JP2005538420A - スペクトル識別装置および方法 - Google Patents

Abstract

走査型光学顕微鏡で用いるためのスペクトル識別装置を提供する。スペクトル識別装置は分散手段（３１）と回転可能なディスク（３６）を含む周波数選択手段とを含む。ディスクは開口部または螺旋形のスロットを備えて形成され、これにより、ディスクが回転すると当該装置によって透過された光の周波数が制御される。当該装置は周波数選択手段から光を受取るための検出器（３９）を含む。当該または各回転可能ディスク（３６）は、分散手段（３１）の後ろの開口平面に配置されるが、ただしこれは、回転可能ディスクの外周部が、カム従動子によって係合されるカム面を設けるよう形作られている場合、必須ではない。走査型光学顕微鏡におけるスペクトル識別の方法がまた提供される。当該方法は、光を分散させ、かつ、回転ディスクの形状により透過された光の周波数が制御される周波数選択手段に光を通すステップを含む。

Description

発明の分野
この発明は、走査型光学顕微鏡で用いるためのスペクトル識別装置と、このような装置を用いる方法とに関する。

発明の背景
いくつかの種類の走査型光学顕微鏡が現在用いられている。これらは共焦点顕微鏡および多光子励起蛍光顕微鏡を含む。多くのこのような顕微鏡においては、照明が、試料の上にわたって走査される光の点に制限されるか、または代替的には、試料が、固定された点に相対的に走査される。ここに記載される発明は、単一の点しか走査されない走査型光学顕微鏡のすべての形態に適用可能である。

光学顕微鏡法の確立された一部の技術は、いわゆる中間の像平面に試料の焦点を合わせる一連のレンズまたは他の焦点合わせ手段を用いる。この平面は、光学的に共役の平面の群、さらに、この群が試料内に焦点の平面を含む上述の中間の像平面、照明絞りの平面、および、カメラを備えたシステムの場合には光電性表面の平面のうちの１つを含む。この共役平面の群は像平面の群として公知である。顕微鏡法の基本テキストには、上述の像平面が、レンズの物理的な開口部またはそれらの後部焦点平面が制限されるかまたは投影されているいわゆる開口平面と顕微鏡の軸に沿って交互になることが教示される。このため、開口平面の群はコンデンサ絞りと、対物レンズの後部焦点平面と、ラムスデン（Ramsden）円（概してアイピースの上方に位置し、コンデンサ絞りと共役する対物レンズの後部焦点平面の小さな円板状の像）とを含む。「像平面」および「開口平面」という用語がここで用いられているのは、それらが先行技術およびこの発明の両方を理解するのに有用であるからである。

ホワイト（White）は、米国特許第５ ０３２ ７２０号において、共焦点顕微鏡内で検出器への光の通路を制御する可変絞りの使用を教示する。この絞りは、試料において焦点が合わされた光の点と光学的に共役するように像平面に配置される。アイリス絞りは上述の専門用語では像平面ストップである。この像平面ストップは、焦点が合わされた点の外側に位置する試料の領域からの光を遮る機能を持つ。このようなストップがあれば、走査型顕微鏡は共焦点顕微鏡として機能する。ホワイトはまた、共焦点顕微鏡内の試料から出てくる放射光を波長に従って２つ以上のビームに分割することを教示しているが、この分割は色反射器によって行なわれる。この設計は、主に同じ試料内に異なる蛍光発光色をもつ複数の蛍光染料を同時に投影する場合に多くの応用例があることを証明した。

ブラーケンホフ（Brakenhoff）は、Ｔ．ウィルソン（T. Wilson）によって編集された「共焦点顕微鏡法（Confocal Microscopy）」（アカデミックプレス社（Academic Press）、１９９０）の１８９頁に掲載された図において、スペクトロメータが、ホワイトの色反射器の代替品として走査型共焦点顕微鏡とともにいかに用いられ得るかを示した。この利点は、検出器に伝わる光の波長が連続した範囲から選択可能であることである。スペクトロメータへの入射開口部が上述に規定される開口平面に配置されなければならないことは、光学素子の当業者には明らかである。このようにしなければ、スペクトロメータによる放射光の色の識別が像平面におけるすべての点に等しく適用され得ない。

