JP2002236257A

JP2002236257A - マルチカラー共焦点顕微鏡

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Publication number: JP2002236257A
Application number: JP2001034741A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Nakamura; 洋之中村; Yukio Taniguchi; 幸夫谷口
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2002-08-23

Abstract

(57)【要約】【課題】多色化された画像、もしくはカラー画像を得
ることのできる共焦点顕微鏡を提供することを課題とす
る。【解決手段】照明部に、波長が互いに異なる二以上の
レーザー光を使用し、検出部１７では、ピンホール１
３’を通って入射した光を分光し、所定の位置毎に特定
の波長の光を集光する、例えばホログラムカラーフィル
ター１８、および、前記ホログラムカラーフィルターが
分光し、集光した光を波長毎に検出する検出器１９とを
備えた構成として、課題を解決した。ホログラムカラー
フィルターの代わりに、集光用レンズと回折格子、ダイ
クロイックミラーを用いてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、照明部に二以上の
波長の異なる光源、もしくは波長を連続的に変更し得る
光源を備えている共焦点顕微鏡に関するものである。ま
た、本発明は、検出器として、（１）ホログラムカラー
フィルター、（２）回折格子と収束用レンズ、もしくは
（３）ダイクロイックミラーおよび必要に応じてフィル
ターとの組み合わせ等による波長帯域分割手段を備えて
いる共焦点顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】共焦点顕微鏡は、試料の三次元構造の任
意の断層像を取出せるものであって、当初は、細胞の吸
光度フォトメトリー等に使われたが、最近では、半導体
製造用のマスクやウェハーの管理にもよく用いられるよ
うになっている。

【０００３】従来の共焦点顕微鏡を、図１を用いて説明
する。共焦点顕微鏡の照明部１０１は、レーザー光源１
０２と、レーザー光源１０２からのレーザー光を絞るた
めに用いるピンホール１０３とからなっており、絞られ
たレーザー光、即ち照明光を、焦点面１０５、即ち、試
料の見たい部分を含む面に収束させる作用を有するレン
ズ１０４等の光学系を伴なっている。

【０００４】レーザー光が焦点面１０５で反射して得ら
れる反射光、もしくはレーザー光が焦点面に当たって生
じた蛍光等の、レーザー光の照射により試料から出た光
は、再びレンズ１０４等の光学系を通った後、その方向
が、照明光の方向の逆方向のままにならないよう、ダイ
クロイックミラー１０６により、相対的に方向を変え、
例えば、試料からでた光がダイクロイックミラー１０６
により曲げられて、照明光が進む方向とは直角な方向を
向いて進行し、その後、先のピンホール１０３とは別の
ピンホール１０３’を通って光電子増倍管等の検出器１
０７によって検出される。

【０００５】上記において、照明部１０１のピンホール
１０３と、試料から出た光が通って検出器に入る手前に
あるピンホール１０３’とは、共焦点、即ち、レンズ１
０４（対物レンズである。）に対して共役な位置関係に
ある。

【０００６】上記のようにして、焦点が合った試料平面
からの光のみが検出器１０７で検出されるので、試料平
面上を光学的に走査して、一つのｘ−ｙ平面のデータを
得た後に、異なる平面に焦点を合わせて、同様な走査を
繰り返すことにより、ｘ−ｙ平面（水平面）を多数積み
上げた、三次元情報を得ることができる。

【０００７】共焦点顕微鏡は、以上のような仕組み、お
よび特長を有しているものの、得られる情報を基にディ
スプレイ上に表示される画像は、通常の光学顕微鏡で観
察される画像がカラー画像であるのにくらべ、本質的に
はモノクロ画像しか得られない。この理由は、使用する
レーザー光源が、単一（＝単波長）の光を出すのみであ
るためである。もちろん、画像処理により、得られる画
像の特定部分に色を付与し、擬似的に多色化を行なうこ
とは可能であるが、波長の異なるレーザー光を用いたと
きに生じる、異なる反射の状態を捉えた、本質的な多色
化ではないため、二種類以上の光源を用いて多色化され
た画像、もしくはカラー画像を得ることのできる共焦点
顕微鏡が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明におい
ては、多色化された画像、もしくはカラー画像を得るこ
とのできる共焦点顕微鏡を提供することを課題とするも
のである。

