JP2013525811A - オンチップの広視野のレンズフリー蛍光画像化 - Google Patents

Abstract

画像化デバイスは、いかなるレンズまたは機械的走査も必要とせずに、広い視野にわたって試料を蛍光画像化するために、圧縮サンプリングアルゴリズムと共に光ファイバのフェースプレート（ＦＯＦ）を使用する。この画像化デバイスは、試料を保持するよう構成された試料ホルダと、試料ホルダの下面の向かい側に試料ホルダと近接して配置されたプリズムまたは半球のガラス面とを有する。光源は、プリズムまたは半球面を介して試料を照明するよう構成されており、実質的に全ての光が試料ホルダの下面で全内部反射される。ＦＯＦは試料ホルダの下面に近接して配置され、光ファイバのアレイは入力側と出力側とを有している。このデバイスは、光ファイバのアレイの出力側に近接して配置された画像センサアレイを有する。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本願は、２０１０年５月３日出願の米国仮特許出願第６１／３３０，７９９号、および２０１１年１月６日出願の米国仮特許出願第６１／４３０，４４９号の権利を主張するものである。米国特許出願第６１／３３０，７９９号および第６１／４３０，４４９号は、本書において完全に説明されたものとして参照により援用される。優先権は、米国特許法１１９条および他の適切な法令に準じて主張するものである。

本発明の分野は概して、いかなるレンズまたは機械的走査も必要とせずに、非常に広い視野にわたってオンチップの蛍光画像化をするデバイスおよび方法に関するものである。

数十年の間、光学顕微鏡法は工学、自然科学、医学および生物学を含む様々な分野に貢献してきた。その長い歴史にもかかわらず、比較的最近まで、光学顕微鏡のデザインや動作原理に著しい変化はなかった。最近の十年間、ナノ世界の域をより理解しようとする探求によってある程度動機付けられ、回折限界などの最も基本的な光学画像化の制約事項を対処することにより、超解像技術が光学顕微鏡法を革新し始めた。このような超解像技術に加えて、幾つもの他の新たな画像化機構は、より優れた速度、信号対雑音比（ＳＮＲ）、コントラスト、処理能力、特異性などに対して光学顕微鏡法の技術の状態を向上させることも実現してきた。顕微鏡法における最近の進歩は、画像化の基本的な障害を克服するために様々な革新的技術を利用し、新たな発見をできるようにすることで様々な分野に著しい刺激を引き起こしてきた。しかし、この進歩とともに、光学画像化プラットフォームの全体的な複雑性や費用が比較的増大してしまい、設備が整った研究所以外において、これらの高性能の光学画像化モダリティの一部の利用が普及することを制限している。

その一方で、小さいピクセル、優れたダイナミックレンジ、フレームレートおよび信号雑音比を有する著しく大きな領域と、さらにより速く、安価かつ強力なデジタルプロセッサおよびメモリとを有する、非常に安価な二次元固体検出アレイを用いて、デジタル技術における急速な発展が起こっている。この進行中のデジタル革命はさらに、進歩した画像化理論と数値アルゴリズムと組み合わせた場合、光学画像化および顕微鏡法について、光学画像化装置を簡略化することについて革新的な別の側面に直面する機会を作り出し、場合によっては性能と引き替えにすることなく、著しく小型で費用効果があり、使い易いものにする。数十年の間、レンズは所望の視野および画像の分解能によって決まる最低の空間−帯域の積で動作するように検出器（アナログまたはデジタル）を補助してきた。しかしながら、上記デジタル革命は、１０００万−２０００万以上の２Ｄの空間−帯域の積が今日では容易に可能となるように、デジタル画像機器について最先端技術に既に進化させている。これは、今日の検出アレイは回折によって生じる情報の歪みの取り扱いに上手く適しており、光学画像化においてレンズを使用することの絶対的な必要性を提起しうるものであることを示唆している。さらに、新たなアルゴリズムと共に、今日のデジタルプロセッサはさらに、ほぼ瞬間的に、物理レンズの役割をすべく検出器の末端で取得された情報を処理するのに適した形態でもある。このことを念頭において、光学画像化デバイスにおいて広く使用されるレンズ（または同様の波面形状要素）は、幾つかの用途での必要性（特にセル顕微鏡法）について、費用効果が高く、小型かつ単純な光学構造に潜在的に交換することが可能であると推測され、この光学構造は、デジタルドメインにおいて、光学要素の複雑さがないことを相殺している。この手法は特に、細胞学、マイクロ流体工学、および資源の限られた状況での必要性や要求事項に対処し、潜在的に感染症を伴う問題に関連する様々な国際的健康状態に対する対策で飛躍的な跳躍をもたらすであろう。

本発明の一実施形態では、画像化デバイスは、試料を保持するように構成された試料ホルダであって、下面を有する試料ホルダと、試料ホルダの下面の向かい側に試料ホルダと近接して配置されたプリズムとを具える。このデバイスは、プリズムの一面を介して試料を照明するよう構成された光源を有しており、実質的に全ての光は、試料ホルダの下面で全内部反射される。光ファイバアレイは試料ホルダの下面に近接して配置され、この光ファイバアレイは入力側と出力側とを有する。このデバイスは、光ファイバアレイの出力側に近接して配置された画像センサアレイを有する。

本発明の他の実施形態では、画像化デバイスが、試料を保持するよう構成された試料ホルダを有し、この試料ホルダは下面を有する。半球面が、試料ホルダの下面の向かい側に試料ホルダと近接して配置される。このデバイスは、半球面を介して試料を照明するよう構成された光源を有しており、実質的に全ての光は、試料ホルダの下面で全内部反射される。光ファイバアレイは試料ホルダの下面に近接して配置され、光ファイバアレイは入力側と出力側とを有しており、光ファイバアレイの入力側は、出力側における光ファイバ導波管の密度と比較して光ファイバ導波管の密度が高い。このデバイスは、光ファイバアレイの出力側に近接して配置された画像センサアレイを有する。

本発明の更に他の実施形態では、試料を画像化する方法が、試料を照明する前にプリズムを通過した蛍光励起放射を用いて試料ホルダに含まれる試料を照明するステップを含んでおり、実質的に全ての蛍光励起放射は、試料ホルダの下面で全内部反射され、試料からの蛍光発光放射が試料ホルダを出る。蛍光発光放射の画像フレームは、画像センサアレイを用いて取得される。次いで、取得した画像フレームは圧縮復号され、復号画像フレームを生成する。

