CN113820843A - 基于环形led照明的高分辨定量相位显微系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，包括环形照明模块以及沿环形照明模块光路方向依次设置的培养皿、探测物镜、共焦单元、空间光调制器以及图像采集模块，其中，环形照明模块包括光源安装架和均匀设置的多个LED，培养皿设置在环形照明模块的正下方且位于探测物镜的焦平面上，多个LED的光能够沿倾斜方向照射在培养皿的样品上，产生非散射光及散射光，探测物镜用于收集散射光和非散射光；空间光调制器用于对样品的非散射光进行相位调制，图像采集模块采集相移图。该系统共路径干涉的光学结构提高了系统对外界扰动的免疫性；基于LED的多角度环形超斜部分相干照明，极大地提高了图像质量和空间分辨率。

Description

基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统。

背景技术

光学显微镜作为非侵入式的成像技术在生命科学研究领域扮演着重要的角色。光学显微镜的原理和结构相对简单，对样品的制备要求较低，空间分辨率和时间分辨率都能够达到较多应用场合的要求，可以对多尺度的活体样品进行长时间非侵入式的探测，已经成为人们认识和研究微观世界的重要手段。其中，荧光显微镜通过荧光物质受激发产生的荧光信号实现特定结构的高对比度成像。近年来，通过科学家们的不懈努力，荧光显微镜的空间分辨率实现了从衍射极限到超分辨率的突破，为活细胞内生物动态过程的研究奠定了基础。但是，荧光显微镜在应用上依然存在一些限制。首先，利用荧光标记物标记细胞内的结构时会对细胞的状态造成一定的改变，对准确探测生物动态过程有一定的影响；其次，荧光显微镜能同时观察的通道数量也有限，目前能实现同步观察的通道数只有四到五个；另外，荧光标记物受激发时存在光毒性以及光漂白性，很难对活体样品进行长时间的连续观察。

数字全息显微镜作为一种将光学干涉和数字全息相结合的定量相位显微技术，通过单次曝光即可恢复得到待测样品的振幅和相位信息，具有很好的成像速度。虽然该方法具有很高的测量精度，但是需要额外的参考光，对光源的相干性要求较高并且对环境的抗干扰能力差，因此很难对活体样品进行长时间地连续观察。为了提高数字全息显微镜的抗干扰能力，Popescu等人提出了一种基于同轴点衍射的物参共路数字全息显微技术。由于物光和参考光历经完全相同的光学元件，因此该系统对环境扰动具有非常好的免疫性。然而，该技术中的参考光是通过对物光波进行滤波产生的，参考光的光强与被测样品的散射程度直接相关，无法保证在任意样品下干涉条纹都具有很好的对比度，也就无法保证重建的准确度。

单光束衍射定量相位显微技术在近几年得到了飞速的发展，该类技术通过对一系列衍射图案进行迭代计算获得样品的复振幅信息。其中，叠层衍射成像(PtychographicIterative Engine,PIE)是一种无需透镜便可获得样品相位信息的成像方法。该技术通过横向移动透光小孔或样品本身来对样品的不同区位进行照明，并依次记录样品的衍射图案，再通过迭代重构即可再现出样品的振幅和相位信息；傅立叶叠层显微成像技术(Fourier Ptychographic Microscope,FPM)整合了相位恢复和合成孔径的概念，是对叠层衍射成像技术的一次重大提升。值得说明的是，利用PIE和FPM重建一张高分辨率的图像需要多张低分辨率的原始图像，成像速度受到了很大的限制，很难用于捕捉快速的动态过程。另外，这两种技术的空间分辨率目前还停留在细胞尺度，都还未应用于细胞器的检测中。

此外，基于相衬的定量相位显微技术在恢复透明样品的相位信息方面发挥着重要的作用。梯度光干涉显微镜(Gradient Light Interference Microscope,GLIM)是一种基于微分干涉显微镜(Differential Interference Microscope,DIC)的相移定量相位显微技术。结合传统DIC高轴向分辨率的特性，GLIM在透射和反射模式下都可以对较厚的样品进行相位成像，因此该技术很适合用于观测较厚的组织样品。然而，利用该技术对样品成像时要求照明光束垂直照射到待测样品上，GLIM的空间分辨率受到很大的限制。另外，Taewoo等人提出基于则涅克相衬的定量相位显微技术(Spatial Light Interference Microscope,SLIM)，利用数值孔径为1.4的物镜和中心波长为590nm的卤素灯获得了350nm的横向分辨率和16Hz的时间分辨率。共路径干涉的光学结构使SLIM对环境扰动具有非常好的免疫性，同时宽光谱照明提高了图像质量，避免了由激光照明引起的散斑噪声。然而，该系统的空间分辨率和时间分辨率还不足以探测活细胞内细胞器的微细结构，仅可探测细胞的整体形态变化。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，包括环形照明模块以及沿所述环形照明模块的光路方向依次设置的培养皿、探测物镜、共焦单元、空间光调制器以及图像采集模块，其中，

所述环形照明模块包括光源安装架和均匀设置在所述光源安装架上的多个LED，所述培养皿设置在所述环形照明模块的正下方且位于所述探测物镜的焦平面上，所述多个LED的光能够沿倾斜方向照射在所述培养皿的样品上，产生不受样品影响的非散射光及与样品相关的散射光，所述探测物镜用于收集所述散射光和所述非散射光；

所述共焦单元用于将所述散射光和所述非散射光入射到所述空间光调制器上，所述空间光调制器用于对样品的所述非散射光进行相位调制，所述图像采集模块采集根据所述散射光和经不同相位调制的非散射光产生的相移图。

