CN108169173A - 一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，首先进行原始强度图像采集，根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率，然后初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱，且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求，并将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中，并进行多轮迭代，迭代得出被测物体的三维频谱，并将该三维频谱变换至空域，最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布。本发明无须采用高放大倍率的物镜，在保证较大的成像视场前提下也可达到较高的重构分辨率。

Description

一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法

技术领域

本发明属于光学显微测量、三维折射率成像技术，特别是一种基于LED阵列的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法。

背景技术

大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的，这是因为细胞内各部份细微结构的折射率和厚度的不同，当光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色，从而使其在显微镜下可见。由于生物细胞内部不同物质对有色染料吸收的吸收率不同，故最终在显微镜下就可以看见生物细胞内部的结构和表现出不同的生物特性(龚志锦,詹熔洲.病理组织制片和染色技术[M].上海科学技术出版社,1994)。但由于这种染色手段会对细胞和组织的正常生理活动造成影响，更有可能会杀死细胞。所以通过光学调控对生物样品的无标记观测手段应运而生，其中，泽尼克相衬成像和微分干涉相衬成像作为传统的无标记成像手段，通过将生物组织的相位延迟转化为强度信息，从而使未染色的细胞和生物组织在镜下可见。此外，待测物体的定量相位信息或者由折射率分布不均引起的光程差可利用干涉的方法来获取，利用干涉成像手段来获取定量相位信息的的典型方法为数字全息显微镜(Digital Holography Microscopy,DHM)，但这类成像方法需要激光光源和复杂的干涉光路，且对环境的振动较为敏感，不利于成像质量的提升(M.K.Kim,Digital HolographicMicroscopy,Springer,New York 2011)。

计算层析成像(Computed Tomography，CT)作为生物医学领域常用的成像手段之一，利用X射线和不同入射角度下的生物组织对X射线的不同吸收率来重构出物体的三维结构信息(Beerlink A,Mell M,Tolkiehn M,et al.Hard x-ray phase contrast imagingof black lipid membranes[J].Applied Physics Letters,2009,95(20):203703-203703-3)。当入射光波长变短至可见光波段的时候，被探测物体与入射光波会发生衍射现象，所以必须利用另一种成像模型来重构生物组织的三维分布。传统的光学衍射层析成像是通过改变干涉系统中物光的入射光波与参考光之间的夹角，从而可以得到每个入射光角度下物体相位分布，最终对生物物体三维折射率分布进行重构。Choi.W等人在2007年提出了衍射层析相位显微镜(Choi W,Fang-Yen C,Badizadegan K,et al.Tomographic phasemicroscopy[J].Nature Methods,2007,4(9):717-719)，该成像方法是将振镜引入马赫曾德离轴全息的干涉系统中，入射光从各个方向扫描样片，重构出了未染色生物细胞和线虫(C.elegans)的三维折射率分布。2009年Sung.Y等人又将基于全息干涉和振镜旋转的方法用于活细胞的动态观察中(Sung,Y.,Choi,W.,Fang-Yen,C.,Badizadegan,K.,Dasari,R.R.,&Feld,M.S.Optical diffraction tomography for high resolution live cellimaging[J].Optics express,2009,17(1),266-277.)。传统三维折射率层析成像方法利用干涉的方法需先获取在每个入射方向上的散射复振幅分布，该方法不仅需要复杂的干涉系统，而且振镜的机械转动也会影响最终的三维重构效果。南京理工大学智能计算成像实验室在2017年提出了一种利用LED照明和光强传输方程的非干涉的三维衍射层析成像方法(Li J,Chen Q,Zhang J,et al.Optical diffraction tomography microscopy withtransport of intensity equation using a light-emitting diode array[J].Optics&Lasers in Engineering,2017,95:26-34.)，该方法通过拍摄在两个或多个不同焦面上的不同角度强度图像堆栈，再利用基于光强传输方程的相位解法直接求解出在不同入射光方向下的相位分布，最终重构出待测样品的三维折射分布。

但是，上述所有三维衍射层析成像方法拍摄的强度图像均为明场图像，即照明数值孔径小与或等于物镜数值孔径NA_ill≤NA_obj，而一些物体高频信息的散射光且没有被充分利用。所以如何将傅里叶衍射层析定理和傅里叶叠层成像技术有机结合，利用低倍物镜的大视场成像和由增大照明角度提升分辨率的方法来同时兼顾大视场和高分辨的三维折射率衍射层析成像是一个亟待解决的一个技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，不仅无须干涉，简化了成像系统光路，而且可高度兼容传统明场显微镜，通过在低倍物镜下增大照明角度就解决了传统三维折射率衍射层析成像高分辨率和大视场不能同时兼顾的技术难题。