図１Ａは、一実施形態による画像化デバイスの概略図である。光ファイバのフェースプレート（ＦＯＦ）が、試料ホルダと画像センサアレイの間に挿入されている。 図１Ｂは、図１ＡのＦＯＦの顕微鏡画像である。ＦＯＦ内の各ファイバの開口数は約０．３である。 図２は、異なる垂直位置に配置された複数の微小チャネルを有する試料ホルダの側面図である。 図３Ａは、本発明の一実施形態による試料を画像化する方法に使用される、取得および圧縮復号動作を概略的に示している。 図３Ｂは、本発明の一実施形態による試料を画像化する動作を示している。 図４Ａは、ＦＯＦを使用せずに撮影した１０μｍ微粒子の蛍光画像を示している。 図４Ｂは、ＦＯＦを使用して撮影した１０μｍ微粒子の蛍光画像を示している。 図４Ｃ１は、ＦＯＦを使用せずに取得した図４Ｂの領域（ｃ）の拡大図を示している。 図４Ｃ２は、ＦＯＦを使用して取得した図４Ｂの領域（ｃ）の拡大図を示している。 図４Ｃ３は、圧縮復号した領域（ｃ）の拡大図を示している。 図４Ｄ１は、ＦＯＦを使用せずに取得した図４Ｂの領域（ｄ）の拡大図を示している。 図４Ｄ２は、ＦＯＦを使用して取得した図４Ｂの領域（ｄ）の拡大図を示している。 図４Ｄ３は、圧縮復号した領域（ｄ）の拡大図を示している。 図４Ｅ１は、ＦＯＦを使用せずに取得した図４Ｂの領域（ｅ）の拡大図を示している。 図４Ｅ２は、ＦＯＦを使用して取得した図４Ｂの領域（ｅ）の拡大図を示している。 図４Ｅ３は、圧縮復号した領域（ｅ）の拡大図を示している。 図４Ｆ１は、ＦＯＦを使用せずに取得した図４Ｂの領域（ｆ）の拡大図を示している。 図４Ｆ２は、ＦＯＦを使用して取得した図４Ｂの領域（ｆ）の拡大図を示している。 図４Ｆ３は、圧縮復号した領域（ｆ）の拡大図を示している。 図５Ａは、ＦＯＦを使用せずに取得した、１０μｍ粒子のデジタルズームしたレンズフリーの蛍光画像を示している。 図５Ｂは、図５Ａの圧縮復号画像の出力（復号画像フレーム）を示している。 図５Ｃは、ＦＯＦを使用して取得した、１０μｍ粒子のデジタルズームしたレンズフリーの蛍光画像を示している。 図５Ｄは、図５Ｃの圧縮復号画像の出力（復号画像フレーム）を示している。 図６Ａ−Ｅは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、異なる分離距離における２の蛍光微小物体（１０μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示しており、ＦＯＦを使用して取得した。 図６Ｆ−Ｊは、図６Ａ−Ｅの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図６Ｋ−Ｏは、図６Ａ−Ｅに示すものと同一セットのレンズフリー画像についてルーシー・リチャードソンアルゴリズムの解析結果を示している。 図７Ａは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、２５μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図７Ｂは、図７Ａの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図７Ｃは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、１９μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図７Ｄは、図７Ｃの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図７Ｅは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、１２μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図７Ｆは、図７Ｅの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図７Ｇは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、７μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図７Ｈは、図７Ｇの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図８Ａは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、２５μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図８Ｂは、図８Ａの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図８Ｃは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、１９μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図８Ｄは、図８Ｃの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図８Ｅは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、１２μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図８Ｆは、図８Ｅの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図８Ｇは、図１Ａの画像化デバイスを用いて取得した、８μｍの分離距離における２の蛍光微小物体（２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像を示している。 図８Ｈは、図８Ｇの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。 図９Ａは、画像化デバイスを用いて、５０μｍの層間Δｚで画像化した２つの層（層１および層２）を示している。 図９Ｂは、広いＦＯＶをデジタルトリミングした領域から取得したレンズフリーの未加工画像を示しており、ＦＯＦを使用せずに画像化した。 図９Ｃは、図９Ｂの未加工画像の層１を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｄは、図９Ｂの未加工画像の層２を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｅは、広いＦＯＶをデジタルトリミングした領域から取得したレンズフリーの未加工画像を示しており、ＦＯＦを使用して画像化した。 図９Ｆは、図９Ｅの未加工画像の層１を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｇは、図９Ｅの未加工画像の層２を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｈは、広いＦＯＶをデジタルトリミングした別の領域から取得したレンズフリーの未加工画像を示しており、ＦＯＦを使用せずに画像化した。 図９Ｉは、図９Ｈの未加工画像の層１を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｊは、図９Ｈの未加工画像の層２を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｋは、広いＦＯＶをデジタルトリミングした別の領域から取得したレンズフリーの未加工画像を示しており、ＦＯＦを使用して画像化した。 図９Ｌは、図９Ｋの未加工画像の層１を圧縮復号した結果を示している。 図９Ｍは、図９Ｋの未加工画像の層２を圧縮復号した結果を示している。 図１０Ａは、他の実施形態による画像化デバイスの概略図である。この実施形態は、プリズムの代わりに半球面を使用している。 図１０Ｂは、先細ＦＯＦの入力側の顕微鏡画像（４０倍対物レンズ）である。 図１０Ｃは、先細ＦＯＦの出力側の顕微鏡画像（４０倍対物レンズ）である。 図１１Ａは、図１０Ａの画像化デバイスの全体的な画像化ＦＯＶ（最大６０ｍｍ^２）を示している。 図１１Ｂは、レンズフリーの蛍光画像の一部の未加工画像フレームを示している。 図１１Ｃは、圧縮復号した後の復号画像フレームを示している。 図１１Ｄは、従来のレンズベースの蛍光顕微鏡（１０倍対物レンズ、ＮＡ＝０．２５）を用いた、同一微粒子（直径４μｍ）の顕微鏡画像を示している。 図１２Ａは、図１０Ａの画像化デバイスを用いて画像化した直径２μｍ粒子の未加工画像を示している。 図１２Ｂは、図１２Ａの復号画像フレームを示している。 図１２Ｃは、図１２ＡのＦＯＶの顕微鏡画像を示している。 図１２Ｄは、図１０Ａの画像化デバイスを用いて画像化した直径２μｍ粒子の未加工画像を示している。 図１２Ｅは、図１２Ｄの復号画像フレームを示している。 図１２Ｆは、図１２ＤのＦＯＶの顕微鏡画像を示している。 図１２Ｇは、図１０Ａの画像化デバイスを用いて画像化した直径２μｍ粒子の未加工画像を示している。 図１２Ｈは、図１２Ｇの復号画像フレームを示している。 図１２Ｉは、図１２ＧのＦＯＶの顕微鏡画像を示している。 図１２Ｊは、図１０Ａの画像化デバイスを用いて画像化した直径２μｍ粒子の未加工画像を示している。 図１２Ｋは、図１２Ｊの復号画像フレームを示している。 図１２Ｌは、図１２ＪのＦＯＶの顕微鏡画像を示している。 図１３Ａは、ジアルジアムリス嚢子のレンズフリーの未加工蛍光画像フレーム４８を示している。 図１３Ｂは、図１３Ａの未加工画像フレーム４８の復号画像フレーム５４を示している。 図１３Ｃは、同一ＦＯＶの従来の顕微鏡画像（１０倍）を示している。

図１Ａは、本発明の一実施形態による画像化デバイス１０を示している。この画像化デバイス１０は、詳しく後述するように、蛍光励起光源として機能する光源１２を有している。光源１２は、蛍光ポンプとして機能可能な幾つかの光源を含みうる。これらは、例として、ダイオード、レーザ、ＬＥＤ、または、単色フィルタに連結されたキセノンランプといったフィルタ付光源さえも含みうる。図１Ａに見られるように、光源１２は任意の開口１４を有することができ、その開口を通って光が通過する。代替的に、光源１２は、光ファイバケーブル（例えば、マルチモード光ファイバケーブル）を含みうる。

さらに図１Ａを参照すると、画像化デバイス１０は、試料１８を保持するよう構成された試料ホルダ１６を有している。この試料１８は、出所が生物学的または非生物学的な微小物体２０を含みうる。一例として、試料１８の微小物体２０は、例えば、１以上の蛍光部分で分類される細胞、細胞小器官などを含みうる。試料ホルダ１６は、試料１８を配置する三次元容量または空間を有しうる。代替的に、試料ホルダ１６は、図２に図示するような一以上の微小チャネル２２を有しうる。図２は、４の垂直方向に積み重ねられた微小チャネル２２を図示している。微小チャネル２２は、流動ベースの画像化用途に利用することができる。例えば、細胞群などを含む流体を有する試料１８を、微小チャネル２２を通して送り込む、あるいは流動させることができる。微小チャネル２２が積み重ねられると、画像化と復号を同時にすることが可能となる。これは特に、迅速に画像化する、および／または珍しい事象を撮影する必要がある場合（例えば、大きい細胞群の癌検診）、あるいはＤＮＡまたはプロテインの微小アレイの用途に適している。

図１Ａに見られるように、試料ホルダ１６は、上面２４と下面２６を有している。図１Ａに示す実施形態では、試料ホルダ１６の下面２６は、厚さ５０μｍのカバーガラスの下面である。図１Ａに見られるように、プリズム２８は、試料ホルダ１６の上に配置される。このプリズム２８は、複数の面を有している。ポンプ光源１２はプリズム２８の面３０の１つに入り、試料ホルダ１６を通過する。ポンプ光源１２は微小物体２０と相互作用し、図１Ａの矢印３２に示すように、蛍光発光を生じさせる。伝搬波の形状をした光源１２からのポンプ光は、試料１８全体を励起した後に全内部反射（ＴＩＲ）する。図１Ａの実施形態では、ＴＩＲは、下面２６に、特にカバーガラスの底小面におけるガラスと空気の界面に生じる。ＴＩＲしたポンプ光は、プリズム２８の面３４、３６を介して反射され、拒絶される。

さらに図１Ａを参照すると、励起した微小物体２０からの蛍光発光３２が、密集した光ファイバフェースプレート（ＦＯＦ）３８を用いて収集されている。ＦＯＦ３８は、入力側４０と出力側４２とを有する光ファイバ導波管のアレイである。図１Ａおよび１Ｂに図示された実施形態では、ＦＯＦ３８内の各ファイバの開口数は約０．３である。ＦＯＦ３８内の各ファイバの周期は約６μｍである。図１Ａに示すＦＯＦ３８の厚さは約１ｃｍである。一般に、ＦＯＦ３８の厚さは、約１００μｍ乃至約５ｃｍの範囲で足りる。ＦＯＦ３８の顕微鏡端面図が、拡大部とともに図１Ｂに図示されている。この実施形態では、ＦＯＦ３８が物理的な拡大を有していないため、詳しく後述する検出アクティブ領域と同等の視野（ＦＯＶ）を有している。

