JP6536620B2

JP6536620B2 - レーザ励起蛍光顕微鏡

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Publication number: JP6536620B2
Application number: JP2017090720A
Authority: JP
Inventors: 奥川　久; 久奥川; 直志相川; 正聡佐藤
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2019-07-03
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Description

本発明は、複数種類の励起光と複数種類の蛍光とを分離する高機能ダイクロイックミラーを備えたレーザ励起蛍光顕微鏡に関する。

複数種類の蛍光色素で多重染色された標本を共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡で観察する場合、波長の異なる複数種類のレーザ光が励起光として使用されると共に、それらの励起光と、それら励起光に応じて生じる複数種類の蛍光とを分離するダイクロイックミラーが使用される。このダイクロイックミラーの波長特性には、分離波長（反射帯域から透過帯域への立ち上がり箇所）が複数化されているという特徴がある。本明細書では、このように分離波長の複数化されたダイクロイックミラーを「高機能ダイクロイックミラー」という。

図２０において実線で示すのは、非特許文献１で紹介された高機能ダイクロイックミラーの透過率の波長特性カーブである。この高機能ダイクロイックミラーには、通常、ガラス基板上に誘電体多層膜を形成したものが使用される。その誘電体多層膜で複数種類の励起光と複数種類の蛍光とを高効率に分離するには、誘電体多層膜の膜設計時に、反射帯域の反射率が高まり、透過帯域の透過率が高まり、波長特性カーブのリップルが抑えられるよう工夫すればよい。

オリンパスカタログ、共焦点レーザ走査型顕微鏡ＦＶ１０００ＦＬＵＯＶＩＥＷＵＩＳ２

しかしながら、誘電体多層膜の特性を強く制御しようとすると、誘電体多層膜の総膜厚は増大する傾向にある。総膜厚が大きいと、多層膜の応力に起因してガラス基板が歪み易くなるので、レーザスポットの形状が悪化し、蛍光画像の空間分解能が低下する虞がある。

そこで本発明は、高効率であり、しかも空間分解能の高いレーザ励起蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一例であるレーザ励起蛍光顕微鏡は、波長の異なる少なくとも２種類の励起光を出射するレーザ光源部と、前記レーザ光源部が出射した前記２種類の励起光を標本へ集光する集光部の間に配置されたダイクロイックミラーであって、前記レーザ光源部が出射した前記２種類の励起光を反射して前記集光部へ入射させると共に、それら２種類の励起光に応じて前記標本で発生した２種類の蛍光を透過させる高機能ダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーを透過した前記２種類の蛍光を個別に検出する複数の検出器を含む検出部と、を備えたレーザ励起蛍光顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーに対する前記励起光及び前記蛍光の入射角度θは、２５°より小さく、前記ダイクロイックミラーに対する前記２種類の蛍光の各々の透過率は、９５％以上であることを特徴とする。

本発明によれば、高効率であり、しかも空間分解能の高いレーザ励起蛍光顕微鏡が実現する。

図１は、顕微鏡システムの構成図である。図２は、スペクトル検出ユニット６００の構成図である。図３は、高機能ダイクロイックミラー２２の透過率の波長特性カーブを説明する図である。図４は、入射角度θ＝１２°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの構成を示す図である。図５は、図４の続きである。図６は、入射角度θ＝１２°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの波長特性カーブである（ｓ偏光成分、ｐ偏光成分）。図７は、入射角度θ＝１２°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの波長特性カーブである（ｓ偏光成分とｐ偏光成分との平均）。図８は、入射角度θ＝１５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの構成を示す図である。図９は、図８の続きである。図１０は、入射角度θ＝１５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである（ｓ偏光成分、ｐ偏光成分）。図１１は、入射角度θ＝１５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである（ｓ偏光成分とｐ偏光成分との平均）。図１２は、入射角度θ＝２５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の構成を示す図である。図１３は、図１２の続きである。図１４は、入射角度θ＝２５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである（ｓ偏光成分、ｐ偏光成分）。図１５は、入射角度θ＝２５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである（ｓ偏光成分とｐ偏光成分との平均）。図１６は、入射角度θ＝４５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の構成を示す図（比較例）である。図１７は、図１６の続きである。図１８は、入射角度θ＝４５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの波長特性カーブ（比較例）である（ｓ偏光成分、ｐ偏光成分）。図１９は、入射角度θ＝４５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの波長特性カーブ（比較例）である（ｓ偏光成分とｐ偏光成分との平均）。図２０は、非特許文献１で紹介された高機能ダイクロイックミラーの透過率の波長特性カーブである。