出願人の知る限りでは、この発明に最も近い先行技術は、恐らく、スペクトロメータが「共焦点蛍光顕微鏡に適した形である」と記載されるエンゲルハルト（Engelhardt）（米
国特許第５，８８６，７８４号）の先行技術である。このスペクトロメータは、この発明に対する先行技術として添付の図面の図１に示される。図１は、エンゲルハルトの米国特許の図１と図３との組合せから得られたものである。

添付の図面の図１を参照すると、共焦点顕微鏡１はレーザ２を含み、当該レーザ２は光のビーム３を放出し、当該光のビーム３はリフレクタ４によって反射され、こうしてフィルタ５およびレンズ６を通過し、当該レンズ６が当該ビームの焦点を開口部または絞り７に合わせる。当該ビームはそこから色ビームスプリッタ８に進み、そこで当該ビームの一部がレンズ９を通り走査鏡１０に反射される。当該ビームは走査鏡１０からアイピースレンズ１１と対物レンズ１２とに進み、対物レンズによって試料１３に焦点が合わされる。試料１３から放出された光は装置を通り元の経路をたどって色ビームスプリッタ８に戻り、ここでビームの一部は、レンズ９により経路１４に沿って第２の開口部１５に焦点が合わされる。エンゲルハルトはこの顕微鏡を共焦点顕微鏡と称したが、これについては実際には、絞り７および１５における開口部が各々、試料１３上の光の点と共役しているはずであり、上述の説明から、これらがともに共役の像平面に位置するはずであることが明らかである。

エンゲルハルトの発明は、図１の絞り１５の左側に位置する部分に示される。これは、プリズムまたはグレーティングなどの分散光学成分の形をとるスペクトロメータを含み、その中に（１５における共焦点開口部を既に通過した）光のビームが進み、その光のビームは色の異なる扇形のビームに分散され、マスク１７およびリフレクタ１８によっていくつかの部分に分けられて、その一部分が検出器１９に進み、異なる波長範囲に対応する別の部分が２２における別の検出器に進む。図１の参照番号２０および２１は不透明なスクリーンを示し、当該不透明なスクリーンは、スペクトル的に分散されて検出器２２に伝わるビームをいくらか遮断するよう直線的に平行移動することができる。エンゲルハルトはこの点について言及していないが、マスクが、すべての波長のために、開口平面またはその同等物に位置するかまたはそれに近接して位置するはずであり、顕微鏡の像平面には絶対に位置しないはずであることが当業者には明らかである。この設計原理に従わない場合、スペクトル分離が顕微鏡像のいくつかの部分と他の部分とに別々に適用されるだろう。また、共焦点開口部を大きくするとスペクトル分解能に悪影響が及ぼされるだろう。

エンゲルハルトの発明は十分に機能するが、以下の不利益を被る。彼の特許に特定されるように一連のマスクおよびバッフルが用いられる場合、これら一連のマスクおよびバッフルは理想的な性能に必要とされるのと同じ開口平面には位置し得ない。また、彼が教示するように、複数のマスクにおけるスリットの幅および位置をともに変えることができる場合、独立した多くのリニアアクチュエータが必要とされる。これらのリニアアクチュエータは低速かつ高価であり、制御および解釈を複雑にしてしまう。後者は、エンゲルハルトの好ましい実施例におけるように分散要素がガラスプリズムである場合に特に深刻であり、この場合、分散角度が異常であり、ガラスタイプの単純な物理的法則および特徴には従わない。これは、異常な分散を補償するために各モータ位置に計算された補正を適用することを必要とする。最終的に、複数の検出器を用いると、異なる波長の光を同時に検出するのには有利であるが、安価または小型の機器の製造を妨げる。