实现本发明目的的技术方案为：一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，步骤如下：

步骤一，原始强度图像采集，将LED光源作为传统显微镜的照明光源，LED面板上的每颗LED依次被点亮，入射光经过聚光镜后从各个不同的入射角下照射样品，并且在被测的厚样品为聚焦情况下，由相机在同步触发信号下采集一系列不同照明角度下的强度图像其中某一个位置下采集的光强为

步骤二，根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率k_in＝(k_x,k_y)；

步骤三，初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱三维频谱矩阵像素个数分别为N_x,N_y,N_z，且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求；

步骤四，三维频谱迭代重构，将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中，并进行多轮迭代；

步骤五，迭代得出被测物体的三维频谱，并将该三维频谱变换至空域，最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布n(r)。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)采用LED阵列作为该显微成像方法的照明光源，且与聚光镜有机组合，这样既保证了照明方向的编程可控，同时也保证了照明数值孔径最高可达到传统阿贝聚光镜的最大值1.20。(2)图像采集过程中不需要机械移动或振镜转动，仅由LED阵列的编程来实现照明光角度的改变。(3)所采集的强度图像中不仅有明场强度图像，还有包含高频衍射信息的暗场强度图像，将暗场图像迭代至三维频谱中，提高了三维成像的轴向分辨率与横向分辨率。(4)无须采用高放大倍率的物镜，在保证较大的成像视场前提下也可达到较高的重构分辨率。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是单颗LED产生入射光线与实际装置示意图。

图2是本发明基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法的流程图。

图3是三维傅里叶衍射层析定理示意图。

图4是明场和暗场情况下不同方向的入射光在三维频谱上对应的位置。

图5是最终重构之后的三维频谱的形状示意图。

图6是利用该方法重构出的实球藻在不同位置上的二维折射率分布和三维折射率分布渲染图。

具体实施方式

如图1所示，传统的明场显微镜的照明光源被替换为高密度LED阵列。LED阵列放置在聚光镜的前焦面位置，后端成像系统与传统明场显微镜一致。其中f为聚光镜的焦距，一般在10-20mm之间，并且LED阵列的中心处于成像系统的光轴上。LED阵列中包括若干个(至少261个)LED单元，它们等间隔排布形成一个二维阵列。其中每个LED单元均为红绿蓝三色LED单元，其典型波长为红光633nm、绿光525nm和蓝光465nm。每个LED单元之间中心间距d典型值1-4mm。LED阵列并不需要进行单独加工，一般在市场上可直接购置。表1给出了一个市面上可购置的LED阵列的产品参数。在此LED阵列中，LED单元共有32行、32列，一共1024个，每个LED单元的亮度在2000cd/m²以上。

表1 LED阵列的物理参数

LED阵列中每个LED单元均可通过单独点亮，点亮LED单元的具体方法为现有常规技术，实现电路可以采用(但不限于)单片机、ARM、或者可编程逻辑器件等现有技术即可实现，具体实现方法可参考相关文献(如郭宝增,邓淳苗：基于FPGA的LED显示屏控制系统设计[J].液晶与显示,2010,25(3):424-428)。

结合图2，本发明利用上述装置实现的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法包括以下步骤：

步骤一，原始强度图像采集。在传统的明场显微镜中，照明光源为高密度LED阵列，每颗单色LED发出的光线均为中心波长为λ₀的准单色光，且在不同介质中的归一化波长为λ。该LED阵列放置于聚光镜的前焦面位置上，且该阵列中心的LED与成像系统的光轴重合。LED面板上的每颗LED依次被点亮，入射光经过聚光镜之后从各个不同的入射角下照射样品，并对被测的厚样品进行聚焦。通过产生同步触发信号控制相机采集光强图像堆栈其中某一个位置下采集的光强为区别于传统的三维衍射层析成像方法中只有明场图像，在拍摄的强度图像序列不仅有包含透射光线的明场图像也有只存在衍射光的暗场图像。

步骤二，计算入射光线的空间频率。根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率k_in＝(k_x,k_y),如图1(b)所示。根据LED面板上被点亮的LED空间位置计算出所对应的入射光空间频率k_in,当k_in小于所用显微物镜可探测空间频率NA_obj/λ时，此时所拍摄的图像为明场图像，而当其中k_in大于NA_obj/λ时，为暗场光线，其中NA_obj为所用物镜的数值孔径。