在本发明的一个实施例中，所述光源安装架包括一个环形安装结构或多个等高度且同心的环形安装结构，所述多个LED沿周向均匀安装在所述环形安装结构上。

在本发明的一个实施例中，所述光源安装架呈拱形结构或半球形结构，所述多个LED均匀安装在所述拱形结构或所述半球形结构的弧面上。

在本发明的一个实施例中，所述共焦单元包括沿光路方向依次设置的第一反射镜、第一镜筒透镜、第二反射镜、线偏振片和第一薄透镜，其中，

所述第一反射镜的反射面位于所述探测物镜的后焦面和所述第一镜筒透镜的前焦面，所述第二反射镜的反射面位于所述第一镜筒透镜的后焦面和所述第一薄透镜的前焦面。

在本发明的一个实施例中，所述空间光调制器和所述图像采集模块之间还设置有第二薄透镜，且所述空间光调制器位于所述第二薄透镜的前焦面，所述图像采集模块位于所述第二薄透镜的后焦面；

所述第一薄透镜和所述第二薄透镜的主轴与所述空间光调制器工作面法线的夹角均小于5度。

在本发明的一个实施例中，所述空间光调制器用于对所述非散射光循环加载0、0.5π、π及1.5π的相位调制。

在本发明的一个实施例中，所述图像采集模块用于采集多个时间点的四张相移图

及

t表示时间。

在本发明的一个实施例中，所述高分辨定量相位显微系统还包括数据处理模块，用于利用所述图像采集模块采集的多个时间点的四张相移图

及

获得样品的相位图。

在本发明的一个实施例中，所述高分辨定量相位显微系统还设置有培养皿环境控制子系统，包括水浴加热器、水泵、硅胶软管、气泵、恒温腔、温度控制器和控制电脑，其中，

所述控制电脑电连接所述水浴加热器、所述水泵、所述气泵和所述温度控制器，用于分别对所述水浴加热器、所述水泵、所述气泵和所述温度控制器进行控制；

所述硅胶软管的进水口连接至所述水浴加热器的水浴中，中段缠绕在所述探测物镜的外周，进水口返回至水浴加热器的水浴中，所述水泵安装在所述硅胶软管的进水口附近；

所述温度控制器电连接所述恒温腔，用于调节所述恒温腔的温度，所述培养皿设置在所述恒温腔中；

所述恒温腔通过气体管道与气体供应装置连通，所述气体供应装置用于向所述恒温腔中提供所需气体，所述气泵安装在所述气体管道上。

在本发明的一个实施例中，所述高分辨定量相位显微系统还集成有辅助荧光子系统，用于在白光光源的照射下获得样品的荧光显微成像结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的高分辨定量相位显微系统不仅具有高的测量精度，还具有以下优点：首先，共路径干涉的光学结构提高了系统对外界扰动的免疫性，可用于活细胞内细胞器的长时间无损观测；其次，基于LED的多角度环形超斜部分相干照明极大地提高了图像质量和空间分辨率；另外，该装置去除了传统定量相衬显微镜中的复杂照明系统，仅用一个由LED组成的简单环形照明模块就实现了大倾斜照明，降低了系统的成本和复杂度，提高了照明光的利用率从而提高了系统的成像速度，简化了样品的安装过程及系统对齐过程，对用户非常友善；最后，本装置首次提出基于水气循环的温度和气体浓度控制系统，该控制系统成本低、可准确控制细胞生存的条件为37℃和5％二氧化碳，具有非常好的灵活性和便携性，可根据实际情况对结构进行调整。

2、该高分辨定量相位显微系统可在正常生存条件下对活细胞内的细胞器进行实时、无标记、高分辨的原位检测，并且可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统。该系统稳定性高、获取的图像质量高、可对透明活细胞内的细胞器进行实时相位成像，在生物医学等领域具有很大的应用价值。该显微系统结构简单、对环境扰动具有非常好的免疫力、具有177nm的横向分辨率、362nm的轴向分辨率及250帧每秒的时间分辨率。利用该装置可在37℃及5％二氧化碳的条件下定量获得透明活细胞内细胞器的相位信息，并可通过图像去卷积处理得到细胞器结构的折射率分布等。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的一种LED的结构示意图；

图3是本发明实施例提供的另外三种环形照明模块的结构示意图；

图4A是本发明实施例提供的一种活细胞生存环境控制系统的结构示意图；

图4B是本发明实施例中细胞培养液的温度相对于水浴加热器中水浴温度的相应曲线；

图5A是在本发明实施例中的环形LED照明模块照明下空间光调制器的相位/电压响应曲线；

图5B是透明活细胞Cos7的四张相移图及重建得到的相位图；

图6是本发明实施例提供的另一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统的结构示意图；

图7A是直径300nm荧光聚苯乙烯小球的相位(左上)和荧光(右下)双通道成像图；

图7B是直径200nm荧光聚苯乙烯小球的相位成像图；

图7C是图7B中白线上的强度变化曲线；

图8是利用本发明实施例的高分辨定量相位显微系统捕捉到活细胞内多种细胞器的结构及动态过程；

图9是利用本发明实施例的高分辨定量相位显微系统在37℃和5％二氧化碳的条件下捕捉到的ADSC细胞有丝分裂过程。

附图标记说明：

1-LED；2-光源安装架；3-培养皿；4-探测物镜；5-第一反射镜；6-第一镜筒透镜；7-第二反射镜；8-线偏振片；9-第一薄透镜；10-空间光调制器；11-第二薄透镜；12-图像采集模块；13-水浴加热器；14-水泵；15-硅胶软管；16-气泵；17-恒温腔；18-温度控制器；19-控制电脑；20-气体供应装置；21-第三反射镜；22-二向色镜；23-滤光片；24-第二镜筒透镜；25-第二图像采集装置；26-第三薄透镜；27-滤光片组；28-宽光谱白光光源。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统进行详细说明。