この発明はこれらの問題を克服することを目的とする。これは、すべての点走査型共焦点顕微鏡に適用可能であるが、発光経路に望遠鏡を含むものと用いれば最良に機能する。このような望遠鏡は共焦点顕微鏡法の技術のうち周知の部分である。

発明の概要
この発明の一局面に従うと、走査型光学顕微鏡で用いるためのスペクトル識別装置が提供される。当該スペクトル識別装置は、分散手段と回転可能部材を含む周波数選択手段とを含み、当該回転可能部材は、当該部材の回転により当該装置によって透過された光の周波数を制御する形をとる。当該装置は好ましくは周波数選択手段から光を受取る検出器を含む。

当該（または各）回転可能部材は好ましくは分散手段の後ろの開口平面に配置されるが、ただし、これは、回転可能部材の外周部がカム従動子によって係合されるカム面を設けるよう形作られ、カム従動子の運動により当該装置によって透過される光の周波数が制御される場合、必須ではない。

単一の回転可能部材が光を遮断するかまたは透過するよう選択的に作用する場合、当該部材は所要の光の遮断または透過をもたらすよう形成されるかまたは形作られる。これは、回転可能部材に不透明領域と透過領域とを備え付け、他の不透明な回転可能部材に１つ以上の光透過開口部を備えるか、または、回転可能部材を通り過ぎる光の通路を制御するよう回転可能部材の外周部を形作ることによって達成され得る。

１対の回転可能部材が用いられる場合、これらは、同じ軸を中心にして、または間隔をあけて平行に配置された軸を中心にして回転し得る。当該部材が協働すると、たとえば光透過スロットを間に規定するよう形作られた当該部材の外周部によって所要の光遮断および透過がもたらされる。

当該または各回転可能部材は円板状の形をした部材であってもよく、当該または各部材は、（たとえばラスタ走査における線の切換を容易にするよう高速で）連続的に回転可能であるか、または割出しされた位置間で段階的に回転可能である。この回転により光の特定の周波帯が透過され得、この周波帯は角回転によって異なり得るかまたは一定であり得る。

この発明の別の局面に従うと、走査型光学顕微鏡におけるスペクトル識別の方法が提供される。当該方法は、光を分散させ、かつ、回転部材の形状により透過された光の周波数が制御される周波数選択手段に当該光を通すステップを含む。

この発明の好ましい実施例においては、当該顕微鏡は、（図１の１４に対応する）放出光経路に望遠鏡が備え付けられた共焦点顕微鏡である。当該望遠鏡は、対物レンズの後部焦点平面と共役し、はるかに小さな対物レンズの後部焦点平面の像を含む開口平面を作り出すように、試料から出てくる光に作用する。この像は、望遠鏡の射出瞳に対応しているが、スペクトロメータに対する入射瞳としての役割を果たす。スペクトロメータはこの像から出る光を受取り、プリズム、回折格子または他の分散手段を通る光の通路によって波長に従って当該光を分散させる。各波長の光の焦点を合わせる（レンズなどの）手段も設けられる。連続した一連の波長を含む白色光が分散手段に入る場合、望遠鏡の射出瞳の無限の一連の像を含む虹状のすじが形成される。当該すじは顕微鏡における他の開口平面と共役した開口平面に位置する。

周波数選択手段は、孔のあけられた薄いディスク、透明な領域を備えた不透明なディスクまたはいくつかのこのようなディスクのうち最も単純な実施例にあり、分散要素の後ろに、かつ、異なる波長の光が検出器に入るのが穿孔によって制御されるようにすじを含む開口平面に配置される。このようなディスクは極めて安価に製造可能であり、単一の安価な回転モータまたは少数のこのようなモータによって制御可能であり、これにより、エンゲルハルトのリニアアクチュエータよりもはるかに高速で波長を切換えることができる。
ディスクを一定の角度位置に回転させることにより、ステップごとに検出の波長を変えることが可能となる。当該ディスクはまた、高速の切換を実現するために連続的に回転させられるかまたは角度回転振動にさらされてもよく、こうして、高速で位置を交互にし得るかまたはこのような一連の位置を通して走査し得る。