步骤三，初始化被测物体的三维频谱被测物体的初始化三维频谱的像素尺寸必须满足最终的成像分辨率，且三维矩阵像素个数N_x,N_y,N_z满足每个方向上的最小采样数，其中k为三维频域变量。当最大照明数值孔径为NA_ill，且NA_ill≥NA_obj时，该成像方法最终可达的横向分辨率的空间频率为：

轴向最高可达空间频率为：

故最终初始化的三维频谱的像素分辨率必须大于系统的横向分辨率：

代入Δu_x,y后可得关系式：

其中ΔX_pixel为初始化之后的三维物函数的像素尺寸。

步骤四，三维频谱的强度迭代重构。当入射光线的空间频率为k_in＝(k_x,k_y)时，利用傅里叶衍射层析定理公式：

即可得到在某确定入射光空间频率下，对应的埃瓦尔德球壳上的物体三维频谱分量，如图3(a)所示。其中为聚焦位置处的被测物体的二维傅里叶频谱，即为埃瓦尔德球壳的定义函数。经过物镜光瞳限制之后的埃瓦尔德球壳上的频谱信息可以被物镜接收到，而后将该频谱信息在反投影至三维对应位置的埃瓦尔德球壳上，如图3(b)和(c)所示。将三维球壳上的频谱成分映射至二维频谱空间中，即可得到在对应入射光角度下的聚焦位置二维复振幅频谱：

其中为二维散射场的傅里叶变换，k_2D为二维频域变量，为三维频谱中与入射光线对应的埃瓦尔德球壳上的频谱分量，k_z定义为投影系数对于明场图像来说，所拍摄的总场包含着入射分量与散射分量，而暗场图像却只有被物体所散射之后的分量，所以拍摄的强度图与散射场和入射光线的关系为：

其中I(x_T)为实际所拍摄的强度图像，U(x_T)为包含散射场U_s(x_T)和入射场U_in(x_T)的总和场，x_T为二维空间变量。

在三维衍射层析成像中，Born近似与Rytov近似是较为常用的两种使散射模型简化的近似方法。其中Born近似可描述为在透射分量与散射分量的总和中，散射成分所占比重极小，即弱散射近似。而Rytov近似则将总场与一阶散射场之间用对数联系起来，这两种近似方法可简化为：

其中U_b(x_T)表示一阶散射场，对上式进行进一步的化简，对各个变量分别除以入射分量U_in(x_T)，化简后的公式可得：

其中U_BN(x_T)，U_NS(x_T)和U_N(x_T)分别表示经由入射光场归一化之后的一阶散射场，散射场和测量的总场，即可表示为和故可以分别得到在Born近似和Rytov近似下所测量的明场和暗场的情况下，总场与一阶散射场之间关系的表达式：

对于Born近似

对于Rytov近似

利用上述关系可以分别得到在Born近似和Rytov近似下将所拍摄的强度图像迭代至二维一阶散射场中的公式为：

对于Born近似

对于Rytov近似

其中为原始估计的一阶散射场，为迭代更新光强信息之后的散射场，为实际拍摄的强度图像，系数α作为调节项可加快收敛速度减小噪声影响。

再对进行二维傅里叶变换得到将由强度收敛之后的一阶散射势的傅里叶变换反投影到三维频谱中对应入射光线下的埃瓦尔德球壳上，即可实现一个照明角度下的三维频谱迭代重构，即表示为：

经过上述公式即可完成一次对三维傅里叶频谱的强度迭代收敛过程。其中图4(a)表示在相干照明情况下在三维频域空间中埃瓦尔德球所覆盖的范围，而图4(b)是明场和暗场情况下不同方向的入射光线在三维频谱上对应的埃瓦尔德球的位置。

步骤五，进行被测物体的三维频谱完整迭代，得到被测物体的三维折射率分布，图5为最终进行强度迭代重构之后的三维频谱的形状示意图，其三维形状为图4(b)的三维渲染图形。根据步骤四进行单次三维频谱光强迭代，将每个照明角度下的强度图依次进行迭代，通过数次的光强迭代之后，所拍摄的强度信息逐渐收敛至三维散射势频谱中，最终即可得到所测量样片的三维频谱信息。最后进行三维逆傅里叶变换得到三维物体的物函数V(r)分布：

其中IFT3表示三维傅里叶变换，再利用物函数散射势计算公式即可得到待测样品的三维折射率分布：

其中k₀为真空中对应波长的波数，n_m(r)为物体所处介质的折射率。图6(a)-(d)为利用该方法所重构出的实球藻在不同轴向平面位置上的二维折射率分布，而图6(e)则是待测的实球藻三维折射率分布渲染图。

Claims (5)