以下、本発明の実施形態を説明する。本実施形態は、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの実施形態である。

先ず、顕微鏡システムの構成を説明する。図１は、顕微鏡システムの構成図である。図１に示すとおり顕微鏡システムには、レーザユニット１０と、共焦点ユニット１００と、顕微鏡本体１１０と、検出ユニット５０と、不図示の制御ユニットとが備えられる。このうちレーザユニット１０と共焦点ユニット１００との間は光ファイバ１８によって光学的に結合され、共焦点ユニット１００と検出ユニット５０との間は光ファイバ３８によって光学的に結合される。

顕微鏡本体１１０には、複数種類の蛍光色素によって多重染色された標本Ｓがセットされている。ここでは簡単のため、染色に使用された蛍光色素の種類数を２とし、励起波長が４０５ｎｍである第１蛍光色素と、励起波長が４８８ｎｍである第２蛍光色素とを想定する。因みに、第１蛍光色素の蛍光波長は、その励起波長の長波長側（おおよそ４３０ｎｍ〜４７０ｎｍの範囲）であり、第２蛍光色素の蛍光波長は、その励起波長の長波長側（おおよそ５１０ｎｍ〜６１０ｎｍの範囲）である。

レーザユニット１０には、第１蛍光色素の励起波長（４０５ｎｍ）と同じ波長のレーザ光を発光するレーザ光源１１と、第２蛍光色素の励起波長（４８８ｎｍ）と同じ波長のレーザ光を発光するレーザ光源１２と、全反射ミラー１５と、コンバイナミラー（ダイクロイックミラー）１６と、ＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）１４と、ファイバカプラ１７とが備えられる。因みに、レーザ光源１１から射出するレーザ光の波長は、個体差があるために、波長４００ｎｍ〜４１５ｎｍのばらつきの幅を持ち、レーザ光源１２から射出するレーザ光の波長も同様に、波長４８６ｎｍ〜４９０ｎｍのばらつきの幅を持つ。

共焦点ユニット１００には、コリメートレンズ２１と、全反射ミラー２２Ａと、高機能ダイクロイックミラー２２と、光スキャナ（ガルバノスキャナなど）２３と、瞳投影レンズ２４と、集光レンズ２７と、ピンホール部材２８と、リレーレンズ３４とが備えられる。このうち高機能ダイクロイックミラー２２は、ガラス基板上に分離膜として誘電体多層膜を形成したものである。

顕微鏡本体１１０には、集光レンズ２５と、対物レンズ２６と、標本Ｓを支持する不図示のステージとが備えられる。対物レンズ２６の焦点が標本Ｓに合った状態では、標本Ｓと、光ファイバ１８の出射端と、ピンホール部材２８と、光ファイバ３８の入射端とは光学的に共役となる。

検出ユニット５０には、コリメートレンズ５１と、ダイクロイックミラー５２と、エミッションフィルタ５３、５６と、集光レンズ５４、５５と、光電子増倍管（ＰＭＴ）５７、５８とが備えられる。

以上の顕微鏡システムにおいて、レーザユニット１０、共焦点ユニット１００、顕微鏡本体１１０、検出ユニット５０は、不図示の制御ユニットに接続される。その制御ユニットには、各部を制御する制御回路や、画像処理を実行する演算回路などが搭載される。また、その制御ユニットは、コンピュータを介して入力器や表示器に接続される。

次に、顕微鏡システムの動作を説明する。

レーザユニット１０において、レーザ光源１２から射出したレーザ光は、コンバイナミラー１６を透過し、ＡＯＴＦ１４、ファイバカプラ１７を介して光ファイバ１８へ入射し、共焦点ユニット１００へ向かう。また、レーザ光源１１から射出したレーザ光は、全反射ミラー１５で反射した後、コンバイナミラー１６で反射し、レーザ光源１２から射出したレーザ光と共通の光路へ導かれる。なお、このレーザユニット１０から共焦点ユニット１００に向かうレーザ光の波長選択や光量調整は、ＡＯＴＦ１４によって行われる。

