JP2006519364A - 分光光度計 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料を分析するための吸収または発光測定を目的として、試料と相互作用させるためにウェルプレートのウェル3中に入れられた液体試料に実質的に単色の励起光ビームを向けるための光学系を有する分光光度計。この光学系は、2つの開口の共役像18,21の間の励起ビーム領域であるケーラー照明領域をウェル外部に確立するための2つの開口46,28を含む。次に、この励起ビーム領域は縮小され、ウェル3中で結像する10,9。本発明は、照射している励起光ビームのいずれの部分をもウェルが遮ることなく液体試料すべてが均一に照射されるように、ウェル空間の形状と一致するようなケーラー照明領域の形状を提供する。
Description
分析用試料は、試料による光の吸収の分光光度測定により、特性決定され、また分析され得る。分析用試料はまた、試料の蛍光の分光光度測定により特性決定され、また分析され得る。
蛍光測定を行う際には、蛍光発光の量が試料を照射する光の量に比例し、そのため照射光量のいくらかの減少が、試料により蛍光発光された光の量の減少と必然的に関連している。これが次には蛍光測定の信号対雑音比を減少させる。
上記光学系は、第1開口および第2開口、ならびに、第1および第2開口の共役像をウェル外部に形成して、その間に単色光のビーム領域を確立するための集束手段を含み、該ビーム領域がウェルの内部形状に類似する形状となるように、第1および第2開口のサイズおよび形状が合わせられる。
類似する形状の光ビーム領域を確立するための共役像を与えるための構成は、「ケーラー照明」共役の例である。これは、最も均一かつ限定されたグレア照射を与え、系の中でのエネルギー損失は最小限である。共役像の間の類似する形状の領域はまた、フィルター、開口およびポラライザーの便利な挿入を有利に提供し、また通常、大きなものよりコスト効率のよい小さなフィルターおよびポラライザーの使用も可能にする。
ケーラー照明共役領域を与える集束手段は、テレセントリック鏡(すなわち、主光線が互いに平行である)であることが好ましい。
ケーラー照明共役をウェル空間へと結びつける、縮小および結像のための結像手段は軸外楕円鏡であることが好ましい。この鏡は光学系において容積縮小結像を行う。例えばウェルの壁に留まることなく384マルチウェルプレートのウェル中へ実質的に単色光のビームの三次元領域を縮小する。この容積共役結像は、2つの主な利点を提供する。第1に、容積結像がケーラー照明共役をウェル空間へと結びつけるために、ウェル中の液体試料の実質的に全部が、限定されたグレアにより均一に照射される。第2に、ウェル中のビームは実質的に円筒形または長方形の平行管状の形状(開口の形状に依存する)であり、ウェルの深さ全体にわたって試料を最小の強度変化で照射するため、焦点合わせはウェル中の試料の高さの影響を受けない。
別法として、その検出系は蛍光および/またはリン光測定のための系であってもよい。本発明の分光光度計は、吸収の検出系および蛍光/リン光測定のための検出系を含んでもよい。
光源と、
試料位置と、
試料位置に置かれたウェルに入れられた液体試料に光源由来の実質的に単色の光のビームを向けるための励起光学系と、
検出器、および実質的に単色の光のビームとの相互作用の後に液体試料から発光された光を検出器へと向けるための発光光学系とを含む分光光度計であって、
この発光光学系が、
(i)ウェルの底面の像およびウェル中の液体試料の上面の像を与えるための結像手段であって、ウェルの内部形状に類似する形状を有する発光の領域を、ウェルの外側で前記2つの像の間に確立する結像手段と、
(ii)類似する形状の発光の領域を、実質的に単色の光を与えるための手段の方へ向けて集束させる集束手段、および発光から実質的に単色の光を与える手段とを含み、
前記検出器が、かかる光を与えるための手段からの実質的に単色の発光を検出するように配置されている分光光度計を提供する。
類似する形状の発光の該領域を確立するために、ウェル容積を縮小し、結像させるための結像手段は、軸外楕円鏡が好ましい。この集束手段はテレセントリック鏡が好ましく、実質的に単色の発光を与える手段はモノクロメーターが好ましいが、その代わりにプリズムまたは光学帯域通過フィルターであってもよい。