【０００９】

【課題を解決する手段】本発明者等は、光源として、波
長が互いに異なる複数のレーザー光源を用いること、検
出部においては、試料からの反射光をホログラムカラー
フィルター等の手段により、波長帯域毎に分離すること
により、使用した複数のレーザー光の反射光を分離して
検出することができ、使用したレーザー光源の種類に基
づく多色画像が得られることを見出した。

【００１０】第１の発明は、照明部として、波長が互い
に異なる二以上のレーザー光を発振するレーザー光源を
備えており、検出器として、入射した光を分光し、所定
の位置毎に特定の波長の光を集光するホログラムカラー
フィルター、および、前記ホログラムカラーフィルター
が分光し、集光した光を波長毎に検出する検出器とを備
えていることを特徴とするマルチカラー共焦点顕微鏡に
関するものである。第２の発明は、照明部として、波長
が互いに異なる二以上のレーザー光を発振するレーザー
光源を備えており、検出部として、入射した光を所定の
方向に分光する回折格子および入射した光を集光するレ
ンズとを組み合わせたもの、および、前記回折格子が分
光し、前記レンズが集光した光を、波長毎に検出する検
出器とを備えていることを特徴とするマルチカラー共焦
点顕微鏡に関するものである。第３の発明は、照明部と
して、波長が互いに異なる二以上のレーザー光を発振す
るレーザー光源を備えており、検出部として、入射した
光を所定の方向に分光し、かつ集光する凹面反射型回折
格子、および、前記凹面反射型回折格子が分光し、集光
した光を、波長毎に検出する検出器とを備えていること
を特徴とするマルチカラー共焦点顕微鏡に関するもので
ある。第４の発明は、照明部として、波長が互いに異な
る二以上のレーザー光を発振するレーザー光源を備えて
おり、検出部として、ダイクロイックミラーおよび必要
に応じてフィルターとの組み合わせによる波長帯域分割
手段、ならびに、前記波長分割手段を透過した光を検出
する検出器とを備えていることを特徴とするマルチカラ
ー共焦点顕微鏡に関するものである。第５の発明は、第
１〜第４いずれかの発明において、前記照明部として、
波長が互いに異なる二種類のレーザー光を発振するレー
ザー光源を備えていることを特徴とするマルチカラー共
焦点顕微鏡に関するものである。第６の発明は、第１〜
第４いずれかの発明において、前記照明部として、波長
が互いに異なる三種類のレーザー光を発振するレーザー
光源を備えていることを特徴とするマルチカラー共焦点
顕微鏡に関するものである。第７の発明は、第１〜第４
いずれかの発明において、前記照明部として、連続的な
発光波長を有し、波長を連続的に変更し得るレーザー光
源を備えていることを特徴とするマルチカラー共焦点顕
微鏡に関するものである。

【発明の実施の形態】

【００１１】本発明においては、レーザー光源およびピ
ンホールからなる照明部、照明部からの照明光を焦点に
収束させる光学系、焦点面の試料から出た試料光を、先
の光学系（＝照明光を焦点に収束させる光学系）を逆行
させた後、試料光の方向を照明光の方向とは異なる方向
に導き、照明部のものとは異なるピンホール（ただし先
のピンホールとは光学系に対して共役な関係にあるピン
ホールである。）を通して検出器に導く、従来の共焦点
顕微鏡の、主として照明部および検出部を改善して、得
られる画像のマルチカラー化を図る。