共焦点ユニット１００において、光ファイバ１８の出射端から射出したレーザ光は、コリメートレンズ２１により平行光束に変換され、全反射ミラー２２Ａへ入射する。全反射ミラー２２Ａへ入射したレーザ光は、全反射ミラー２２Ａで反射し、高機能ダイクロイックミラー２２へ入射する。

高機能ダイクロイックミラー２２の分離波長は、第１蛍光色素の励起波長（４０５ｎｍ）の長波長側と、第２蛍光色素の励起波長（４８８ｎｍ）の長波長側とに設定されている（詳細は後述）。よって、レーザ光源１１から射出したレーザ光に含まれる励起光（波長４０５ｎｍ）と、レーザ光源１２から射出したレーザ光に含まれる励起光（波長４８８ｎｍ）とは、高機能ダイクロイックミラー２２で反射する。

高機能ダイクロイックミラー２２で反射した励起光は、光スキャナ２３へ入射する。光スキャナ２３へ入射した励起光は、光スキャナ２３の２つの可動ミラーで順に反射してから光スキャナ２３を射出する。光スキャナ２３を射出した励起光は、瞳投影レンズ２４を介して顕微鏡本体１１０へ向かう。

顕微鏡本体１１０へ入射した励起光は、集光レンズ２５を介して対物レンズ２６へ入射する。対物レンズ２６へ入射した励起光は、その対物レンズ２６によって集光され、標本Ｓ上にレーザスポットを形成する。この状態で光スキャナ２３が駆動されると、レーザスポットが標本Ｓ上を二次元走査する。

標本Ｓのレーザスポット上では、蛍光が発生する。その蛍光は、レーザスポットを形成した励起光の光路を逆方向に進行しながら対物レンズ２６、集光レンズ２５、瞳投影レンズ２４、光スキャナ２３を介して高機能ダイクロイックミラー２２へ入射する。その蛍光の高機能ダイクロイックミラー２２に対する入射角度は、全反射ミラー２２Ａで反射したレーザ光の高機能ダイクロイックミラー２２に対する入射角度と同じである。

高機能ダイクロイックミラー２２の分離波長は、前述したとおり、第１蛍光色素の励起波長（４０５ｎｍ）の長波長側と、第２蛍光色素の励起波長（４８８ｎｍ）の長波長側とに設定されている（詳細は後述）。よって、高機能ダイクロイックミラー２２へ入射した蛍光の多くは、高機能ダイクロイックミラー２２を透過し、集光レンズ２７へ向かう。

集光レンズ２７へ入射した蛍光は、ピンホール部材２８のピンホールに向けて集光する。ピンホールに向かって集光した蛍光のうち、ピンホールから外れた領域に入射した余分な光線は、ピンホール部材２８においてカットされ、ピンホールに入射した必要な光線は、ピンホール部材２８を通過してリレーレンズ３４へ向かう。リレーレンズ３４へ入射した蛍光は、光ファイバ３８へ入射し、検出ユニット５０へ向かう。

検出ユニット５０において、光ファイバ３８の出射端から射出した蛍光は、コリメートレンズ５１により平行光束に変換され、ダイクロイックミラー５２へ入射する。そのダイクロイックミラー５２の分離波長は、第１蛍光色素の蛍光波長（４３０ｎｍ〜４７０ｎｍ）と第２蛍光色素の蛍光波長（５１０ｎｍ〜６１０ｎｍ）との間の波長に設定されている。よって、検出ユニット５０に入射した蛍光のうち、第１蛍光色素で発生した蛍光（第１蛍光）はダイクロイックミラー５２で反射し、第２蛍光色素で発生した蛍光（第２蛍光）はダイクロイックミラー５２を透過する。