蛍光発光３２は、ＦＯＦ３８の出力側４２を出た後に、吸収フィルタ４４を通過する。この吸収フィルタ４４を用いて、ポンプ光源１２から拡散した光の検出を除去または軽減する。図１Ａに示す吸収フィルタ４４は、厚さ７５μｍ乃至１００μｍのプラスチックベースの吸収フィルタである。この吸収フィルタ４４は、蛍光発光３２を通過させることができる。図１Ａに見られるように、この蛍光発光３２は、画像センサアレイ４６へと通過している。画像センサアレイ４６は、比較的広い、例えば８ｃｍ^２よりも広い検出アクティブ領域を有していることが好ましいが、他のサイズも有効である（例えば、約１ｍｍ^２乃至約２０ｃｍ^２の範囲内）。画像センサアレイ４６は、市販のＣＭＯＳまたはＣＣＤデバイスを含みうる。図１Ａは、９μｍのピクセルサイズおよび２５ｍｍ×２５ｍｍのアクティブ領域を有する、ＫＯＤＡＫ（ＣＡＩ−１１００２）から入手可能な大型フォーマットＣＣＤを示している。

図１Ａを参照すると、デバイス１０の一般的な寸法は、ｗ_１×ｗ_２＝２５ｍｍ×３５ｍｍ；ｐ＝１．７ｃｍ；ｋ〜１０−１００μｍ；ｆ＝１−２ｃｍを含む。当然のことながら、これらの寸法は変更することができる、あるいは具体的な上記寸法を越えて変化させることができる。

画像センサアレイ４６は、未加工の画像フレーム４８を取得するために使用される。図３Ａに示すように、これらの未加工画像フレーム４８は、その後のデータ処理のために、コンピュータ５０または他のマイクロプロセッサに転送されるか通信される。特に、コンピュータ５０は、圧縮復号アルゴリズム５２を搭載する、あるいはそれを有するように構成されている。詳しく後述するように、圧縮復号アルゴリズム５２を未加工画像フレーム４８に適用して、復号画像フレーム５４を生成する。この圧縮復号アルゴリズム５２は、画像センサアレイ４６でサンプリングされた二次元（２Ｄ）レンズフリー画像を作り出す蛍光点の分布を復元する。復号画像フレーム５４は、例えば、コンピュータ５０に接続されたディスプレイ５６に表示することができる。復号画像フレーム５４が追加の画像処理ステップを受けるようにすることもできる。例えば、復号画像フレーム５４は、特定の珍しい微小物体２０を分析することができ、特に珍しい表現型（例えば、癌）を示す細胞などを画像化する。コンピュータ５０は、このような細胞を識別し、これをユーザに強調表示することができる。

図３Ｂは、図１Ａに示すデバイス１０を使用して試料を画像化するために用いられる操作順序を示している。操作１０００では、光源１２を用いて、プリズム２８を通る励起放射で試料１８を照明する。操作１１００では、ＦＯＦ３８を通過した蛍光放射の未加工画像フレーム４８を画像センサアレイ４６において取得する。操作１２００では、次いで未加工画像フレーム４８が圧縮復号アルゴリズム５２を受けて、復号画像フレーム５４を生成する。

オンチップのレンズフリー蛍光画像化と圧縮サンプリング理論の関係を簡潔に説明すると、試料容量内の蛍光粒子／細胞分布は、

で表すことができ、Ｎはボクセルの数を表している。このモデルを実際の画像化試験に上手く適応させるため、

の物理的グリッドサイズをｄであると仮定する。視覚化するため、単純な微小流体チャネルについて、

がチャネルのアクティブ面上の点を表し、キャプチャした細胞はＮ×ｄ^２の画像化領域内に存在していると考えることができる。しかし、多層微小チャネルについては、

は３Ｄの不連続容量を表している。

広視野の蛍光血球計算、珍しい細胞の解析および高処理の微小アレイの画像化といった、この作業を対象とした用途については、通常、

が始めはスパースであると仮定することができ、これにより、

のＳ係数のみが非ゼロとなり、Ｓ＜＜Ｎとなる。対象の細胞の殆どは、空間分解能が限られていることによりオーバーサンプリングされず、実際の

に対してＳ値を限定してしまうため、この仮定は更に本発明の等倍レンズフリー構造を正当化するものである。従って、その基本的な理論の重要な要求事項であるため、

のスパース性は、圧縮サンプリングに真っ先に関連してくる。

図１Ａに示すようなレンズフリーの蛍光画像化プラットフォームでは、

が、画像センサアレイ４６に作用する強度分布を一意的に特定する。

の各非ゼロ要素について、波動が伝達され、試料ホルダ１６の異なる層を通過した後に、試料容量内の他の蛍光点によって作られた波動に非干渉的に加わる。したがって、検出面の直上（測定／サンプリングされる前）の強度分布は、以下のように記載することができる。

ここで、文字ψ_ｉ（ｘ，ｙ）は、ｃ_ｉの物理的位置に生じる、検出面直前の２Ｄ波強度を表している。ψ_ｉの分析的形態は、図１Ａに表されるような、特定のレンズフリー構造について得ることができる。しかしながら、実用的な観点から、小さな蛍光微小物体２０などを用いることで、各物体面について容易に測定することができる。

図１Ａにおいてフェースプレートを使用しなくとも、所与の物体面についてのψ_ｉの機能的形態が空間不変量であることが直接見て取れる。これは、ψ_ｉ（ｘ，ｙ）＝ｐ（ｘ−ｘ_ｉ，ｙ−ｙ_ｉ）と言うことと同等であり、ｐ（ｘ，ｙ）は所与の物体層についてのシステムの非干渉性点拡がり関数（ｐｓｆ）であり、（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）はｃ_ｉの物理的位置を指している。式（１）はサンプリング面の直前の強度を表しているため、この定義では、ｐ（ｘ，ｙ）は検出器におけるピクセルサイズとは関係ないことに留意されたい。試料とフェースプレート面の間には著しい間隙があり、フェースプレートの底面と検出面の間にも同様の間隙があるため、図１Ａに示すように密集したＦＯＦ３８についても同じ空間不変性の性質がある。したがって、図１Ａのレンズフリーの蛍光画像化構造について、フェースプレートの作用が有ろうと無かろうと、通常は次のように記載することができる。

多層の蛍光微小物体２０についても、異なる層の非干渉性点拡がり関数をさらに合計に含む場合、同様の式を書くことができる。

式（２）は、「既に」スパースな蛍光物体分布

を、画像センサアレイ４６によってこれからサンプリングしようとする光強度分布に関連付けるものである。ψ_ｉ（ｘ，ｙ）で与えられる表示基底は、レンズフリーの回折に基づいているため、直交基底ではない。

は既にスパースであって、表示基底とは無関係であると仮定されているため、圧縮復号の用途をこの作業に限定するものではない。一方、ψ_ｉ（ｘ，ｙ）が直交基底を形成しないということは、圧縮復号できる空間分解能を限定し、ｃ_ｉ値は密接していることにより、対応するψ_ｉ（ｘ，ｙ）は、所与の検出信号雑音比（ＳＮＲ）に対して互いによく類似する。これは、後述するように、システムの制限等長性に関係している。しかしながら、等倍で広視野のレンズフリー蛍光画像化を実現するために空間分解能を犠牲にするということは既知であるため、その物理的意味合いは何ら新しいものではない。

次に、検出アレイにおけるｆ（ｘ，ｙ）のサンプリングを、次のように公式化することができる。

ここで、Φ_ｍ＝φ（ｘ−ｘ_ｍ，ｙ−ｙ_ｍ）がサンプリング／測定基底を表しており、ｍ＝１、すなわちＭは、（ｘ_ｍ，ｙ_ｍ）の中心座標を有する検出アレイのｍ^ｔｈピクセルを表し、φ（ｘ，ｙ）はピクセル関数を表し、これはＷ／２以下の｜ｘ｜、｜ｙ｜については検出定数Ｋ、Ｗ／２より大きい｜ｘ｜、｜ｙ｜については０であると概算することができる（Ｗを正方ピクセルサイズと仮定する）。この記載では、画像センサアレイ４６のフィルファクタは、量子効率などと共に、全てＫに一括される。この例では、（ピクセルビニングを通して）W＝９μｍおよびＷ＝１８μｍを使用していることに留意されたい。

これらの定義について、レンズフリーの蛍光画像化の問題は、次のように要約することができる。すなわち、Ｉ_ｍから独立しているＭの測定値に基づいて、試料におけるスパースな蛍光源分布

