JP2003098439A

JP2003098439A - 観察切り替え可能な顕微鏡

Info

Publication number: JP2003098439A
Application number: JP2001290943A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Kono; 芳弘河野
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2003-04-03
Also published as: US20030058530A1; US20050207005A1

Abstract

(57)【要約】【課題】同じ対物レンズを用いて全反射顕微鏡観察、
蛍光顕微鏡観察、反射干渉顕微鏡観察間の切り替えが可
能な高性能な顕微鏡。【解決手段】対物光学系１と、対物光学系１を経た標
本Ｓからの光を撮像素子１０上に結像する結像光学系９
とを備え、対物光学系１から結像光学系９に至る観察光
路中に、照明光学系からの照明光を反射して対物光学系
１に入射させ、対物光学系１を経た標本Ｓからの光を結
像光学系９に透過させる光学部材７を備えた顕微鏡にお
いて、照明光学系中には、対物光学系１の瞳面上の照明
光集光位置を光軸に垂直な方向で調整する機構１５〜１
８が設けられ、観察光路中には、対物光学系１の瞳面上
での照明光集光位置に応じて観察波長を選択する波長選
択手段１２が設けられている観察切り替え可能な顕微
鏡。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は、観察切り替え可能
な顕微鏡に関し、特に、同じ対物レンズを用いて全反射
顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、反射干渉顕微鏡観察の切
り替えが可能な高性能な顕微鏡に関するものである。

【従来の技術】これまでに数々の顕微鏡観察法が開発さ
れてきたが、それらを１台の顕微鏡で簡単に切り替えて
分子の検出や生物、細胞、卵等を観察するのは容易では
なかった。例えば、蛍光顕微鏡（Fluorescence Microsc
opy ）から全反射顕微鏡（Total Internal Reflection
Fluorescence Microscopy 。例えば、特開平９−１５９
９２２号公報）に切り替えて観察するとか、又は、全反
射顕微鏡から反射干渉顕微鏡（Interference Reflectio
n Microscopy又はReflection Contrast Microscopy。例
えば、ドイツ特許公開明細書第２，６２６，５４０号）
に切り替えるとか、蛍光顕微鏡から全反射顕微鏡に切り
替えるとかの切り替えを行うのは容易ではなかった。ま
た、多波長でこれらの観察を切り替えるのも非常に困難
を伴う作業であった。しかし、同じ標本を観察し続けた
い場合、例えば、ある分子に他の分子を加えた場合の変
化や、細胞に刺激を加えた場合の刺激の前後での変化の
観察や、長時間タイムラプス観察を行う場合には、簡単
に各種観察方法が切り替えられて、ベストな光学性能が
得られることが求められる。また、多波長で観察が簡単
に切り替えられことが求められている。

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような現
状に鑑みてなされたものであり、その目的は、同じ対物
レンズを用いて全反射顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、反
射干渉顕微鏡観察間の切り替えが可能な高性能な顕微鏡
を提供することである。

【課題を解決するための手段】上記目的を達成する本発
明の観察切り替え可能な顕微鏡は、対物光学系と、前記
対物光学系を経た標本からの光を撮像素子上に結像する
結像光学系とを備え、前記対物光学系から前記結像光学
系に至る観察光路中に、照明光学系からの照明光を反射
して前記対物光学系に入射させ、前記対物光学系を経た
標本からの光を前記結像光学系に透過させる光学部材を
備えた顕微鏡において、照明光学系中には、前記対物光
学系の瞳面上の照明光集光位置を光軸に垂直な方向で調
整する機構が設けられ、かつ、前記観察光路中には、前
記対物光学系の瞳面上での照明光集光位置に応じて観察
波長を選択する波長選択手段が設けられていることを特
徴とするものである。この場合に、対物光学系の瞳面近
傍に全反射顕微鏡観察の際の全反射戻り光を遮断する全
反射戻り光遮断手段が配置されていることが望ましい。