ダイクロイックミラー５２で反射した第１蛍光は、エミッションフィルタ５３、集光レンズ５４を介して光電子増倍管５７へ入射し、ダイクロイックミラー５２を透過した第２蛍光は、エミッションフィルタ５６、集光レンズ５５を介して光電子増倍管５８へ入射する。ここでエミッションフィルタ５３、５６の各々は、誘電体多層膜からなる干渉フィルタであり、蛍光波長のみを選択的に透過して他の波長を遮光するフィルタである。そのために、エミッションフィルタ５３の透過波長帯域は４３０ｎｍ〜４７０ｎｍに、エミッションフィルタ５６の透過波長帯域は５１０ｎｍ〜６１０ｎｍに設定されている。これらのフィルタは、第１蛍光色素の励起波長（４０５ｎｍ）と第２蛍光色素の励起波長（４８８ｎｍ）とを遮光する。したがって、標本Ｓのレーザスポット上で反射したレーザ光が、蛍
光に混入して同じ経路を通ったとしても、光電子増倍管５７、５８に不要なレーザ光として入射するのを防止する。光電子増倍管５７、５８の各々は、不図示の制御ユニットによって光スキャナ２３と共に制御され、入射光量を示す電気信号を生成する。よって、前述した二次元走査の期間中に光電子増倍管５７が繰り返し生成する電気信号は、標本Ｓで生じた第１蛍光による蛍光画像を示し、前述した二次元走査の期間中に光電子増倍管５８が繰り返し生成する電気信号は、標本Ｓで生じた第２蛍光による蛍光画像を示す。これらの蛍光画像は、制御ユニットを介してコンピュータへ取り込まれ、表示器へ表示されたり、コンピュータの記憶部（ハードディスクドライブなど）に保存されたりする。

なお、以上の顕微鏡システムでは、検出ユニット５０の代わりに、図２に示すスペクトル検出ユニット６００を使用することもできる。図２に示すとおり、スペクトル検出ユニット６００には、コリメートレンズ６１と、反射型の回折格子６２と、集光ミラー６３と、マルチチャンネル式の光電子増倍管６４とが備えられる。光電子増倍管６４の受光チャンネルの数は、例えば３２である。

このスペクトル検出ユニット６００において、光ファイバ３８の出射端から射出した蛍光は、コリメートレンズ６１により平行光束に変換され、回折格子６２へ入射する。回折格子６２に入射した蛍光は、波長毎に少しずつずれた方向へ反射する。それらの各波長の蛍光は、集光ミラー６３へ入射し、集光ミラー６３で反射する。集光ミラー６３で反射した各波長の蛍光は、光電子増倍管６４の互いに異なる受光チャンネルに集光し、それぞれ電気信号に変換される。なお、標本Ｓのレーザスポット上で反射したレーザ光も、蛍光に混入して同じ経路を通るが、蛍光と波長が異なるので、その大部分は光電子増倍管６４の受光チャンネルの外側に集光するので、電気信号に変換されることはない。前述した二次元走査の期間中に光電子増倍管６４が繰り返し生成する各チャンネルの電気信号は、標本Ｓの蛍光スペクトル画像を示す。この蛍光スペクトル画像は、制御ユニットを介してコンピュータへ取り込まれ、表示器へ表示されたり、コンピュータの記憶部（ハードディスクドライブなど）に保存されたりする。

なお、蛍光スペクトル画像を取り込んだコンピュータは、試薬メーカーが公開している第１蛍光色素の発光スペクトルデータと、試薬メーカーが公開している第２蛍光色素の発光スペクトルデータとに基づき、蛍光スペクトル画像から、第１蛍光による蛍光画像と第２蛍光による蛍光画像とを分離（アンミックス）することもできる。

次に、高機能ダイクロイックミラー２２を説明する。

図１に示すとおり、高機能ダイクロイックミラー２２の姿勢は、高機能ダイクロイックミラー２２に対するレーザ光及び蛍光の入射角度θが４５°より小さくなるよう設定される。高機能ダイクロイックミラー２２の前段に配置された全反射ミラー２２Ａは、高機能ダイクロイックミラー２２の入射光路を折り畳むために配置された光路折り曲げミラーである。

このように入射角度θを４５°より小さくすると、高機能ダイクロイックミラー２２の反射／透過率の波長特性が、入射光の偏光方位に依存しにくくなる。その結果、所望の波長特性を得るのに必要な誘電体多層膜の総膜厚を抑え易くなる。実際、入射角度θを４５°より小さくすると、高機能ダイクロイックミラー２２の誘電体多層膜の総膜厚は、１９．３１９３μｍ未満に抑えられる。

そして、誘電体多層膜が薄化することにより、膜応力が弱くなり、高機能ダイクロイックミラー２２の平面度が維持されるので、レーザスポットの形状も良好に保たれ、その結果、蛍光画像の空間分解能は高く維持される。また、誘電体多層膜が薄化し層数が減るた
め、高機能ダイクロイックミラー２２の製造コストも抑えられる。