【００１２】本発明のマルチカラー共焦点顕微鏡の照明
部の光源は、カラー化を行なう上では、白色光源である
ことが好ましいが、白色光源として一般的なハロゲンラ
ンプ等を用いて発光させた白色光は、共焦点顕微鏡に特
有なピンホールを通りにくいので、赤、青、緑の波長の
異なるレーザー光を用いることにより、擬似的なカラー
画像とすることが次善の策である。図２は、そのような
波長の異なるレーザー光を発振する三つのレーザー光源
を備えた、本発明のマルチカラー共焦点顕微鏡に用いる
照明部１１を説明するための図である。勿論、レーザー
光源の数は三つに限ることなく、色再現の必要上、二種
類であっても、四種類以上であってもよい。

【００１３】レーザー光源１２ａ、１２ｂ、および１２
ｃとしては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（波長；６３２．８ｎ
ｍ）、Ａｒレーザー（波長；５１４．５ｎｍおよび４８
８ｎｍ）、Ｋｒレーザー（波長；６４７．１ｎｍ、５６
８．２ｎｍ、および５２０．８ｎｍ）、ＹＡＧレーザー
（波長；５３２ｎｍ）、半導体レーザー（波長；８５０
ｎｍ、６７０ｎｍ、６３５ｎｍ、およびその他。なお、
８５０ｎｍは赤外域である。）、Ｈｅ−Ｃｄ白色レーザ
ー（波長；６３５．５ｎｍ、６３６．０ｎｍ、５３３．
７ｎｍ、５３７．８ｎｍ、および４４１．６ｎｍが同時
発振）、もしくはＨｅ−Ｃｄレーザー（波長；４４１ｎ
ｍ）等を使用することができる。また、上記のうち、半
導体レーザーは、電流値や温度の変化により、発振波長
を変えることができる。また、波長可変ダイレーザー
は、波長選択素子の制御により連続的に発振波長が変え
られる。レーザーの種類としては、現在、多くのものが
知られているが、上記したものは、比較的扱いやすく、
好ましいものである。

【００１４】上記のレーザー光源のうち、赤、緑、およ
び青の光源として、赤；Ｈｅ−Ｎｅレーザー（波長；６
３２．８ｎｍ）、緑；ＹＡＧレーザー（波長；５３２ｎ
ｍ）、および青；Ａｒレーザー（波長；４８８ｎｍ）の
組み合わせが、好ましい一例である。また、赤、緑、お
よび青の光源としては、これらの三色を同時に発振し得
る白色レーザーを用いると、より好ましい。赤、緑、お
よび青のうちの二つ、あるいは、赤、緑、および青以外
の組み合わせからなる二つを選んで二色使用することも
できる。また、色再現上は三色で充分であるが、画像の
コントラストを向上させるために、４色以上を使用した
り、あるいは二色以上の組み合わせにおいて、そのうち
の一つもしくはそれ以上として赤外、もしくは紫外を用
いることも有効な場合がある。

【００１５】本発明において、「波長が互いに異なる二
以上のレーザー光を発振するレーザー光源」を使用する
とは、（１）波長Ａ、波長Ｂ、および波長Ｃとが異なる
とき、波長Ａのレーザー光を発振するレーザー光源、波
長Ｂのレーザー光を発振するレーザー光源、および波長
Ｂのレーザー光を発振するレーザー光源の三つのレーザ
ー光源を使用するように、別々のレーザー光源から異な
る単一波長のレーザー光が発振されるレーザー光源を使
用する場合と、（２）単一のレーザー光源から、波長
Ａ、波長Ｂ、および波長Ｃの三つのレーザー光を発振す
るレーザー光源を使用するように、同一のレーザー光源
から異なる波長の二以上のレーザー光が発振されるレー
ザー光源を使用する場合の二つの場合を含んでいる。さ
らに、三以上のレーザー光が使用されるときであれば、
（３）単一波長のレーザー光が発振されるレーザー光源
と、異なる波長の二以上のレーザー光が発振されるレー
ザー光源の組み合わせや、後者のような異なる波長の二
以上のレーザー光が発振されるレーザー光源を複数使用
することも含む。