【発明の実施の形態】まず、本発明の観察切り替え可能
な顕微鏡の基本的な考え方を説明する。最高の光学性能
を蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡と反射干渉顕微鏡で得るた
めには、これまでは、異なるＮＡの対物レンズを用いな
ければならなかった。まず、最高の蛍光顕微鏡像を得る
には、ＮＡ（開口数）１．３３以上１．３８未満の対物
レンズが必要である。なぜなら、落射蛍光照明を行う場
合、標本とカバーガラスの間で励起光が全反射してしま
うと、この反射光が像方向への戻り光となるので、像の
コントラストを落とすという問題が発生してしまう。通
常、蛍光顕微鏡には、励起光のみを透過するバンドパス
フィルター（励起フィルター）が入っている。しかしな
がら、全反射した明るい励起光は、励起フィルターでは
完全にカットされず、わずかに漏れて像面まで到達し、
像のコントラストを低下させる。また、全反射顕微鏡の
場合は、標本とカバーガラスの間で全反射を起こさせて
エバネッセント波（ＥｖａｎｅｓｃｅｎｔＷａｖｅ）
を発生させるので、対物レンズのＮＡは１．３８以上の
ものが必要になる。標本が培養液中の細胞の場合、ＮＡ
が１．３８未満の対物レンズを用いると、対物レンズ側
から全反射照明を行うことは非常に困難である。逆に、
反射干渉顕微鏡像をコントラスト良く観察しようとする
と、照明光の全反射成分をカットしなければならない。
その場合は、ＮＡ１．３８未満で照明しなければ、コン
トラストの良い反射干渉顕微鏡像は観察できない。以上
のような点を鑑みると、少なくとも蛍光照明で標本観察
し、かつ、切り替えてエバネッセント波で照明して標本
観察を行うには、対物レンズのＮＡは１．４以上が必要
である。そこで、本発明では、ＮＡが１．４以上の対物
レンズを用いる。なお、ＮＡ１．４１以上の対物レンズ
を用いると、照明光学系のＮＡを切り換えることによ
り、全反射顕微鏡、蛍光顕微鏡や反射干渉顕微鏡の各観
察が良好に行える。なお、顕微鏡の対物レンズは、開口
数（ＮＡ）を最大で設計しようとすると、最大でＮＡ
２．０程度まで上げることができる。この開口数を超え
ると、設計に使える硝子や、また、イマージョンオイル
として使える物質が非常に限定されてしまう。その結
果、対物レンズの透過率を広い範囲で高くすることが困
難であったり、イマージョンオイルの透過率を高くする
ことができなくなる。以下、そのために実施例を図面を
参照にして説明する。図１に本発明の実施例１の顕微鏡
システムの構成を示す。また、図２にそのための光源部
の構成を示す。この実施例は、照明光としてレーザ光を
用いる場合の例である。照明光としてレーザ光は、シン
グルモード光ファイバー２の射出端３から射出される。
そして、コレクターレンズ４、視野絞り５、照明レンズ
６を経て、倒立顕微鏡の観察光路中に斜めに配置された
ダイクロイックミラー７に入射する。ダイクロイックミ
ラー７で反射されたレーザ光は、対物レンズ１に入射
し、対物レンズ１の上方に配置されたペトリディッシュ
（シャーレ）５０中に配置された標本Ｓを下方から照明
する。標本Ｓで発生した蛍光は対物レンズ１に入射し、
ダイクロイックミラー７を透過して、ダイクロイックミ
ラー８を経て結像レンズ９に入射する。そして、撮像素
子１０上に標本Ｓの蛍光像を形成する。ダイクロイック
ミラー８で分けられた別の光は別の結像レンズ９’に入
射し、別の撮像素子１０’上に標本Ｓの蛍光像を形成す
る。なお、撮像素子１０としては、ＣＣＤ、ＳＩＴ管、
イメージインテンシファイアー付きＣＣＤ等が用いられ
る。また、ダイクロイックミラー７、８の代わりにハー
フミラー７’を用いれば、標本Ｓの表面で散乱された光
による観察ができる。また、干渉像を得ることもでき
る。ダイクロイックミラー７は、照明光波長（励起光）
を反射し、標本Ｓで発生した蛍光波長を透過する。上記
の構成において、光ファイバー２の射出端３はコレクタ
ーレンズ４の略前側焦点面上に配置されている。射出端
３から射出された光は、照明レンズ６によって対物レン
ズ１の瞳面に集光（結像）する。また、視野絞り５が標
本Ｓの面に結像するように、コレクターレンズ４と照明
レンズ６の焦点距離、コレクターレンズ４、照明レンズ
６、視野絞り５、対物レンズ１の位置が決められてい
る。そして、光ファイバー２の射出端３は移動片１６に
取り付けられている。この移動片１６は、断面がコの字
の固定枠１５内で配置されている。また、移動片１６は
固定枠１５内で拡張性のバネ１７の一端と調節ネジ１８
の先端の間に挟持されている。したがって、調節ネジ１
８を回転させると、調節ネジ１８自体が照明系光軸に垂
直な方向に移動する。そして、その移動に伴って移動片
１６が移動する。この結果、照明系光軸に垂直な方向に
おける光ファイバー２の射出端３の位置が調節可能にな
る。また、光ファイバー２の射出端３とは反対側の端部
は、図２に示すような光源部に接続されている。この光
源部は、波長４８８ｎｍの光を発振するＡｒレーザ２１
と、波長５４８ｎｍの光を発振するＨｅ−Ｎｅレーザ２
２と、波長５３２ｎｍの光を発振するＹＡＧ−Ｎｄレー
ザ２３の３本のレーザ２１〜２３を備え、これらの３つ
の波長のレーザ光は、波長５３２ｎｍの光を反射するミ
ラー２６、波長５３２ｎｍの光を透過し波長５４８ｎｍ
の光を反射するダイクロイックミラー２５、波長４８８
ｎｍの光を透過し波長５３２〜５４８ｎｍの光を反射す
るダイクロイックミラー２４により１つの光束として合
成され、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏ−ＯｐｔｉｃＴｕ
ｎａｂｌｅＦｉｌｔｅｒ：音響光学型波長可変フィル
ター）２７に入射する。なお、このＡＯＴＦ２７を制御
することにより、光ファイバー２に結合される波長が選
択されるようになっている。また、ＡＯＴＦ２７はシャ
ッターとしての機能も担い得るものである。また、対物
レンズ１は、図３（ａ）に示すように、例えばＮＡ１．
４３の顕微鏡対物レンズ４０が対物胴（鏡筒）４１内に
保持されている。また、顕微鏡対物レンズ４０の後側焦
点面近傍に図３（ｂ）に示すようなガラス板４２が光軸
の周りで回転調節可能に取り付けられている。ガラス板