を概算したい。

更に考察すると、式（３）は仮想の近距離サンプリング試験を表し、画像センサアレイ４６の各ピクセルがｆ（ｘ，ｙ）の一部を測定する。画像センサアレイ４６に作用する任意の強度分布ｆ（ｘ，ｙ）について、少数のピクセル値（Ｉ_ｍ）が関数全体を表すことはできない。しかしながら、ファーフィールドに位置する非干渉性点光源のスパース分布によって、検出面においてサンプリングされる強度の分析結果を作り出す場合、より少ないピクセルを用いて、圧縮復号に基づいて光源分布を復元することができる可能性がある。この復号ステップを効率的に作用させるため、各ピクセルは、理想的には全てのｃ_ｉ値から“ある程度の”寄与を検出すべきであり、これは、比較的広い点拡がり関数（ｐｓｆ）を必要とすることを示唆している。しかしながら、蛍光の拡がりも検出面における信号強度を低下させるため、点拡がり関数の最適範囲は、検出ＳＮＲによって実質的に特定される。ある極端な例では、同一のスパース光源分布

が仮に画像センサアレイ４６のピクセルと直接接触して配置された場合、非干渉性の各点源は１つのピクセル値にのみ寄与しているため、圧縮復号することはできない。例えば、同じピクセル上に位置する２のサブピクセルの点源は、その特定のピクセルにのみ寄与し、測定ＳＮＲに関わらず、それらを物理的に分解することは不可能である。しかしながら、同じ２のサブピクセル点が、検出面上にある程度離れて位置しており、これにより、より多くのピクセルが発光の加重寄与（weighted contribution）を検出できる場合には、圧縮復号を介して互いに分解することができる。

ここでは、非適応的な画像化について検討しているため（すなわち、蛍光粒子／細胞の想定されるｘ−ｙ位置について先験的な情報はない）、

を再構築するためにピクセル値（Ｉ_ｍ）のサブセットは使用していない。したがって、単一の層の物体については、図１Ａのような等倍を用いて、Ｎ×ｄ^２＝Ｍ×Ｗ^２がある。ここで、物体面において１０μｍ未満の空間分解能を要求するため、ｄ＝２−３μｍを使用しており、これはＷ＝９μｍについてＮが９Ｍ以上であることを示唆している。幾つかの試験については、ｄ＝２μｍとともにＷ＝１８μｍのピクセルサイズも使用しており、Ｎ＝８１Ｍであることを示唆している。さらに、３の異なる蛍光微小チャネル２２が垂直方向に積み重ねられ、一度のスナップショットで同時に画像化される多層の試験については、Ｎ＝２７Ｍであり、これらはすべて、測定数（Ｍ）が再構築点の数（Ｎ）よりも著しく少ないため、圧縮画像化であることを示している。

この手法において、

を概算するための復号プロセスの有効性はさらに、全ての起こりうるｍ＝１：Ｍおよびｉ＝１：Ｎ組についてのΦ_ｍとψ_ｉの間の最大空間関係に依存している。したがって、この最大空間相関係数は、サンプリング基底と表示基底の間の非干渉性の測定を規定し、Ｍの測定から

を正確に再構築する可能性に関係させることができる。所与の物体面について、Φ_ｍとψ_ｉの双方のシフト不変性により、この干渉性の算出は、ピクセル関数φ（ｘ，ｙ）と非干渉性点拡がり関数ｐ（ｘ，ｙ）の間の相関関係の算出に相当する。これらの２つの空間関数の間の相対関係が小さくなると、圧縮復号プロセスがより正確かつ効率的になる。このことに基づいて、最大相関係数を減少させる、すなわちΦ_ｍとψ_ｉの間の非干渉性を増加させることにより、小さいピクセルサイズはオンチップのレンズフリー手法に更に役立つものとなる。

したがって、本書に記載された圧縮サンプリングの主な機能は、式３に示すレンズフリーの画像ピクセルの復号を介して、式１−２に公式化された回折に誘起される拡がりの影響をデジタル処理して取り消すことであると、結論づけることができる。しかしながら、このような圧縮プロセスは、（ＦＯＶが縮小することを犠牲にした従来の蛍光顕微鏡法のように）レンズの使用を介して、またはＦＯＦ３８の使用を介して、デジタルというよりも、物理的にすることもできる。図１ＡにおけるＦＯＦ３８を使用すると、回折に誘起された拡がりを部分的に復号し、ＦＯＦ３８を用いてｐ（ｘ，ｙ）が狭く且つ強くなるため、φ（ｘ，ｙ）とｐ（ｘ，ｙ）の間の相関関係を比較的高めることもできる。サンプリング基底と表示基底の間の干渉性は比較的高いにもかかわらず、ＦＯＦ３８を使用する検出ＳＮＲの向上は、ｐ（ｘ，ｙ）ならびにＩ_ｍ値の測定をより良くすることができ、これは実現可能な空間分解能の観点から圧縮復号プロセスの精度を高める。

上記の解析は、最終的な結論を変化させることなく、異なるセットの測定基底および表示基底を用いてもなされうることに留意されたい。上記解析において、回折プロセスは測定の一部として含まれておらず、それゆえ、測定基底のみが、画像センサアレイ４６においてサンプリングしたピクセルを含む。代替的な表記として、表示基底にψ_ｉ（ｘ，ｙ）＝δ（ｘ−ｘ_ｉ，ｙ−ｙ_ｉ）を使用することができ、これは、Ψが単位行列であることを示唆している。物体の

は既にスパースであり、スパース行列を単位行列とみなすことができるため、これは意外な選択肢ではない。この表示基底の定義に基づいて、測定基底Φ_ｍは回折プロセスおよびピクセルサンプリングプロセスの双方を含む必要がある。式３の導関数に類似する、測定基底は以下のようになる。

予想通り、全ての起こりうるｍとｉの組についてのΦ_ｍとψ_ｉの間の相関関係は、前と同様であって、前述の基底の選択肢を用いて帰着したものと同じ結論が生じる。

単に表記の問題であるが、この新たな基底の組では、空間分解能をシステムの制限等長性（ＲＩＰ）に性質的に関連付けることも容易である。ＲＩＰは、Ｎ＞ＭおよびＳ＜＜Ｎについてのスパース信号再構築のロバスト性の目安である。この新たな基底の選択肢については、ΦΨ＝Φから取り出されるＳ列の全ての想定されるサブセットが互いにほぼ直交している場合に、ＲＩＰを保持する。ピクセルサイズが対象の物体層の非干渉性ｐｓｆよりも狭いと仮定すると、以下のように近似することができる。

したがって、このレンズフリーのシステムにおいてＲＩＰを保持するため、ｉ＝１：Ｎの任意のＳの選択肢について、サブセットの関数

は、（ｘ_ｍ，ｙ_ｍ）についてほぼ直交となる。単に回折に依存している場合、所与の検出ＳＮＲについて実現可能な分解能を実質的に限定する密集した空間（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）では、この状況を満たすことは難しくなりうる。再び、オンチップの広視野レンズフリーの蛍光画像化を実現するために分解能と交換することは既知であるため、これは物理的に驚くべきことではない。構成された面は、非干渉性ｐｓｆの空間不変性を不規則に中断することによって優れた分解能を実現することに役立ちうる。

上述のように、圧縮サンプリング理論の主な機能は、検出アレイでサンプリングされる２Ｄのレンズフリー画像を作り出した、蛍光点分布を復元することである。各物体の層について当該システムの非干渉性ｐｓｆが分かると、（例えば、１の微小チャネル２２または垂直に積み重ねた微小チャネル２２の範囲内の）任意の蛍光源分布について、検出アレイにおける予想レンズフリー画像を容易に算出することができる。この事実を用いて、圧縮サンプリングアルゴリズムを介して、所与の２Ｄのレンズフリー蛍光測定に基づいて、物体体積における蛍光源分布を最適化することができる。使用された特定の圧縮サンプリングアルゴリズムは、S.-J.Kim等の「An Interior-Point Method for Large-Scale 11-Regularized Least Squares」、IEEE Journal on Selected Topics in Signal Processing、１（４）：６０６−６１７、（２００７年１２月）において説明されたアルゴリズムに基づいており、これは参照により本書に援用される。この特定の圧縮復号器の選択は、大きいデータセットからスパース信号を復元するように特に設計されているため、提示される広いＦＯＶの蛍光画像プラットフォームに非常に適している。

より具体的には、再構築／復号プロセスは、Ｉ_１正則化された最小二乗問題（ＬＳＰ）として、以下のように公式化することができる。

ここで、β＞０は正則化パラメータであり；Ｉ_ｄｅｔはセンサアレイで検出される未加工蛍光画像（ベクトル形式）であり；Ｍ_ｃｏｍνはシステムの非干渉性点拡がり関数に基づく２Ｄコンボリューション行列を表し；

は、検出面においてレンズフリー画像を作り出す蛍光源分布であり；

は、ベクトル

のＩ_ｐノルムを表している。垂直に積み重ねられた複数の微小チャネル２２については、各光源の層について別個のＭ_ｃｏｍνがある。ここで使用されている圧縮復号アルゴリズム５２は、トランケートのニュートン内点法に基づいており、特に広いスケールのデータセットについて非負制約を用いて式（６）のスパース解