ディスクにおける穿孔の位置、形状および寸法を計算することにより、ガラスプリズムにおける異常な分散効果の補正が可能となるか、または波長による検出器感度のばらつきが補償される。穿孔または他のマーカが、ディスク上、または同じ軸上に装着されるかもしくは当該ディスクと連係して移動する装置上に随意に設けられることにより、ディスク位置を電子的に決定することが可能となる。類似の穿孔またはマーカが、共焦点顕微鏡におけるレーザまたは他の光源からの入射光を切換えるのに役立つよう随意に設けられる。

この発明は、添付の図面に関連して例示の目的でさらに説明される。

詳細な説明
図２を参照すると、（３１〜３７の参照番号が付された構成要素で示される）スペクトル識別装置が共焦点顕微鏡１に示される。当該共焦点顕微鏡１は、図１における同様に番号付けされた構成要素に対応する走査構成要素２〜１３を有する。図２には、レンズ２３および２４からなるケプラー式望遠鏡に入射する光が示される。光入射レンズ２３は図１の光ビーム１４に相当する。これは、走査型顕微鏡１における試料１３によって放出される光を含む。望遠鏡は、標準的な光学専門用語に従うと開口平面である平面２５において、走査型顕微鏡の対物レンズの後部焦点平面の焦点の合った像を生成する。望遠鏡によってこうして形成された後部焦点平面の像は、対物レンズの実際の開口寸法と比べて極めて小さくなる。光ビーム２６がこの縮小された像から絞り２８に進み、便宜上リフレクタ２７によって偏向される。絞り２８は、顕微鏡が共焦点顕微鏡として機能する必要がある場合、当該絞り２８を閉じて共焦点開口部を設けることができる像平面に位置する。光の一部分が絞り２８を通過して、その焦点距離だけ平面２５から離されている正レンズ２９に入る。幾何光学の法則に従うと、開口平面２５における小さな像から拡散するビーム２６がレンズ２９によって実質的に平行にされ、当該光が平行なビーム３０としてプリズム３１または他の分散手段へと進む。個々の波長の光は、平行なビームとして、但し他の波長をもつ類似のビームに対してある角度をなして進み続ける。図２には３つの異なる波長をもつ光が示される。３つの異なる波長をもつ光が正レンズ３２に進むと、当該正レンズ３２が平行なビームを３３、３４および３５におけるそれぞれの焦点に合わせる。各焦点には、開口平面２５における像の像が存在する。これらおよび他の波長の像は中継された開口平面に位置し、ここには、軸３７によって規定された中心軸を中心にして回転可能なセレクタディスク３６が配置されている。当該セレクタディスク３６は不透明な領域と透明な領域とを有し、軸３７を中心とした回転により、当該ディスク３６上における異なる半径方向の距離に対応する異なる波長の光が、ディスクを通過し得るかまたは遮断され得る。ディスク３６を通過し得る光は、レンズ３８によって随意に集中されて検出器３９に進む。

