４の実施例では、分光に影響のない小さい角度でハーフミラー１２に入射させるようにシュワルツ鏡１０，１４を配置したことにより、試料への照射面積、光量、蛍光検出の解像度などを減少させることなく、図１の実施例で使用されているシュワルツ鏡１８を省いてシュワルツ鏡の数を１つ少なくしている。シュワルツ鏡の数が少なくなると、光学系を小さくすることができ、光軸調整も容易になり、コスト低下につながる。

図４（Ｂ）は図４（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。９，１３及び１７はウォルタ鏡又は楕円面鏡であり、シュワルツ鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図４（Ｂ）の実施例の動作は図４（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図５（Ａ）は第４の実施例を表わす。この実施例は、図４（Ａ）の実施例において、励起光学系の焦点２４ａの位置に励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４を配置し、蛍光光学系の焦点１９の位置に蛍光検出の解像度を向上させるピンホール３６を配置したものである。

図５（Ｂ）は図５（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９，１３及び１７はシュワルツ鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図５（Ｂ）の実施例の動作は図５（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図６（Ａ）は第５の実施例を表す。この実施例でも、シュワルツ鏡１０，１４は分光に影響のない小さい角度でハーフミラー１２に光を入射させるように配置されているが、図４（Ａ）の実施例と比較すると、シュワルツ鏡１０，１４による結像の位置が異なっている。図６（Ａ）の実施例では、シュワルツ鏡１０から射出された励起光がハーフミラー１２で反射された後に位置４０に結像するようにシュワルツ鏡１０が配置されている。また、シュワルツ鏡１４は、像４０からの励起光を集光して試料面１６上に結像するとともに、試料面１６から発生した蛍光を励起光の像と同じ位置４０に結像するように配置されている。蛍光はその結像点４０からハーフミラー１２を透過して分光器２０へ入射する。

この実施例でもシュワルツ鏡１４は励起光学系と蛍光光学系に共通の共焦点光学系を構成しているが、試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点４０は励起光学系の焦点であるとともに蛍光光学系の焦点を兼ねている。

この実施例においても、焦点４０の位置にピンホール４２を配置することができる。このピンホール４２は励起光スポットの大きさを制限するとともに、蛍光検出の解像度を上げる作用をし、共通の焦点４０の位置に１つ配置するだけですむ利点がある。
ピンホールの数が少なくなると、光学系が小さくなり、光軸調整も容易になり、コスト低下にもなる。

図６（Ｂ）は図６（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９，１３及び１７はシュワルツ鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図６（Ｂ）の実施例の動作は図６（Ａ）の実施例の動作と同じである。

以上の実施例は分光手段としてグレーティングを用いた分光器を使用している。それに対し、図７以降の実施例又は参考例においては分光手段として分光フィルタを使用する。グレーティングは波長精度が高い利点があり、分光フィルタは検出感度を高める上で利点がある。

図７（Ａ）は参考例を表わす。光源２から発生する白色光はシュワルツ鏡１０により集光され、平行光として射出される。その射出された光は励起光を選択する分光フィルタ４４を透過して波長が選択されて励起光となる。励起光はハーフミラー１２で反射され、シュワルツ鏡１４で試料面１６に集光されて照射される。試料面１６から発生した蛍光はシュワルツ鏡１４で集光され、平行光となってハーフミラー１２を透過し、蛍光を選択するための分光フィルタ４６を透過してシュワルツ鏡１８に入射し、集光されて検出器２２に入射する。

この参考例では、シュワルツ鏡１０とシュワルツ鏡１４により励起光学系の共焦点光学系を構成しており、光源１２の像が試料面１６上に結ばれる。蛍光光学系においてはシュワルツ鏡１４とシュワルツ鏡１８により共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の蛍光像が検出器２２の入口に結ばれる。検出器２２の入口付近の蛍光の焦点位置には蛍光検出の解像度を上げるためのピンホール３６が配置されている。

図７（Ｂ）は図７（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡を放物面鏡に置き換えた参考例を表わす。放物面鏡１１，１５及び１９はシュワルツ鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図７（Ｂ）の参考例の動作は図７（Ａ）の参考例の動作と同じである。