1.一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，其特征在于步骤如下：

步骤一，原始强度图像采集，将LED光源作为传统显微镜的照明光源，LED面板上的每颗LED依次被点亮，入射光经过聚光镜后从各个不同的入射角下照射样品，并且在被测的厚样品为聚焦情况下，由相机在同步触发信号下采集一系列不同照明角度下的强度图像其中某一个位置下采集的光强为

步骤二，根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率k_in＝(k_x,k_y)；

步骤三，初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱三维频谱矩阵像素个数分别为N_x,N_y,N_z，且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求；

步骤四，三维频谱迭代重构，将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中，并进行多轮迭代；

步骤五，迭代得出被测物体的三维频谱，并将该三维频谱变换至空域，最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布n(r)。

2.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，其特征在于在步骤二中：根据LED面板上被点亮的LED空间位置计算出所对应的入射光空间频率k_in,当k_in小于所用显微物镜可探测空间频率NA_obj/λ时，此时所拍摄的图像为明场图像。而当其中k_in大于NA_obj/λ时，为暗场光线，其中NA_obj为显微物镜的数值孔径，λ为不同介质中的归一化波长。

3.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，其特征在于在步骤三中：被测物体的初始化三维频谱的像素尺寸必须满足最终的成像分辨率，且三维矩阵像素个数分别N_x,N_y,N_z满足每个方向上的最小采样数，其中k为三维频域变量，当最大照明数值孔径为NA_ill，且时，该成像方法最终可达的横向分辨率的空间频率为：

轴向最高可达空间频率为：

故最终初始化的三维频谱的像素分辨率必须大于系统的横向分辨率：

代入Δu_x,y后可得关系式：

其中ΔX_pixel为初始化之后的三维物函数的像素尺寸。

4.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，其特征在于在步骤四中：当入射光线的空间频率为k_in＝(k_x,k_y)时，利用傅里叶衍射层析定理公式：

即可得到在某确定入射光空间频率下，对应的埃瓦尔德球壳上的物体三维频谱分量；其中为聚焦位置处的被测物体的二维傅里叶频谱，即为埃瓦尔德球壳的定义函数；将三维球壳上的频谱成分映射至二维频谱空间中，即可得到在对应入射光角度下的聚焦位置二维复振幅频谱：

其中为二维散射场的傅里叶变换，k_2D为二维频域变量，为三维频谱中与入射光线对应的埃瓦尔德球壳上的频谱分量，k_z定义为投影系数对于明场图像来说，所拍摄的总场包含着入射分量与散射分量，而暗场图像却只有被物体所散射之后的分量，所以拍摄的强度图与散射场和入射光线的关系为：

其中I(x_T)为实际所拍摄的强度图像，U(x_T)为包含散射场U_s(x_T)和入射场U_in(x_T)的总和场，x_T为二维空间变量；

在三维衍射层析成像中，Born近似与Rytov近似方法简化为：

其中U_b(x_T)表示一阶散射场，对上式进行进一步的化简，对各个变量分别除以入射分量U_in(x_T)，化简后的公式可得：

其中U_BN(x_T)，U_NS(x_T)和U_N(x_T)分别表示经由入射光场归一化之后的一阶散射场，散射场和测量的总场，即可表示为故可以分别得到在Born近似和Rytov近似下所测量的明场和暗场的情况下，总场与一阶散射场之间关系的表达式：

对于Born近似

对于Rytov近似

利用上述关系可以分别得到在Born近似和Rytov近似下将所拍摄的强度图像迭代至二维一阶散射场中的公式为：

对于Born近似

对于Rytov近似

其中为原始估计的一阶散射场，为迭代更新光强信息之后的散射场，为实际拍摄的强度图像，系数α作为调节项可加快收敛速度减小噪声影响；

再对进行二维傅里叶变换得到将由强度收敛之后的一阶散射势的傅里叶变换反投影到三维频谱中对应入射光线下的埃瓦尔德球壳上，即可实现一个照明角度下的三维频谱迭代重构，即表示为：

经过上述公式即可完成一次对三维傅里叶频谱的强度迭代收敛过程。

5.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法，其特征在于在步骤五中：将每个照明角度下的强度图依次进行迭代，通过数次的光强迭代之后，所拍摄的强度信息逐渐收敛至三维散射势频谱中，最终即可得到所测量样片的三维频谱信息，最后进行三维逆傅里叶变换得到三维物体的物函数V(r)分布为：

其中IFT3表示三维傅里叶变换，再利用物函数散射势计算公式即可得到待测样品的三维折射率分布：

其中r为三维空间变量，k₀为真空中对应波长的波数，n_m(r)为物体所处介质的折射率。