セレクタディスク３６の３つの異なる実施例が図３に示される。ここでは、ディスクの不透明な領域は斜めの平行線模様で示されている。１３個の長方形の孔を備えたディスク４０が示されるが、その数は任意である。長手の長方形の領域４１を部分的に覆うディスク４０が示され、当該長手の長方形の領域４１は図２の３３、３４および３５などの分散した像のすじに対応する。ディスク４０が４１における照明のすじに対して示される位置にあれば、１つの短い帯域における波長だけがスロット４８を介して検出器３９に進むことが可能となる。軸３７によって規定される回転軸を示す中央の円を中心にしてディスクを回転させることにより、異なるスロットが照明された領域にもたらされる。ディスク４
０の図に示されるように、スロットを螺旋形に配置することにより、連続した長くなる波長または短くなる波長が検出のために中に入ることが可能となり得る。各スロットの半径範囲から光の通過帯域の幅が決定される。螺旋の正確な形状は、ディスクの等しい角度ずれが波長の点で通過帯域の中心の等しいずれをもたらすよう随意に選択される。これにより、ディスクがプリズム３１のガラスの非線形の分散を補償することが可能となる。代替的には、半径方向のスロット幅は、検出器のスペクトル感度のばらつきを波長に従って補償するよう選択される。ディスク４０上の４９に示されるように、２つ以上のスロットが単一の半径方向の線上に随意に配置されることにより、２つの異なる周波帯における検出が可能となる。４９における２つのスロット間における不透明な材料の薄いブリッジは、レーザなどの波長の非常に制限された１つの範囲を遮断するが、これは、強いレーザ源が用いられるが近傍の波長で放出された信号が弱いものである蛍光顕微鏡法および他の形式の顕微鏡法においては特に有利である。

ディスク４２は異なる実施例であり、途切れない螺旋形のスロット５０がディスクに形成されている。これにより、ディスクが回転し透過ウインドウが分散した光照射野４３にわたって移動すると、スペクトルを通じて検出周波帯を連続的に走査することが可能となる。

図３に示される構成要素４４および４５を同じ軸上で組合せて、螺旋形のスロットを備えた複合ディスク４６を設ける。この異なる実施例においては、部分４４および４５の相対的な回転を用いてスロット幅を変え、こうして４７において光から選択される通過帯域を変え、複合ディスク４６の回転により、スペクトル内における検出の中心波長の位置を変える。

図４はセレクタディスクのさらなる実施例を示す。螺旋形のディスク５１および５３は平行であるが空間的にずらされた別々の軸を中心にして回転可能であり、両方のディスクは、５２においてスペクトル的に分散された光のすじを制御するよう形作られた外周部を有する。軸を別々にすることにより、ディスク４６に対するディスクのモータ駆動が単純化される。参照番号５４、５５および５６は類似の構成を示すが、螺旋形の向きが逆の外周部を備える。

参照番号５７および５８はディスクおよび光照射野をそれぞれ示し、そのディスクの縁端のプロファイルは２つの螺旋形を有する。５９および６０は類似の構成を示すが、４つの螺旋が１つのディスクに組合されている。ディスク５７および５９は単独で用いられるかまたは４６、５１および５３と同様に他のディスクと組合せて用いられて、所与のモータ速度のために波長のスペクトルを通じてより高速の走査をもたらし得る。

この発明はまた、ディスクまたは当該ディスクに機械的に接続された要素を含む。当該ディスクまたは当該要素は、検出された周波帯の選択以外の機能を有する（ホール効果センサなどの電子センサを含む）スロットまたはマーカを備える。これらは、（たとえばスロットの付いた光スイッチにより）ディスクのホーム位置を識別する単純な穿孔、またはディスク位置を明瞭に読取ることを可能にするエンコーダ領域、または顕微鏡に対する照明の直接的なシャッタもしくは間接的な切換えを可能にするスロットもしくはマーカを含む。たとえば、検出波長を制御する同じディスクが、この発明に従って、いくつかのレーザのうち適切なレーザに切換え得、同時に検出周波帯を切換え得る。

また、透過領域が光学フィルタ特性を有しているディスクが含まれるが、当該透過領域はディスクの材料に組込まれるか、またはディスクに取付けられディスクとともに回転する。

この発明はまた、スペクトル領域がディスクによって直接規定されるのではなくカム従動子によって規定される形を含む。当該カム従動子は回転カムのプロファイルを追従し、これにより、スペクトル的に分散された光の可変部分を遮断するように平行移動させられる。