有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。

应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例一

请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统的结构示意图。该高分辨定量相位显微系统包括环形照明模块以及沿环形照明模块的光路方向依次设置的培养皿3、探测物镜4、共焦单元、空间光调制器10以及图像采集模块12。

环形照明模块包括光源安装架2和均匀设置在光源安装架2上的多个LED(发光二极管)1，培养皿3设置在环形照明模块的正下方且位于探测物镜4的焦平面上，多个LED 1的光能够沿倾斜方向照射在培养皿3的样品上，从而产生极大倾斜照明，产生不受样品影响的非散射光及与样品相关的散射光，探测物镜4用于收集散射光和非散射光。如图1所示，本实施例的光源安装架2包括一个环形安装结构，所述多个LED 1沿周向均匀安装在所述环形安装结构上，所有的LED 1组成一个环状光源。所述多个LED 1的波长在可见光范围，要求具有小的发散角，保证足够高的光强利用率，且具有窄的光谱带宽。在本实施例中，所有的LED 1具有相同的波长。

请参见图2，图2是本发明实施例提供的一种LED的结构示意图。本实施例的LED 1具有特殊的结构，其端部含有一个小焦距的微透镜，从而将原本大角度发散的光会聚为单方向均匀传播的平行光。在本实施例中，多个同型号的LED 1均匀分布在光源安装架2上，LED 1发出的非偏振且非相干的平行光直接照射到底部贴附有活细胞的培养皿3上，且其能量集中在成像视野的正中心。

需要说明的是，在实际中，所述环形照明模块不仅限于图1中的结构，其可以由不同波长的LED交错组合而成，也可以由不同照明数值孔径的环形光源组合而成，以配合不同数值孔径的物镜来满足不同应用场合的需求。

在另一实施例中，光源安装架2可以包括位于同一高度的多个不同直径且同心的环形安装结构，每个环形安装结构上分别均匀安装有多个LED，且每个LED的轴线均穿过探测物镜4的前焦点。在又一实施例中，光源安装架2可以呈拱形结构或半球形结构，所述多个LED 1均匀安装在所述拱形结构或所述半球形结构的弧面上。

具体地，请参见图3，图3是本发明实施例提供的另外三种环形照明模块的结构示意图，其中，(A)为两种波长的LED交错安装，能够实现双波长环形照明；(B)为单一波长LED安装于拱形光源安装架上，能够实现多角度环形照明；(C)为单一波长LED安装于等高的多个不同直径的环形光源安装架上，能够实现多角度环形照明。

进一步地，所述共焦单元用于将所述散射光和所述非散射光入射到所述空间光调制器10上，空间光调制器10用于对样品的所述非散射光进行相位调制，图像采集模块12用于采集样品的相移图像。

本实施例的共焦单元包括沿光路方向依次设置的第一反射镜5、第一镜筒透镜6、第二反射镜7、线偏振片8和第一薄透镜9，其中，第一反射镜5的反射面位于探测物镜4的后焦面和第一镜筒透镜6的前焦面，第二反射镜7的反射面位于第一镜筒透镜6的后焦面和第一薄透镜9的前焦面，第一反射镜5和第二反射镜7用于折光使系统更为紧凑。线偏振片8用于将LED发出的非偏振光调制为线偏振光。

进一步地，空间光调制器10和图像采集模块12之间还设置有第二薄透镜11，且空间光调制器10位于第二薄透镜11的前焦面，图像采集模块12位于第二薄透镜11的后焦面。

具体地，培养皿3放置于探测物镜4的前焦面处，探测物镜4和第一镜筒透镜6构成共焦的望远镜系统，培养皿3上的样品经过探测物镜4和第一镜筒透镜6的放大成像后再经过由第一薄透镜9和第二薄透镜11构成的共焦系统成像到图像采集模块12的工作面上。所述环形照明模块上的LED 1照射到样品后产生不受样品影响的非散射光及受样品折射率和厚度影响的散射光。所述非散射光以环形光源的形式成像到探测物镜4的后焦面处，并被第一镜筒透镜6和第一薄透镜9构成的共焦系统成像到位于第一薄透镜9和第二薄透镜11共焦面处的空间光调制器10上。所述散射光以球面波的形式被探测物镜4收集并被传播到处于第二薄透镜11后焦面处的图像采集模块12上，期间，散射光在空间光调制器10的工作面上是均匀的平面波。

值得注意的是，散射光和非散射光均被空间光调制器10反射后在图像采集模块12上干涉产生相移图。在本实施例中，第一薄透镜9和第二薄透镜11的主轴与空间光调制器10工作面法线的夹角均须小于5度，以保证空间光调制器10对光场进行准确的相位调制。另外，由于空间光调制器10对光场相位进行调制具有偏振方向选择性，因此在空间光调制器10之前加入与其偏振方向相同的线偏振片8，从而保证空间光调制器10可对射入其工作面的所有光场进行相位调制。

在本实施例中，空间光调制器10对样品的非散射光循环加载0、0.5π、π及1.5π的相位调制。具体地，在对活细胞进行长时间的观察时，利用空间光调制器10对样品的非散射光循环加载0、0.5π、π及1.5π的相位调制，并由图像采集模块12进行同步采集，对每个时间点的四张相移图进行计算得到该时间点样品的相位图，从而以相位的形式展现透明活细胞的连续动态变化。