４２には、顕微鏡対物レンズ４０のＮＡが１．３８とな
る位置４４より外側の半周以上の領域に遮光膜４３が設
けられいる。この遮光膜４３の位置を変えるには、鏡筒
４１の外周に設けられた回転リング４５を回転すればよ
いようになっている。なお、遮光膜４３としては、光吸
収膜、光反射膜等がある。光吸収膜の方が好ましい。そ
して、光ファイバー２の射出端３からダイクロイックミ
ラー７に至る照明光路中には、フィルターホイール１１
が配置され（図１の場合は、コレクターレンズ４と視野
絞り５の間）、また、ダイクロイックミラー又はハーフ
ミラー８から撮像素子１０、１０’に至る観察光路中に
は、フィルターホイール１２、１２’が配置されている
（図１の場合は、結像レンズ９、９’の入射側）。フィ
ルターホイール１１、１２、１２’中に配置され選択的
に光路中に挿入可能なフィルターについては、後記す
る。以上において、撮像素子１０、撮像素子１０’の制
御はパソコン３０に接続されたコントローラー３１によ
り行われる。また、光ファイバー２の射出端３の位置調
節、フィルターホイール１１、１２、１２’のフィルタ
ー選択、ダイクロイックミラー７とハーフミラー７’の
交換、ＡＯＴＦ２７の制御は、パソコン３０に接続され
たコントローラー３２により行われるようになってい
る。すなわち、コントローラー３２を介して調節ネジ１
８を不図示のモータ等で回すことにより、光ファイバー
２の射出端３の位置を、照明光がペトリディッシュ５０
の底に設けたカバーガラスの標本Ｓ側界面で全反射する
位置（以下、全反射照明位置とする。）と照明光が標本
Ｓを透過する位置（以下、透過照明位置とする。）との
間で連続的に移動させることができる。また、コントロ
ーラー３２を介してあるいは手動で、ダイクロイックミ
ラー７とハーフミラー７’を交換する。また、同様にコ
ントローラー３２を介して、ＡＯＴＦ２７を制御するこ
とにより、照明に用いるレーザ光の波長を選択すること
ができる。さらに、コントローラー３２を介してあるい
は手動で、フィルターホイール１２、１２’を回転して
観察に用いるバンドパスフィルターを選択することがで
きる。また、コントローラー３２を介してあるいは手動
で、フィルターホイール１１を回転してディフューザー
（フロスト）やシャッターを照明光路中に挿入すること
ができる。このような構成において、全反射顕微鏡、蛍
光顕微鏡、反射干渉顕微鏡としての動作及び切り替えは
次のようになる。全反射顕微鏡像を観察する場合は、ま
ず、ＡＯＴＦ２７を制御して照明に用いるレーザ光の波
長を選択する。そして、光ファイバー２の射出端３の位
置を、全反射照明位置に移動する。照明光を観察光路中
に導入するために、ダイクロイックミラー７を挿入す
る。また、フィルターホイール１２、１２’を回転させ
て観察光路中に挿入するバンドパスフィルターを蛍光波
長を透過するものに選択する。ここで、撮像素子１０と
撮像素子１０’で観察する蛍光像の波長が異なる場合に
は、フィルターホイール１２で選択するバンドパスフィ
ルターとフィルターホイール１２’で選択するバンドパ
スフィルターとは、透過する波長のバンドが異なる。以
上のように光ファイバー２の射出端３の位置を全反射照
明位置に調整すると、射出端３から出た光束は、コレク
ターレンズ４、視野絞り５、照明レンズ６、ダイクロイ
ックミラー７を経て、対物レンズ１の瞳の最周辺のＮＡ
１．３８以上の位置（ガラス板４２の位置４４より外
側）近傍に結像する。そして、ガラス板４２の透過部を
通過して顕微鏡対物レンズ４０により略平行光束化さ
れ、ペトリディッシュ５０の底に設けたカバーガラスの
標本Ｓ側界面で全反射する角度で対物レンズ１から射出
する。この全反射光は再び対物レンズ１に入射し、顕微
鏡対物レンズ４０によりガラス板４２の遮光膜４３上に
再結像して遮断される。よって、この全反射光は蛍光像
観察のコントラストを低下させるノイズ光にはならな
い。一方、全反射により発生したエバネッセント波は標
本Ｓの表面を薄く照明する。これにより、標本Ｓのエバ
ネッセント波照明領域から蛍光が生じる。この蛍光はガ
ラス板４２の遮光膜４３により遮断されずに対物レンズ
１から射出し、ダイクロイックミラー７を透過して、ダ
イクロイックミラー８により２つに分けられる。フィル
ターホイール１２、１２’中のバンドパスフィルターを
透過し、それぞれ撮像素子１０、撮像素子１０’上に全
反射蛍光顕微鏡像を形成する。この像はコントローラー
３１の制御により撮像・記録される。また、反射干渉顕
微鏡像を得たい場合は、ＡＯＴＦ２７を制御してその照
明に用いるレーザ光の波長を選択する。そして、光ファ
イバー２の射出端３の位置を、透過照明位置、すなわ
ち、照明のＮＡが１．２程度又はそれ以下になるような
位置に調整する。照明光を観察光路中に導入するため
に、この場合は、ハーフミラー７’を挿入する。また、
フィルターホイール１２、１２’を回転させて、観察光
路中に挿入するバンドパスフィルターを照明光を透過す
るものに選択する。以上のように光ファイバー２の射出
端３の位置を透過照明位置に調整すると、射出端３から
出た光束は、コレクターレンズ４、視野絞り５、照明レ
ンズ６、ハーフミラー７’を経て、対物レンズ１の瞳の
ＮＡ１．２程度以下の位置に結像する。そして、ガラス
板４２の中心の透過部を通過して顕微鏡対物レンズ４０
により略平行光束化される。この光束は、ペトリディッ
シュ５０の底に設けたカバーガラスの標本Ｓ側界面で一
部がフレネル反射され、残りは透過して標本Ｓの表面で
反射される。両反射光は再び対物レンズ１に入射して遮
光膜４３で遮断されることなく対物レンズ１から射出
し、ハーフミラー７’を透過して、ハーフミラー８によ
り２つに分けられる。フィルターホイール１２、１２’
中のバンドパスフィルターを透過し、それぞれ撮像素子
１０、撮像素子１０’上に反射干渉顕微鏡像を形成す
る。この像はコントローラー３１の制御により撮像・記
録される。なお、ハーフミラー８を取り除けば、明るい
反射干渉像が得られる。また、蛍光顕微鏡像を得たい場
合は、ＡＯＴＦ２７を制御してその照明に用いるレーザ
光の波長を選択する。そして、光ファイバー２の射出端
３の位置を透過照明位置に調整する。ただし、反射干渉
