JP2016206199A - 微粒子サンプルの特徴付けと定量化のためのイメージサイトメータ - Google Patents

Abstract

【課題】微粒子サンプルの特徴付けと定量化のためのイメージサイトメータを提供する。【解決手段】本発明は、サンプルの画像を捕捉し、モーメンタム領域において分析するためのイメージサイトメータに関する。サイトメータには、サンプルを光ビームで照明するための光源と、ビーム伝播方向においてサンプルの後方に位置付けられた、空間平面内のフーリエ変換結果を生成するための光変換システムと、光センサアレイと、光学システムに関して、フーリエ変換結果が光センサアレイ上に結像されるように位置付けられた空間選択的フィルタと、が設けられる。【選択図】図１

Description

本発明は光学装置、より詳しくはイメージサイトメータに関する。

光学技術は、生体及び病原性サンプル中の微量の微粒子の検出となると非常に強力でありうる。より具体的には、大きな研究所やクリニックでは、光学顕微鏡はまた、微粒子（細胞、微生物その他）の高解像度の画像生成のために蛍光標識と共に広く使用されている。市販の蛍光顕微鏡は嵩張り、高額であるが、これはその面倒な組立とそれを構成する光学要素のコストの高さによる。ここ数年、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサアレイに基づく低コストのイメージング技術を利用することによって、市場のニーズを満たす、より小型で安価なイメージングソリューションを見出すための努力がなされてきた。

フローサイトメトリは、レーザに基づくよく知られた蛍光技術であり、近年、目覚ましい成長と革新を遂げた。この分析的研究技術は、単独の細胞や粒子についての異なるパラメータを迅速かつ非常に高い信頼性で測定できる。電荷結合素子（ＣＣＤ）の使用における進化は、高額なレーザ源を最大で２桁も差のある安価な発光ダイオードに置き換え、高機能な顕微鏡をより単純でより経済的な近接検出方式に置き換えることにより、低価格化の大きな可能性をはらむ。これらの装置は、イメージサイトメータ（Ｉ−ＣＹＴ）と呼ばれ、コンピュータスクリーン上での直接的な細胞画像形成を通じて容易に動作可能である。フローサイトメータとは異なり、Ｉ−ＣＹＴは、細胞を１つずつレーザで照射することによって動作するのではなく、何千個という細胞を１枚の写真に画像化し、分析することによって動作する。これらの理由から、Ｉ−ＣＹＴは、従来のフローサイトメータと同様の特性と利益を提供しながら、より安価であるため、徐々に市場に導入されつつある。米国特許第８，８６６，０６３号及び米国特許第７，８７２，７９６号は、イメージサイトメータとの場合と同様に、イメージセンサを利用した顕微鏡システムを開示しており、これはサンプルのレプリカである画像を空間領域（実空間又は座標空間とも呼ばれる）内で検出する。しかしながら、空間領域における画像の検出は、空間解像度と実視野（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ）（ＦＯＶ）と被写界深度（ｄｅｐｔ ｏｆ ｆｉｅｌｄ）（ＤＯＦ）の間のトレードオフを示唆する。光学顕微鏡システムの解像度は、（光源の波長λのオーダの）回折限界によって限定される。米国特許第７，８７２，７９６号では、装置のＤＯＦを増大させるためにレンズレットアレイが用いられている。しかしながら、ＦＯＶは依然としてシステム内の顕微鏡対物レンズによって限定され、したがって、同特許の中で開示されている装置ではλ／２の解像度が実現される可能性があるが、ＦＯＶは小さくなる。米国特許第８，８６６，０６３号には、サンプルを少なくとも２次元で走査して、画像を複数の走査位置で捕捉するように構成された光源を使用することによってＦＯＶを改善した装置か記載されている。しかしながら、ＤＯＦは限定され、ＦＯＶを増大させるためのこの提案によるソリューションは、捕捉された複数の画像からサンプルを再構成するための長い計算を示唆しており、それにも、光源の走査を提供するための面倒な機械的調整が必要となる。

