JP3684564B2 - 顕微鏡 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡に関し、特に落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来の落射蛍光像を得る落射蛍光顕微鏡では対物レンズを共用して蛍光色素を発光させる励起光をダイクロイックミラーで反射させて試料に照射すると共に励起光により発生した蛍光をダイクロイックミラーで透過させて通常の光学顕微鏡で観察するものである。
【0003】
また、従来の共焦点像を得る共焦点顕微鏡は複数の集光手段及び開口の設けられた2枚の円板を回転させてこの円板にレーザ光を照射して開口を通過した光で試料を光走査し、試料からの蛍光を再び前記開口を介して観察することにより共焦点像を得るものである。
【0004】
図5はこのような従来のニポーディスク方式の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。図5において1は光源(図示せず。)から出力される励起光であるレーザ光、2は集光手段としてピンホールアレイと同一の配置でマイクロレンズが形成された円板(以下、マイクロレンズ板と呼ぶ。)、3はダイクロイックミラー、4は開口としてピンホールアレイが形成された円板(以下、ピンホール板と呼ぶ。)、5は対物レンズ、6は試料、7はリレーレンズ、8はCCDカメラ等の2次元画像を得ることができる光検出器である。また、2〜4及び7は共焦点光スキャナ50を構成している。
【0005】
レーザ光1はマイクロレンズ板2に入射され、マイクロレンズ板2に設けられた各々のマイクロレンズによりダイクロイックミラー3を介してピンホール板4上の各々のピンホールに集光される。ピンホール板4上の各々のピンホールを通過した光は対物レンズ5を介して試料6の上を走査する。
【0006】
励起光であるレーザ光1により試料6で生じる蛍光は戻り光として再び対物レンズ5を介してピンホール板4に入射され、ピンホール板4上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー3で反射され、リレーレンズ7を介して光検出器8に入射される。
【0007】
また、マイクロレンズ板2及びピンホール板4は同一の軸に固定され、この軸に取付けられたモータ等の駆動手段(図示せず。)によって同期して回転される。
【0008】
ここで、図5に示す共焦点顕微鏡の動作を説明する。レーザ光1は同期して回転するマイクロレンズ板2上の各々のマイクロレンズ及びピンホール板4上の各々のピンホールを通過することにより試料6表面を走査する。そして、試料6からの蛍光は再び同一のピンホールを通過してダイクロイックミラー3で反射されリレーレンズ7を介して光検出器8に入射されて蛍光の共焦点像が結像される。
【0009】
また、光検出器8で蛍光の共焦点像を得るためにはダイクロイックミラー3は励起光であるレーザ光1を透過させ、戻り光である蛍光を反射させる必要がある。図6は励起光であるレーザ光1の波長が、例えば、”488nm”である場合のダイクロイックミラー3の透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【0010】
励起光により生じる蛍光は励起光波長よりも長いので図6に示すダイクロイックミラー3では”488nm”の励起光を透過させると共に”515nm”以上の蛍光を反射する透過反射分光特性を有している。このため、ダイクロイックミラー3をレーザ光1は透過して、試料6からの戻り光である蛍光はダイクロイックミラー3で反射されるので光検出器8で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【0011】
また、図7は励起光であるレーザ光が2波長の周波数成分を含む場合に用いるダイクロイックミラー3の透過反射分光特性を示す特性曲線図である。例えば、励起光であるレーザ光1の波長が”488nm”及び”568nm”であるとすれば、ダイクロイックミラー3では”488nm”及び”568nm”の励起光を透過させると共に”515〜540nm”の蛍光及び”600nm以上”の蛍光をそれぞれ反射する透過反射分光特性を有している。
【0012】
すなわち、このような透過反射分光特性を有するダイクロイックミラー3を用いることにより2波長のレーザ光1であっても共焦点像を得ることが可能になる。
【0013】
また、複数種類の蛍光試薬を試料に用いる多重染色法は広く用いられており、付加された複数の蛍光試薬により生じる蛍光信号を同時に観察することは試料の特定部位を同定するのに極めて有効であり、例えば、図7に示すような透過反射分光特性を有するダイクロイックミラーを用いることによりそれが可能になる。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、複数の蛍光試薬により生じる蛍光信号を同時に観察するためには異なる波長の励起光を同時に試料に照射する必要がある。この場合、1つのレーザ光源に必要な励起波長が全て含まれていない場合には複数のレーザ光源を用いたり、あるいは、蛍光試料の吸収波長の一致した波長を出力するレーザ光源が無い場合には水銀ランプやキセノンランプなどのインコヒーレントな光源から必要な波長成分を得る必要があると言った問題点があった。
【0015】
また、複数の光源から得られた光束を同一光軸上に一致させて混合させるための光学系が別途必要であり、装置が大型化してしまうと言った問題点があった。
【0016】
さらに、特に紫外領域に吸収波長を有する蛍光試薬に対しては紫外線レーザ光源を用いることにより、複数波長の励起光を用いる必要がなくなるものの紫外線レーザ光源は高価であり、短寿命で不安定であると言った問題点があった。
従って本発明が解決しようとする課題は、安価で小型であって落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡を実現することにある。
【0017】
【課題を解決するための手段】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項1記載の発明は、
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、対物レンズと、落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第2のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を透過させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を反射し前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた2種類の蛍光を前記戻り光として透過させる落射蛍光照明手段とを備えたことにより、安価で小型であって落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0018】
請求項2記載の発明は、
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、対物レンズと、落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第2のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を反射させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を透過させ前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた2種類の蛍光を前記戻り光として反射させる落射蛍光照明手段とを備えたことにより、安価で小型であって落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0019】
