CN110702682A - 一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜 - Google Patents

一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种干涉‑散射增强模式下的暗场显微镜，包括用于发出光线的光源、由若干个反射镜组成的反射光路以及设置于待测样品上方的检测装置，光源发出平行光束经过待测样品后进入反射光路内，并经反射光路再次以平行光束经过待测样品，待测样品发生散射而被检测装置所检测。相对现有技术，本发明技术方案具有结构简易、方便操作且检测灵敏、可靠性高等优点，相对现有的暗场显微镜，本发明具有显著提高显微镜分辨率和应用范围、满足纳米尺度的观测和成像要求，搭建成本低廉，具有能在普通实验室普及和应用等优点。

Description

一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜
技术领域
本发明涉及暗场显微镜技术领域，特别涉及一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜。
背景技术
在生命科学技术领域中，为了研究纳米药物和肿瘤细胞的相互作用以及细胞分泌的纳米级别的细胞外囊泡，采用显微成像技术是必不可少的技术手段，现有技术通常采用以分子荧光为代表的光谱分析手段，其具有实时、原位、非侵入等优势，从而在生命分析技术领域中得到广泛应用，但由于荧光分析需要对研究对象进行荧光标记，这样使得标记过程不仅繁琐、耗时，并且不可避免地干扰研究对象行为，甚至造成研究对象死亡等情况。
为解决荧光分析存在的上述技术问题，暗场显微镜应运而生，暗场显微镜具有光学信号稳定、免标记、快速成像等优点，在生命分析技术领域中具有独特优势，并且近年来，暗场显微成像技术在单细胞和单纳米粒子分析领域中受到日益广泛关注。
普通光学显微镜的分辨率受到光波长限制，一般不会超过0.3微米，并且暗场显微镜的聚光镜和普通显微镜聚光镜不相同，因为现有技术的暗场显微镜是使光线形成一个锥形并照射到被观察的样品上，与此同时，暗场显微镜的照明中，为了达到只让光线从侧面照射被观察样品目的，通常会采用一块遮光板过滤垂直入射光，而使得只有侧面光通过，若载物台没有样品，则聚光镜的数值孔径又大于物镜，那么中空的锥形光束则无法进入到物镜里面，并且暗场显微镜下的观察背景是黑色的。此时若在载物台上放置被观察的样品，锥形光束照射在被检测物件上，在样品的表面和内部发生反射、衍射和折射，而样品的散射信号则会被位于入射光轴中心的物镜收集成像。
为了克服现有技术中的暗场数字全息显微术照明光中存在的环形照明光内外半径环径比可控调节性差、光波不均匀、成像对比度弱、光能量大量丢失等问题，以及提高系统分辨率、增强再现像对比度，中国专利(公开号CN107907983A)公开了一种基于局域空心光束照明的数字全息显微镜装置及其工作方法，首先利用平面波照射到锥镜后产生类无衍射贝塞尔光束，贝塞尔光束经透镜聚焦后形成局域空心光束，然后生成的局域空心光束进入暗场聚光镜后形成环形光锥照明实验样品以得到物体的散射光，然后数字全息术将物体的散射光与球面波参考光干涉，干涉的条纹通过光电耦合装置记录到计算机中，但是该专利技术方案依然存在暗场显微镜中照明光束的光波不均匀、背景信号大以及光能力大量丢失以及成像对比度差等技术问题，并且该专利技术方案采用锥镜形成类无衍射贝塞尔光束以及经过透镜聚焦形成局域空心光束无法通过多次光路的干涉而进一步提高分辨率，经多次光路干涉后则会产生严重的成像失真现象。
发明内容
本发明的主要目的是提出克服现有技术问题并提出一种结构简易、方便操作且检测灵敏可靠的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，旨在通过待测样品的入射光和反射光发生干涉现象，使待测样品的散射信号大幅度增强，最终被检测装置所清晰且高灵敏地捕捉待测样品的成像。
为实现上述目的，本发明提出的一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，包括用于发出光线的光源、由若干个反射镜组成的反射光路以及设置于待测样品上方的检测装置，光源发出平行光束经过待测样品后进入反射光路内，并经反射光路若干次以平行光束经过待测样品而被检测装置所检测。
优选地，所述反射光路包括处于同一平面内且沿光路依次设置的第一反光镜、第二反光镜、第三反光镜以及第四反光镜，所述光源与待测样品之间设有第一准直镜头将光源发出的光线耦合后首次经过待测样品，第二反光镜和第三反光镜之间设有减光片，第三反光镜和待测样品之间设有第二准直镜头与第三反光镜反射的光线耦合后再次经过待测样品，第四反光镜设置于第二准直镜头经过待测样品后的光线前部并将光线持续反射至待测样品。