米国特許第８，８６６，０６３号公報 米国特許第７，８７２，７９６号公報

本発明は、空間周波数領域（モーメンタム領域又はフーリエ領域とも呼ばれる）の中、すなわち空間周波数情報を含む平面内で、サンプルの画像を撮影し、分析する。すると、実（空間）画像をフーリエ解析によって再構成できる。以下、「空間周波数」の代わりに「周波数」という用語を使用する。

この目的のために、本発明には、光ビームでサンプルを照明するための光源と、ビーム生成方向においてサンプルの後方に配置され、空間平面内でフーリエ変換結果を生成するための光学変換システムと、光センサアレイと、光学変換システムに関して、フーリエ変換結果が光センサアレイ上に結像されるように配置される空間選択的フィルタと、が設けられる。

サンプル情報が空間領域ではなく周波数領域内のデータを通じて回収されることを考えると、本発明は、大きいＦＯＶとＤＯＦを組み合わせた結果として、１回の撮影で大きい体積（１〜１０ミリリットル）を分析し、微粒子の濃度を自動的かつ正確に推定し、粒子径と複雑性（吸光度）の点で集団を識別することができる。さらに、本開示のシステムにより、適正な光センサアレイを選択して、広い実視野についてサブミクロンの解像度を達成でき、そうする中で機械的な調整や複雑な計算は一切不要である。

図面一式は説明を完全なものとするために、また本発明をよりよく理解するために添付されている。前記図面は本発明の好ましい実施形態を示しており、これは本発明の範囲を限定するものとしてではなく、単に本発明の実施方法の一例として解釈するべきである。

本発明の一般的な実施例を示す図である。 ＯＴＳとして光学レンズを用いた１つの実施形態を示す図である。 本発明の中で空間選択的フィルタとして使用されるマイクロレンズアレイを示す図である。 空間選択的フィルタとしての吸光ポリママスクを示す図である。 蛍光フィルタを備える１つの実施形態を示す図である。 反射フィルタを備える本発明による蛍光サイトメータの他の実施形態を示す図である。 フィルタの使用を避けるために光源が斜めに設置されている１つの実施形態を示す図である。 ２帯域蛍光バンドパスフィルタを備える１つの実施形態を示す図である。 データの処理方法を概略的に示す図である。 本発明の中で使用されるマイクロレンズアレイを示す図である。 本発明において使用される吸光ポリママスクを示す図である。 拡張された装置ＦＯＶを証明する、図３の実施形態からの未処理の捕捉データを示す図である。 ＯＴＳまでの距離に関係なく、サンプルから同じデータが得られる様子を示し、したがって大きい装置ＤＯＦ能力（≒１ｍｍ）を証明する図である。 図３の実施形態により捕捉された２種類の微生物のサンプルボリュームの処理から得られたグラフである。 図３の実施形態により捕捉された混合微生物集団での水サンプルの処理から得られたグラフである。 ＦＩＴＣに結合されたＥ．ｃｏｌｉ抗体で標識され、図５の実施形態により捕捉された、図１４の水サンプルの処理から得られたグラフである。

本発明は以下のように機能する。サンプルを光源で照明する。あるサンプルボリュームについて、前記量と光源との相互作用の結果として、広い周波数帯域で発光する。発光工程はインコヒーレントであり、それゆえ、強度が合算され、干渉効果を生じない。サンプルは光変換システム（ＯＴＳ）の正面に、それに近接して設置される。ＯＴＳは不可欠な部品であり、それは、これによってサンプルボリュームと光ビームとの間の相互作用により生成されるビームのフーリエ変換結果を回収できるからである。利用可能なＯＴＳの例はレンズ、曲率半径がレンズの焦点距離の２倍に等しい曲面鏡、又はピンホールである。