請求項3記載の発明は、
請求項1若しくは請求項2記載の発明である顕微鏡において、
前記光源の出力光若しくは前記落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることにより、任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を選択することが可能になる。
【0020】
請求項4記載の発明は、
請求項1若しくは請求項2記載の発明である顕微鏡において、
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも長いことにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0021】
請求項5記載の発明は、
請求項1若しくは請求項2記載の発明である顕微鏡において、
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも短いことにより、共焦点像と共焦点像よりも短波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0023】
【発明の実施の形態】
以下本発明を図面を用いて詳細に説明する。図1は本発明に係る顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。図1において1〜8及び50は図5と同一符号を付してあり、9は落射蛍光照明用光源、10がピンホール板4と対物レンズ5との間に設けられたダイクロイックミラーである。また、9及び10は落射蛍光照明手段51を構成している。
【0024】
レーザ光1はマイクロレンズ板2に入射され、マイクロレンズ板2に設けられた各々のマイクロレンズによりダイクロイックミラー3を介してピンホール板4上の各々のピンホールに集光される。ピンホール板4上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー10を透過した後対物レンズ5を介して試料6の上を走査する。
【0025】
一方、落射蛍光照明用光源9の出力である落射蛍光照明光はダイクロイックミラー10で反射されて対物レンズ5を介して試料6に照射される。
【0026】
励起光であるレーザ光1及び落射蛍光照明により試料6で生じる2種類の蛍光は戻り光として再び対物レンズ5を介してダイクロイックミラー10に入射される。入射された2種類の蛍光はダイクロイックミラー10を透過してピンホール板4に入射され、ピンホール板4上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー3で反射され、リレーレンズ7を介して光検出器8に入射される。
【0027】
また、マイクロレンズ板2及びピンホール板4は同一の軸に固定され、この軸に取付けられたモータ等の駆動手段(図示せず。)によって同期して回転される。
【0028】
ここで、図1に示す実施例の動作を説明する。レーザ光1は同期して回転するマイクロレンズ板2上の各々のマイクロレンズ及びピンホール板4上の各々のピンホールを通過することにより試料6表面を走査する。そして、レーザ光1により試料6で生じる第1の蛍光は再び同一のピンホールを通過してダイクロイックミラー3で反射されリレーレンズ7を介して光検出器8に入射されて蛍光の共焦点像が結像される。
【0029】
一方、落射蛍光照明用光源9の出力である落射蛍光照明光はダイクロイックミラー10で反射されて対物レンズ5を介して試料6を照射し、落射蛍光照明光により試料6で生じる第2の蛍光もまた第1の蛍光と同一のピンホール板4のピンホールを通過してダイクロイックミラー3で反射されリレーレンズ7を介して光検出器8に入射されて落射蛍光像が結像される。
【0030】
例えば、励起光であるレーザ光1の波長が”488nm”、落射蛍光照明用光源9の出力である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光1の波長よりも長い”568nm”の場合、ダイクロイックミラー3が図6に示すような透過反射分光特性、ダイクロイックミラー10が図2に示すような透過反射分光特性をそれぞれ有するようにする。
【0031】
励起光である”488nm”のレーザ光1は図6及び図2に示す特性からダイクロイックミラー3及びダイクロイックミラー10をそれぞれ透過して試料6に入射される。励起光であるレーザ光1により生じる第1の蛍光は励起光波長よりも長いので図2に示す特性のダイクロイックミラー10では第1の蛍光を透過させ、図6に示す特性のダイクロイックミラー3では第1の蛍光を反射させる。このため、試料6からの戻り光である第1の蛍光は光検出器8に入射されるので光検出器8で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【0032】
一方、落射蛍光照明用光源9の出力である波長が”568nm”の落射蛍光照明光は図2に示す特性からダイクロイックミラー10により反射されて試料6に入射される。落射蛍光照明光により生じる第2の蛍光は落射蛍光照明光の波長よりも長いので図2に示す特性のダイクロイックミラー10では第2の蛍光を透過させ、図6に示す特性のダイクロイックミラー3では第2の蛍光を反射させる。このため、試料6からの戻り光である第2の蛍光は光検出器8に入射されるので光検出器8で落射蛍光像を得ることが可能になる。
【0033】
また、試料6で生じる第1及び第2の蛍光はそれそれ同一の光路を経て光検出器8に入射されるので光検出器8では落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像として結像されることになる。
【0034】
この結果、ピンホール板4と対物レンズ5との間にダイクロイックミラー10を設けて落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光を試料6に照射させて、ダイクロイックミラー10で試料6で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラー3で前記蛍光を反射させることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0035】
なお、光路上でレーザ光1若しくは落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることにより任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。また、レーザ光1若しくは落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光の出射を停止させることでも任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【0036】
また、図1に示す実施例ではダイクロイックミラー10でレーザ光1を透過させ、落射蛍光照明用光源9の出力光を反射させると共に試料6で生じた2種類の蛍光を透過させているが、その逆であっても構わない。
【0037】
また、第2のダイクロイックミラーであるダイクロイックミラー10の位置は従来の落射蛍光顕微鏡に設けられているダイクロイックミラーに置けば良い。
【0038】
また、上述の説明では落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光1の波長よりも長い場合に関して説明しているが、落射蛍光照明用光源9の出力である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光1の波長よりも短い場合であっても構わない。
【0039】