【００１６】図２の例では、レーザー光源１２ａおよび
１２ｃからの各レーザー光は、ミラー１６ａおよび１６
ｄにより、中央のレーザー光源１２ｂの方を向くよう反
射させられ、対応するミラー１６ｂおよび１６ｃにより
反射させられ、ミラー１６ｂおよび１６ｃを透過した、
レーザー光源１２ｂからのレーザー光と重ねられ、この
ようにして互いに重ねられた波長の異なる三種類のレー
ザー光は、レンズ１０を用いて絞られ、ピンホール１３
を経由して光学系に向かう。勿論、一本のレーザー管か
ら複数のレーザーが発振するときは、ミラー等の使用を
省くことができる。

【００１７】互いに重ねられた、もしくは重なった、波
長の異なる三種類のレーザー光は、光学系により、試料
面である焦点面に収束させられ、焦点面において反射
し、得られた反射光が、再び前の光学系に戻り、光学系
とレーザー光源側のピンホール１３との間に設置された
ダイクロイックミラー（図１におけるダイクロイックミ
ラー１０６と同等である。）により、さらに反射させら
れて、図３〜図５を引用して、以降に説明するように、
ピンホール１３’を通り、検出部１７に向かう。上記し
た照明部のピンホール１３と、検出部１７の前にあるピ
ンホール１３’とは光学系に対して、共役の位置関係に
あるものである。

【００１８】本発明における検出部１７は、図３〜図５
に示すように、検出すべき光を種々の手段により分光し
て、分光された各々の光を検出器１９で検出する。

【００１９】図３に示すように、検出すべき光は、ホロ
グラムカラーフィルター１８により分光する。ホログラ
ムカラーフィルター１８は、集光機能をも備えているの
で、検出器１９としては、分光し、集光した光を検出す
る検出器を必要な数だけ、必要な位置に配置し複合され
たものを使用することが好ましいが、必要な位置に従来
と同様な光電子増倍管を配置して検出してもよい。

【００２０】本発明で用いるホログラムカラーフィルタ
ー１８は、比較的波長選択性の少ないものか、もしくは
波長選択性の強いものとして、赤（Ｒ）光回折用ホログ
ラム層、緑（Ｇ）光回折用ホログラム層、および青
（Ｂ）光回折用ホログラム層の三層からなる三層型のも
のであるか、もしくは一層に赤（Ｒ）光回折用ホログラ
ム、緑（Ｇ）光回折用ホログラム、および青（Ｂ）光回
折用ホログラムが多重記録された一層型のものである。
特に、連続的な波長帯域の光を利用する場合には、波長
選択性の少ないものが好ましい。また、ホログラムカラ
ーフィルター１８としては、体積型ホログラム、もしく
はレリーフ型ホログラムが使用できる。

【００２１】ホログラムカラーフィルター１８が体積型
ホログラムの場合、公知の体積ホログラム記録材料を用
いて形成することができ、そのような体積ホログラム記
録材料としては、銀塩材料、重クロム酸ゼラチン乳剤、
光重合性樹脂、光架橋性樹脂等が挙げられるが、マトリ
ックスポリマー、光重合可能な化合物、光重合開始剤及
び増感色素とからなる乾式の体積位相型ホログラム記録
用途の感光性材料を用いることが好ましい。上記の体積
ホログラム記録材料は、塗布液の状態で準備し、スピン
コーティング法により塗布形成して使用するとよく、ま
た、市販の感光材フィルム（例えば、デュポン社製、
「オムニデックス７０６Ｍ」、膜厚２０μｍ）を利用す
ることもできる。

【００２２】三層型のホログラムカラーフィルター１８
を形成するには、例えば、ガラスやプラスチックの基板
上に、上記の体積ホログラム記録材料をスピンコート
し、乾燥処理を行なった後、更に、層間保護膜である酸
素遮断膜としてポリビニルアルコールをスピンコートに
より塗布し、乾燥処理を行ない光学的に密着させ、赤
（Ｒ）用感光材料層とする。この赤（Ｒ）用感光材料層
に、原版である計算機ホログラムを密着させ、赤（Ｒ）
用ホログラフィックレンズアレイ記録用の波長をもった
レーザー光により露光した後、加熱処理し、赤（Ｒ）用
ホログラフィックレンズアレーを得る。以降、同様の操
作で、緑（Ｇ）用ホログラフィックレンズアレイ、酸素
遮断膜、青（Ｇ）用ホログラフィックレンズアレイ、お
よび酸素遮断膜を形成する。