のときとは異なり、全反射を起こさないような角度であ
るＮＡ１．３８未満で照明光が標本Ｓに直接達するよう
な位置に調整する。照明光を観察光路中に導入するため
に、ダイクロイックミラー７を挿入する。また、フィル
ターホイール１２、１２’を回転させて観察光路中に挿
入するバンドパスフィルターを蛍光波長を透過するもの
に選択する。ここで、撮像素子１０と撮像素子１０’で
観察する蛍光像の波長が異なる場合には、フィルターホ
イール１２で選択するバンドパスフィルターとフィルタ
ーホイール１２’で選択するバンドパスフィルターと
は、透過する波長のバンドが異なる。以上のように光フ
ァイバー２の射出端３の位置を透過照明位置に調整する
と、射出端３から出た光束は、コレクターレンズ４、視
野絞り５、照明レンズ６、ダイクロイックミラー７を経
て、対物レンズ１の瞳のＮＡ１．３８未満の位置に結像
する。そして、ガラス板４２の中心の透過部を通過して
顕微鏡対物レンズ４０により略平行光束化され、標本Ｓ
を透過し、標本Ｓの照明領域から蛍光が生じる。その蛍
光はガラス板４２の遮光膜４３により遮断されずに対物
レンズ１を射出し、ダイクロイックミラー７を透過し
て、ダイクロイックミラー８により２つに分けられる。
フィルターホイール１２、１２’中のバンドパスフィル
ターを透過し、それぞれ撮像素子１０、撮像素子１０’
上に蛍光顕微鏡像が形成されう。この像はコントローラ
ー３１の制御により撮像・記録される。なお、この蛍光
顕微鏡像を得る場合で、特に標本Ｓの表面をエバネセン
ト波の場合より厚く、かつ、通常の蛍光像より薄い範囲
を観察するには、照明光のＮＡを１．３８近くの限られ
た輪帯状の範囲内に限定すればよい。このようにすれ
ば、ペトリディッシュ５０の底のカバーガラスから標本
Ｓ側に出る照明光が、光軸に対して９０°に近い角度に
することができる。以上において、蛍光顕微鏡像と全反
射顕微鏡像あるいは反射干渉顕微鏡像を簡単に切り替え
る別の方法としては、フィルターホイール１１中にディ
フューザー（フロスト）を配置しておき、全反射顕微鏡
像あるいは反射干渉顕微鏡像を得る照明状態でフロスト
を照明光路中に挿入することで、蛍光顕微鏡像を観察で
きるようにすることもできる。すなわち、フロストは光
ファイバー２の射出端３から射出されたレーザ光を拡散
する。そのため、全反射顕微鏡像あるいは反射干渉顕微
鏡像を得るときの照明光路にフロストを入れると、レー
ザ光はフロストによって拡散され対物レンズ１の瞳全域
を通過して蛍光照明になる。フロストを光路から外す
と、全反射のための照明や反射干渉のための照明とする
ことができる。このようなフロストは、フィルターホイ
ール１１中に配置する代わりに、ダイクロイックミラー
７近傍にそれと共に切り替わるようにマウントしても同
様の機能が得られる。また、観察に必要なダイクロイッ
クミラー７やハーフミラー７’、フィルターホイール１
２、１２’により観察光路に挿入されるバンドパスフィ
ルターは、蛍光顕微鏡像と全反射顕微鏡像と反射干渉顕
微鏡像では異なる。そのため、ダイクロイックミラー７
やハーフミラー７’を電動で移動可能にしたり、フィル
ターホイール１２、１２’を電動で回転可能にしておけ
ば、非常に容易に各種観察法を切り替えることができ
る。また、図１の配置において、パソコン３０中には、
予め顕微鏡像の観察手順、切り替え手順を入力しておく
ことにより、コントローラー３１、３２を介して自動的
に観察法を切り替えて各種顕微鏡像を観察・記録するこ
とができる。なお、対物レンズ１に設ける遮光膜４３に
ついては、前記のようにガラス板４２のＮＡ１．３８以
上の半周以上の領域にコーティングによって形成しても
よいが、その代わりに、同様の形状の絞り部材を金属の
板で作製することもできる。また、この遮光膜４３ある
いは絞り部材としては、全反射光の戻り光を完全にカッ
トできなくても、透過率で約７０％以上をカットできれ
ば、全反射した光はかなり減衰するので、コントラスト
の良い像が得られる。また、この遮光膜４３あるいは絞
り部材は、図３（ａ）に示したような回転調整機構を有
すると、照明光の入射する方向に合わせて遮光部の位置
を調整できるので使いやすくできる。図４は実施例２の
顕微鏡システムの構成を示す図であり、この実施例２は
実施例１の変形例である。図１の場合と異なるのは、フ
ィルターホイール１１、視野絞り５が省かれ、視野絞り
５の位置（標本Ｓの面と共役で照明レンズ６の前側焦点
位置近傍）にＡＯＴＦ又はＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏ
ｐｔｉｃＭｏｄｕｌａｔｏｒ：音響光学素子）１３が
配置されており、このＡＯＴＦ又はＡＯＭ１３はコント
ローラー３２により動作制御されるようになっている点
であり、その他は図１〜図３の場合と同様である。この
実施例においては、対物レンズ１の瞳面における照明光
の結像位置の制御を、ＡＯＴＦ又はＡＯＭ１３による照
明光偏向角θを電気的に変えることによって行う。もち
ろん、光ファイバー２の射出端３の照明系光軸に対する
位置の調節と併用してもよい。ＡＯＴＦ又はＡＯＭ１３
より射出する光束の偏向角θを制御することで、射出端
３から射出した照明光の結像位置のＮＡを１．３８以上
あるいはそれ未満に調節して、蛍光照明、全反射照明、
反射干渉照明の何れかに選択できる。この場合に、ＡＯ
ＴＦ又はＡＯＭ１３をシャッターとして使うこともでき
る。ただし、この実施例では、全反射顕微鏡像あるいは
反射干渉顕微鏡像観察を得る照明状態で蛍光顕微鏡像を
観察するようにするには、ＡＯＴＦ又はＡＯＭ１３の射
出側にフロストを挿入可能に構成すればよい。以上、レ
ーザ光を照明光として用いる場合の照明光のＮＡを制御
する実施例を説明したが、次に、高圧水銀灯、高圧キセ
ノンランプ、キセノン水銀ランプ、ハロゲンランプ、メ
タルハロイドランプ等のレーザ以外の光源、通称白色光
源を用いた実施例について説明する。このような光源を
用いる場合でも照明光のＮＡを制御することができる。
図５は実施例３の顕微鏡システムの構成を示す図であ
り、この実施例３は、照明系を除くと、図１の実施例１
と同様である。上記のような白色光源２０から射出した