因みに、入射角度θが小さいほど、誘電体多層膜は薄化し易くなる。例えば、入射角度θを２５°より小さくすれば、総膜厚は１３．４３６４７μｍ未満に抑えられ、入射角度θを１５°より小さくすれば、総膜厚は１０．２７７２８μｍ未満に抑えられる。また、入射角度θを１２°に設定すれば、総膜厚を９．４２４２８μｍにまで抑えることができる。

但し、入射角度θは、小さ過ぎないことが望ましく、最小でも１０°は確保されることが望ましい。なぜなら、入射角度θが１０°以下であると、必要な光線が蹴られないよう高機能ダイクロイックミラー２２からその周辺の光学素子（全反射ミラー２２Ａ又は光スキャナ２３）までの距離を大きく確保しなければならなくなり、共焦点ユニット１００が大型化するからである。

よって、本実施形態では、入射角度θは０°＜θ＜４５°の範囲内、望ましくは１０°＜θ＜２５°の範囲内、さらに望ましくは１０°＜θ＜１５°の範囲内（例えば１２°程度）に設定されるものとする。

また、本実施形態では、高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性を制御し易くなったことを利用し、波長特性を以下のとおり制御する。

次に、高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性が満たす条件を説明する。図３は、高機能ダイクロイックミラー２２の透過率の波長特性カーブを説明する図である。

図３に示すとおり、高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブには、短波長側から順に、第１の反射帯域３０１、第１の透過帯域４０１、第２の反射帯域３０２、第２の透過帯域４０２が並んでいる。

このうち第１の反射帯域３０１は、２種類の蛍光色素のうち、一方の蛍光色素の励起波長をカバーし、第２の反射帯域３０２は、他方の励起波長をカバーしている。

また、第１の透過帯域４０１は、２種類の蛍光色素のうち、一方の蛍光色素の蛍光波長をカバーし、第２の透過帯域４０２は、他方の蛍光色素の蛍光波長をカバーしている。

よって、第１の反射帯域３０１と第１の透過帯域４０１との境界波長が高機能ダイクロイックミラー２２の一方の分離波長に相当し、第２の反射帯域３０２と第２の透過帯域４０２との境界波長が高機能ダイクロイックミラー２２の他方の分離波長に相当する。

ここで、第１の反射帯域３０１の反射率、第２の反射帯域３０２の反射率、第１の透過帯域４０１の透過率、第２の透過帯域４０２の透過率は、それぞれ９５％以上であり、第１の透過帯域４０１の波長幅Ｔ_１、第２の透過帯域４０２の波長幅Ｔ_２は、それぞれ２５ｎｍ以上である。

したがって、この高機能ダイクロイックミラー２２によると、２種類の蛍光色素の各々の励起光を顕微鏡本体１１０へ効率よく導入することができ、かつ、標本Ｓで発生した２種類の蛍光の各々を検出ユニット５０（又はスペクトル検出ユニット６００）へ効率よく導入することができる。したがって、本実施形態の顕微鏡システムは、２種類の蛍光画像の各々を高感度に検出することができる。

なお、検出感度を更に高めるためには、第１の反射帯域３０１の反射率は、その波長幅
Ｒ_１の９０％以上に亘り９８％以上の値を示し、第２の反射帯域３０２の反射率は、その波長幅Ｒ_２の９０％以上に亘り９８％以上の値を示し、第１の透過帯域４０１の透過率は、その波長幅Ｔ_１の９０％以上に亘り９８％以上の値を示し、第２の透過帯域４０２の透過率は、その波長幅Ｔ_２の９０％以上に亘り９８％以上の値を示すことが望ましい。

また、第１の反射帯域３０１から第１の透過帯域４０１までの立ち上がり幅Ａ_１は６ｎｍ以下、第２の反射帯域３０２から第２の透過帯域４０２までの立ち上がり幅Ａ_２は６ｎｍ以下である。つまり、第１反射帯域３０１から第１の透過帯域４０１までの立ち上がり、第２反射帯域３０２から第２の透過帯域４０２までの立ち上がりは、それぞれ急峻である。

したがって、仮に、２種類の蛍光色素の一方又は双方のストークスシフトが短かったとしても、２種類の蛍光画像の検出感度が低下することは無い。

また、第１の透過帯域４０１と第２の透過帯域４０２との間隙Ｂは、２０ｎｍ以下に抑えられる。また、前述したとおり第１の透過帯域４０１、第２の透過帯域４０２の各々の透過率は９５％以上と高いので、第１の透過帯域４０１、第２の透過帯域４０２の各々にリップルは生じていないとみなせる。