最後に、空間選択的フィルタをＯＴＳの後方に、サンプルと相互作用するビームのフーリエ変換を実現するのに適した距離に設置する。入射ビームは空間選択的フィルタの下部構造によるサンプリングを通じてＸＹ平面内で複数の領域に分割され、それゆえ、部分画像の集合が生成され、換言すれば、周波数情報が部分画像の中に選択的に含まれる。空間サンプリングは、空間選択的フィルタにより生成され、対応する光センサにより検出された部分画像からなる。センサアレイは、空間選択的フィルタの直後に、これに近接して配置される。その結果として得られる画像はすべての部分画像の合成物であり、各々がサンプルボリュームとの相互作用の後のビームをフーリエ変換結果の一部を含む。その結果として得られるこれらの部分画像の強度分布を測定することにより、サンプルのエネルギースペクトルを把握できる。

ＯＴＳの好ましい実施形態は収束レンズである。このようなレンズは本来、後述するように、二次元フーリエ変換を実行する。レンズの正面に配置されるサンプルが振幅Ａの垂直入射平面波により照明される一般的配置を考える。サンプルの振幅透過率はｔ_Ａで表される。この場合、サンプルから出てレンズに入射するビームは、以下のように表すことができる。

光学素子による入射光ビームに対するレンズの効果は、以下のように表すことができる。

したがって、レンズの背後の振幅分布は以下のようになる。

フレネルの回折公式を使うと、レンズからの距離ｚにおける分布Ｕ_ｆ（ｕ，ｖ）を求めることができる。

したがって、入射場分布Ｕ_ｆ（ｕ，ｖ）は、レンズ開口に対する入射場の二次位相因子での二次元フーリエ変換結果に比例し、座標（ｕ，ｖ）における光の振幅と位相は、周波数（ｕ／（λｆ），ｖ／（λｆ））における入力スペクトルの振幅と位相に関係する。

収束レンズの焦点距離を「ｆ」とする。サンプルボリュームは、光源からの垂直入射光により均一に照明されると仮定する。レンズの後方において、複素場分布はレンズ開口内の二次元フーリエ変換結果に比例する。すると、空間領域内でサンプルボリュームを通過した光照射野の振幅と位相は、周波数（ｆ’＝ｕ／（λ・ｆ））で測定されたフーリエ成分の振幅と位相から再構成できる。したがって、ＯＴＳの後方で測定されたパワー（エネルギー）分布からサンプル情報を回収することができる。以下のようなより具体的な構成を考える：収束レンズの正面の（これに近接する）距離「ｄ」（「ｄ」は「ｆ」よりはるかに小さい）に配置された入力サンプルボリュームが、垂直入射コリメートビームにより照明される。サンプルボリュームの後方のビームのフーリエ変換結果が、収束レンズの後方の距離「ｆ」で結像する。

ピンホールの場合、空間領域から周波数領域への変換は、以下のようになる：
開口に入射する光の平面波［Ａ（ｘ）］は像平面上にＡ（ｘ）のフーリエ変換結果を生成する。特に、長方形ではなく円形の回折開口を考え、開口の半径をｗとする。したがって、ｑが開口の平面内の半径座標であるとすると、ｔ_Ａ（ｑ）＝ｃｉｒｃ（ｑ／ｗ）となる。問題の円形対称により、フーリエ変換をフーリエ−ベッセル変換として書き換えることが示唆される。フラウンホーファ回折パターン内の振幅分布は、
となり、式中、Ｊ_１は第１種ベッセル関数である。

曲面鏡は、鏡の曲率半径がレンズの焦点距離（ｆ）の２倍に等しいとき、レンズと同等である。

光信号がＯＴＳによって変換されると、ある画像が空間フィルタにより選択される。このようなフィルタの例は、開口、マイクロレンズアレイ、及び吸光ポリママスク、すなわち入射ビームを空間フィルタ処理が可能な複数の開口で構成される二次元アレイ様構造である。各開口は入射ビームのうち、その振幅と位相の両方に関する情報を保持する部分を選択する。それによって、空間選択的フィルタの後で検出される光信号に含まれるサンプル情報は、光センサアレイにより検出される画像の適当なデータ処理の後に回収できる。複数の二次元アレイ様構造は、本開示による発明を実施するための空間選択的フィルタ処理要件を満たすことがわかっており、その中で、マイクロレンズアレイと、透過性ウェルアレイで構成される吸光ポリママスクが本発明にとって好ましいソリューションであると考えられる。レンズアレイ、ポリママスク、又はこの明細書に適合するその他の構造のピッチは、光センサアレイにより捕捉される部分画像の周期を決定する。マイクロレンズ、ウェル、又はこれと同等のものの開口は、空間選択的フィルタの空間フィルタ処理能力を決定する。