综上，由于散射光和非散射光历经完全相同的光学元件，该高分辨定量相位显微系统对环境扰动具有非常好的免疫性；同时，由于采用多个部分相干的LED进行极大倾斜照明，图像质量和空间分辨率得到了极大的提升；另外，简单的环形照明模块极大地简化了定量相位显微通道的照明模块，降低了系统的复杂度和安装样品的不便性；系统中加入反射镜后，装置的体积得到了极大地减小，使装置更为紧凑。

值得一提的是，传统的基于相衬的定量相位显微镜采用复杂的照明系统实现多角度的同步照明。具体来说，一卤素灯产生的发散光经过一个收集透镜和一个环形通光掩膜的滤波作用后产生环状的光源，该通光掩膜处于一聚光透镜的前焦面处，由此产生多角度的斜照明。为了实现高的空间分辨率，也即极大倾斜照明，照明模块就需要一个具有大数值孔径的水浸物镜浸没在培养液中并正对着探测物镜。如此才可实现无标记、高分辨的定量相位显微成像，但这也极大地增加了系统的复杂度和成本，降低了系统对外界干扰的免疫能力(照明模块和探测模块的对齐很容易受操作人员的影响)，并且样品安装的过程极为不便，不容易实现技术的推广。相比而言，本发明实施例的装置极大地简化了照明模块的结构，仅采用一个由多个离散LED均匀组装而成的环形照明模块就实现对样品的极大倾斜照明，极大地降低了系统的成本及复杂度，去除了由聚光透镜浸入细胞培养液而对细胞状态带来的不利影响，并提高了系统对外界的抗干扰能力，方便用户使用。

进一步地，对活细胞进行观察时需要保证细胞的生存条件为37℃和5％的二氧化碳，这对于长时间准确观察活细胞内细胞器的动态过程极为重要。由于成像系统是一种高分辨显微装置，因此常采用油浸物镜作为探测物镜，虽然有成熟的小型化细胞保温腔来维持细胞周围的温度，但是油浸物镜会将培养液中的大量热量吸走，因此还需要给探测物镜加热。

请参见图4A，图4A是本发明实施例提供的一种活细胞生存环境控制系统的结构示意图。该活细胞生存环境控制系统包括水浴加热器13、水泵14、硅胶软管15、气泵16、恒温腔17、温度控制器18和控制电脑19。控制电脑19电连接水浴加热器13、水泵14、气泵16、恒温腔17和温度控制器18，以分别对水浴加热器13、水泵14、气泵16、恒温腔17和温度控制器18进行控制。硅胶软管15的进水口连接至水浴加热器13中的水浴中，硅胶软管15的中段缠绕在探测物镜4的周围，水泵14安装在硅胶软管15的进水口附近，硅胶软管15的进水口返回至水浴加热器13中的水浴中，水浴加热器13用于通过加热水对探测物镜4进行加热。温度控制器18连接恒温腔17，用于调节恒温腔17的温度。在本实施例中，温度控制器18在控制电脑19的控制下，使得恒温腔17保持在细胞生存所需要的37℃。气泵16通过气体管道一端与恒温腔17的内腔连通，另一端与气体供应装置20连通，用于向所述恒温腔17中通入所需的气体。在本实施例中，所述气体供应装置20为商用培养箱，用于向所述恒温腔17中提供5％二氧化碳气体。

具体地，将水浴加热器13中加热好的温水通过水泵14循环到硅胶软管15中，此硅胶软管15具有非常好的柔韧性，可以很容易缠绕在探测物镜4的周围，从而将硅胶软管15中温水的热量传递给探测物镜4实现加热。温水通过硅胶软管15循环时不可避免地存在热量的传递和损失，因此探测物镜4镜头处的温度(即细胞培养液的温度)与水浴加热器13中的水浴温度存在一定的差异，请参见图4B，图4B是本发明实施例中细胞培养液的温度相对于水浴加热器中水浴温度的相应曲线。水浴温度不同时，探测物镜4的镜头处温度也不同，并且从图4B中可以观察到，经过连续150分钟的测量，本实施例的活细胞生存环境控制系统可实现细胞培养液温度的准确控制。另一方面，在本实施例中，通过一个气泵16将商用培养箱中的适配气体循环到放置有培养皿3的恒温腔中，实现气体浓度的准确控制(如，5％二氧化碳)。如此，便可准确控制细胞生存的条件为37℃和5％二氧化碳，该活细胞生存环境控制系统成本低，具有非常好的灵活性和便携性，可根据实际情况进行调整。

进一步地，本实施例的高分辨定量相位显微系统还包括数据处理模块(附图中未示出)，用于利用所述图像采集模块12采集的不同相位调制下的相移图，得到样品的相位图，具体处理过程如下所述。

本实施例的环形照明模块中每一个LED 1发出的光是具有一定波长范围的自然光，由大量随机波列组成，各列波的振动方向、传播方向以及相位差都是随机的，因而各列波之间是非相干的，各个波列之间是强度的叠加。但对于其中的某一列波而言自身是相干的，因此在所述环形照明模块照明下，首先以相干的处理手段来求解某一列波照明下的光场分布，然后以非相干的处理手段来合成各列波同时照明下的强度分布。

现考虑单色波光源，其角频率表示为w，并且假定待测样品是一个具有折射率分布为

的散射体，其中，

是散射体的空间坐标。单色波光场在散射体内传递时的标量光场分布为

根据则涅克相衬原理可知，该单色照明光透过样品后的光场可分为不受样品影响的散射光

和受样品折射率及厚度影响的散射光

值得注意的是，实际成像的过程中，所有LED同时点亮，由于不同频率的光场之间是非相干的，同时不同角度的照明在实际情况中是利用不同光源实现的，因此由不同照明角度产生的光场之间也是非相干的，因此在没有空间光调制器10调制的情况下，环形照明模块照明下，图像采集模块12探测到的总光强分布可表示为：