また、この発明にはいくつかの動作モードが含まれる。これらは連続的な割出しされた位置へのディスクの回転運動を含む。すなわち、一定の角度寸法の回転ステップごとに異なるセレクタディスク位置を連続的に表示することや、検出周波帯のより高速な切換、たとえばラスタ走査システムにおける線の切換えを容易にするようセレクタディスクを継続的に回転させることを含む。ディスクが連続的に、または明確に角度増分的に角振動の態様で回転して、たとえば２つ以上の検出周波帯を繰り返し交互にし得ることも予想される。好ましい動作モードにおいては、レーザなどからの単色光が分光システムへと反射される間、ディスク実施例４６、５１、５４、５７および５９が連続的に回転している。ディスクが回転すると、この公知の波長の光のブレイクスルー点が検出され、ここから、機器の波長スケールが自動的に較正され得る。

この手段により、複合的な実施例の各ディスクが独立して較正され得る。

また、この発明には、セレクタディスクの後に光経路に配置される複数の検出器を用いる顕微鏡システムが含まれる。これは、色分離の他の手段がセレクタディスクと組合せて用いられるシステム、たとえば、ディスクの表面に固定されるかもしくは接着されるカラーフィルタを用いることにより色分離の手段がセレクタディスクの前もしくは後ろまたはセレクタディスク上にさえも配置され得るシステムを含む。

既に説明された先行技術を示す図である。 共焦点顕微鏡で用いられる、この発明に従ったスペクトル識別装置の好ましい実施例を示す図である。 図２のスペクトル識別装置のさまざまな回転可能部材を示す図である。 図２のスペクトル識別装置のさまざまな回転可能部材を示す図である。

Claims (12)

1. 走査型光学顕微鏡において用いるためのスペクトル識別装置であって、前記スペクトル識別装置は分散手段と回転可能部材を含む周波数選択手段とを含み、前記回転可能部材は、前記部材の回転により当該装置によって透過された光の周波数を制御する形をとる、スペクトル識別装置。
2. 前記装置は、前記周波数選択手段から光を受取るための検出器を含む、請求項１に記載のスペクトル識別装置。
3. 前記または各回転可能部材は、前記分散手段の後ろの開口平面に配置される、請求項１または２に記載のスペクトル識別装置。
4. 前記または各回転可能部材は、カム従動子によって係合されるカム面を設けるよう外周部が形作られており、前記カム従動子の運動により、前記装置によって透過される光の周波数が制御される、請求項１または２に記載のスペクトル識別装置。
5. 前記回転可能部材は、光を選択的に遮断または透過するよう形成されるかまたは形作られる、請求項１から４のいずれかに記載のスペクトル識別装置。
6. 前記回転可能部材が不透明領域と透過領域とを有し、他の不透明な回転可能部材に１つ以上の光透過開口部を備える、請求項５に記載のスペクトル識別装置。
7. 前記回転可能部材は、前記回転可能部材を通り過ぎる光の通路を制御するよう成形された外周部を有する、請求項５に記載のスペクトル識別装置。
8. １対の回転可能部材が用いられ、同じ軸または間隔をあけて平行に配置された軸を中心にして回転し、当該部材は所要の光遮断および光透過をもたらすよう協働する、請求項１から４のいずれかに記載のスペクトル識別装置。
9. 前記または各回転可能部材は円板状の形をした部材であり、前記または各部材は連続的に回転可能であるかまたは割出しされた位置間で段階的に回転可能である、請求項１から８のいずれかに記載のスペクトル識別装置。
10. 前記または各回転可能部材の回転により光の特定の周波帯が透過され、この周波帯は角回転によって異なり得るかまたは一定であり得る、請求項１から９のいずれかに記載のスペクトル識別装置。
11. 走査型光学顕微鏡におけるスペクトル識別の方法であって、光を分散させ、かつ、回転部材の形状により透過された光の周波数が制御される周波数選択手段に光を通すステップを含む、方法。
12. 同じ軸を中心にして、または間隔をあけて平行に配置された軸を中心にして前記部材を回転させるステップをさらに含む、請求項１１に記載の走査型光学顕微鏡におけるスペクトル識別の方法。

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