マイクロレンズアレイ構成の場合、フィルタ処理能力は各マイクロレンズの開口角（Ｎ_ｍ）により決まる。
式中、「ｆ_ｍ」は各マイクロレンズの焦点距離、「Ｄ_ｍ」はその直径を表す。

マイクロレンズは小型レンズであり、一般的にその直径は1ミリメートル（ｍｍ）未満であり、１０マイクロメートル（μｍ）程度に小さいことが多い。典型的なマイクロレンズは、１つの平面と光を屈折させる１つの球状凸面を持つ単独の素子であってもよい。マイクロレンズは非常に小さいため、これらを支持する基板は通常、レンズより厚い。より高性能のレンズは非球面を使用しているかもしれず、そのほかには何層かの光学材料を使って、設計された性能を達成するものがあるかもしれない。マイクロレンズアレイは支持基板上に1次元又は２次元アレイとして形成された複数のマイクロレンズを含む。個々のレンズが円形の開口を有し、重複させることができない場合、基板の最大範囲を使用するように、これらは六角形のアレイに配置されてもよい。しかしながら、それでもレンズ間にはギャップがあり、これは非円形の開口を持つマイクロレンズを作ることによってしか小さくすることができない。この光センサアレイでは、非常に小型のレンズシステムが光をフォトダイオードの表面に合焦させて、収束させる役割を果たし、それがピクセルデバイスの非感光領域に当たらないようにする。フィルファクタは、アクティブ屈折領域、すなわち光を検出面へと誘導する領域と、マイクロレンズアレイが占める総隣接領域との比である。マイクロレンズアレイは、体積サンプルの光学的フーリエ変換結果に対するポイントスキャニング顕微鏡対物レンズのアレイとして機能する。

吸光ポリママスクの場合、フィルタ効果を以下のように表すことができる。
式中、「ｄ_m」はマスク開口素子の直径、「Ｌ_ｍ」はマスクの高さを表し、角度ファイ、「ψ_m」は、本質的に入射ビームの空間周波数に関係づけられる法線に関する受光角を表す。

吸光ポリママスクは、ピッチがマイクロレンズアレイのそれと同等であるが、開口がレンズの直径より小さい（１％〜３０％）ウェルアレイであり、それゆえ堅牢な構造を提供する。マスクの高さはフィルタ処理能力を決定する。前記高さは、エイリアシングとアンダーサンプリングの両方を回避する範囲内にあるべきであり、好ましくは、マスクの高さとウェル開口とのアスペクト比（ＡＲ＝Ｌ_ｍ／ｄ_ｍ）が１〜１０という結果になるべきであり、これは６〜４５度の受光角に対応する。受光角が６度未満であると、光信号のアンダーサンプリングの原因となるかもしれず、したがって、サンプルに関する情報を回復するには不十分であり、その一方で、受光角が４５度を超えると、深刻な有害エイリアシングの原因となりうる。マスクが厚くなるほど（高さが増すほど）、構造はより選択的となる。しかしながら、高い選択性と情報損失の原因となる信号のアンダーサンプリングとの間にトレードオフがある。

最後に、結果として得られた画像は光センサアレイによって検出される。このようなアレイの例はＣＣＤ、従来の携帯電話のカメラ、又はその他あらゆる携帯機器、等である。

データ抽出は、フーリエ光学原理に基づいており、検出されたパターン強度は以下の式で求められる。
２次元構成の場合、これは空間周波数分布を表す。画像の中心はゼロ空間周波数であり、その他の強度点の各々（ｎλＺ_ｉｆ_０）は捕捉された信号の調波を表す。