其中，角括号<>表示时间尺度上的平均处理，

表示照明波矢，

表示非散射光的总强度，

表示散射光的总强度，

表示散射光与非散射光之间的互相干函数，

表示样品对光场的平均相位调制函数。

在本实施例中，不被样品影响的非散射光被空间光调制器10调制(调制相位

及1.5π)，而带有样品信息的高阶散射光不经过任何器件的调制，此时图像采集模块12探测到的总光强表示为：

利用相移算法可计算得到样品的相位分布：

需要说明的是，实际的光学系统不可避免地存在衍射效应，因此图像的空间分辨率和对比度也受到极大的影响。在所述环形照明模块的环形部分相干光照明下，光场的传递服从严格的光衍射理论，成像过程满足部分相干成像理论。由于实际观察的散射体内部折射率随位置改变非常慢，散射体内部的标量光场服从Helmholtz方程。因此，散射场与非散射场之间的互谱密度(互相干函数

的傅里叶变换)可计算为：

这里，

该式即为环形部分相干光照明下定量相位显微系统的传递函数。其中，j表示复数虚部，～表示空间傅里叶变换，S(w)表示非散射光的强度，k_o是光场在真空中的波数，

是散射势

的空间傅里叶变换；

表示散射体的频谱坐标，

是散射体的散射谱坐标，

是照明向量，

为角谱空间的单位向量，

通过相移操作(公式(3))可计算得到散射场与非散射场之间的互相干函数

再通过去卷积处理就可以得到样品的折射率分布，进而得到样品的厚度分布，从而提高系统的空间分辨率和图像对比度。

从公式(5)可知，本实施例的高分辨定量相位显微系统的传递函数与探测物镜的数值孔径NA_det、对样品的照明角度(也即照明数值孔径NA_s)及照明光的波长λ有关。具体来说，探测物镜的数值孔径越大、照明光的倾斜角度越大、照明光的波长越短，空间分辨率就越高。根据瑞利判据，横向空间分辨率可计算为0.82λ/(NA_s+NA_det)，轴向分辨率可计算为0.82λ/(n_m·cos(asin(NA_s/n_m)))，其中，n_m表示培养液的折射率。值得说明的是本实施例装置中的环形照明模块是由多个同型号单独的发光二极管组合而成的，因此，通过单个LED的部分相干照明及多角度照明的平均效应可以有效提高图像质量。另外，在传统的基于相衬的定量相位显微技术中，除了对非散射光做一系列相位调制外，还需对非散射光做一定的幅值衰减(透过率0.1-0.3)，极大地增加了系统的复杂度。由公式(3)可知，分母和分子各自的相减作用及相除操作将非散射光的幅值调制完全去除，因此，在本装置中首次去除了非散射光的幅值调制模块，极大地简化了成像系统。

进一步地，在对活细胞样品进行长时间观察时，利用空间光调制器10对样品的非散射光循环加载0、0.5π、π及1.5π的相位调制，并由图像采集模块12进行同步采集，然后利用公式(3)对每个时间点的四张相移图进行计算得到该时间点样品的相位图，从而可以以相位的形式展现透明活细胞的连续动态变化。具体地，对于传统的重建方法，假定第一个时间点t1处的四张相移图表示为

及

由这四张图根据公式(3)产生的相位图表示为

第二个时间点t2处的四张相移图表示为

及

由这四张图根据公式(3)产生的相位图表示为

第三个时间点t3处的四张相移图表示为

及

由这四张图根据公式(3)产生的相位图表示为

由此产生时间序列相位图

等。

在本实施例的系统中，通过重复使用每个时间点的原始相移图将时间分辨率提高为传统重建方法的4倍，此时系统的时间分辨率只与空间光调制器液晶的切换时间和图像采集模块的曝光时间有关。具体地，第一张相位图

利用公式(3)对

及

进行处理得到，与传统重建方法得到的第一张相位图

相同；第二张相位图

利用公式(3)对

及

进行处理得到；第三张相位图

利用公式(3)对

及

进行处理得到；第四张相位图

利用公式(3)对

及

进行处理得到；第五张相位图

利用公式(3)对

及

进行处理得到，与传统重建方法得到的第二张相位图

相同。相比于传统的重建方法，本实施例采用的重建方法在两个时间点t1和t2之间得到额外的三张相位图，从而有效地将时间分辨率提高至原来的4倍，仅由空间光调制器切换液晶的时间和图像采集模块的曝光时间决定。

在本实施例中，LED 1的选择需考虑其具有很小的发散角、大功率、短中心波长及窄光谱范围，从而使该高分辨定量相位显微系统具有高的时间、空间分辨率且保证空间光调制器可对光场进行准确的相位调制。优选地，LED 1的直径为5mm，其波长范围为470nm±10nm，单个LED功率为0.36瓦。

所述环形照明模块(环形光源)的设计考虑三个方面，一方面尽可能多地增加LED的数量从而提高对样品的照明强度来提高成像速度，同时通过平均效应提高图像质量；一方面尽可能增大照明角度从而提高空间分辨率，即增大光源安装架2的直径并减小环形光源与样品间的距离；另一方面考虑培养皿3具有一定的深度，要保证样品具有足够的成像视野，即样品横向移动一定范围时，由多个LED组成的环形光源各个角度的照明光均不会被培养皿侧部遮挡。基于此，在本实施例中，优选地，光源安装架2的直径为100mm，其与培养皿3底部的距离为50mm，从而对样品实现45度的环形大角度照明(照明数值孔径为sin45°＝0.71，此时该系统的横向空间分辨为0.82λ/(NA_s+NA_det)＝177nm，轴向空间分辨率为0.82λ/(n_m·cos(asin(NA_s/n_m)))＝362nm)，同时尽可能多地安装LED。在本实施例中，如图1所示，光源安装架2通过3D打印实现，安装有38个LED 1，可对样品实现45度环形照明。在此条件下，该高分辨定量相位显微系统的成像视野至少为直径20mm的圆形区域。