したがって、スペクトル検出ユニット６００（図２）が検出する蛍光スペクトル画像には、標本Ｓで生じた蛍光のスペクトルが殆ど欠け無く反映される。その結果、前述したアンミックスは高精度に行われる。

また、第１の反射帯域３０１、第２の反射帯域３０２の各々の反射率は９５％以上と高いので、検出ユニット５０（又はスペクトル検出ユニット６００）へ不要なレーザ光が入射する可能性は低い。

したがって、検出ユニット５０（又はスペクトル検出ユニット６００）は、高いＳＮ比で蛍光画像（又は蛍光スペクトル画像）を検出することができる。特に、スペクトル検出ユニット６００の内部では、マルチチャンネル式の光電子増倍管６４に不要なレーザ光が入射するのを防止する措置として、最も効果的な措置である、誘電体多層膜からなる干渉フィルタを使用することが出来ず、高いＳＮ比で蛍光スペクトル画像を検出することが困難なので、効果が高い。

次に、高機能ダイクロイックミラー２２の実施例を説明する。

図４、図５は、入射角度θ＝１２°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の構成を示す図である。その構成は、石英ガラス基板上にＮｂ_２Ｏ_５の誘電体膜とＳｉＯ_２の誘電体膜とが交互に形成されたものである。なお、図５は、図４の続きである。これらの図４、図５に示すとおり、入射角度θ＝１２°の条件下では、誘電体多層膜の総膜厚は、９．４２４２８μｍに抑えられる。

図６、図７は、入射角度θ＝１２°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである。図６では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性とを別々に描いており、図７では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性との平均を描いてある。図６に示すとおり、θ＝１２°の条件下では、ｐ偏光成分に対する特性とｓ偏光成分に対する特性とのばらつきが小さいので、図７に示すとおり、波長特性カーブの形状は良好になる。なお、ここで言う「良好な形状」とは、反射帯域の反射率が高く、透過帯域の透過率が高く、反射帯域から透過帯域への立ち上がりが急峻であり、透過帯域同士の間隙が狭く、リップルの少ない形状のことを指す。

図８、図９は、入射角度θ＝１５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の構成を示す図である。その構成は、石英ガラス基板上にＮｂ_２Ｏ_５の誘電体膜とＳｉＯ_２の誘電体膜とが交互に形成されたものである。なお、図９は、図８の続きである。これらの図８、図９に示すとおり、入射角度θ＝１５°の条件下では、誘電体多層膜の総膜厚は、１０．２７７２８μｍに抑えられる。

図１０、図１１は、入射角度θ＝１５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである。図１０では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性とを別々に描いており、図１１では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性との平均を描いてある。図１０に示すとおり、θ＝１５°の条件下では、ｐ偏光成分に対する特性とｓ偏光成分に対する特性とのばらつきが小さいので、θ＝１２°のときほどではないものの、図１１に示すとおり波長特性カーブの形状は良好となる。

図１２、図１３は、入射角度θ＝２５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の構成を示す図である。その構成は、石英ガラス基板上にＮｂ_２Ｏ_５の誘電体膜とＳｉＯ_２の誘電体膜とが交互に形成されたものである。なお、図１３は、図１２の続きである。これらの図１２、図１３に示すとおり、入射角度θ＝２５°の条件下では、誘電体多層膜の総膜厚は、１３．４３６４７μｍに抑えられる。

図１４、図１５は、入射角度θ＝２５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラー２２の波長特性カーブである。図１４では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性とを別々に描いており、図１５では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性との平均を描いてある。図１４に示すとおり、θ＝２５°の条件下では、ｐ偏光成分に対する特性とｓ偏光成分に対する特性とのばらつきが小さいので、θ＝１５°のときほどではないものの、図１５に示すとおり波長特性カーブの形状は良好となる。

図１６、図１７は、入射角度θ＝４５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの構成を示す図（比較例）である。その構成は、石英ガラス基板上にＮｂ_２Ｏ_５の誘電体膜とＳｉＯ_２の誘電体膜とが交互に形成されたものである。なお、図１７は、図１６の続きである。これらの図１６、図１７に示すとおり、入射角度θ＝４５°の条件下では、誘電体多層膜の総膜厚は大きく、１９．３１９３μｍである。