各部分画像は、サンプルボリュームの統計パラメータに関する情報、例えば粒子径と複雑性等の情報を含み、粒子の計数も可能となる。複雑性と粒子径の情報をペアにして散布図にし、結果を使用者に提示することができる。前記散布図により、１つのサンプルボリューム内の複数の微粒子を差別化できる。複雑性のパラメータは、サンプルの吸光度の測定値、すなわち入射ビームがどれだけサンプルによって吸収されるかを指す。

様々な実施形態を、図を参照しながら以下に示す。

図１は本発明の概略図を示し、これは波長帯域制限光源（Ａ１）と、光学変換システム（ＯＴＳ）（Ｂ１）と、空間選択的フィルタ（Ｂ２）と、光センサアレイ（Ａ２）と、を含む。この図はまた、装置内のサンプル（Ｃ１）の位置も示している。サンプルは、光源とＯＴＳとの間に設置される。

図２では、光学レンズがＯＴＳとして使用されている（Ｂ１１）。空間選択的フィルタ（Ｂ２）がレンズの角周波数平面に設置され、サンプルボリューム（Ｃ１）がＯＴＳレンズの付近に設置される。

図３は、空間選択的フィルタとしてのマイクロレンズアレイと、照明を改善するために光源をサンプル上に合焦させるための光学レンズを使用した実施形態を示している。合焦光学レンズ（例えば、焦点距離５０ｍ）（Ｂ３）は、波長帯域制限ＬＥＤ光源（Ａ１）をサンプルボリュームのある領域に合焦させ、その結果得られるビームはＯＴＳ（Ｂ１）によって集光される。ＯＴＳから出たビームは、マイクロレンズアレイ（Ｂ２１）に入射し、これはＯＴＳ（Ｂ１）により生成された空間フーリエ変換成分を分解する。前記アレイは、アレイ面積が１０ｍｍ×１０ｍｍ、合計１１１１個のマイクロレンズのピッチが３００μｍ、厚さが１．２ｍｍであるものとすることができる。光センサアレイ（Ａ２）は、ベイヤフィルタ技術を用いた市販のＣＭＯＳイメージセンサとすることができ、その大きさは５．７０ｍｍ×４．２８ｍｍ、ピッチは２．２μｍである。

図４は、本発明の他の実施形態を示しており、これはマイクロレンズアレイの代わりに吸光ポリママスクを使用することによって、検出信号のエイリアシング効果を防止、又は少なくとも削減する。装置のそれ以外の構成部品は、図２の実施形態と同じである。吸光ポリママスクは、直径２５０μｍ、ピッチ３００μｍの２次元開口アレイ２５０からなる、１０ｍｍ×１０ｍｍ×６ｍｍ（ＸＹＺ）の大きさの構造とすることができる。結果として得られる全体的な構造は１１１１の異なる開口からなり、その各々が光センサアレイへの入射ビームを個別にサンプリングする。

蛍光フィルタを使用する１つの実施形態が図５に示されている。適切な蛍光ファルタはポンプ光を減衰させ（吸収し）、蛍光信号を透過させる。これによって、特に粒子径及び／又は複雑性が微粒子間で差別化するのに不十分である場合、システムの特異性をさらに高める。図１について述べたシステムは、３μｍ差まで、粒子径により微粒子を差別化できることがわかったが、分析対象の多くの生体サンプルが、同等の粒子径の微生物を複数有しているかもしれない。このような場合は、標識し、図５の蛍光フィルタを追加することによって、標的微生物を区別できる。合焦光学レンズ（Ｂ３）（例えば、焦点距離５０ｍｍ）は、波長帯域制限ＬＥＤ光源（Ａ１）をサンプルボリューム（Ｃ２）のある領域に合焦させる。このサンプルボリュームは蛍光ビーム（Ｃ３）を発生させ、これがＯＴＳ（Ｂ１）によって集光される。残りのポンプ信号は蛍光フィルタ（Ｂ４）により減衰（フィルタ処理）され、それによって空間選択的フィルタ（Ｂ２）を通過した蛍光発光だけが残って、光センサアレイ（Ａ２）により検出される。