探测物镜4的选择考虑其放大率及数值孔径，本实施例的探测物镜4为浸油物镜，放大倍率为100X，数值孔径NA＝1.44。

第一镜筒透镜6要与探测物镜4配合从而形成矫正良好的无限远光学系统，并在整个视场上实现复消色差矫正，同时配合探测物镜4实现特定的放大率，与标准消色差透镜相比应具有更好的整体像差矫正功能。因此需选择为无限远矫正套筒透镜。优选地，第一镜筒透镜6为焦距200mm的镜筒透镜，从而配合所选的探测物镜4实现100X的放大率。

图像采集模块12在选择时需要考虑其成像速度和量子效率，优选地为sCOMS图像采集模块，其像素数量为2048×2048，单个像素尺寸为6.5μm×6.5μm，量子效率达到82％，成像速度达到1000帧每秒。线偏振片8为线偏振片，光场经过该偏振片后波前变形小于四分之一波长。

第一薄透镜9和第二薄透镜11的选择考虑三个方面，一方面保证本实施例系统的成像满足采样定律；一方面要保证空间光调制器10能完全对系统光瞳口径进行相位调制(即探测物镜4的通光孔径通过第一镜筒透镜6和第一薄透镜9成像后在空间光调制器10的工作范围内)；另一方面要保证第一薄透镜9和第二薄透镜11的主轴与空间光调制器10工作面法线的夹角均小于5度。优选地，本实施例的第一薄透镜9和第二薄透镜11采用两英寸的消色差透镜，从而减小高分辨成像过程中的像差，第一薄透镜9是焦距为250mm的双胶合消色差透镜；透镜11是焦距为300mm的双胶合消色差透镜。

空间光调制器10的液晶切换时间为2毫秒，具有8比特相位调制分辨率。具体地，空间光调制器10的工作范围为17.7mm×10.6mm，探测物镜4的光瞳直径为5.76mm，通过第一镜筒透镜6和第一薄透镜9的成像后，探测物镜4的光瞳口径在空间光调制器10工作面上的直径为7.2mm(远小于10.6mm)；其次，系统的横向分辨率为177nm，其成像到图像采集模块12的工作面的尺寸为21.24μm，是图像采集模块单个像素尺寸的3.3倍，满足采样定律。

如前所述，在本实施例的高分辨定量相位显微系统中，空间光调制器10对样品散射光和非散射光相位的调制是实现样品相位精确测量的关键。由于液晶对施加在每个像素上的电压响应是非线性的，因此需要进行相位/电压的响应曲线校准。理论上，光源的光谱带宽越窄，空间光调制器对光场相位的调制精度越高。与传统定量相衬显微镜所使用的卤素灯相比，本实施例的高分辨定量相位显微系统所使用的LED光谱带宽非常窄，只有20nm，因此，空间光调制器可以对样品光场进行精确的相位调制。利用伽马校准方法，在环形照明模块的照明下得到空间光调制相位/电压的响应曲线，如图5A所示。在本实施例中，对透明的Cos7活细胞进行了成像，图5B左侧的四张图分别是给非散射光添加0、0.5π、π和1.5π的相位延迟时图像采集模块采集到的相移图，图5B右侧的图是利用移相算法重建得到的相位图像。结果表明，该相位图像很好地展示了传统明场显微镜无法显示的线粒体图像。

本实施例的高分辨定量相位显微系统不仅具有高的测量精度，还具有以下优点：首先，共路径干涉的光学结构提高了系统对外界扰动的免疫性，可用于活细胞内细胞器的长时间无损观测；其次，基于LED的多角度环形超斜部分相干照明极大地提高了图像质量和空间分辨率；另外，该装置去除了传统定量相衬显微镜中的复杂照明系统，仅用一个由LED组成的简单环形照明模块就实现了大倾斜照明，降低了系统的成本和复杂度，提高了照明光的利用率从而提高了系统的成像速度，简化了样品的安装过程及系统对齐过程，对用户非常友善；最后，本装置首次提出基于水气循环的温度和气体浓度控制系统，该控制系统成本低、可准确控制细胞生存的条件为37℃和5％二氧化碳，具有非常好的灵活性和便携性，可根据实际情况对结构进行调整。

实施例二

在上述实施例的基础上，本实施例提供了另一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统。该高分辨定量相位显微系统包括定量相位显微子系统和辅助荧光子系统。

所述定量相位显微子系统包括环形照明模块以及沿环形照明模块的光路方向依次设置的培养皿3、探测物镜4、共焦单元、空间光调制器10以及图像采集模块12。

环形照明模块包括光源安装架2和均匀设置在光源安装架2上的多个LED 1，培养皿3设置在环形照明模块的正下方且位于探测物镜4的焦平面上，多个LED1的光能够沿倾斜方向照射在培养皿3的样品上，从而产生极大倾斜照明，产生不受样品影响的非散射光及与样品相关的散射光，探测物镜4用于收集散射光和非散射光。

所述共焦单元用于将所述散射光和所述非散射光入射到所述空间光调制器10上，空间光调制器10用于对样品的所述非散射光进行相位调制，图像采集模块12用于采集样品的相移图像。

