CN103268009A - 垂直照明暗场显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明给出了一种垂直照明的暗场显微系统。该显微镜包含：照明光源及准直光学系统，用于会聚入射光的长工作距离聚光镜，用于反射所会聚入射光束的小尺寸平面反射镜及镜架，用于收集散射光的大数值孔径长工作距离物镜，用于对所收集散射信号进行成像的光学系统以及成像CCD。现有的倾斜照明暗场显微镜具有一个严重问题：在观察暗场信号或者进行光谱分析时，所得结果容易受到衬底的影响。本发明垂直照明暗场显微镜可以解决这个问题，获得单纯由结构、瑕疵和边界等产生的信号。此为，本发明同时具有透射和反射两种工作方式，在对于微纳米结构进行分析时可以提供更多的信息。

Description

垂直照明暗场显微镜

技术领域

本发明涉及一种暗场显微镜系统，特别涉及一种垂直照明的暗场显微系统，同时具有透射和反射两种工作方式。

背景技术

在很多应用领域，人们都需要暗场显微镜来对微弱的散射结构、粒子进行成像。比如：半导体工业里面，对镜面反射为主的芯片、晶片进行瑕疵、软标记成像；生物科技里面，对细胞、近透明软组织等进行成像；纳米技术领域，对单个纳米点、纳米线进行成像。在现有的技术中，这种暗场显微镜往往利用环形光阑获得环形光束，将这种环形光束会聚到样品表面，而样品的散射信号则用位于入射光轴中心的物镜来收集，包含透射、反射两种方式。样品表面的镜面反射无法进入收集物镜，于是人们观察到的将仅仅是样品表面结构、瑕疵或者颗粒的散射信号。典型案例如：一种反射式暗场显微镜的照明系统(CN201020577904)；用环形照射的暗场检查系统(CN201080033782)。科研中，还经常用一种替代的方式来实现这类暗场显微镜的照明，即只使用一个方向斜入射照明光，比如dx.doi.org/10.1021/nl300160y(Nano Lett.2012，12，2817-2821)中所提的第一种方案。无论哪种方案，入射光线本质上都是斜入射照明。

在实际应用中，很多时候斜入射照明不是最佳方案，甚至可能会得到一些不想要的结果，比如dx.doi.org/10.1021/nl300160y(Nano Lett.2012，12，2817-2821)中所提的第一种方案在不同的偏振光入射的情况下，测量散射光的光谱就会得到不同的结果。为此，dx.doi.org/10.1021/nl300160y(Nano Lett.2012，12，2817-2821)中提出了第二种方案：小角度入射。在专利共轴小角度暗场光照(CN200480005357)中也有类似的描述。然而这依然是斜入射，不是真正的垂直入射。

本发明设计了一种真正垂直照明的暗场显微镜，这种照明方式下，散射信号非常接近前向、背向散射，更重要的是，此时照明光场的电磁场矢量都是平行于样品表面的，不存在电磁场和样品衬底的耦合，而这种耦合在斜入射照明的情况下是非常常见的，并且在对散射信号的分析中，这种耦合是有害的。该暗场显微镜还具备前向、后向散射两种方式。

发明内容

本发明所提暗场显微镜，包括照明光源，长工作距离聚光镜或者聚光物镜，用于反射所会聚入射光束的小尺寸平面反射镜或者平面反射棱镜及镜架，用于收集散射光的大数值孔径(NA)长工作距离物镜，用于对所收集散射信号进行成像的光学系统(不同的镜片组合用于获得不同的放大率)以及成像CCD。

所述的长工作距离聚光镜或者聚光物镜，其工作距离需要能保证入射的白光能得到有效的会聚，同时聚光镜自身又不能遮挡收集物镜的光路。典型配置是33.5mm工作距离，10×放大率。

所述的平面反射镜或者平面反射棱镜及其镜架，要求其尺寸足够大，能反射入射光的整个光斑，又不能太大，以至于遮住了收集物镜。典型尺寸：3mm直径圆形平面反射镜相对于收集光路光轴45°放置，或者短轴3mm，长轴4mm的椭圆平面反射镜45°放置，又如直角棱镜，3mm短边长和高度，将斜边镀膜用于宽带反射。镜架的选择，以不能或者尽可能少地遮挡散射光为好。以直角棱镜的镜架为例，一种典型的镜架方案是把棱镜胶合于一块圆形平板玻璃上面，玻璃的直径超过收集物镜的直径，额外制作的该平板玻璃的镜架将不会对收集光路有任何阻挡。