を迅速に提供し、これは一般に蛍光画像化を確実に満たすものである。

試験結果−第１の実施形態

画像化デバイス１０の性能および画像化法を立証および定量化するため、図１Ａのレンズフリーのセットアップを用いて、蛍光微粒子（直径２μｍと１０μｍ）を画像化した。光源１２は４９５ｎｍの励起波長を有しており、蛍光放射は５０５ｎｍで放出された。このセットアップでは、光ファイバのフェースプレートとともに、画像センサアレイ４６（ＫＯＤＡＫから入手可能なＫＡＩ−１１００２、ピクセルサイズ：９μｍ、アクティブ領域：２５ｍｍ×３５ｍｍ）について大型フォーマットＣＣＤを使用し、各ファイバの開口数は０．３未満、周期は６μｍ未満であった。図１Ｂは、使用したＦＯＦ３８の端面図を示している。これらの蛍光画像化試験の結果を、以下に要約して記載しており、本願のプラットフォームの幾つかの重要な特徴を指摘している。

図４Ａおよび４Ｂに見られるように、画像化デバイス１０におけるＦＯＦ３８の存在は、物体の蛍光シグネチャの回折に誘起された拡がりを著しく減少させる。特に、図４Ａに見られるように、検出面における蛍光シグネチャのＦＷＨＭは、ＦＯＦ３８を用いると、１８０μｍ未満から３６μｍ未満まで、５倍まで減少する。フェースプレートの厚さを除いて、他の全ての垂直方向距離は、両構成において、すなわちフェースプレートが有っても無くても、（対照比較をするため）同一に維持されることに留意されたい。優れた検出ＳＮＲおよび高い空間分解能を実現できるようにするために、この改善点は極めて重要である。

この試験に使用されたＦＯＦ３８の物理的機能は、０．３未満の有効開口数で試料からの蛍光発光を収集し、それを画像センサアレイ４６へと誘導することである。しかしながら、微小物体２０からの蛍光発光は、ＦＯＦ３８上のエアギャップにわたって１の有効開口数で拡がるため、（各ファイバの受光ＮＡよりも大きい角度に相当する）幾つかの斜めの蛍光線は誘導されないままとなる。このような誘導されない光線も（複数のファイバ断面にわたって様々な部分反射を受け）センサ面において検出され、各ファイバのコアを通って誘導される蛍光信号上に非干渉的に重ね合わせられる。しかしながら、ＦＯＦ３８の厚さは比較的大きい（１ｃｍ未満）ため、これらの誘導されない蛍光波の寄与は、誘導された蛍光信号よりも弱い。

従って、画像化デバイス１０に使用されるＦＯＦ３８は、図４に示すように、検出面における信号の拡がりを著しく減少させるにもかかわらず、検出面において特有の非干渉性点拡がり関数（ｐｓｆ）を作り出すことで、記録された画像にそれ自体の歪みをもたらしてしまう。２Ｄの非干渉性点拡がり関数の厳密な空間形状は、フェースプレートの周期性やラチス、各ファイバの開口数、試料面とＦＯＦ３８の上面の間の距離、ＦＯＦ３８の出口面と検出アレイの間の距離によって特定される。一旦、これらのパラメータの全てが図１Ａの構成に示すように画像化配列に固定されると、所与の物体面について得られるｐｓｆを、例えば、低密度で画像化される小径の蛍光粒子を用いて、容易に測定することができる。さらに、試料とフェースプレート面の間の物理的間隙（１−５００μｍ未満）は、フェースプレートと検出面の間の間隙（１−５００μｍ未満）と共に、この非干渉性点拡がり関数が本願の画像化ＦＯＶの全てにおいて空間的に不変であることを保証し、これにより、各物体面を復号するために単一の点拡がり関数を使用することが可能となる。

図５Ａ−５Ｄは、同一の視野を復号するためにＦＯＦ３８を使用した画像化デバイス１０の性能と、使用しない場合の性能とを比較した画像を示している。図５Ｃおよび５Ｄに見られるように、密接した蛍光粒子の分解に関して、いかなる再構築による人為的結果または不明確さもなく、ＦＯＦ復号画像の性能は明らかに優れている。これは、図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄの矢印から分かる。

図６Ａ−６Ｅは、図１Ａの画像化デバイス１０を用いて取得した、異なる分離距離における２の蛍光微小物体２０（１０μｍ）を撮影したレンズフリーの蛍光未加工画像を示しており、ＦＯＦ３８を使用して取得した。図６Ａ−６Ｅの挿入画像（各画像の右下隅）は、同一粒子の透過顕微鏡画像を示しており、それぞれの場合の中心間の距離（ｇ）が比較するためにのみ算出されている。図６Ｆ−６Ｊは、図６Ａ−６Ｅの画像フレームを圧縮復号した後に得られる画像フレームを示している。図６Ａ−６Ｅでは、ｇ_ＣＳは、各画像の分解される蛍光粒子の中心間距離を指しており、ＣＳは「圧縮サンプリング（compressive sampling）」を意味する。ｇ＝１０μｍの場合（右端の列）であっても、ｇ_ＣＳ＝９μｍで互いから蛍光微小物体２０を明確に分解することができる。復号画像のピクセルサイズは３μｍであり、未加工のレンズフリー画像は、検出アレイにおいてＷ＝９μｍのピクセルサイズ、すなわちＮ＝９Ｍでサンプリングされている。（挿入図に示す顕微鏡画像とは異なり）ｇ_ＣＳ＝９μｍの場合の再構築点が互いに接触しない理由は、このシステムの非干渉性点拡がり関数が直径１０μｍの蛍光粒子を用いて概算されているからである。

これらの復号画像の算出時間は、Intel Centrino Duo Core、１ＧＨｚのＰＣにおいて、０．１分乃至０．５分の間で変動する。図６Ｋ−６Ｏは、図６Ａ−６Ｅに示すものと同一の一連のレンズフリー画像のルーシーリチャードソンアルゴリズムの解析結果を示している。図６Ｋ−６Ｏでは、ｇ_ＬＲは各画像の分解した蛍光粒子の中心間距離を指し、ＬＲは「ルーシーリチャードソン（Lucy-Richardson）」を意味する。これらの解析の反復回数は、２００乃至４００回となり、各画像のＣＳ結果の総計算時間に適合する。これらの結果は、ＬＲアルゴリズムはｇが１８μｍ未満の粒子を分解することができ、ＣＳ復号器はｇが１０μｍ未満の粒子を明確に分解することができるということを示している。

図７Ａ−７Ｈは、異なる分離距離における２の蛍光微小物体２０（直径２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像、ならびに圧縮復号画像を示している。これらの画像は、図１Ａの画像化デバイス１０を使用して取得し、ＦＯＦ３８を使用して取得した。レンズフリーの未加工画像（図７Ａ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｇ）を復号して、互いに密接した粒子を分解した。挿入画像（図７Ｂ、７Ｄ、７Ｆ、７Ｈの各復号画像の右下隅）は、同一粒子の通常の透過顕微鏡画像を示しており、各場合での中心間距離（ｇ）が比較するために算出されている。最下列は、それぞれｇが１２μｍおよび８μｍ未満離れている２μｍの微小物体２０の分解を示している。レンズフリーの未加工蛍光画像のピクセルサイズはＷ＝９μｍであり、復号画像のピクセルサイズは２μｍ、すなわちＮ〜２０Ｍである。このシステムの点拡がり関数は、低密度で画像化される直径２μｍの蛍光粒子を用いて概算している。

図８Ａ−８Ｈは、異なる分離距離における２の蛍光微小物体２０（直径２μｍ）を撮影したレンズフリーの未加工蛍光画像、ならびに圧縮復号画像を示している。これらの画像は、図１Ａの画像化デバイス１０を用いて取得し、ＦＯＦ３８を使用して取得した。図７Ａ−７Ｈとは異なり、画像センサアレイ４６におけるピクセルサイズはＷ＝１８μｍであり、これにより、画像センサアレイ４６の４ピクセルを復号して、互いに密接した蛍光微小物体２０を分解する。復号画像のピクセルサイズは、それでも、図７Ａ−７Ｈと同様に２μｍであり、この場合にはＮ＝８１Ｍであることを示唆している。図７Ａ−７Ｈと比較するとＭが著しく減少するため、圧縮復号の性能は比較的低下し、これは、ｇ＝８μｍの場合（右下隅）の再構築について特に明らかである。Ｎ＝８１Ｍにもかかわらず、このデバイスおよび方法は、図８Ｆ（例えば、ｇ＝１２μｍ）に示すようなサブピクセルの物体の復号化を実現している。