図１８、図１９は、入射角度θ＝４５°の条件下で設計された高機能ダイクロイックミラーの波長特性カーブ（比較例）である。図１８では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性とを別々に描いており、図１９では、ｓ偏光成分に対する特性とｐ偏光成分に対する特性との平均を描いてある。図１８に示すとおり、θ＝４５°の条件下では、ｐ偏光成分に対する特性とｓ偏光成分に対する特性とのばらつきが大きいので、図１９に示すとおり、波長特性カーブの形状は不良となる。

以上の図４〜図１９によると、入射角度θが小さいほど誘電体多層膜が薄化され、しかも波長特性カーブの形状が良好になることが判明した。したがって、高機能ダイクロイックミラー２２に対する入射角度θを４５°より小さくするだけで、高機能ダイクロイックミラー２２の歪み防止と、高機能ダイクロイックミラー２２の高性能化との双方が同時に達成されることは、明らかである。

（その他）
なお、本実施形態の顕微鏡システムでは、標本Ｓを染色する複数種類の蛍光色素（ここでは２種類）の組み合わせが変更される可能性を想定し、図１に示したレーザユニット１０、高機能ダイクロイックミラー２２、ダイクロイックミラー５２の各々は、交換可能で
あることが望ましい。その場合、例えば、共焦点ユニット１００には、分離波長の組み合わせの互いに異なる複数種類の高機能ダイクロイックミラーが装着されたターレット（ホイール状の交換装置）が搭載される。

因みに、交換装置は、ダイクロイックミラーの枚数分だけホイールの径が大きくなり、大型化してしまうのが常であるが、本実施形態の顕微鏡システムのようにダイクロイックミラーに対する入射角度θが４５°より小さい場合は、ダイクロイックミラーの面積を小さくすることができるので、その分だけ交換装置も小型化される。

また、本実施形態では、標本Ｓを染色した蛍光色素の種類数が２である場合を想定したが、３以上に拡張してもよい。その場合、レーザユニット１０が出射可能なレーザ光の種類数は３以上に設定され、高機能ダイクロイックミラー２２の分離波長の個数も３以上に設定され、検出ユニット５０が検出可能な蛍光画像の数（又はコンピュータがアンミックス可能な蛍光画像の数）も３以上に設定される。このように蛍光色素の種類数が３以上であった場合にも、高機能ダイクロイックミラー２２に対する入射角度θを４５°より小さくするだけで、上述した実施形態と同様の効果が得られる。

なお、以上の実施形態において説明された発明を整理して、付記として開示する。

（付記１）
２種類の蛍光色素を個別に励起する２種類の励起光を出射するレーザ光源部と、前記２種類の蛍光色素が含まれる標本へ前記２種類の励起光を集光する対物レンズと、前記レーザ光源部と前記対物レンズとの間に配置されたダイクロイックミラーであって、
前記レーザ光源部が出射した前記２種類の励起光を反射して前記対物レンズへ入射させると共に、それら２種類の励起光に応じて前記標本に含まれる前記２種類の蛍光色素から個別に発生した２種類の蛍光を透過させる高機能ダイクロイックミラーと、
前記レーザ光源部が出射した前記２種類の励起光を反射し、前記２種類の励起光を２５°よりも小さい入射角度θで前記ダイクロイックミラーに入射させるミラーと、
前記ダイクロイックミラーで反射された前記２種類の励起光を前記対物レンズに導くと共に、前記対物レンズを介した前記２種類の蛍光を２５°よりも小さい入射角度θで前記ダイクロイックミラーに入射させる光スキャナと、
前記ダイクロイックミラーを透過した前記２種類の蛍光を分光して検出する検出器を含む検出部と、を備え、
前記ダイクロイックミラーは、複数の反射帯域および複数の透過帯域を有することを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記２）
付記１に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記検出部が生成した蛍光スペクトルデータを、前記２種類の蛍光色素の一方に対応する蛍光スペクトルデータと、他方に対応する蛍光スペクトルデータとに、アンミックスするアンミックス部をさらに備える
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記３）
付記１または付記２に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーの反射／透過率の波長特性カーブは、
前記複数の反射帯域の各々の反射率は９５％以上であり、
前記複数の透過帯域の各々の透過率は９５％以上であり、
前記複数の透過帯域の波長幅の各々は２５ｎｍ以上であり、
前記２種類の蛍光色素の一方の励起波長に対応する反射帯域から前記２種類の蛍光色素
の一方の蛍光波長に対応する透過帯域までの立ち上がり幅と、前記２種類の蛍光色素の他方の励起波長に対応する反射帯域から前記前記２種類の蛍光色素の他方の蛍光波長に対応する透過帯域までの立ち上がり幅との各々は６ｎｍ以下である
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記４）
付記１から付記３の何れか一項に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーに対する前記励起光及び前記蛍光の入射角度θは、１０°＜θ＜２５°の式を満たす
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記５）
付記４に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーに対する前記励起光及び前記蛍光の入射角度θは、１０°＜θ＜１５°の式を満たす
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記６）
付記５に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーに対する前記励起光及び前記蛍光の入射角度θは、
１２°である
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