整个照明光路中，上述器件的布局是为了实现反射暗场成像。如果把光的传播方向全部反过来，对于透明样品而言即为透射暗场。

所述的长工作距离收集物镜，其数值孔径和工作距离都要足够大，以保证上述平面反射器件能被置于收集物镜和样品之间，同时又有足够的散射光能被物镜所接受。

所述成像光学系统和CCD，根据实际需要可以有多种不同的放大率、分辨率选择。此为本领域的技术人员所公知的常识。光学系统可以通过平面镜、翻转镜等，实现光路从成像CCD到光谱仪的切换，用于对选定的散射信号进行光谱分析。

下面将会结合附图来解释本发明内容及其应用。

附图说明

图1，垂直入射暗场显微镜的反射模式，a为原理示意图，b为样机实物图；

图2，垂直入射暗场显微镜的透射模式；

图3，小直角棱镜用于反射入射光实现垂直入射，a为原理示意图，b为实物图

图4，小直角棱镜用于反射透射光以获得暗场图像

具体实施方法

下面结合附图来解释本发明内容及其应用。

图1是垂直入射暗场显微镜的反射模式，其中a为原理示意图，b为样机实物图。白光光源经过光纤耦合1、透镜准直2等入射到聚光镜3上，经过长工作距离聚光镜3会聚，会聚焦点经过平面反射镜或者平面反射棱镜4反射后正好落在样品5表面上。反射镜4上面的光斑刚好没有超过平面反射镜的尺寸，而反射镜4对样品5上任意一点的张角都小于收集物镜6的数值孔径所对应的张角。于是样品上的反射信号将沿入射光路原路返回，透射信号(对于透明样品)穿过样品离开显微镜系统，而散射信号越过反射镜4被长工作距离物镜6收集，并被光学系统7成像到CCD或者光谱仪8上，供观察图像或者进行光谱分析。一种常用的方法，是在收集光路中加入一个翻转镜，实现成像CCD和光谱仪光路之间的实时切换，此乃本领域通用技术，在图1中未标出。

从图1我们可以看出，样品表面的任何瑕疵、标记、粒子和结构等，产生的散射信号都会被观察到，而所有的镜面反射/透射信号，以及样品基底自身的部分漫反射都被反射镜4所遮挡而无法进入成像光路。同时，激发这些散射信号的入射光是真正地垂直于基底的，而不是传统的斜入射或者小角度入射，因此其电磁场强度都是平行于基底表面的，不会产生额外的耦合效应

图2是垂直入射暗场显微镜的透射模式，仅适用于透明样品。白光光源经过光纤耦合1、透镜准直2等入射到聚光镜3上，经过长工作距离聚光镜3会聚，会聚焦点落在样品5表面上。透过样品5的光斑经过反射镜4反射离开显微镜系统。同上，反射镜4上面的光斑刚好没有超过平面反射镜的尺寸，而反射镜4对样品5上任意一点的张角都小于收集物镜6的数值孔径所对应的张角。于是样品表面上的反射信号将沿入射光路原路返回，透射信号穿过样品离开显微镜系统，只有散射信号越过反射镜4被长工作距离物镜6收集，并被光学系统7成像到CCD或者光谱仪8上，供观察图像或者进行光谱分析。

和反射模式略有不同，此时反射镜4起的主要作用是将全部透射信号、样品基底的部分散射信号反射离开收集光路。由于暗场显微镜的工作特点，将反射镜4换成任何其他的吸收体、背向反射体等都将极大地破坏暗场显微镜的性能，些微的反射、透射、或者基底散射信号进入收集光路就将导致暗场信号被掩盖。

在透射模式中，形成暗场的原理和反射模式相同，区别是这里获得了前向散射信号。我们知道，不同尺寸的结构、瑕疵的前/后向散射信号强度甚至光谱都可能不同，因此这两种模式在实际应用中都有非常重要的作用。