白色照明光は、コレクターレンズ４により集光される。
その集光位置には、照明系光軸に対して垂直な方向に位
置調節可能な絞り板２８が配置されている。その絞り板
２８の開口２９を通った照明光は、投影レンズ１４、視
野絞り５、照明レンズ６を経て、ダイクロイックミラー
７で反射され、対物レンズ１に入射する。そして、対物
レンズ１の上方に配置されたペトリディッシュ５０中に
配置された標本Ｓを下方から照明する。標本Ｓで発生さ
れた蛍光は対物レンズ１に入射し、ダイクロイックミラ
ー７を透過して、ダイクロイックミラー８を経て結像レ
ンズ９に入射する。そして、撮像素子１０上に標本Ｓの
蛍光像を形成する。ダイクロイックミラー８で分けられ
た別の光は、別の結像レンズ９’に入射し、別の撮像素
子１０’上に標本Ｓの蛍光像を形成する。なお、ハーフ
ミラー７’を用い、８をハーフミラーにすれば、標本Ｓ
の表面から散乱された光による像の観察が行える。ま
た、干渉像も得ることができる。上記の構成において、
絞り板２８は投影レンズ１４の略前側焦点面上に配置さ
れている。絞り板２８の開口２９から射出された光は、
照明レンズ６によって対物レンズ１の瞳面に集光（結
像）する。また、視野絞り５が標本Ｓの面に結像するよ
うに、投影レンズ１４、照明レンズ６の焦点距離、コレ
クターレンズ４、照明レンズ６、視野絞り５、対物レン
ズ１の位置が決められている。そして、絞り板２８は透
明移動片１６’に取り付けらている。この透明移動片１
６’は断面がコの字の底が透明あるいは開口を有した固
定枠１５’内に配置されている。また、透明移動片１
６’は固定枠１５’内で拡張性のバネ１７の一端と調節
ネジ１８の先端の間に挟持されている。したがって、調
節ネジ１８を回転させると、調節ネジ１８自体が照明系
光軸に垂直な方向に移動し、それに伴って透明移動片１
６’が移動する。この結果、照明系光軸に垂直な方向に
おける絞り板２８の開口２９の位置が調節可能になる。
絞り板２８に設けられた開口２９は、図６に示したよう
に円環の１８０°より小さい弧部分を切り取った形状を
しており、その外周の半径はこの照明系の照明領域の外
周Ｌの半径に略等しく設定されている。したがって、コ
ントローラー３２を介して調節ネジ１８を回し、絞り板
２８の位置を照明系光軸に対して垂直な方向に調節する
ことにより、対物レンズ１の瞳面に結像したときの位置
を、図６（ａ）、（ｂ）に示すように異ならせることが
できる。図６（ａ）は、その瞳の最周辺のＮＡ１．３８
以上の位置（ガラス板４２の位置４４より外側）近傍に
結像した状態で、図６（ｂ）は、ＮＡ１．３８以下の位
置（ガラス板４２の位置４４より内側）近傍に結像した
状態である。このように、瞳面に結像する位置を選択的
に調節可能にすることができる。そして、この実施例に
おいては、照明光源として白色光源２０を用いているの
で、蛍光像、干渉像何れを観察する場合も、照明光の波
長を選択する波長選択フィルター（バンドパスフィルタ
ー）を照明光路中に配置する必要がある。具体的には、
絞り板２８からダイクロイックミラー７又はハーフミラ
ー７’に至る照明光路中に、そのような波長選択フィル
ターを光路中に選択して挿入するフィルターホイール１
１が配置されている（図５の場合は、投影レンズ１４と
視野絞り５の間）。このような構成において、全反射顕
微鏡、蛍光顕微鏡、反射干渉顕微鏡としての動作及び切
り替えは次のようになる。全反射顕微鏡像を観察する場
合は、まず、フィルターホイール１１を制御して照明に
用いる照明光の波長を選択する。そして、絞り板２８の
開口２９の位置を、照明光がペトリディッシュ５０の底
に設けたカバーガラスの標本Ｓ側界面で全反射する位置
に移動調整する。照明光を観察光路中に導入するため
に、照明光波長（励起光）を反射し標本Ｓで発生した蛍
光波長を透過するダイクロイックミラー７を挿入する。
また、フィルターホイール１２、１２’により観察光路
中に挿入するバンドパスフィルターを蛍光波長を透過す
るものに選択する。ここで、撮像素子１０と撮像素子１
０’で観察する蛍光像の波長が異なる場合には、フィル
ターホイール１２で挿入するバンドパスフィルターとフ
ィルターホイール１２’で挿入するバンドパスフィルタ
ーとではその波長に応じて透過する波長のバンドが異な
るように選ばれる。以上のように絞り板２８の開口２９
の位置を全反射顕微鏡像の位置に移動調整すると、絞り
板２８の開口２９から出た光束は、投影レンズ１４、視
野絞り５、フィルターホイール１１中の波長選択フィル
ター、照明レンズ６、ダイクロイックミラー７を経て、
対物レンズ１の瞳の最周辺のＮＡ１．３８以上の位置
（ガラス板４２の位置４４より外側）近傍に結像し、ガ
ラス板４２の透過部を通過して顕微鏡対物レンズ４０に
より略平行光束化され、ペトリディッシュ５０の底に設
けたカバーガラスの標本Ｓ側界面で全反射する角度で対
物レンズ１から射出し、その全反射光は再び対物レンズ
１に入射し、顕微鏡対物レンズ４０によりガラス板４２
の遮光膜４３上に再結像して遮断されるので、この全反
射光は蛍光像観察のコントラストを低下させるノイズ光
にはならない。ここで、ペトリディッシュ５０の底のカ
バーガラスの標本Ｓ側界面での全反射により発生したエ
バネッセント波は標本Ｓの表面を薄く照明し、標本Ｓの
エバネッセント波照明領域から蛍光が生じる。その蛍光
はガラス板４２の遮光膜４３により遮断されずに対物レ
ンズ１を透過し、ダイクロイックミラー７を透過して、
ダイクロイックミラー又はハーフミラー８により２つに
分けられ、フィルターホイール１２、１２’中の観察し
ようとする蛍光波長に応じたバンドパスフィルターを透
過し、それぞれ撮像素子１０、撮像素子１０’上に全反
射蛍光顕微鏡像が結像され、コントローラー３１の制御
により撮像・記録される。また、反射干渉顕微鏡像を得
たい場合は、フィルターホイール１１を制御して照明に
用いる照明光の波長を選択する。そして、絞り板２８の
開口２９の位置を、照明光が標本Ｓを通り抜けるような
位置に、すなわち、ＮＡ１．２程度又はそれ以下になる
ような位置に絞り板２８の開口２９の位置を調整する。
照明光を観察光路中に導入するために、この場合は、ハ
ーフミラー７’を挿入する。また、フィルターホイール