光源と、
試料位置と、
試料位置に置かれた内部形状を有するウェルに入れられた液体試料に光源由来の実質的に単色の光のビームを向けるための光学系とを含む分光光度計であって、
その光学系が、
(i)実質的に単色の光のビームを得るための、実質的に単色の光を与えるための手段に関連する第2開口が後に続く入射開口と、
(ii)入射部および第2開口の共役像を与えるための集束手段であって、共役像の形状およびサイズにより決定された特有の形状を有する実質的に単色の光のビームの領域を前記2つの共役像の間に確立する集束手段と、
(iii)ウェル中の液体試料と相互作用させるために特有の形状の光ビーム領域を縮小してウェル中に結像させるための結像手段であって、光ビームのいずれの部分をもウェルが遮ることなく液体試料の実質的にすべてが均一に照射されるように、光ビーム領域の特有の形状がウェルの内部形状と一致する結像手段とを含み、
実質的に単色の光ビームと相互作用した後の、液体試料からの光を検出するための検出系をさらに含む分光光度計である。
本発明の実施形態の分光光度計の光学的スループットは、モノクロメーターの2つの開口である入射スリットの開口および格子の開口、またはこの組み合わせの共役像に依存している。この系のスループットは、
Tsys=As×Ag/F2
またはTsys=Asi×Agi/L2
により計算できる。
ここで、
As:入射スリットの開口面積
Ag:格子の開口面積
F:モノクロメーターの焦点の長さ
Asi:入射スリットの開口の像の面積
Agi:格子の開口の像の面積
L:2つの像の間の距離
である。
Twell=At×Ab/D2
により計算できる。
ここで、
At:ウェルの上端の開口面積
Ab:ウェルの底面の開口面積
D:ウェルの深さ
である。
本発明において、系は最良の効率に達し、すなわちTsys=Twellである。
吸光度測定
標的ウェル3の透明な底面から出た光は、吸光度検出器光学系7により吸光度検出器8に焦点を合わせられる。吸光度検出器8からの電気信号は吸光度対照検出器23からの電気信号とともに、標的ウェル3中の試験溶液(図示せず)の吸光度測定に用いられる。
蛍光/リン光測定
もし標的ウェル3中の試験溶液が前記のように照射されたときに蛍光を発するならば、発光した試料から集光された蛍光発光は、前記のメイン・ビーム・スプリッター11から標的ウェル3へという光の進行とは逆の方向で同じ光路をたどる。蛍光発光の一部分はメイン・ビーム・スプリッター11を通過し、標的ウェル3の底面の像42を、そして標的ウェル3の上端の像39を形成する。像42と像39との間の細い発光ビーム領域は、像21と像18との間の励起光ビームに関して前記したようなケーラー照明を構成する。この場合もやはり、必要に応じて像42と像39との間の細い発光ビーム領域にフィルター40および/またはポラライザー41が配置されるのが有利である。(符号42および39は絞りを表しているが、かかる絞りがそこに必要なわけではなく、本発明のこの実施形態ではただそれぞれの像が符号42および39の位置に確立されることに注意)。細い発光ビーム領域のサイズが小さいことにより、物理的に小さいフィルターまたはポラライザーの使用が可能となるため、相当するコストの削減が可能となる。
本発明の分光光度計の試験結果
検出限界は分析機器にとって重要な性能指数である。この検出限界は、特定の条件下において特定の信頼水準で検出され得る特定の物質の濃度として定義される。この検出限界は一般に、当該特定の物質を含まない試料の一連の測定から得られるシグナルの標準偏差の3倍に等しいシグナルを生じる濃度として定められる。検出限界は低いほどよい。