画像化デバイス１０および方法の他の態様は、垂直方向に積み重ねられた複数の微小チャネル２２に位置する蛍光微小物体２０の分布を再構成する機能である。これにより、画像化デバイス１０および方法は、画像センサアレイ４６における二次元（２Ｄ）のレンズフリー蛍光画像を、圧縮サンプリングを介して三次元（３Ｄ）分布に復号することが可能となり、これはオンチップの蛍光画像化用途の処理能力を更に高めるためには特に重要である。

図９Ａ−９Ｍは、２の異なる微小チャネル２２に位置する蛍光微粒子２０（直径１０μｍ）が、同時に画像化および復号された画像を示している。この特定の試験では２の異なる微小チャネル２２を使用したが、同じ画像化および復号化技術を使用して、図２に示すような、更に層状となった微小チャネル２２を復号することもできる。これらの試験では、蛍光チャネルは、垂直方向に５０μｍ離れている。図９Ａは２つの層（層１および層２）を図示しており、層間Δｚが５０μｍで画像化した。図９Ｂおよび９Ｈは、広いＦＯＶの２つの異なるデジタルトリミングされた領域から得たレンズフリー未加工画像を示しており、ＦＯＦ３８を使用することなく画像化した。図９Ｃおよび９Ｄは、図９Ｂの未加工画像の２つの層を圧縮復号した結果を示している。図９Ｉおよび９Ｊは、図９Ｈの未加工画像の２つの層を圧縮復号した結果を示している。図９Ｅおよび９Ｋは、広いＦＯＶの２つの異なるデジタルトリミングされた領域から得たレンズフリーの未加工画像を示しており、ＦＯＦ３８を用いて画像化した。図９Ｆおよび９Ｇは、図９Ｅの未加工画像の２つの層を圧縮復号した結果を示している。図９Ｌおよび９Ｍは、図９Ｋの未加工画像の２つの層を圧縮復号した結果を示している。図９Ｂ−９Ｍに見られるように、互いに重なった蛍光シグネチャを分解するＦＯＦ３８の優れた性能が明らかである。

この圧縮サンプリングベースの再構築法は、場合によって同じ目的のために使用できる既存の幾つかの解析法と、定量的に比較することができる。このようなニューメリカルレシピの１つが、ルーシーリチャードソンのアルゴリズムであり、このアルゴリズムは、検出画像に基づく蛍光源分布を最大限の確度の概算に反復的に集束させるために、非干渉性の点拡がり関数（ｐｓｆ）の情報に依存している。このアルゴリズムは、スパース物体のみに限定されず、通常は数百回の反復回数内で蛍光源分布へと非常に効率的に集束することが明らかになっている。圧縮サンプリングベースの再構築に対するこのアルゴリズムの性能の比較が図６Ｋ−６Ｏに図示されており、特に空間分解能における圧縮復号法の利点を明確に示している。図６Ｆ−６Ｊと図６Ｋ−６Ｏとの比較は、同じ一連のレンズフリーの蛍光測定について、圧縮復号器は１０μｍ未満の分解能を実現するが、ルーシーリチャードソンの解析アルゴリズムは２０μｍ未満の分解能を実現することを実証している。ルーシーリチャードソンのアルゴリズムは、最適化の制約条件として物体のスパース性を必要としないため、この反応は直観的に予想されうる。分解能に加えて、２つの手法の他の重要な差異は、スパース物体について容易に多層再構築を実施することができる圧縮サンプリングとは異なり、ルーシーリチャードソンのアルゴリズムは、３Ｄ再構築を処理するために著しい改変を必要とすることである。

図１０Ａは、本発明の他の実施形態による画像化デバイス６０を図示している。この画像化デバイス６０は、前述のような蛍光励起光源として機能する光源１２を有している。図１０Ａに見られるように、光源１２は、光ファイバケーブル（例えば、マルチモードの光ファイバケーブル）を有し、その角度は、画像化領域全体にわたってＴＩＲを生成するように調整することができる。図１０Ａの画像化デバイス６０では、１５ｎｍ未満の帯域で中心波長が５８０ｎｍとなるように、単色光分光器に連結されたキセノンランプによる光源１２を提供した。試料ホルダ１６は、微小物体２０を含む試料１８を保持する３次元容量を有しうる。微小物体２０は、粒子、細胞などを含みうる。前述の実施形態のように、画像センサアレイ４６を使用する。この特定の例では、１１メガピクセルのＣＣＤセンサチップ（ＫＯＤＡＫ、ＫＡＩ−１１００２、９μｍのピクセルサイズ）を用いて、約６０ｍｍの画像化ＦＯＶを取得した。プリズム２８を有する代わりに、半球面６２を、上面２４と下面２６を有する試料ホルダ１６の上に配置し、試料１８を通してポンプ光を伝達するために使用する。半球面６２はガラスから作ることができ、屈折率整合ゲル（図示せず）を用いて、光源１２からのポンプ励起光を試料１８に接続する。光ファイバケーブル（光源１２）の向きは、画像センサアレイ４６の実質的に全てのアクティブ領域にわたり、下面２６におけるＴＩＬを生成するよう調整することができる。

画像化デバイス６０はさらに、微小物体２０から放出された蛍光３２を捕捉する先細ＦＯＦ６４を有している。先細ＦＯＦ６４は、入力側６６と出力側６８を有している。先細ＦＯＦ６４の機能は、微小物体２０からの蛍光発光を高密度グリッドの光導波路（２μｍ未満の周期）でサンプリングし、大きいグリッドサイズ（４．８μｍ未満の周期）を有する画像センサアレイ４６に送達することであり、これにより、物体面の相対距離はおよそ２．４倍未満にまで拡大する。市販の先細ＦＯＦ６４の例は、例えば、Ｅｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓから入手可能な先細ＦＯＦ（ＮＴ５５−１３４、開口数：１．０、サイズ比１８：８ｍｍ；８．８×２０×１５ｍｍ）を含む。当然のことながら、他の先細ＦＯＦ６４を使用することもできる。微小物体２０から放出される蛍光３２は、先細ＦＯＦ６４の入力側６６に透過し、出力側６８を介して先細ＦＯＦ６４を出る。先細ＦＯＦ６４と画像センサアレイ２６の間には吸収フィルタ４４が配置される。

吸収フィルタ４４は、厚さ３０μｍのガラス基板を染料でコーティングすることにより製造できる。この製造プロセスは、シクロペンタノン溶剤にオラゾール染料を溶解させて、ＫＭＰＲ１００５のフォトレジスト（０．４ｇｍｌ^−１未満の染料濃度）を添加するステップから始まり、その後、直径０．４５μｍの多孔質フィルタを用いて、混合物内の過剰な染料剤を除去する。次いで、材料溶液を、２０００ｒｐｍで２０秒間のスピンコーティング、１００℃で３００秒間の焼成、１３ｍＷ／ｃｍ^２で３５秒間のフラッド露光、および最後に１００℃で更に１２０秒間の焼成によって処理する。次いで、このように製造した吸収フィルタ４４の１つを、真空ペンを用いて、画像センサアレイ４６の上に静かに配置することができる。ハウジング（図示せず）を画像化デバイス６０の光学要素を覆うように形成してもよい。励起光または環境光からの漏れを減少させるために、不要な光を遮ることが重要であり、これにより画像コントラストを減少させることができる。

図３Ａを引き続き参照すると、未加工画像は、処理用のコンピュータ５０に転送することができる。処理は、詳しく上述したように、未加工画像フレーム４８に圧縮復号アルゴリズム５２を受けさせるステップを含みうる。次いで、圧縮復号した画像フレーム５４をディスプレイ５６に表示する、あるいは更なる処理を受けさせることができる。未加工画像フレーム４８への圧縮復号アルゴリズム５２の実施は、例えばＬａｂｖｉｅｗのような、従来の実験処理ソフトウェアを用いて実行することができる。

図１０Ａおよび１０Ｂは、先細ＦＯＦ６４の入力側６６および出力側６８それぞれの顕微鏡（４０倍対物レンズ）画像を示している。先細ＦＯＦ６４の主な機能は、ＰＳＦ工学の観点からも理解することができる。すなわち、画像センサアレイ４６における所与のピクセルサイズについて、ＦＯＦ６４を使用することにより、最適ＰＳＦが作りだされる。図１０Ａに示すようにＦＯＦ６４を先細にすると、画像の拡大によって他の利点を付加し、これにより、検出ＳＮＲを犠牲にすることなく、あるいは広い画像化ＦＯＶ内に空間収差を引き起こすことなく、より多くのピクセルが微小物体２０のレンズフリー発光を検出することができる。ＰＳＦ工学に加えて、先細ＦＯＦ６４の他の有効な機能は、画像センサアレイ４６およびリーダー回路から微小物体２０を熱的に分離することであり、これにより、試料ホルダ１６内の動作温度を上手く制御することができる。