【００２３】上記において、原版としては、計算機ホロ
グラムを用いずに、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、および青
（Ｂ）の各ホログラフィックレンズアレイと同様の特性
を有する体積型ホログラムを用いてもよいし、また、原
版を用いずに、２光束干渉露光によって作製するように
してもよい。

【００２４】ホログラムカラーフィルター１８がレリー
フ型ホログラムの場合には、露光量により、硬化もしく
は分解の程度が異なるよう設計された、いわゆる感光性
樹脂もしくはレジストと呼ばれる樹脂組成物を用い、や
はり、ガラスやプラスチックの基板上に、上記の体積ホ
ログラム記録材料と同様、スピンコート等により感光性
樹脂層を形成し、原版を用いるか、もしくは２光束干渉
露光によって、露光法により作製するか、または、その
ようにして作製した凹凸型ホログラムもしくはその複製
物を型として使用し、ガラスやプラスチックの基板上に
積層された熱可塑性樹脂もしくは熱硬化性樹脂の樹脂層
の表面に型付けし、その後、必要に応じて硬化させるこ
とにより、作製することができる。

【００２５】ホログラムカラーフィルター１８に可視波
長域以外での特性を持たせる場合にも、同様の方法によ
り行なうことができる。

【００２６】図４（ａ）に示すように、検出すべき光
は、回折格子２１により分光してもよい。回折格子２１
は、集光用のレンズ２０と組み合わせて使用してもよい
し、あるいは、図４（ｂ）に示すように、反射層２１ｃ
を表面に有する、それ自身で集光機能を有する凹面反射
型回折格子２１ｂを用いて、分光および集光を行なわせ
てもよい。回折格子２１は、一般的な機械切削で作製し
てもよいし、上記したホログラムカラーフィルターの製
造方法に準じて製造することもできる。図示したものも
含め、回折格子としては、格子面に反射層を伴なった平
面反射型回折格子、凹面反射型回折格子、エチエル平面
反射型回折格子、平面透過型回折格子、もしくはホログ
ラム回折格子を必要に応じて、レンズと組み合わせて使
用することができる。分光された光は、図２を引用して
説明したホログラムカラーフィルター１８を使用したと
きと同様、検出器１９としては、分光し、集光した光を
検出する検出器を必要な数だけ、必要な位置に配置し複
合されたものを使用することが好ましい。

【００２７】図５に示すように、検出すべき光は、ダイ
クロイックミラー２２および２２’により分光してもよ
い。ダイクロイックミラー２２および２２’は、波長に
より透過率の異なるものである。二つのダイクロイック
ミラー２２および２２’は、必要に応じて、バンドパス
フィルターと組み合わせてもよい。分光された光の各々
は、それぞれ、別の検出器１９により検出される。な
お、図示しないが、ダイクロイックミラーを三枚用い
て、検出すべき光を同じ側にすこしずつ角度を変えて反
射させ、図３および図４を引用して説明したのと同様な
検出器１９を用いてもよい。