优选地，所述第一反光镜、所述第二反光镜、所述第三反光镜、所述第四反光镜内部设有可调整空间镜面角度的旋转机构，第一反光镜、第二反光镜、第三反光镜和第四反光镜内部包括至少一个镜面。
优选地，所述光源、所述第一准直镜头、所述第一反光镜、所述第二反光镜、所述第三反光镜、所述第二准直镜头以及所述第四反光镜同时与第一三维调节台相连，所述待测样品与第二三维调节台相连，第一三维调节台和第二三维调节台相互分离。
优选地，所述减光片的透过率为0-100％。
优选地，所述光源为激光光源、LED灯光源、金属卤素灯光源、高压钠灯光源的任意一种或多种，光源发出的光束至少为一束。
优选地，所述待测样品为固态样品、气态样品或液态样品。
优选地，所述检测装置为物镜和工业相机，检测装置还与计算机以及显示屏相连。
本发明技术方案相对现有技术具有以下优点：
本发明技术方案通过光源产生的平行光首次照射于待测样品，然后通过由多个反光镜组成的反射光路系统而将反射光再次照射于待测样品内，从而使得首次照射于待测样品表面的入射光和通过反射光路系统的反射光在光程上存在光程差，从而相应地产生干涉现象，在干涉的条件下使粒子的散射信号大幅度增强，被位于入射光轴中心的物镜收集检测信号并在相机中成像。
因此，本发明技术方案通过采用平行光取代传统的环形光束，并采用干涉-散射增强模式能显著提高光波的均匀性，降低背景信号并提高暗场显微镜的分辨率和应用范围、满足纳米尺度的观测和成像要求，通过简易的光路反射系统而使得整体装置制造成本大幅度降低，具备在普通实验室普及和广泛应用的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜的俯视结构示意图；
图2为现有技术的暗场显微镜的观察效果图；
图3为本发明的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜的观察效果图。
附图标号说明：
标号 名称 标号 名称
1 光源 7 第三反光镜
2 第一准直镜头 8 第二准直镜头
3 待测样品 9 第四反光镜
4 第一反光镜 10 第一三维调节台
5 第二反光镜 11 第二三维调节台
6 减光片
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜。
请参见图1，本发明实施例的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜包括用于发出光线的光源1、由若干个反射镜组成的反射光路以及设置于待测样品3上方的检测装置(图上未标示)，光源1发出平行光束经过待测样品3后进入反射光路内，并经反射光路再次以平行光束经过待测样品而被检测装置所检测。
具体地，本实施例的反射光路包括处于同一平面内的第一反光镜4、第二反光镜5、第三反光镜7以及第四反光镜9，其中光源1与待测样品3之间设有第一准直镜头2将光源1发出的光线耦合后首次经过待测样品3，第二反光镜5和第三反光镜7之间设有减光片6，第三反光镜7和待测样品3之间设有第二准直镜头8与第三反光镜7反射光线耦合后再次经过待测样品3，第四反光镜9设置于第二准直镜头8经过待测样品3后的光线前部并将光线持续反射至待测样品3。
因此本实施例的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜进行工作时，首先通过光源1向待测样品3发出光线，而光线经过第一准直镜头2后变为平行光束并进入至待测样品3内部，其中部分光线会被待测样品3所吸收而使得待测样品3向散射入射光，而另一部分光线则穿过待测样品3而被第一反光镜4进行反射，光线再经第一反光镜4反射至第二反光镜5，光线再经第二反光镜5反射至第三反光镜7，而当光线经过第三反光镜7和待测样品3之间的第二准直镜头8后形成平行光，然后经待测样品3后，光线再照射至第四反光镜9，而第四反光镜9持续地将光线反射至待测样品3。因此本实施例技术方案的入射光和反射光存在光程差而发生干涉现象，最终通过设置于待测样品3上方的检测装置检测到待测样品3的散射信号，通过待测样品3的入射光和反射光发生干涉现象，从而使得待测样品3的散射信号大幅度增强，最终被检测装置所清晰且高灵敏地捕捉待测样品的成像，如图2和图3所示，本实施例的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜先比现有技术的散射效果更加明显，并且通过入射光和反射光之间发生干涉现象，增强待测样品的中粒子的散射信号，能够显著提高检测灵敏度。