例えば、励起光であるレーザ光1の波長が”488nm”、落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光1の波長よりも短い”350nm”の場合、ダイクロイックミラー3が図3に示すような透過反射分光特性、ダイクロイックミラー10が図4に示すような透過反射分光特性をそれぞれ有するようにする。
【0040】
励起光である”488nm”のレーザ光1は図3及び図4に示す特性からダイクロイックミラー3及びダイクロイックミラー10をそれぞれ透過して試料6に入射される。励起光であるレーザ光1により生じる第1の蛍光は励起光波長よりも長いので図4に示す特性のダイクロイックミラー10では第1の蛍光を透過させ、図3に示す特性のダイクロイックミラー3では第1の蛍光を反射させる。このため、試料6からの戻り光である第1の蛍光は光検出器8に入射されるので光検出器8で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【0041】
一方、落射蛍光照明である”350nm”の落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光は図4に示す特性からダイクロイックミラー10により反射されて試料6に入射される。落射蛍光照明光により生じる第2の蛍光は落射蛍光照明光の波長よりも長いので図4に示す特性のダイクロイックミラー10では第2の蛍光を透過させ、図3に示す特性のダイクロイックミラー3では第2の蛍光を反射させる。このため、試料6からの戻り光である第2の蛍光は光検出器8に入射されるので光検出器8で落射蛍光像を得ることが可能になる。
【0042】
また、試料6で生じる第1及び第2の蛍光はそれそれ同一の光路を経て光検出器8に入射されるので光検出器8では落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像として結像されることになる。
【0043】
この結果、ピンホール板4と対物レンズ5との間にダイクロイックミラー10を設けて落射蛍光照明用光源9の出力光である落射蛍光照明光を試料6に照射させて、ダイクロイックミラー10で試料6で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラー3で前記蛍光を反射させることにより、共焦点像と共焦点像よりも短波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0044】
【発明の効果】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
請求項1及び請求項2の発明によれば、ピンホール板と対物レンズとの間に第2のダイクロイックミラーを設けて落射蛍光照明用光源の出力光を試料に照射させて、ダイクロイックミラーで試料で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラーで前記蛍光を反射させることにより、高価で不安定な紫外線レーザを用いる必要がなくなるので、安価で小型であって落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡が実現できる。
【0045】
また、請求項3の発明によれば、レーザ光若しくは落射蛍光照明用光源の出力光のどちらか一方の光束を遮ることにより、任意に落射蛍光像、若しくは、蛍光の共焦点像を選択することが可能になる。
【0046】
また、請求項4の発明によれば、落射蛍光照明光の波長をレーザ光の波長よりも長くすることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【0047】
また、請求項5の発明によれば、落射蛍光照明光の波長をレーザ光の波長よりも短くすることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明に係る顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。
【図2】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図3】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図4】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図5】従来のニポーディスク方式の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。
【図6】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図7】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【符号の説明】
1 レーザ光
2 マイクロレンズ板
3,10 ダイクロイックミラー
4 ピンホール板
5 対物レンズ
6 試料
7 リレーレンズ
8 光検出器
9 落射蛍光照明用光源
50 共焦点光スキャナ
51 落射蛍光照明手段
Claims (5)
- 複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、
対物レンズと、
落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、
前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、
前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第2のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を透過させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を反射し前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた2種類の蛍光を前記戻り光として透過させる落射蛍光照明手段と
を備えたことを特徴とする顕微鏡。 - 複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、
対物レンズと、
落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、
前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、
前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第2のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を反射させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を透過させ前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた2種類の蛍光を前記戻り光として反射させる落射蛍光照明手段と
を備えたことを特徴とする顕微鏡。 - 前記光源の出力光若しくは前記落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることを特徴とする
請求項1若しくは請求項2記載の顕微鏡。 - 前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも長いことを特徴とする
請求項1若しくは請求項2記載の顕微鏡。 - 前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも短いことを特徴とする
請求項1若しくは請求項2記載の顕微鏡。
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