本实施例的共焦单元包括沿光路方向依次设置的二向色镜、第一镜筒透镜6、第二反射镜7、线偏振片8和第一薄透镜9，其中，第一反射镜5的反射面位于探测物镜4的后焦面和第一镜筒透镜6的前焦面，第二反射镜7的反射面位于第一镜筒透镜6的后焦面和第一薄透镜9的前焦面，第一反射镜5和第二反射镜7用于折光使系统更为紧凑。线偏振片8用于将LED发出的非偏振光调制为线偏振光。所述定量相位显微子系统的具体结构和工作过程，请参见实施例一，这里不再赘述。

需要说明的是，在本实施例中，将实施例一中的第一反射镜5替换为二向色镜，该二向色镜用于将实施例中的高分辨定量相位系统与本实施例中的辅助荧光子系统相隔离，要求其表面曲率半径在一千米左右，也就是对其表面反射光引起的波前变形小于五分之一波长，从而避免对反射的相位通道引起像差。

辅助荧光子系统用于在白光光源的照射下，获得样品的荧光显微成像结果。该辅助荧光子系统由荧光激发和荧光收集两部分组成，这里不限制荧光显微成像的具体结构，仅以普通宽场荧光显微镜为例。

在本实施例中，如图5所示，所述辅助荧光子系统包括第三反射镜21、二向色镜22、滤光片23、第二镜筒透镜24、第二图像采集装置25、第三薄透镜26、滤光片组27和宽光谱白光光源28。

宽光谱白光光源28结合滤光片组27为所述辅助荧光子系统提供不同波长的激发光，二向色镜22用于耦合荧光通道的激发光路和信号收集光路，第二镜筒透镜24用于减小系统像差，第二图像采集装置25用于采集样品的荧光通道图像，其像素的尺寸及数量应满足成像系统采样率和视野的要求。

具体地，宽光谱白光光源28产生的白光经过滤光片组27的滤波后产生所需的不同波长的照明光，经过第三薄透镜26、二向色镜22、第三反射镜21及显微物镜4的传播后，照射到培养皿3的样品上。产生的荧光信号经过探测物镜4、第一反射镜5、第三反射镜21、二向色镜22、滤光片23和第二镜筒透镜24后，被第二图像采集装置25收集。

在本实施例中，第二图像采集装置25为Andor相机，其像素数量为2048×2048，单个像素尺寸为6.5μm×6.5μm，量子效率达到82％，成像速度达到1000帧每秒。

进一步地，为了验证该高分辨定量相位显微系统的空间分辨率和对样品相位恢复的准确性，利用本实施例的高分辨定量相位显微系统(包括辅助荧光子系统)对直径300nm的荧光聚苯乙烯小球(Huge Biotechnology，RF300C)进行同步成像，如图7A所示，图7A是直径300nm荧光聚苯乙烯小球的相位(左上)和荧光(右下)双通道成像图。考虑到聚苯乙烯的折射率n是1.55左右，同时培养液的折射率n_m为1.33，因此由300nm聚苯乙烯小球所引起的理论最大相位变化为2π·(n-n_m)·d/λ＝2π·(1.55-1.33)·300/470＝0.88rad，而实际测得的最大相位变化为0.9rad，因此，本实施例的高分辨定量相位显微系统具有非常高的相位恢复精度。另一方面，该高分辨定量相位显微系统的理论横向空间分辨为0.82λ/(NA_s+NA_det)＝177nm，轴向空间分辨率为0.82λ/(n_m·cos(asin(NA_s/n_m)))＝362nm。在此用直径200nm的聚苯乙烯小球(Huge Biotechnology,RF200C)进行了实际的测量，结果见图7B和图7C所示，其中，图7B是直径200nm荧光聚苯乙烯小球的相位成像图；图7C是图7B中白线上的强度变化曲线。本实施例对20个小球进行了随机测量，利用高斯函数拟了它们的轮廓线，结果表明，实际测得的横向空间分辨率为245nm，而轴向分辨率为500nm。一方面，系统成像过程中不可避免地存在光学像差，另一方面，样品的实际成像过程是其与系统点扩散函数之间的卷积，因此利用200nm小球测得的空间分辨率比理论的大一些。

进一步地，请参见图8，图8是利用本发明实施例的高分辨定量相位显微系统捕捉到活细胞内多种细胞器的结构及动态过程，其中，(A)为脂肪干细胞内多种细胞器间的相互作用；(B)为Cos7细胞丝状伪足结构；(C)为巨噬细胞内线粒体及脂滴等的分布；(D)为脂肪干细胞在20℃条件下凋亡时通过胞饮内吞在细胞核周围产生大量液泡；(E)为在250Hz成像速度下捕捉到Cos7细胞凋亡时内质网网络的高速振动过程。利用本实施例的高分辨定量相位显微系统，在无需荧光标记的前提下即可捕捉到活细胞内多种细胞器的精细结构，例如，内质网网络结构、线粒体(内嵴)、细胞核、细胞骨架、伪足、液泡、溶酶体(脂滴，内体)，如图8中的(A)、(B)、(C)、(D)所示。同时利用本实施例的高分辨定量相位显微系统还成功捕捉到多种细胞器的动态过程，例如，内质网网络的高速振动过程(250Hz的成像速度)，如图8(E)所示；脂肪干细胞凋亡时通过胞饮内吞产生大量液泡，这些液泡与溶酶体和线粒体等有相互作用；内质网对物质进行运输时存在“搭便车”及“让路”等行为；线粒体在细胞骨架及内质网的作用下发生融合和分裂等。