試験結果−第２の実施形態

図１０Ａに示すような画像化デバイス６０を、直径４および２μｍの蛍光粒子、さらにジアルジアムリス嚢子（Giardia Muris cysts）を画像化して試験した。前述の実施形態のように、微小物体２０のレンズフリーの蛍光画像を反映した未加工画像フレーム４８を、画像センサアレイ４６において検出した。これらの未加工画像フレーム４８は次いで、図３Ａおよび３Ｂに示すように圧縮復号アルゴリズム５２を受け、復号画像フレーム５４を生成する。

直径４μｍおよび２μｍの蛍光ビーズ（励起５８０ｎｍ／発光６０５ｎｍ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から購入した。保存溶液は、一定小分量の脱イオン水で４０００倍に希釈した。次いで、マイクロピペットを用いて、ビーズ溶液（１０μｌ未満）を使い捨てのガラス基板（厚さ：３０−１００μｍ未満）上に移し、画像化デバイス６０を用いて画像化する前に、別のガラス基板を用いてサンドイッチ状に挟む。

ジアルジアムリス嚢子は、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社（米国ルイジアナ州、ニューオーリンズ）から購入した。これらの嚢子の保存溶液は、１ｍＬ当たり５×１０^６未満の寄生虫濃度を有している。寄生虫の動的運動を防ぐため、ｐＨ７．４／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５％ホルマリン／ＰＢＳに固定した。少量の溶液（例えば、１００−２００μＬ）を遠心分離機にかけて、ＰＢＳ懸濁液の形態に再懸濁した。標識染料については、５μＬの染料と１００μＬの寄生虫を含む懸濁液の混合比で、１ｍＭのＳＹＴＯ（登録商標）６４核酸染料を使用した。一旦調製して、この混合物を３０分未満、暗所で培養した。寄生虫本体内の染料標識が活性した直後（放出ピーク波長：６１９ｎｍ）、別の遠心分離およびＰＢＳの再懸濁により、（不要な背景を取り込む可能性がある）非結合染料を除去した。次いで、画像化デバイス６０において広視野のレンズフリー画像化をするために、最後の試料液を２枚のガラススライドの間に配置した。

第１の実施形態と同様に、圧縮サンプリングベースの復号を用いて、回折による影響を部分的に復元する。この方法では、レンズフリー画像化システムの点拡がり関数を、小さい蛍光粒子（例えば、直径２μｍ未満）を用いて測定した。幾つかの隔離した粒子のレンズフリー蛍光スポットを互いに位置合わせして、次いで平均化し、画像化デバイス６０のレンズフリーの蛍光点拡がり関数を得た。確認されたｐｓｆに基づいて、物体面における蛍光点源の任意の分布について、検出面でサンプリングされる推定レンズフリー蛍光パターンを算出することができる。所与のレンズフリー蛍光画像を復号するため、（上述のような、トランケートのニュートン内点法を用いて）圧縮復号アルゴリズム５２は、算出したレンズフリー蛍光パターンと画像センサアレイ４６で測定したレンズフリー蛍光パターンの間のＩ_１正則化された最小二乗誤差によって規定されるコスト関数を反復的に最小化する。この全体的な最適化プロセスは、物体面における蛍光分布のスパース性に基づいており、例えば、３．２ＧＨｚプロセッサ（インテルコアｉ５ＣＰＵ６５０）を用いて、対象の領域を０．５−２分かけて４０−６０回繰り返した後に通常は集束する。この圧縮復号プロセスの結果、画像化デバイス６０の分解能は著しく増加し、６０ｍｍ^２までの広視野にわたって４μｍ未満の分解能を実現する。

図１１Ａ−１１Ｄは、４μｍの大きさの微小物体２０の画像のパネルを示している。図１１Ａは、図１０Ａの画像化デバイス６０の画像化ＦＯＶ全体（６０ｍｍ^２未満）の広視野レンズフリー画像を示している。図１１Ｂは、レンズフリー蛍光画像の一部の未加工画像フレーム４８を示している。図１１Ｃは、圧縮復号した後の復号画像フレーム５４を示している。図１１Ｄは、従来のレンズベースの蛍光顕微鏡（１０倍対物レンズ、ＮＡ＝０．２５）を使用した、同一微小物体２０（直径４μｍ）の顕微鏡画像を示している。

画像化デバイス６０の分解能を定量化するため、図１２Ａ−１２Ｌに示すように、蛍光粒子（直径２μｍ）が互いに近接した対象の狭い領域を分析した。図１２Ｃ、１２Ｆ、１２Ｉ、１２Ｌは、これらの蛍光粒子の明視野顕微鏡画像を示しており、粒子間の距離（ｄ）に関しては参照のようになる。図１２Ａ、１２Ｄ、１２Ｇ、１２Ｊは、同一粒子の（画素化された）レンズフリーの未加工蛍光画像を示している。図１２Ｂ、１２Ｅ、１２Ｈ、１２Ｋは、分解能を確認するために、それぞれの未加工画像フレーム４８をＣＳ復号した態様を示している。従来のレンズベースの顕微鏡とは異なり、このレンズフリーのプラットフォームに生じる不可避の回折により、１５μｍ未満離れた物体は、検出面で互いに部分的に重なることに留意されたい。図１２Ｂ、１２Ｅ、１２Ｈ、１２Ｋは、互いに密接した蛍光粒子を分解し、４μｍ未満のレンズフリーの空間分解能を実現できることを立証している。このレンズフリーオンチップ撮像装置のＣＣＤチップにおけるピクセルサイズが９μｍであると考慮すると、４μｍ未満の分解能は非常に大きいものである。

画像化デバイス６０の性能はさらに、図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃに示すような、標識化されたジアルジアムリス嚢子を画像化することによっても実証される。小型のオンチッププラットフォーム内の広いＦＯＶと組み合わせる場合、これらの結果は、現場環境で水媒性の寄生虫を素早くスクリーニングするために特に重要となりうる。図１３Ａは、ジアルジアムリス嚢子のレンズフリーの未加工蛍光画像フレーム４８を示している。図１３Ｂは、図１３Ａの未加工画像フレーム４８の復号画像フレーム５４を示している。図１３Ｃは、同一ＦＯＶの従来の顕微鏡画像（１０倍）を示している。

画像化デバイス６０の先細ＦＯＦ６４の機能は、微小物体２０からの蛍光発光が、密集したグリッドの光導波管（２μｍ未満の周期）でサンプリングされ、大きいグリッド（４．８μｍ未満の周期）を有する画像センサアレイ４６に送達され、これにより、物体面の相対距離がおよそ２．４倍に拡大される点である。この拡大は空間分解能にとって重要なパラメータであるが、このプラットフォームには、得られる分解能に著しい影響を与える他の因子もある。

信号雑音比（ＳＮＲ）の検出

このパラメータは、センサのノイズフロアから、フェースプレートとセンサおよび物体とフェースプレートの距離、フェースプレートの開口数、さらに物体の発光強度、および暗視野背景の強度にまでわたる幾つかの因子によって決定される。原則的に、未加工蛍光画像のＳＮＲが非常に高い場合、圧縮復号画像の分解能は、先細フェースプレートの拡大とは無関係となり、サブミクロンレベルの理論アプローチとなる。したがって、光電子センサアレイの能動的冷却が、画像化ＦＯＶと引き替えにすることなく、レンズフリー分解能を更に向上させるために使用できる重要な手段となる。先細ＦＯＦ６４の厚さが１−２ｃｍより大きいということは、センサチップから試料を熱的に分離することもでき、試料に損傷を与えることなく、センサを能動的に冷却するのに役立つ。一般に、先細ＦＯＦ６４の厚さは、約１００μｍ乃至約５ｃｍの範囲内で十分である。このようにデジタルＳＮＲが増大すると、プラットフォームの検出開口数も増大し、これにより、更に多くの斜めの蛍光線をセンサのノイズフロア上で検出することができる。従って、増大したＳＮＲレベルの下では、検出開口数は最終的に先細ＦＯＦ６４の開口数によって限定され、この実験のセットアップでは１未満であった。

検出ＳＮＲを設定する他の重要なパラメータが、フェースプレートとセンサおよび物体とフェースプレートの距離である。物体とフェースプレートの垂直距離は、接触構造を用いて最小限にすることができる（すなわち、５−１０μｍ未満）。しかしながら、フェースプレートとセンサの垂直距離は、吸収フィルタ４４の厚さで限定されねばならず、この厚さは２０−３０μｍ未満程度まで狭くなりうる。画像化デバイス６０の検出ＳＮＲを直接的に決定する他のパラメータの１つは、（背景と比較した）試料の蛍光発光強度であり、これは、標識染料の量子効率、励起強度および波長、さらには試料の標識化効率によって主に決定される。得られる画像のデジタルＳＮＲは、画像化デバイス６０の空間分解能に影響を与える最も重要な因子の１つであり、得られるＳＮＲをさらにシステム的に向上させることにより、サブミクロンの分解能を潜在的に実現することができる。