図６は、サンプルボリュームの後に残るポンプビームを抑制する反射フィルタ（Ｂ５）を使用する別の実施形態を示す。ポンプの拒絶は、蛍光検出の場合に特に重要である。ポンプが蛍光信号より多く拒絶されれば、蛍光フィルタは不要であろう。蛍光発光は全方向性であるため、一部の蛍光信号が反射フィルタにより反射されても、十分な蛍光強度が光センサアレイ（Ａ２）に到達し、捕捉画像からサンプル情報を回収する。

図７の実施形態において、入射ポンプビームはサンプルボリュームに斜めに入射する。それにより、フィルタの使用を回避できる。

図８は、多波長蛍光（２波長蛍光）Ｉ−ＣＹＴ構成を示している。光源（Ａ１）は、１つ又は複数の波長帯域制限ＬＥＤ光源を表す。２帯域蛍光バンドパスフィルタ（Ｂ６）が、図５の蛍光フィルタの代わりに使用されている。より具体的には、このシステムは、ＦＩＴＣ（励起及び発光波長がそれぞれ４９５ｎｍ及び５１９ｎｍ）とＰｅｒＣＰ（励起及び発光波長がそれぞれ４７０ｎｍ及び６７０ｎｍ）で蛍光標識されたサンプルボリュームを、励起ピーク内に中心を置く単独のＬＥＤ光源と５２４ｎｍ／６７６ｎｍ ２帯域蛍光バンドパスフィルタを使って分析するために利用できる。情報はセンサにおいて、カラーイメージセンサを使用し、各発光波長に対応するカラーチャネルからデータを回収することによって単数化できる。これによってシステムの特異性がさらに高まり、それは、微粒子を複雑性、粒子径、蛍光発光によって分別できるようになったからである。

蛍光信号について述べたことは、自家蛍光構成にも当てはまる。すなわち、この場合、ポンプが検出対象の微粒子から直接蛍光を誘発させ、蛍光標識が不要であることを意味する。これは、標識からの蛍光が微粒子に付着し、微粒子自体からの自家蛍光が同じサンプルボリューム領域から発せられ、したがって、信号を同様に処理でき、それゆえ本発明を適用できるからである。

本発明の実現性によって、標準的な光学チャンバ、キュベット、及び流体工学装置（移動部品を持たない装置）を使ってボリュームサンプルを配分できる。光学チャンバ又はキュベットは、断面が円形又は正方形で、一方の端が密閉された、プラスチック、ガラス、又は溶融石英（ＵＶ光のため）で構成され、実験用サンプルを保持するように設計された小型の管状容器である。精度より速度が重視される高速アッセイでは、使い捨てのプラスチックキュベットが使用されることが多い。

さらに、未処理のサンプルをフィルタ処理し、純化できる一方で、標準的な濃縮フィルタを使って濃縮できる。微粒子濃縮器は、使い捨て、単回使用のみの、生体サンプルを濃縮及び／又は純化するためのポリマ膜を備える限外濾過装置である。様々な微粒子に対する本発明の光信号応答は直線的であり、したがって、実際の微粒子濃度をよりよく測定するために濃縮器を使用した場合に本発明は単一値補正係数を必要とする。

図９は、光データ処理を示している。サンプルボリューム（Ｃ１）がＯＴＳ （Ｂ１）の付近に設置されると、フーリエ光学素子の原理から、（Ｂ１）からの距離（Ｂ８）、すなわち空間周波数平面又はフーリエ平面と呼ばれる位置において、受信信号（Ｃ４）はＯＴＳ（Ｂ１）により集光される入射ビームのフーリエ変換結果と同等であるとされる。前記地点（Ｂ８）に空間選択的フィルタ（Ｂ２）を設置することにより、空間フーリエ変換結果のいくつかの部分画像が生成され、それらの各々がフィルタの１つの部分構造に対応する。上記の部分画像で構成される完全な画像が、センサ（Ａ２）で捕捉される。