如前所示，本实施例的系统可对活细胞在正常生存条件下(37℃+5％二氧化碳)进行长时间无标记且高分辨地连续观察。同时，我们知道细胞分裂是生命生存的基础，是生物体繁衍和生死交替的必要条件。因此还利用该系统在没有任何荧光标记的前提下捕获了小鼠干细胞(ADSC)有丝分裂的动态过程，如图9所示。在整个观察的过程中，凭借本实施例的活细胞生存环境控制系统，精确地维持了细胞正常生存的条件，即37℃和5％CO₂。从图9所示的结果中，可以发现细胞分裂是从染色体分裂开始的。具体而言，染色质凝聚产生的染色体在纺锤体微管的作用下分离成了完全相同的姐妹染色单体，并最终平均分配到两个子细胞中。在第12分钟左右，分裂细胞中间出现一个收缩环用以加速分裂过程。在第26分钟左右，核膜出现并将染色体包裹起来形成新的细胞核(被白线包围)，这意味着有丝分裂完成。有趣的是，可以发现在胞质分裂的过程中，随着卵裂沟的出现，细胞周围出现许多突出的气泡(第9.35分时箭头所指位置等)，这些气泡在有丝分裂结束时消失。突出气泡的出现有助于新细胞粘附在培养皿底部，而突出气泡出现的机制需在生物学家的帮助下进行挖掘。

综上，该高分辨定量相位显微系统可在正常生存条件下对活细胞内的细胞器进行实时、无标记、高分辨的原位检测，并且可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统。该系统稳定性高、获取的图像质量高、可对透明活细胞内的细胞器进行实时相位成像，在生物医学等领域具有很大的应用价值。该显微系统结构简单、对环境扰动具有非常好的免疫力、具有177nm的横向分辨率、362nm的轴向分辨率及250帧每秒的时间分辨率。利用该装置可在37℃及5％二氧化碳的条件下定量获得透明活细胞内细胞器的相位信息，并可通过图像去卷积处理得到细胞器结构的折射率分布等。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，包括环形照明模块以及沿所述环形照明模块的光路方向依次设置的培养皿(3)、探测物镜(4)、共焦单元、空间光调制器(10)以及图像采集模块(12)，其中，

所述环形照明模块包括光源安装架(2)和均匀设置在所述光源安装架(2)上的多个LED(1)，所述培养皿(3)设置在所述环形照明模块的正下方且位于所述探测物镜(4)的焦平面上，所述多个LED(1)的光能够沿倾斜方向照射在所述培养皿(3)的样品上，产生不受样品影响的非散射光及与样品相关的散射光，所述探测物镜(4)用于收集所述散射光和所述非散射光；

所述共焦单元用于将所述散射光和所述非散射光入射到所述空间光调制器(10)上，所述空间光调制器(10)用于对样品的所述非散射光进行相位调制，所述图像采集模块(12)采集根据所述散射光和经不同相位调制的非散射光产生的相移图。

2.根据权利要求1所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述光源安装架(2)包括一个环形安装结构或多个等高度且同心的环形安装结构，所述多个LED沿周向均匀安装在所述环形安装结构上。

3.根据权利要求1所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述光源安装架(2)呈拱形结构或半球形结构，所述多个LED均匀安装在所述拱形结构或所述半球形结构的弧面上。

4.根据权利要求1所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述共焦单元包括沿光路方向依次设置的第一反射镜(5)、第一镜筒透镜(6)、第二反射镜(7)、线偏振片(8)和第一薄透镜(9)，其中，

所述第一反射镜(5)的反射面位于所述探测物镜(4)的后焦面和所述第一镜筒透镜(6)的前焦面，所述第二反射镜(7)的反射面位于所述第一镜筒透镜(6)的后焦面和所述第一薄透镜(9)的前焦面。

5.根据权利要求1所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述空间光调制器(10)和所述图像采集模块(12)之间还设置有第二薄透镜(11)，且所述空间光调制器(10)位于所述第二薄透镜(11)的前焦面，所述图像采集模块(12)位于所述第二薄透镜(11)的后焦面；

所述第一薄透镜(9)和所述第二薄透镜(11)的主轴与所述空间光调制器(10)工作面法线的夹角均小于5度。

6.根据权利要求5所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述空间光调制器(10)用于对所述非散射光循环加载0、0.5π、π及1.5π的相位调制。

7.根据权利要求6所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，所述图像采集模块(12)用于采集多个时间点的四张相移图

及

t表示时间。

8.根据权利要求7所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，还包括数据处理模块，用于利用所述图像采集模块(12)采集的多个时间点的四张相移图

及

获得样品的相位图。

9.根据权利要求1所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，还设置有培养皿环境控制子系统，包括水浴加热器(13)、水泵(14)、硅胶软管(15)、气泵(16)、恒温腔(17)、温度控制器(18)和控制电脑(19)，其中，

所述控制电脑(19)连接所述水浴加热器(13)、所述水泵(14)、所述气泵(16)和所述温度控制器(18)，用于分别对所述水浴加热器(13)、所述水泵(14)、所述气泵(16)和所述温度控制器(18)进行控制；

所述硅胶软管(15)的进水口连接至所述水浴加热器(13)的水浴中，中段缠绕在所述探测物镜(4)的外周，进水口返回至水浴加热器(13)的水浴中，所述水泵(14)安装在所述硅胶软管(15)的进水口附近；

所述温度控制器(18)电连接所述恒温腔(17)，用于调节所述恒温腔(17)的温度，所述培养皿(3)设置在所述恒温腔(17)中；

所述恒温腔(17)通过气体管道与气体供应装置(20)连通，所述气体供应装置(20)用于向所述恒温腔(17)中提供所需气体，所述气泵(16)安装在所述气体管道上。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的基于环形LED照明的高分辨定量相位显微系统，其特征在于，还集成有辅助荧光子系统，用于在白光光源的照射下获得样品的荧光显微成像结果。

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