（付記７）
付記１〜付記６の何れか一項に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーの分離膜は、
誘電体多層膜からなる
ことを特徴とするレーザ励起蛍光顕微鏡。

１０…レーザユニット，１００…共焦点ユニット，１１０…顕微鏡，５０…検出ユニット，１８…光ファイバ，３８…光ファイバ，１１…レーザ光源，１２…レーザ光源，１５…全反射ミラー，１６…コンバイナミラー（ダイクロイックミラー），１４…ＡＯＴＦ（音響光学フィルタ），１７…ファイバカプラ

Claims

波長の異なる少なくとも２種類の励起光を出射するレーザ光源部と、
対物レンズと、
前記レーザ光源部と前記対物レンズとの間に配置され、第１面およびその反対側の第２面を有するダイクロイックミラーと、
光スキャナと、を備え、
前記ダイクロイックミラーは、前記レーザ光源部から出射された第１の励起光を前記第１面で反射して前記対物レンズへ導き、多重染色された標本から発生する第１の蛍光を前記第１面から前記第２面に透過して、前記第１の蛍光による蛍光画像を生成するための検出器に導き、前記レーザ光源部から出射された第２の励起光を前記第１面で反射して前記対物レンズへ導き、前記標本から発生する第２の蛍光を前記第１面から前記第２面に透過して、前記第２の蛍光による蛍光画像を生成するための検出器に導き、
前記第１の励起光は、前記ダイクロイックミラーの前記第１面へ入射し、
前記第１の蛍光は、前記第１の励起光及び前記第２の励起光とは異なる光路から前記ダイクロイックミラーの前記第１面へ入射し、
前記第２の励起光は、前記ダイクロイックミラーの前記第１面へ入射し、
前記第２の蛍光は、前記第１の励起光及び前記第２の励起光とは異なる光路から前記ダイクロイックミラーの前記第１面へ入射し、
前記ダイクロイックミラーは、前記第１の励起光、前記第２の励起光、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の前記ダイクロイックミラーに対する入射角がいずれも２５°未満に固定されるように配置され、
前記ダイクロイックミラーは、複数の反射帯域および複数の透過帯域を有し、
前記第１の励起光の波長は、前記複数の反射帯域の１つに含まれ、
前記第２の励起光の波長は、前記複数の反射帯域の他の１つに含まれ、
前記第１の蛍光の波長は、前記複数の透過帯域の１つに含まれ、
前記第２の蛍光の波長は、前記複数の透過帯域の他の１つに含まれるレーザ励起蛍光顕微鏡。
ミラーをさらに備え、
前記第１の励起光は、前記ミラーを介して前記ダイクロイックミラーに入射し、
前記第２の励起光は、前記ミラーを介して前記ダイクロイックミラーに入射する請求項１に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡。
前記第１の蛍光は、前記光スキャナを介して前記ダイクロイックミラーに入射し、
前記第２の蛍光は、前記光スキャナを介して前記ダイクロイックミラーに入射する請求項１又は２に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡。
前記ダイクロイックミラーは、誘電体多層膜である請求項１〜３のいずれか１項に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡。
前記第１の励起光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１５°未満であり、
前記第１の蛍光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１５°未満であり、
前記第２の励起光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１５°未満であり、
前記第２の蛍光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１５°未満である請求項１〜４のいずれか１項に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡。
前記第１の励起光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１０°より大きく、
前記第１の蛍光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１０°より大きく、
前記第２の励起光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１０°より大きく、
前記第２の蛍光の前記ダイクロイックミラーへの入射角は、１０°より大きい請求項１〜５のいずれか１項に記載のレーザ励起蛍光顕微鏡。