本発明の分光光度計の使用により達成された検出限界の向上の例として、第1に従来技術のウェルプレートリーダー(図1に相当)、第2に図2に相当するウェルプレートリーダーを用いた、フルオレセイン10pmol/lを含有する試験溶液の蛍光測定の結果から計算したフルオレセインの検出限界を、表1に示す。それぞれの場合において、384ウェルのウェルプレート中のウェル3中に入れられた試験溶液、50/50ビーム・スプリッター11を使用し、また測定は30フラッシュを10サイクル繰り返して行った。試験溶液の試料100μlを用いる場合には、ウェルはほぼ満杯に近く、その検出限界はそれぞれの機器に関して同じであった。試料容積を50μlに減少させた場合には、ウェル3は半分満たされていたのみであった。本発明の実施形態の分光光度計機器の検出限界は2倍に悪化したが、従来技術の機器では6倍に悪化した。このことは、限られた容積の試料溶液中の目的の低濃度物質の測定において、本発明が従来技術よりも有利であることを説明している。
2は励起モノクロメーター29の入射スリット46の第2の像である。
3は標的ウェルである。
5は標的ウェル3に隣接するウェルである。
7は吸光度検出器8のための光学系である。
8は吸光度検出器である。
9は軸外楕円鏡である。
10は大きな平面反射(平面)鏡である。
11はメイン・ビーム・スプリッターである。
12は蛍光対照検出器16のためのビーム・スプリッターである。
13は第1アテニュエーターである。
14は蛍光対照検出器16のための曲面鏡である。
15は第2のアテニュエーターである。
16は蛍光対照検出器である。
17は吸光度対照検出器23のためのビーム・スプリッターである。
18は励起モノクロメーター29の入射スリット46の第1の像の位置を示す。
19は励起ポラライザーである。
20は励起フィルターである。
21は励起モノクロメーター29の励起回折格子の線条面28の第1の像の位置を示す。
22は吸光度対照検出器23のための曲面鏡である。
23は吸光度対照(参照)検出器である。
24は集束鏡(励起)である。
25は平面反射(平面)鏡(光源光学系)である。
26はレンズ(光源光学系)である。
27はキセノンアークフラッシュランプである。
28は励起モノクロメーター29の励起回折格子の線条面である。
29は励起モノクロメーターである。
30は励起モノクロメーター29の平行光線鏡である。
31は励起モノクロメーター29の集束鏡である。
32は発光モノクロメーター34の平行光線鏡である。
33は発光モノクロメーター34の集束鏡である。
34は発光モノクロメーターである。
35は発光モノクロメーター34の発光回折格子の線条面である。
36は発光検出器37のための曲面鏡である。
37は発光検出器である。
38は集束鏡(発光)である。
39は標的ウェル3の上端の像の位置を示す。
40は発光フィルターである。
41は発光ポラライザーである。
42は標的ウェル3の底面の像の位置を示す。
45は吸光度対照検出器23のためのアテニュエーターである。
46は励起モノクロメーター29の入射スリットである。
47は励起モノクロメーター29の射出スリットである。
48は発光モノクロメーター34の入射スリットである。
49は発光モノクロメーター34の射出スリットである。
Claims (16)
- 実質的に単色の光のビームをウェル中の液体試料へ向けるための光学系であって、第1開口および第2開口、ならびに、前記第1および第2開口の共役像を前記ウェルの外部に形成して、これらの共役像の間に単色の光のビーム領域を確立するための集束手段を含み、前記ビーム領域が前記ウェルの内部形状に類似する形状となるように、前記第1および第2開口のサイズおよび形状が合わせられている光学系と、
前記ウェルにおいて前記ビーム領域を前記ウェルの内部サイズと一致するサイズに結像させるための結像手段であって、結像された前記ビーム領域のいずれの部分をも前記ウェルが遮ることなく前記ウェル中の液体試料を実質的にすべて照射するための単色の光のビームの結像された前記領域のための結像手段とを含む分光光度計。 - 前記第1および第2開口の共役像が実質的に同じサイズであり、そのために光のビームの前記領域が実質的に一定の横断面である、請求項1記載の分光光度計。
- 前記第1および第2開口の共役像を与えるための前記集束手段がテレセントリック鏡である、請求項1または2記載の分光光度計。
- 光のビームの前記領域を前記ウェル中に結像させるための前記結像手段が軸外楕円鏡である、請求項1ないし3のいずれかに記載の分光光度計。
