CN103105353A - 基于纳米光纤探针的单细胞检测仪及其探针制作方法 - Google Patents

Abstract

一种基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，包括有纳米探针、光源单元、微操系统、电学检测单元、细胞定位系统和光子探测单元，纳米探针最内层为光纤层，在光纤层外壁包裹有纳米环电极层，在纳米环电极层外壁包裹有绝缘层。基于纳米光纤探针的单细胞检测仪的探针制作方法，包括有拉制、溅射、绝缘层制作和聚焦离子束切割四个步骤。本发明具有高灵敏度，可以实现单细胞级别的检测，相比于传统的需要粉碎数以百万计的细胞的检测手段，需要的细胞样品量大大减少，提高了早期疾病检测的成功率。它可以进行活体细胞的检测，避免了细胞处理过程中假象的产生。极大的提高了时空分辨率和可检测的靶标物范围，实时检测分析单细胞内的生物化学机制。

Description

基于纳米光纤探针的单细胞检测仪及其探针制作方法

技术领域

本发明涉及电学及光学技术在生物领域的应用，特别是一种单细胞检测仪及其探针的制作方法。

背景技术

近年来，随着细胞生理研究的逐渐深入，科学家们发现，即使是同样的遗传物质，同样的周边环境，这些细胞还是会朝着不同的方向发展，有时还会生成不同的功能。单个细胞看似相同，但其化学成分和应激反应却十分不同，而且单个细胞的变化还关系到癌症，神经疾病等重大疾病。植物和动物的单细胞生物过程也远远没有完全揭示。因此单细胞分析是理解和破译许多关键的生命进程的重要手段。但是单细胞的尺寸非常小，其内含的化学成分也是超微量的，而当前的分析方法Western blot，则需要通过破碎数以百万计的细胞来实现细胞内生化指标的检测，所以传统分析方法不足以发现单个细胞水平上的差异。不仅如此，传统方法多为定点检测，无法实现实时监测。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，它可以通过光电两种信号对细胞及亚细胞进行检测，提高细胞检测的时间和空间分辨率。

本发明的该目的是通过这样的技术方案实现的，它包括有纳米探针、光源单元、微操系统、电学检测单元、细胞定位系统、光子探测单元和数据采集及分析单元，纳米探针最内层为光纤层，在光纤层外壁包裹有纳米环电极层，在纳米环电极层外壁包裹有绝缘层；

光源单元，用于生成波长和强度均可调的光线，并通过光纤层发射至待测细胞；

微操系统，用于移动纳米探针，纳米探针安装在微操系统的动力输出端；

电学检测单元，包括有信号发生器和检测信号接收与分析器，电学检测单元的信号发生器通过纳米环电极层与电学检测单元的检测信号接收与分析器；信号发生器产生激励电信号至纳米环电极，再进入待测细胞，其电活性组分所产生的反馈电信号，检测信号接收与分析器接收并分析检测细胞中的电活性组分后反馈的电信号；

细胞定位系统，包括有用于承载待测细胞的载台和用于移动及定位待测细胞的移动载台定位装置；

光子探测单元，包括有用于接收通过待测细胞光信号的传感器和检测装置，传感器接收到的信号通过滤波器和倒置显微镜发送至检测装置，检测装置用于检测光信号的强度；

数据采集及分析单元，控制微操系统和细胞定位系统，接收并分析电学检测单元和光子探测单元的数据信号。

本发明的另一个目的就是提供一种基于纳米光纤探针的单细胞检测仪的探针制作方法，它可以制备出支持光电两种信号传输的纳米级探针，制备的探针可以向细胞发射光和电信号，接收细胞反馈的光和电信号，为细胞检测分析提供原始数据。

本发明的该目的是通过这样的技术方案实现的，具体步骤如下：1）采用激光加热的方法将多模光纤拉制成纳米探针；

2）在纳米探针的侧壁溅射上金涂层作为纳米环电极层； 

3）在纳米环电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成一层绝缘层；

4）对步骤3）处理后得到的样品通过聚焦离子束进行处理。

进一步，在步骤4）后进行以下处理：

5）在绝缘层外壁溅射上金涂层作为外纳米环电极层Ⅰ；

6）在外纳米环电极层Ⅰ的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成外绝缘层Ⅰ；

7）在绝缘层Ⅰ外壁溅射上金涂层作为外纳米环电极层Ⅱ；

8）在外纳米环电极层Ⅱ的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成外绝缘层Ⅱ。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明具有高灵敏度，可以实现单细胞级别的检测，相比于传统的需要粉碎数以百万计的细胞的检测手段，需要的细胞样品量大大减少，提高了早期疾病检测的成功率。由于可以进行活体细胞的检测，避免了细胞处理过程中假象的产生，其数据可靠度比破碎细胞样品更高。不仅如此检测仪可以提供单个细胞的数据，从而得出整个细胞群体的反应曲线，而不仅是一个平均值，能更好的分析数据。相对于传统手段中的单靶标物检测，多个靶标物实时光电检测的实现，更是可以明确细胞传导过程中多个生物因子的相互作用及关联，对解析疾病机理有重大作用。本发明首次实现的亚细胞级别的药物刺激和药效检测对了解病理以及提高药物作用都有极大的推动。通过本发明，可实现实际意义上的单细胞检测，并极大的提高了时空分辨率和可检测的靶标物范围，实时检测分析单细胞内的生物化学机制。并可以在同一个探针上，实现亚细胞级别药物刺激/释放，以及光学信号和电学信号的同步检测，由此极大的推动的单细胞检测技术的发展。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。