図８（Ａ）は第６の実施例を表わす。図７（Ａ）の参考例と比較すると、励起光学系において試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されるのを防ぐために、励起光学系の共役な焦点位置に光源の像を形成し、その位置にピンホール３４を設けることができる構成になっている点で異なる。この実施例では、光源２からの白色光がシュワルツ鏡８ｂにより集光され、平行光として射出されてシュワルツ鏡８ｃ入射し、シュワルツ鏡８ｃにより焦点２４の位置に結像する。その焦点２４を経た白色光はシュワルツ鏡１０に入射し、シュワルツ鏡１０で平行光とされた後は、図７（Ａ）の実施例と同じ光学系によって光学フィルタ４４で波長が選択されて励起光となり、ハーフミラー１２からシュワルツ鏡１４をへて試料面１６に集光して照射される。試料面１６からの蛍光はシュワルツ鏡１４、ハーフミラー１２を経て、分光フィルタ４６で波長選択され、シュワルツ鏡１８により集光され、ピンホール３６を経て検出器２２に入射する。

励起光学系においてはシュワルツ鏡１０とシュワルツ鏡１４により共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点２４の位置に励起光スポットの大きさを制限するためのピンホール３４が配置されている。

図８（Ｂ）は図８（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡を放物面鏡に置き換えた実施例を表わす。放物面鏡９ｂ，９ｃ，１１，１５及び１９はシュワルツ鏡８ｂ，８ｃ，１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図８（Ｂ）の実施例の動作は図８（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図９（Ａ）は第７の実施例を表す。この実施例では、光源２からの白色光がシュワルツ鏡１０で集光され、平行光となって光学フィルタ４４を透過し、励起波長が選択される。その励起光はハーフミラー１２で反射され、シュワルツ鏡５０によって焦点４０に結像する。結像した励起光は、シュワルツ鏡５２とシュワルツ鏡１４によって試料面１６に集光されて試料を照射する。試料１６からの蛍光はシュワルツ鏡１４,５２により焦点４０に蛍光像を結ぶ。蛍光はシュワルツ鏡により集光され、平行光となってハーフミラー１２を透過し、蛍光を選択する光学フィルタ４６を経て検出器２２に入射して検出される。

この実施例ではシュワルツ鏡１４とシュワルツ鏡５２により励起光学系と蛍光光学系の共通の共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の焦点と共役な位置に両光学系に共通の焦点４０をもっている。
この実施例では励起光スポットの大きさを制限するとともに、蛍光検出の解像度を上げるために、共通の焦点４０にピンホール４２を１つ配置するだけですむ。

図９（Ｂ）は図９（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡を放物面鏡に置き換えた実施例を表わす。放物面鏡１１，１５，５１及び５３はシュワルツ鏡１０，１４，５０及び５２にそれぞれ替わるものである。
図９（Ｂ）の実施例の動作は図９（Ａ）実施例の動作と同じである。

図１０（Ａ）は第８の実施例を表わす。この実施例では光源２からの白色光がシュワルツ鏡１０により集光され、分光に影響のない小さい角度で射出されてハーフミラー１２の手前の位置２４に光源の像を結ぶようにシュワルツ鏡１０が配置されている。光源からの光が、その後、光学フィルタ４４を経て励起光が選択され、ハーフミラー１２で反射されてシュワルツ鏡１４に入射し、集光されて試料面１６に照射されるようにシュワルツ鏡１４が配置されている。試料面１６からの蛍光はシュワルツ鏡１４で集光され、小さい角度で射出され、ハーフミラー１２を透過して光学フィルタ４６で蛍光が選択された後、検出器２２の入口の近くの位置１９に結像する。その後検出器２２に入射して検出される。

シュワルツ鏡１４は励起光学系と蛍光光学系で共通の共焦点光学系を構成している。励起光学系において試料面１６上の焦点に共役な焦点２４には励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４が配置され、蛍光光学系の共役な焦点１９には蛍光検出の解像度を向上させるピンホール３６が配置されている。

図１０（Ｂ）は図１０（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡１３及び１７はシュワルツ鏡１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図１０（Ｂ）の実施例の動作は図１０（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図１１（Ａ）は第９の実施例を表わす。この実施例ではシュワルツ鏡１０から小さい角度で射出した光源２からの光が、ハーフミラー１２で反射された後に位置４０に結像するようにシュワルツ鏡１０が配置されている。シュワルツ鏡１０とハーフミラー１２の間の光路上に励起光を選択する光学フィルタ４４が配置されている。位置４０に結像した励起光が、シュワルツ鏡１４を経て試料面１６上に集光して照射されるようにシュワルツ鏡１４が配置されている。試料面１６からの蛍光はシュワルツ鏡１４で集光され、励起光の像と同じ位置４０に結像した後、ハーフミラー１２を透過して光学フィルタ４６で蛍光波長が選択された後、検出器２２に入射して検出される。