１２、１２’により観察光路中に挿入するバンドパスフ
ィルターを照明光を透過するものに選択する。以上のよ
うに絞り板２８の開口２９の位置を反射干渉顕微鏡像の
位置に移動調整すると、絞り板２８の開口２９から出た
光束は、投影レンズ１４、視野絞り５、フィルターホイ
ール１１中の波長選択フィルター、照明レンズ６、ハー
フミラー７’を経て、対物レンズ１の瞳のＮＡ１．２程
度以下の位置に結像し、ガラス板４２の中心の透過部を
通過して顕微鏡対物レンズ４０により略平行光束化さ
れ、ペトリディッシュ５０の底に設けたカバーガラスの
標本Ｓ側界面で一部がフレネル反射され、残りは透過し
て標本Ｓの表面で反射され、両反射光は再び対物レンズ
１に入射して遮光膜４３で遮断されることなく対物レン
ズ１を透過し、ハーフミラー７’を透過して、ダイクロ
イックミラー又はハーフミラー８により２つに分けら
れ、フィルターホイール１２、１２’中のその反射光の
みを通過させるバンドパスフィルターを透過し、それぞ
れ撮像素子１０、撮像素子１０’上に反射干渉顕微鏡像
が結像され、コントローラー３１の制御により撮像・記
録される。また、蛍光照明にしたい場合は、フィルター
ホイール１１を制御して照明に用いる照明光の波長を選
択する。そして、絞り板２８の開口２９の位置を、全反
射を起こさないような角度であるＮＡ１．３８以下で照
明光が標本Ｓに直接達するような位置に調整する。照明
光を観察光路中に導入するために、照明光波長（励起
光）を反射し標本Ｓで発生した蛍光波長を透過するダイ
クロイックミラー７を挿入する。また、フィルターホイ
ール１２、１２’により観察光路中に挿入するバンドパ
スフィルターを蛍光波長を透過するものに選択する。こ
こで、撮像素子１０と撮像素子１０’で観察する蛍光像
の波長が異なる場合には、フィルターホイール１２で挿
入するバンドパスフィルターとフィルターホイール１
２’で挿入するバンドパスフィルターとではその波長に
応じて透過する波長のバンドが異なるように選ばれる。
以上のように絞り板２８の開口２９の位置を蛍光顕微鏡
像の位置に移動調整すると、絞り板２８の開口２９から
出た光束は、投影レンズ１４、視野絞り５、フィルター
ホイール１１中の波長選択フィルター、照明レンズ６、
ダイクロイックミラー７を経て、対物レンズ１の瞳のＮ
Ａ１．３８以下の位置に結像し、ガラス板４２の中心の
透過部を通過して顕微鏡対物レンズ４０により略平行光
束化され、標本Ｓを透過し、標本Ｓの照明領域から蛍光
が生じる。その蛍光はガラス板４２の遮光膜４３により
遮断されずに対物レンズ１を透過し、ダイクロイックミ
ラー７を透過して、ダイクロイックミラー又はハーフミ
ラー８により２つに分けられ、フィルターホイール１
２、１２’中の観察しようとする蛍光波長に応じたバン
ドパスフィルターを透過し、それぞれ撮像素子１０、撮
像素子１０’上に蛍光顕微鏡像が結像され、コントロー
ラー３１の制御により撮像・記録される。なお、この蛍
光照明の場合、標本Ｓの表面をエバネセント波の場合よ
り厚く、かつ、通常の蛍光像より薄い範囲を観察する場
合、照明光のＮＡを１．３８近くまで持っていってペト
リディッシュ５０の底のカバーガラスから標本Ｓ側に出
る照明光が光軸に対して９０°に近い角度になるように
照明角を簡単に切り替えることで対応することができ
る。以上において、別の方法で蛍光顕微鏡像と全反射顕
微鏡像あるいは反射干渉顕微鏡像を簡単に切り替える方
法としては、フィルターホイール１１中に同じ波長選択
フィルターにディフューザー（フロスト）を設けたフィ
ルターを配置しておき、全反射顕微鏡像あるいは反射干
渉顕微鏡像観察位置でフィルターホイール１１を操作し
てそのフロスト付き波長選択フィルターに切り替えるこ
とで蛍光顕微鏡像を観察できるようにすることもでき
る。すなわち、フロストは全反射顕微鏡像あるいは反射
干渉顕微鏡像観察位置の照明光を拡散するため、照明光
路にフロストを入れると、照明光は拡散し対物レンズ１
の瞳全域を照明して蛍光照明になる。フロストを持たな
い波長選択フィルターに切り替えると、全反射のための
照明や反射干渉のための照明とすることができる。この
ようなフロストは、フィルターホイール１１中に配置す
る代わりに、ダイクロイックミラー７近傍にそれと共に
切り替わるようにマウントしても同様の機能が得られ
る。以上のように、観察に必要なダイクロイックミラー
７やハーフミラー７’、フィルターホイール１２、１
２’により観察光路に挿入される蛍光像を通すバンドパ
スフィルターが、蛍光顕微鏡像と全反射顕微鏡像と反射
干渉顕微鏡像では異なるため、電動で移動可能なダイク
ロイックミラー７やハーフミラー７’、また、フィルタ
ーホイール１２、１２’により電動で切り替え可能にバ
ンドパスフィルターが装着でき、非常に容易に各種観察
法を切り替えることができる。次に、本発明の実施例４
について説明する。この実施例は、上記のような各種観
察法で標本Ｓの経時変化を観察する場合に、外気の温度
変化等によってピントズレが発生しない実施例である。
標本Ｓの経時変化を観察する場合、培養液とガス、温度
をコントロールすることで細胞が過ごしやすい環境を作
ることが非常に重要である。そこで、各種観察法で標本
Ｓの経時変化を観察する場合は、標本を保持する機械部
品に対物レンズ１を取り付けるようにする。図７はこの
実施例の顕微鏡システムの構成を示す図であり、図７の
場合、顕微鏡の照明系、観察系は図５の白色光源２０を
用いる場合の構成を用いているが、図１又は図４の構成
を用いても同様である。そして、この実施例において
は、片側に底を持つ円筒状の機械部品６１の底内部に同
軸に対物レンズ１がその後端の装着部において一体に取
り付けられる。図示はされていないが、この機械部品６
１は顕微鏡本体に一体に取り付けて構成される。この機
械部品６１の長さｂは対物レンズ１の全長の３０％から
１６０％の大きさに構成され、その直径ａは対物レンズ
１の直径の１．２倍から６倍以内に構成されている。こ
のようなコンパクトな寸法とすることで、顕微鏡に取り
付けやすい構造となっている。この機械部品６１の底と
は反対の開口部上に標本を保持する載置部６２が一体に
取り付けられており、また、機械部品６１の中間にはネ