レンズフリーの点拡がり関数（ＰＳＦ）

画像化デバイス６０のレンズフリーＰＳＦは、検出面において画像センサアレイ４６によってサンプリングされる前の、物体面における光点源の放出パターンを表す２Ｄの空間関数によって規定される。画像センサアレイ４６における強力な検出ＳＮＲおよび広いピクセルサイズ（例えば、通常は９μｍ未満を利用する）の下では、最も狭いレンズフリーＰＳＦが、必ずしもＣＳ復号した分解能を向上させるための最高の手段ではない。この理由をよりよく理解するために、レンズフリーＰＳＦの空間幅が、画像センサアレイ４６における広いピクセルサイズよりも仮に小さく作られると仮定する。この場合、サブピクセルレベルで互いに近接している２の蛍光点は、１つのピクセルに双方とも寄与しているため、どのような種類のデジタル復号器を使用しても、それらを分解することは不可能である。要するに、同一ピクセル内のこれらの２の点源の非常に多くの異なる組み合わせが同一信号を生じさせることにより、サブピクセルレベルで復号することを物理的に不可能にしている。

しかしながら、画像センサアレイ４６における同一のピクセルサイズおよびデジタルＳＮＲについて、レンズフリーＰＳＦの幅が増大した場合（例えば、センサ面から物体面までの垂直距離を僅かに増加させることによって実現しうる）、（ＰＳＦの実質的な幅によって影響される）幾つかの異なるピクセルが２つの密接した点源の加重和を検出することができるため、これらのサブピクセル離れた物体を復号可能にする。この結論は、空間の拡がりによって検出ＳＮＲが著しく低下（センサのノイズフロアに接近する）しない限り当てはまる。

換言すると、画像センサアレイ４６における所与の大きいピクセルサイズについて、特定のＰＳＦ幅に達した後、その幅が更に増大すると、信号の拡散によって検出ＳＮＲが部分的に減少し始めることがあり、これは画像センサアレイ４６におけるピクセルサイズおよびレンズフリープラットフォームの騒音性能によって完全に決定される最適ＰＳＦについての境界を設定する。上述のように、これを防ぐ方法の１つは、画像センサアレイ４６の表面から物体面までの垂直距離を僅かに増加させることである。

レンズフリーの蛍光オンチップの画像化における先細ＦＯＦ６４の主な機能の１つは、ＰＳＦ工学の観点から理解することができる。すなわち、センサチップにおける所与のピクセルサイズについて、フェースプレートを使用して、最適ＰＳＦが作り出される。ＦＯＦ６４の先細構造は、画像の拡大を通して他の利点を付加し、これにより、検出ＳＮＲを犠牲にすることなく、あるいは大きい画像化ＦＯＶ内の空間収差を引き起こすことなく、より多くのピクセルが、物体のレンズフリーの発光を検出することができる。

本発明の実施形態を図示し記載してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変をすることができる。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲、およびその均等物を除き、限定すべきではない。

Claims (22)

1. 試料を保持するよう構成され、下面を有している試料ホルダと；
   前記試料ホルダの下面の向かい側に、前記試料ホルダと近接して配置されたプリズムと；
   前記プリズムの一面を介して前記試料を照明するよう構成された光源であって、実質的に全ての光は前記試料ホルダの下面において全内部反射される光源と；
   前記試料ホルダの下面に近接して配置され、入力側と出力側とを有する光ファイバのアレイと；
   前記光ファイバのアレイの出力側に近接して配置された画像センサアレイと、を具えていることを特徴とする画像化デバイス。
2. 請求項１に記載の画像化デバイスがさらに、前記光ファイバのアレイの出力側と前記画像センサアレイの間に置かれた吸収フィルタを具えていることを特徴とする画像化デバイス。
3. 請求項１に記載の画像化デバイスにおいて、前記光ファイバのアレイが、約１００μｍ乃至約５ｃｍの範囲の厚さを有することを特徴とする画像化デバイス。
4. 請求項１に記載の画像化デバイスにおいて、前記光ファイバのアレイが、約０．０１乃至約１の範囲の開口数を有する複数の光ファイバを具えていることを特徴とする画像化デバイス。
5. 請求項１に記載の画像化デバイスにおいて、前記光ファイバのアレイが、約１μｍ乃至約５０μｍの範囲の周期を有する複数の光ファイバを具えていることを特徴とする画像化デバイス。
6. 請求項１に記載の画像化デバイスにおいて、前記試料ホルダが、複数の微小チャネルを具えていることを特徴とする画像化デバイス。
7. 請求項６に記載の画像化デバイスにおいて、前記複数の微小チャネルが、垂直方向に積み重ねられた微小チャネルを含むことを特徴とする画像化デバイス。
8. 請求項１に記載の画像化デバイスにおいて、前記画像センサアレイが、約１ｍｍ^２乃至約２０ｃｍ^２の範囲の検出アクティブ領域を有していることを特徴とする画像化デバイス。
9. 請求項１に記載の画像化デバイスがさらに、前記試料ホルダの下面と前記光ファイバのアレイの入力側の間に隙間を具えており、当該隙間の寸法は約１μｍ乃至約５００μｍであることを特徴とする画像化デバイス。
10. 請求項１に記載の画像化デバイスがさらに、前記光ファイバのアレイの出力側と前記画像センサアレイの間に隙間を具えており、当該隙間の寸法は約１μｍ乃至約５００μｍであることを特徴とする画像化デバイス。
11. 請求項１に記載の画像化デバイスがさらに、前記プリズムの他の面を介して前記試料を照明するよう構成された第２の光源を具えていることを特徴とする画像化デバイス。
12. 試料を保持するよう構成され、下面を有している試料ホルダと；
    前記試料ホルダの下面の向かい側に、前記試料ホルダと近接して配置された半球面と；
    前記半球面を介して前記試料を照明するよう構成された光源であって、実質的に全ての光は前記試料ホルダの下面において全内部反射される光源と；
    前記試料ホルダの下面に近接して配置され、入力側と出力側とを有する光ファイバのアレイであって、当該光ファイバのアレイの入力側は、前記出力側における光ファイバの導波管の密度と比較して高い光ファイバの導波管の密度を有している光ファイバのアレイと；
    前記光ファイバのアレイの出力側に近接して配置された画像センサアレイと、を具えていることを特徴とする画像化デバイス。
13. 請求項１２に記載の画像化デバイスがさらに、前記光ファイバのアレイの出力側と前記画像センサアレイの間に置かれた吸収フィルタを具えていることを特徴とする画像化デバイス。
14. 請求項１２に記載の画像化デバイスにおいて、前記光ファイバのアレイの入力側における前記光ファイバの導波管の密度は、前記光ファイバのアレイの出力側における前記光ファイバの導波管の密度の５倍より大きいことを特徴とする画像化デバイス。
15. 請求項１２に記載の画像化デバイスにおいて、前記光ファイバのアレイが、約１００μｍ乃至約５ｃｍの範囲の厚さを有することを特徴とする画像化デバイス。
16. 試料を画像化する方法において：
    試料を照明する前にプリズムを通過する蛍光励起放射を用いて試料ホルダに含まれる試料を照明するステップであって、実質的に全ての前記蛍光励起放射が前記試料ホルダの下面において全内部反射され、前記試料からの蛍光発光放射が前記試料ホルダから出るステップと；
    画像センサアレイを用いて、前記蛍光発光放射の画像フレームを取得するステップと；
    復号画像フレームを生成すべく、取得した前記画像フレームを圧縮復号するステップと、を含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１６に記載の方法がさらに、前記試料ホルダの下面と前記画像センサアレイの間に置かれた光ファイバのアレイを介して、前記試料ホルダから出る前記蛍光発光放射を前記画像センサアレイに移動させるステップを含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１６に記載の方法において、前記試料が、複数の細胞を含むことを特徴とする方法。
19. 請求項１６に記載の方法がさらに、複数の細胞内に含まれる１以上の対象の細胞を識別するステップを含むことを特徴とする方法。
20. 請求項１７に記載の方法において、第１のエアギャップが前記光ファイバのアレイから前記試料ホルダの下面を分離し、第２のエアギャップが前記光ファイバのアレイと前記画像センサアレイを分離していることを特徴とする方法。
21. 請求項１６に記載の方法において、前記試料ホルダが、少なくとも１の微小チャネルを具えていることを特徴とする方法。
22. 請求項２１に記載の方法において、さらに複数の微小チャネルを具えており、当該複数の微小チャネルは、異なる垂直位置に配置された微小チャネルを具えていることを特徴とする方法。
    

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