本発明の１つ実施形態において使用されるマイクロレンズアレイ（Ｂ２１）の概略が図１０に示されている。（Ｂ２１１）は、一方向へのアレイ全体の大きさ、（Ｂ２１２）は直交方向への大きさを指し、（Ｂ２１３）はアレイの厚さを示し、（Ｂ２１４）はレンズ間のピッチである。図２の好ましい実施形態に関して、マイクロレンズアレイは、長さが（Ｂ２１１）に沿って１０ｍｍ、（２１２）に沿って１０ｍｍ、厚さ（Ｂ２１３）が１．２ｍｍ、ピッチ（Ｂ２１４）が３００μｍであり、全体として１１１１のマイクロレンズのアレイとなる。

本発明の１つの実施形態において使用される吸光ポリママスク（Ｂ２２）の概略は図１１からわかる。（Ｂ２２１）は、アレイのＸ及びＹ方向の全体の大きさを指し、（Ｂ２２２）は直交するＺ方向の大きさを指し、（Ｂ２２３）はマスクの開口間のピッチを示し、（Ｂ２２４）は前記開口の径を示す。図３の好ましい実施形態に関して、吸光ポリママスクは、長さが（Ｂ２２１）に沿って１０ｍｍ、（Ｂ２２２）に沿って６ｍｍ、ピッチ（Ｂ２２３）が３００μｍ、開口サイズ（Ｂ２２４）が２５０μｍであり、全体として１１１１の開口を有する構造となる。

図１２は、図３の実施形態からの未処理の捕捉画像を示しており、装置ＦＯＶが拡張していることを証明する。明視野顕微鏡を含むイメージング応用の先行技術の場合、ＦＯＶは装置内で使用される顕微鏡対物レンズに依存する。例えば、１６倍の対物レンズの場合、ＦＯＶは１．３ｍｍ^２である。本発明では、サンプルはフーリエ変換結果を捕捉するレンズの背後に、極めて近接して設置される。したがって、このシステム内の倍率は約１である。したがって、サンプル捕捉面積はセンサにおいて結像されるものと同等であり、すなわち、５．７０ｍｍ×４．２８ｍｍ＝２４．３９ｍｍ^２で、大きさＦＯＶ＝２４．３９ｍｍ^２が実現される。これに対し、先行技術では、実空間で画像を捕捉することは、サンプルをレンズから離して設置しなければならないことを意味し、したがって倍率が１より大きくなり、有効視野が縮小する。

図１３において、５μｍの粒子のサンプルをＯＴＳからの異なる距離において捕捉し、処理して、サンプル粒子径と複雑性の情報を回収した。結果を表す図のグラフは、ＯＴＳまでの距離に関係なく、同じデータが得られる様子を示しており、それゆえ、装置のＤＯＦ能力（≒１ｍｍ）が大きいことを証明している。微粒子の検出は、回収される粒子径と複雑性情報の点で反復可能である。

図１４は、図３の実施形態で捕捉された２つのサンプルボリュームの処理から得られた散布図を示し、ＯＴＳ（Ｂ１）は図２に示される光学レンズ（Ｂ１１）である。濃度１０^４ ＣＦＵ／ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のサンプルと同じ濃度のＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）のサンプルを、どちらもリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、捕捉、処理した。大腸菌微生物の平均粒子径は２μｍであることがわかっており、酵母の平均粒子径は５μｍである。グラフは、分析した体積サンプル内の微粒子の複雑性（横軸）と粒子径（縦軸）を示す。このグラフから、捕捉信号から得られるその粒子径と複雑性のパラメータの点で、異なる微生物を検出し、特徴付けし、区別できることが明らかである。

図１５は、図３の実施形態で捕捉された汚染水サンプルの処理から得られる散布図を示す。サンプルは当初、未知の種類の微生物を含んでいた。大腸菌の存在を確認するために、大腸菌濃度１０^４ＣＦＵ／ｍｌの増菌培養液１ｍｌを、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）蛍光マーカに抗大腸菌を結合させたものとともにＰＢＳで希釈し、汚染水サンプル２ｍｌに添加した。このプロセスにより、添加された濃度１０^４ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌が確実に蛍光標識される。その結果として得られたグラフは、サンプルの完全な微生物負荷に対応する情報を示している。