ジ調整部６３が設けられ、載置部６２上に載せられた標
本Ｓのピント調節を可能にしている。そして、円筒状の
機械部品６１内部には、ヒーター６４と温度検知器６５
が設けられ、対物レンズ１を保持している機械部品６１
内部の温度を一定に保つことができるようになってい
る。また、標本Ｓを保持したペトリディッシュ５０が載
置された載置部６２上に、ペトリディッシュ５０を気密
に覆うようにお碗状のインキュベータ７０が載置可能に
なっており、インキュベータ７０内部には、ヒーター７
３と温度検知器７４が設けられ、標本Ｓが外気によって
温度変化を受けないように２０℃前後から４０℃前後ま
で温度制御可能になっている。なお、標本Ｓの環境のＣ
Ｏ₂や各種ガスの濃度をコントロールできるように、イ
ンキュベータ７０にはガス導入パイプ７２とガス排出パ
イプ７３が設けられ、細胞を活かし続けるために必要な
ガスを導入したり、細胞をガスで刺激したりできるよう
になっている。また、細胞を活かし続けるために必要な
培養液や細胞を刺激するための液体をロードしたりサン
クションを行う液用パイプ７１も設けられている。この
ような構成であるので、対物レンズ１と機械部品６１の
温度を経時変化観察の間中一定に保つことができる。特
に、全反射顕微鏡像の観察が可能なＮＡの高い（ＮＡ
１．４以上）対物レンズ１程焦点深度が小さくなるた
め、厳密に温度コントロールを行わないと、温度変化に
よってピントズレが発生するので、このような厳密な標
本Ｓ及び対物レンズ１周辺の温度管理は、光学的にも標
本Ｓのためにも重要になる。さらに、細胞の経時変化を
観察する場合に重要なことは、観察光学系の切り替えを
自動でできることである。仮に、経時観察を手動の顕微
鏡で行おうとすると、例えば、照明系のシャッターを手
で開け、照明角又は照明のＮＡを最適化し、全反射顕微
鏡像を結像させ、カメラで撮影し、次に、手動で蛍光用
のダイクロイックミラーに切り替え、照明光の最適化を
行い、カメラの露光時間を調節し、撮影を行い、さらに
照明光の角度又はＮＡを切り替え、カメラの露光時間を
調節し、撮影を行う。これらの作業を人手を用いて行わ
なければならず、非常に操作がわずらわしく、また、間
違いも起こしやすい。そこで、以上の本発明の顕微鏡シ
ステムを用いて、照明光の標本Ｓへの照射、未照射の切
り替え、照明角度の切り替え、照明用フィルターの切り
替え（例えば、励起フィルターやフロスト等を切り替え
ること）、観察用フィルターの切り替え（例えば、ダイ
クロイックミラー、バンドパスフィルター等を切り替え
ること）等をコンピューター３０を経由してプログラム
に基づき自動で行えることが非常に重要である。自動で
これらの切り替えを行えることで、長時間の観察が簡単
に間違いなく行うことができる。以上、本発明の観察切
り替え可能な顕微鏡をいくつかの実施例に基づいて説明
してきたが、本発明はこれら実施例に限定されず種々の
変形が可能である。本発明の観察切り替え可能な顕微鏡
は例えば次のように構成することができる。〔１〕対物光学系と、前記対物光学系を経た標本から
の光を撮像素子上に結像する結像光学系とを備え、前記
対物光学系から前記結像光学系に至る観察光路中に、照
明光学系からの照明光を反射して前記対物光学系に入射
させ、前記対物光学系を経た標本からの光を前記結像光
学系に透過させる光学部材を備えた顕微鏡において、照
明光学系中には、前記対物光学系の瞳面上の照明光集光
位置を光軸に垂直な方向で調整する機構が設けられ、か
つ、前記観察光路中には、前記対物光学系の瞳面上での
照明光集光位置に応じて観察波長を選択する波長選択手
段が設けられていることを特徴とする観察切り替え可能
な顕微鏡。〔２〕前記対物光学系の瞳面近傍に全反射顕微鏡観察
の際の全反射戻り光を遮断する全反射戻り光遮断手段が
配置されていることを特徴とする上記１記載の観察切り
替え可能な顕微鏡。〔３〕前記照明光の光源がレーザからなり、光ファイ
バーを介して前記レーザからのレーザ光が前記照明光学
系に導かれ、前記光ファイバーの射出端が前記対物光学
系の瞳面と共役に配置され、前記光ファイバーの射出端
を前記照明光学系の光軸に垂直な方向に位置調整するこ
とで、前記対物光学系の瞳面上の照明光集光位置を光軸
に垂直な方向で調整するように構成されていることを特
徴とする上記１又は２記載の観察切り替え可能な顕微
鏡。〔４〕前記照明光の光源がレーザからなり、光ファイ
バーを介して前記レーザからのレーザ光が前記照明光学
系に導かれ、前記光ファイバーの射出端が前記対物光学
系の瞳面と共役に配置され、前記光ファイバーの射出端
から前記光学部材の間に前記レーザ光を偏向させる光偏
向手段が配置され、前記レーザ光の偏向角を調整するこ
とで、前記対物光学系の瞳面上の照明光集光位置を光軸
に垂直な方向で調整するように構成されていることを特
徴とする上記１又は２記載の観察切り替え可能な顕微
鏡。〔５〕前記照明光の光源が白色光源からなり、前記白
色光源からの照明光で絞り板の開口が照明されることに
より前記白色光源からの照明光が前記照明光学系に導か
れ、前記絞り板が前記対物光学系の瞳面と共役に配置さ
れ、前記絞り板を前記照明光学系の光軸に垂直な方向に
位置調整することで、前記対物光学系の瞳面上の照明光
集光位置を光軸に垂直な方向で調整するように構成され
ていることを特徴とする上記１又は２記載の観察切り替
え可能な顕微鏡。〔６〕前記光ファイバーの入射端側に複数のレーザか
らの波長の異なるレーザ光を合成する手段と、合成され
たレーザ光から前記光ファイバーに導入するレーザ光の
波長を選択する手段とが設けられていることを特徴とす
る上記３又は４記載の観察切り替え可能な顕微鏡。〔７〕前記白色光源から前記光学部材の間に前記対物
光学系に入射させ照明光の波長を選択する照明光波長選
択手段が設けられていることを特徴とする上記５記載の
観察切り替え可能な顕微鏡。〔８〕前記対物光学系の取り付け端に一体に前記対物
光学系を取り囲む円筒状部材が取り付けられ、前記円筒
状部材の前記対物光学系先端側端部に標本載置部が取り
付けられ、前記円筒状部材内部に温度調整機構が設けら
れていることを特徴とする上記１から７の何れか１項記
載の観察切り替え可能な顕微鏡。