【００２８】

【発明の効果】請求項１の発明によれば、波長の異なる
二以上のレーザー光を用い、ホログラムカラーフィルタ
ーを用いて分光、集光して検出させることにより、多色
化された画像もしくはカラー画像を得ることが可能なマ
ルチカラー共焦点顕微鏡を提供することができる。請求
項２の発明によれば、波長の異なる二以上のレーザー光
を用い、検出部においては、集光用レンズと回折格子を
組み合わせて使用することにより、多色化された画像も
しくはカラー画像を得ることが可能なマルチカラー共焦
点顕微鏡を提供することができる。請求項３の発明によ
れば、波長の異なる二以上のレーザー光を用い、検出部
においては、凹面反射型回折格子を使用することによ
り、多色化された画像もしくはカラー画像を得ることが
可能なマルチカラー共焦点顕微鏡を提供することができ
る。請求項４の発明によれば、波長の異なる二以上のレ
ーザー光を用い、検出部においては、ダイクロイックミ
ラー等を用いた波長帯域分割手段を検出器と組み合わせ
て使用することにより、多色化された画像もしくはカラ
ー画像を得ることが可能なマルチカラー共焦点顕微鏡を
提供することができる。請求項５の発明によれば、請求
項１〜請求項４いずれか記載の発明の効果に加え、波長
が互いに異なる二種類のレーザー光を用いたことによる
二色画像が得られるマルチカラー共焦点顕微鏡を提供す
ることができる。請求項６の発明によれば、請求項１〜
請求項４いずれか記載の発明の効果に加え、波長が互い
に異なる三種類のレーザー光を用いたことによる三色画
像が得られるマルチカラー共焦点顕微鏡を提供すること
ができる。請求項７の発明によれば、請求項１〜請求項
４いずれかの発明の効果に加え、光源の数を減らすこと
ができるので、照明部をコンパクトにしたマルチカラー
共焦点顕微鏡を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の共焦点顕微鏡を示す図である。

【図２】マルチカラー共焦点顕微鏡の照明部を示す図で
ある。

【図３】ホログラムカラーフィルターを用いた検出部を
示す図である。

【図４】回折格子を用いた検出部を示す図である。

【図５】ダイクロイックミラーを用いた検出部を示す図
である。

【符号の説明】

１０、２０レンズ１１照明部１２レーザー光源１３ピンホール１６、２２ミラー１７検出部１８ホログラムカラーフィルター１９検出器２１回折格子

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】照明部として、波長が互いに異なる二以
上のレーザー光を発振するレーザー光源を備えており、
検出器として、入射した光を分光し、所定の位置毎に特
定の波長の光を集光するホログラムカラーフィルター、
および、前記ホログラムカラーフィルターが分光し、集
光した光を波長毎に検出する検出器とを備えていること
を特徴とするマルチカラー共焦点顕微鏡。
【請求項２】照明部として、波長が互いに異なる二以
上のレーザー光を発振するレーザー光源を備えており、
検出部として、入射した光を所定の方向に分光する回折
格子および入射した光を集光するレンズとを組み合わせ
たもの、および、前記回折格子が分光し、前記レンズが
集光した光を、波長毎に検出する検出器とを備えている
ことを特徴とするマルチカラー共焦点顕微鏡。
【請求項３】照明部として、波長が互いに異なる二以
上のレーザー光を発振するレーザー光源を備えており、
検出部として、入射した光を所定の方向に分光し、かつ
集光する凹面反射型回折格子、および、前記凹面反射型
回折格子が分光し、集光した光を、波長毎に検出する検
出器とを備えていることを特徴とするマルチカラー共焦
点顕微鏡。
【請求項４】照明部として、波長が互いに異なる二以
上のレーザー光を発振するレーザー光源を備えており、
検出部として、ダイクロイックミラーおよび必要に応じ
てフィルターとの組み合わせによる波長帯域分割手段、
ならびに、前記波長分割手段を透過した光を検出する検
出器とを備えていることを特徴とするマルチカラー共焦
点顕微鏡。
【請求項５】前記照明部として、波長が互いに異なる
二種類のレーザー光を発振するレーザー光源を備えてい
ることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のマルチ
カラー共焦点顕微鏡。
【請求項６】前記照明部として、波長が互いに異なる
三種類のレーザー光を発振するレーザー光源を備えてい
ることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のマルチ
カラー共焦点顕微鏡。
【請求項７】前記照明部として、連続的な発光波長を
有し、波長を連続的に変更し得るレーザー光源を備えて
いることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のマル
チカラー共焦点顕微鏡。