- 実質的に単色の光のビームを与えるためのモノクロメーターを含み、前記第1開口が前記モノクロメーターの入射スリットであり、かつ前記第2開口がその回折格子の開口である、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の分光光度計。
- 光源と、
試料位置と、
前記試料位置に置かれ、内部形状を有するウェルに入れられた液体試料に前記光源由来の実質的に単色の光のビームを向けるための光学系とを含む分光光度計であって、
前記光学系が、
(i)実質的に単色の光のビームを得るための入射開口であって、実質的に単色の光を与えるための手段に関連する第2開口が後に続く入射開口と、
(ii)前記入射開口および前記第2開口の共役像を与えるための集束手段であって、前記共役像の形状およびサイズにより決定された特有の形状を有する実質的に単色の光のビームの領域を前記共役像の間に確立する集束手段と、
(iii)前記ウェル中の液体試料と相互作用させるために特有の形状の前記光のビーム領域を縮小して前記ウェル中に結像させるための結像手段であって、当該光のビームのいずれの部分をも前記ウェルが遮ることなく当該液体試料が実質的にすべて均一に照射されるよう、前記光のビーム領域の前記特有の形状が前記ウェルの前記内部形状と一致する結像手段とを含み、
実質的に単色の光のビームと相互作用した後の、当該液体試料からの光を検出するための検出系をさらに含む、分光光度計。 - 光源と、
試料位置と、
前記試料位置に置かれたウェルに入れられた液体試料に前記光源由来の実質的に単色の光のビームを向けるための励起光学系と、
検出器、および実質的に単色の光のビームとの相互作用の後に当該液体試料から発光された光を前記検出器へと向けるための発光光学系とを含む分光光度計であって、
前記発光光学系が、
(i)前記ウェルの底面の像および前記ウェル中の液体試料の上面の像を与えるための結像手段であって、前記ウェルの内部形状に類似する形状を有する前記発光の領域を、前記ウェルの外側で前記2つの像の間に確立する結像手段と、
(ii)前記類似する形状の前記発光の領域を、前記実質的に単色の光を与えるための手段の方へ向けて集束させるための集束手段、および前記発光から実質的に単色の光を与えるための手段とを含み、
前記検出器が、かかる光を与えるための前記手段からの実質的に単色の発光を検出するように配置されている分光光度計。 - 類似する形状の前記発光の領域が実質的に一定の横断面を有する、請求項7記載の分光光度計。
- 類似する形状の前記発光の領域を確立するための前記像を与えるための前記結像手段が軸外楕円鏡である、請求項7または8に記載分光光度計。
- 前記集束手段がテレセントリック鏡である、請求項7ないし9のいずれかに記載の分光光度計。
- 前記実質的に単色の発光を与えるための手段がモノクロメーターである、請求項7ないし10のいずれかに記載の分光光度計。
- 液体試料からの蛍光発光またはリン光発光を検出するための発光光学系および検出器を含む分光光度計であって、
前記発光光学系が、
(i)前記ウェルの前記底面の像および前記ウェル中の液体試料の上面の像を与えるための結像手段であって、前記ウェルの前記内部形状に類似する形状を有する前記発光の領域を、前記ウェルの外側で前記ウェルおよび前記液体試料の前記像の間に確立する結像手段と、
(ii)前記類似する形状の発光の領域を、前記実質的に単色の光を与えるための手段の方へ向けて集束させるための集束手段、および前記発光から実質的に単色の光を与えるための手段とを含み、
前記検出器が、かかる光を与えるための前記手段からの前記実質的に単色の発光を検出するように配置されている請求項1ないし5のいずれかに記載の分光光度計。 - 前記類似する形状の発光の領域が実質的に一定の横断面を有する、請求項12記載の分光光度計。
- 前記類似する形状の発光の領域を確立して前記像を与えるための前記結像手段が軸外楕円鏡である、請求項12または13記載の分光光度計。
- 前記発光のための前記集束手段がテレセントリック鏡である、請求項12ないし14のいずれかに記載の分光光度計。
- 前記実質的に単色の発光を与えるための手段がモノクロメーターである、請求項12ないし15のいずれかに記載の分光光度計。
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