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の観察切り替え可能な顕微鏡においては、照明光学系中
には、対物光学系の瞳面上の照明光集光位置を光軸に垂
直な方向で調整する機構が設けられ、観察光路中には、
対物光学系の瞳面上での照明光集光位置に応じて観察波
長を選択する波長選択手段が設けられているので、同じ
対物レンズを用いて全反射顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観
察、反射干渉顕微鏡観察間の切り替えが容易に可能な高
性能な顕微鏡を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の顕微鏡システムの構成を示
す図である。

【図２】実施例１のための光源部の構成を示す図であ
る。

【図３】実施例１の対物レンズの構成を示す断面図と全
反射戻り光遮断手段を示す平面図である。

【図４】本発明の実施例２の顕微鏡システムの構成を示
す図である。

【図５】本発明の実施例３の顕微鏡システムの構成を示
す図である。

【図６】実施例３の絞り板の形状と作用を説明するため
の図である。

【図７】本発明の実施例４の顕微鏡システムの構成を示
す図である。

【符号の説明】

Ｓ…標本Ｌ…照明系の照明領域の外周１…対物レンズ２…シングルモード光ファイバー３…シングルモード光ファイバー射出端４…コレクターレンズ５…視野絞り６…照明レンズ７…ダイクロイックミラー７’…ハーフミラー８…ダイクロイックミラー又はハーフミラー９、９’…結像レンズ１０、１０’…撮像素子１１、１２、１２’…フィルターホイール１３…ＡＯＴＦ又はＡＯＭ１４…投影レンズ１５、１５’…固定枠１６…移動片１６’…透明移動片１７…拡張性のバネ１８…調節ネジ２０…白色光源２１…Ａｒレーザ２２…Ｈｅ−Ｎｅレーザ２３…ＹＡＧ−Ｎｄレーザ２４、２５…ダイクロイックミラー２６…ミラー２７…ＡＯＴＦ２８…絞り板２９…絞り板の開口３０…パソコン３１、３２…コントローラー４０…顕微鏡対物レンズ４１…対物胴（鏡筒）４２…ガラス板４３…遮光膜４４…ＮＡが１．３８となる位置４５…回転リング５０…ペトリディッシュ（シャーレ）６１…円筒状の機械部品６２…載置部６３…ネジ調整部６４…ヒーター６５…温度検知器７０…インキュベータ７１…液用パイプ７２…ガス導入パイプ７３…ガス排出パイプ７４…ヒーター７５…温度検知器

フロントページの続きＦターム(参考） 2H041 AA21 AB10 AC01 AZ02 AZ05 2H052 AA04 AA09 AB06 AB24 AB25 AB26 AC04 AC06 AC14 AC17 AC25 AC26 AC27 AC30 AC34 AD03 AD10 AD31 AD32 AD34 AD35 AF21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】対物光学系と、前記対物光学系を経た標
本からの光を撮像素子上に結像する結像光学系とを備
え、前記対物光学系から前記結像光学系に至る観察光路
中に、照明光学系からの照明光を反射して前記対物光学
系に入射させ、前記対物光学系を経た標本からの光を前
記結像光学系に透過させる光学部材を備えた顕微鏡にお
いて、照明光学系中には、前記対物光学系の瞳面上の照明光集
光位置を光軸に垂直な方向で調整する機構が設けられ、かつ、前記観察光路中には、前記対物光学系の瞳面上で
の照明光集光位置に応じて観察波長を選択する波長選択
手段が設けられていることを特徴とする観察切り替え可
能な顕微鏡。
【請求項２】前記対物光学系の瞳面近傍に全反射顕微
鏡観察の際の全反射戻り光を遮断する全反射戻り光遮断
手段が配置されていることを特徴とする請求項１記載の
観察切り替え可能な顕微鏡。