図１６は、同じサンプルに対応する散布図を示しているが、今回は図５の実施形態で捕捉されたものである。この場合、ＦＩＴＣ発光大腸菌に対応するデータだけが回収される。

本文中、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及びその派生形（例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”等）は、排他的な意味で解釈するべきではなく、すなわち、これらの用語は、記載され、定義されているものが、それ以外の要素、ステップ、その他を含む可能性を排除しないと解釈するべきである。

それに対して、本発明は明らかに、本明細書に記載されている具体的な実施形態に限定されないだけでなく、特許請求の範囲で定義された本発明の一般的範囲内で、当業者であれば着想しうるあらゆる変形（例えば、材料、寸法、構成部品、構成、その他の選択に関するもの）も包含する。

Claims (14)

1. 微粒子サンプルの特徴付けと定量化を行うためのイメージサイトメータにおいて、
   サンプルに向けられる入射ビームを生成し、ビームがサンプルを通過した後に実空間内の光信号が生成されるようにする光源と、
   サンプルの後方に位置付けられ、空間周波数領域における光信号のフーリエ変換結果を生成する光変換システムと、
   光変換システムの複数の焦点、すなわちサンプル上のある地点から発せられた光線が収束する点に配置された空間選択的フィルタと、
   焦点に位置付けられ、結像されたフーリエ変換結果を検出する光センサアレイと、
   を含むことを特徴とするイメージサイトメータ。
2. 請求項１に記載のサイトメータにおいて、
   光変換システムは光学レンズ、曲面鏡、又はピンホールであることを特徴とするサイトメータ。
3. 請求項１又は２に記載のサイトメータにおいて、
   空間選択的フィルタはマイクロレンズアレイであることを特徴とするサイトメータ。
4. 請求項３に記載のサイトメータにおいて、
   マイクロレンズは、直径が１ミリメートル未満、好ましくは１０マイクロメータであり、支持基板上で２次元アレイを形成する小型レンズであることを特徴とするサイトメータ。
5. 請求項１又は２に記載のサイトメータにおいて、
   空間選択的フィルタは吸光ポリママスクであることを特徴とするサイトメータ。
6. 吸光ポリママスクは、深さ１ミリメートル未満、好ましくは１０マイクロメートルのピッチを有し、開口がピッチより１％〜３０％小さいウェルを有することを特徴とするサイトメータ。
7. 請求項５又は６に記載のサイトメータにおいて、
   マスクの高さは１ｍｍ〜１０ｍｍの間であることを特徴とするサイトメータ。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のサイトメータにおいて、
   光センサアレイは、光信号をデジタル化する２次元フォトダイオードと、サンプルを表す情報を回収する処理手段と、を含むことを特徴とするサイトメータ。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のサイトメータにおいて、
   サンプルの後に、光信号をセンサアレイに合焦させるための補助光学レンズを含むことを特徴とするサイトメータ。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のサイトメータにおいて、
    サンプルと光変換システムとの間に設置された蛍光バンドパスフィルタをさらに含むことを特徴とするサイトメータ。
11. 請求項１０に記載のサイトメータにおいて、
    蛍光フィルタは多帯域蛍光バンドパスフィルタであることを特徴とするサイトメータ。
12. 請求項１〜１１に記載のサイトメータにおいて、
    光センサは、携帯電話、スマートフォン、スマートタブレット、又はウェブカム等の携帯機器のイメージセンサからなることを特徴とするサイトメータ。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のサイトメータにおいて、
    サンプル容器は光透過性チャンバ、キュベット、又はマイクロ流体装置であることを特徴とするサイトメータ。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサイトメータにおいて、
    サンプルボリュームは、微粒子フィルタと濃縮器を使って調整されることを特徴とするサイトメータ。