この実施例では励起光学系と蛍光光学系で共焦点光学系の共役な焦点４０が共通した位置にあり、その位置にピンホール４２を配置することにより、１つのピンホール４２が励起光スポットの大きさの制限と蛍光検出の解像度向上の両方の機能を果たすことができる。

図１１（Ｂ）は図１１（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９及び１７はシュワルツ鏡１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図１１（Ｂ）の実施例の動作は図１１（Ａ）の実施例の動作と同じである。

図１０（Ａ），（Ｂ）、図１１（Ａ），（Ｂ）の実施例では、ハーフミラー１２への入射角を分光に影響のない小さい角度にすることにより、シュワルツ鏡、ウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡の数を減らしている。

図１２（Ａ）は光源からの白色光の受光光量を増加させるための励起光学系の一部を示したものである。光源２に関しシュワルツ鏡８ｆとは反対側に凹面ミラー６を配置して光源２からの白色光を集光してシュワルツ鏡８ｆに入射させ、シュワルツ鏡８ｆでさらに小さい像に結像した後、シュワルツ鏡１０に入射させる。その後、図１１と同様に、シュワルツ鏡１０により分光に影響のない小さい角度で射出される。その後の光学系は図１１（Ａ）と同じである。
この実施例では、シュワルツ鏡８ｆと１０の間の共焦点２４の位置にも励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４を配置することができる。

図１２（Ｂ）は図１２（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９ｆ及び１３はシュワルツ鏡８ｆ及び１０にそれぞれ替わるものである。
図１２（Ｂ）の実施例の動作は図１２（Ａ）の実施例の動作と同じである。

本発明は化学、工業、臨床、バイオ分野などの分野において、試料を特定の波長の励起光で励起し、発生した蛍光を測定することにより試料を分析するために利用することができ、特に平面上に存在する試料の分析に適する蛍光測定装置として利用することができる。

（Ａ），（Ｂ）は第１の実施例を示す概略構成図である。 実施例で使用するシュワルツ鏡を示す概略正面図である。 （Ａ），（Ｂ）は第２の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第３の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第４の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第５の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は参考例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第６の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第７の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第８の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第９の実施例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は第１０の実施例を示す概略構成図である。

符号の説明

２ 白色光源としてのキセノンランプ
４，２０ 分光器
６ 凹面ミラー
８，１０，１４，１８，８ｂ，８ｃ，８ｆ，５０，５２ シュワルツ鏡
９，９ｆ，１３，１７ ウォルタ鏡又は楕円面鏡
９ｂ，９ｃ，１１，１５，１９，５１，５３ 放物面鏡
１２ ハーフミラー
１６ 試料面の焦点
１９，２４，２４ａ，４０ 共役な焦点
２２ 検出器
３４,３６，４２ ピンホール
４４，４６ フィルタ

Claims (9)

1. 白色光源と、
   前記白色光源から出た光を分光する励起側分光手段と、
   レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、
   レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、
   前記蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、
   前記蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備え、
   前記励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しており、
   かつ前記励起光学系は光源からの白色光又は分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備え、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系であることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記励起光学系と蛍光光学系は前記結像光学系を共通のものとして備えている請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記励起光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールが配置されている請求項１に記載の蛍光検出装置。
4. 前記蛍光光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成している請求項１から３のいずれかに記載の蛍光検出装置。
5. 前記蛍光光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールが配置されている請求項４に記載の蛍光検出装置。
6. 前記励起光学系と蛍光光学系は試料面上に一方の焦点を共通にもつ共焦点光学系を構成しており、かつ試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点を共通の焦点としている請求項２に記載の蛍光検出装置。
7. 前記共通の焦点の位置にピンホールが配置されている請求項６に記載の蛍光検出装置。
8. 前記結像光学系はシュワルツ鏡、ウォルタ鏡、楕円面鏡及び放物線鏡のうちの少なくとも1つを含んでいる請求項１から７のいずれかに記載の蛍光検出装置。
9. 前記励起光学系と蛍光光学系とは一部の光路を共通にしており、その共通の光路とそれぞれの光路との分岐位置に励起光と蛍光を分離するハーフミラー又はダイクロイックミラーを備えている請求項１から８のいずれかに記載の蛍光検出装置。

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