图3是上述反射镜4的一个实施例，用于反射模式。原理上，该反射镜可以为任意的平面反射镜，但是由于有限的空间尺寸的限制、两种立体张角的限制(参见具体实施方法第一段)，以及对镜架不能遮挡散射信号的要求，我们单独设计了一种特殊的平面反射镜：平面反射棱镜。图3a为原理示意图，图3b为实物图。该直角棱镜的斜面被镀上了铝膜用于对宽带可见光全反射，会聚的入射光被反射后聚焦在样品上，散射信号越过反射棱镜被物镜收集。典型的尺寸：短边长和高度都为3mm，对应于工作距离为6mm左右、NA0.7的收集物镜。该反射棱镜的镜架需要单独设计，以避免遮挡散射信号。我们设计的方案是：把反射棱镜胶合于一薄玻璃片上，玻璃片的直径大于收集物镜的直径，典型数值：1英寸直径，0.2mm厚，紧贴收集物镜，如图3(b)所示；为玻璃片再设计一个圆形镜架，支撑位置可以远离光路。这样就即可以避免对散射信号的遮挡，也避免了额外增加反射棱镜对样品的张角(普通镜架会增加图2中4、6的间距)。

图4是同样的反射棱镜，用于透射模式。其光路和图3(a)正好反过来，虽然原理上有些微差别，但是器件完全相同。因此如果透射、反射光源以及收集离开显微镜光轴的光信号的器件(比如光陷阱)同时配备齐全的话，我们无需换任何器件即可实现透射、反射暗场信号的实时切换，进行成像或者光谱分析。这对于生物、材料里面很多短寿命样品或者需要原位测量的样品来讲重要性是不言而喻的。

虽然我们结合附图和具体实施方法阐述了本发明的原理与应用方法，但是需要指出，本发明不受所公开的实施例的限制，相反，本发明将涵盖权利要求的精神所容许的各种变化和等价配置。

Claims (8)

1.一种垂直照明的暗场显微镜，其部件包括：照明光源及准直光学系统，长工作距离聚光镜用于会聚入射光，用于反射所会聚入射光束的小尺寸平面反射镜及镜架，用于收集散射光的大数值孔径长工作距离物镜，用于对所收集散射信号进行成像的光学系统以及成像CCD。

2.如权利要求1所述的垂直照明暗场显微镜，其照明光源为宽带卤素灯或者宽带光源的组合，可提供从350nm-2000nm波长范围的近紫外-可见-红外照明；准直光学系统包含光纤、透镜或者透镜组，用于将光源准直。

3.如权利要求1所述的垂直照明暗场显微镜，其长工作距离聚光镜的工作距离＞30mm，放大率大于或者等于10，并且可以用长工作距离物镜替代。

4.如权利要求1所述的垂直照明暗场显微镜，其用于反射所会聚入射光束的小尺寸平面反射镜，位于收集物镜和样品中间，可以是3mm直径圆形平面反射镜相对于收集光路光轴45°放置，或者短轴3mm，长轴4mm的椭圆平面反射镜45°放置，也可以用平面反射棱镜实现，棱镜的短边长和高度都为3mm，棱镜的斜面镀宽带反射膜，比如铝膜；平面镜或者平面反射棱镜固定于一个直径＞2cm的玻璃片上，玻璃片的厚度小于1mm，玻璃片本身固定于一个金属镜架上，由于其尺寸超过所述的收集物镜，将不会对散射信号造成任何额外的阻挡。

5.如权利要求1所述的垂直照明暗场显微镜，其用于收集散射光的长工作距离物镜，其工作距离大于等于6mm，数值孔径大于等于0.55，放大率大于等于50。

6.如权利要求1所述的垂直照明暗场显微镜，其成像光学系统可以直接成像在CCD上面用于对图像观察，也可以用翻转镜、分束镜等成像在光谱仪入射面上进行光谱分析。

7.垂直入射暗场显微镜的反射模式，入射光从垂直于收集光路光轴的方向射向权利要求1所述的平面反射镜，被反射后会聚于样品上，样品的散射信号越过所述平面反射镜被长工作距离收集物镜收集。

8.垂直入射暗场显微镜的透射模式，入射光从与收集光路共轴的方向射向样品，透射光被权利要求1所述的平面反射镜反射后从垂直的方向离开收集光路，样品的散射信号则继续向前传播，越过所述平面反射镜被长工作距离物镜收集。

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