优选地，本实施例第一反光镜4、第二反光镜5、第三反光镜7、第四反光镜9内部设有可调整镜面空间角度的旋转机构，其中本实施例的旋转机构包括设置于反光镜背面的安装凹槽座、与第一三维调节台10相连的球头凸块，通过安装凹槽座和球头凸块相互套紧配合作用，再通过内螺纹旋紧套环以将安装凹槽座和球头凸块拧紧配合相连。而在本发明的其他实施例中，旋转机构包括将反光镜和第一三维调节台10相连的球头铰链。因此通过调整每个反光镜与第一三维调节台10之间的空间角度以使得四个反光镜能够形成可靠的反射光路。优选地，本实施例的第一反光镜4、第二反光镜5、第三反光镜7和第四反光镜9内部包括至少一个镜面，也就是第一反光镜4、第二反光镜5、第三反光镜7以及第四反光镜9内含有一个平面镜、或两个平面镜或者多个平面镜，并且本实施例的多个反光镜的平面镜形成的反射光路可使得反射光束与入射光束产生干涉作用，增强待测样品3中粒子的散射信号，显著提高检测灵敏度。更重要的是，本实施例通过的第四反光镜9设置于经过待测样品3后的反射光线前部，从而使得第四反光镜9反射的光线继续向待测样品3方向反射并继续发生干涉致使散射信号继续增强，从而有效提高检测灵敏度。
另外，本实施例的光源1、第一准直镜头2、第一反光镜4、第二反光镜5、第三反光镜7、第二准直镜头8以及第四反光镜9同时与第一三维调节台10相连，待测样品3与第二三维调节台11相连，第一三维调节台10和第二三维调节台11相互分离，因此通过第一三维调节台10调整反光镜和准直镜头的空间安装位置，通过第二三维调节台11调整待测样品3的空间角度，以适应性地调整待测样品3与反射光路之间的空间关系。
优选地，本实施例的减光片6的透过率为0-100％，通过减光片3适应性地调节反射光束的反射强度，以调节至最佳的反射-散射信号，而本实施例的光源1可为激光光源、LED灯光源、金属卤素灯光源、高压钠灯光源的任意一种或多种同时工作，光源1发出的光束至少为一束，而待测样品3为固态样品、气态样品或液态样品，检测装置为设置于待测样品上方且用于对待测样品干涉-散射信号进行收集小数值孔径的物镜和成像的工业相机，检测装置还与计算机以及显示屏相连以方便观察，因此通过工业相机实时记录，物镜收集到的待测样品3的干涉-散射信号，并在显示屏显示以方便用户观察。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，包括用于发出光线的光源、由若干个反射镜组成的反射光路以及设置于待测样品上方的检测装置，光源发出平行光束经过待测样品后进入反射光路内，并经反射光路若干次以平行光束经过待测样品而被检测装置所检测。
2.如权利要求1所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述反射光路包括处于同一平面内且沿光路依次设置的第一反光镜、第二反光镜、第三反光镜以及第四反光镜，所述光源与待测样品之间设有第一准直镜头将光源发出的光线耦合后首次经过待测样品，第二反光镜和第三反光镜之间设有减光片，第三反光镜和待测样品之间设有第二准直镜头与第三反光镜反射的光线耦合后再次经过待测样品，第四反光镜设置于第二准直镜头经过待测样品后的光线前部并将光线持续反射至待测样品。
3.如权利要求2所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述第一反光镜、所述第二反光镜、所述第三反光镜、所述第四反光镜内部设有可调整空间镜面角度的旋转机构，第一反光镜、第二反光镜、第三反光镜和第四反光镜内部包括至少一个镜面。
4.如权利要求3所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述光源、所述第一准直镜头、所述第一反光镜、所述第二反光镜、所述第三反光镜、所述第二准直镜头以及所述第四反光镜同时与第一三维调节台相连，所述待测样品与第二三维调节台相连，第一三维调节台和第二三维调节台相互分离。
5.如权利要求4所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述减光片的透过率为0-100％。
6.如权利要求5所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述光源为激光光源、LED灯光源、金属卤素灯光源、高压钠灯光源的任意一种或多种，光源发出的光束至少为一束。
7.如权利要求6所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述待测样品为固态样品、气态样品或液态样品。
8.如权利要求7所述的干涉-散射增强模式下的暗场显微镜，其特征在于，所述检测装置为物镜和工业相机，检测装置还与计算机以及显示屏相连。
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