附图说明

本发明的附图说明如下。

图1为本发明的结构示意图；

图2为探针制作流程示意图；

图3为探针的结构示意图；

图4为实施例1的实验结果曲线图；

图5为实施例2的实验结果示意图；

图6为实施例3的实验结果曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

工作时，将对检测靶标具特异性的生物分子如反应酶涂在纳米探针上，纳米探针的针端部插入待测细胞，反应酶与细胞内对应物质发生反应，反应后可产生的荧光分子，通过对荧光产物的光学分析就可以得到对应物质的含量。检测仪的光源单元将光信号发送至纳米探针的光纤，光信号通过光纤进入细胞内，光子探测单元采集穿过细胞的光信号，并对光信号的强度进行检测。激励电信号通过纳米环电极进入待测细胞，待测细胞中的电活性组分所产生的电信号再由纳米环电极接收并传送至电学检测单元分析与处理。例如，光电倍增管可用于光子探测单元，检测的光信号通过合适的滤波器传送到光电倍增管，光电倍增管的输出信号将由电脑上的数据卡实时采集与分析。同时，激励电信号通过纳米环电极进入待测细胞，待测细胞中的电活性组分所产生的电信号再由纳米环电极接收并传送至电学检测单元分析与处理。例如，恒电位仪可用作电学检测单元产生功能激励电信号，接受并分析待测细胞中的电活性组分所产生的电信号。

基于纳米光纤探针的单细胞检测仪的探针制作方法，具体步骤为：

1）采用激光加热的方法将直径为400微米的多模光纤拉制成纳米探针；

2）在纳米探针的侧壁溅射上5-100纳米厚的金涂层作为纳米环电极层； 

3）在纳米环电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成一层绝缘层；

4）对步骤3）处理后得到的样品通过聚焦离子束进行处理。

实施例1：

本发明开发了一个基于乳酸脱氢酶的光纤纳米传感器以实现单个癌细胞的乳酸分析。先在纳米探针上修饰一层聚合物刷以利于增加乳酸脱氢酶纳米光纤传感器的纳米尖端上的固定量，该脱氢酶在促进乳酸的转换的同时所产生的荧光副产品NADH，可用于测定乳酸浓度。该纳米光纤传感器可实现高空间分辨率，低背景干扰，宽动态范围（0.06-3mM）适合单细胞乳酸分泌的生理范围。该传感器成功地检测了细胞外乳酸的扩散曲线，并可以明确区分不同细胞如两种乳腺癌细胞的乳酸分泌水平，如图4所示，图4中左图为修饰了聚合物刷的的纳米探针的乳酸检测标准曲线；右图为单细胞外乳酸的检测结果MCF-7乳腺癌细胞（n = 5）和MCF-7/HER2细胞（n=5）。误差棒代表标准偏差。这种纳米传感器不仅可以探测单个细胞的化学组分，还可以用于检测单个活细胞中的蛋白表达水平，从而提供了一个具有潜质的高灵敏度癌症检测手段。该传感器在评估代谢药物对癌细胞的新陈代谢和生存的影响这个方面也具有极大潜力。

实施例2：

本发明的单细胞检测仪不仅可以用于动物细胞的研究，由于其纳米级别的探针，还适用于真菌及细菌的单细胞检测，只需将纳米探针精准的刺入真菌细胞菌丝的不同亚细胞位点。如图5所示，在不同的菌丝位点，所测量到的荧光强度十分不同，跨越几个数量级，图5为单个真菌细胞中亚细胞级别的荧光检测，菌丝中亚细胞位点（１－６）的荧光强弱相差很大。这个初步结果表明亚细胞位点的荧光信号极有可能与新层代谢的关键部位有关。更深入的单细胞分析在揭示细胞中真菌毒素合成中的关键部位和关键基因，酶的单细胞异质性以及真菌毒素细胞间扩散感染机制方面有很大的潜力。

实施例3：

探针结合了纳米环电极和光纤传感器，可以同时实时检测高空间分辨率的电学和光学信号。图6为同步光电检测PC12细胞中的钙离子水平变化及多巴胺释放。（a）源于多巴胺释放的典型电流响应和（c）钙离子荧光信号;（b，d）为相对应的统计分析结果（N = 10）。a：神经生长因子停药后24小时A，b：在含100ng/mL的NGF的培养液体中分化3天，c：停药后的细胞在添加了150μM　L-DOPA中培养液中孵育60分钟。箭头表示的高钾溶液加入的时间点。误差棒代表标准偏差;　**和*表示p <0.01和P <0.05。如图6的a和c所示，在退化的PC12细胞中，不仅钙内流显著减少的，多巴胺分泌相比于分化的PC12神经细胞也减少很多。而当退化的PC12细胞在添加了100uM　L-DOPA的培养液中孵化1小时后，多巴胺的释放量比之前明显回复，证明了L-DOPA可在一定层度上挽救胞吐变性的神经元功能，但不能完全恢复。然而，L-DOPA治疗无法显著地提高钙离子内流。同步光电检测得到的数据表明L-DOPA的功能只是增加多巴胺在囊泡中的含量；当施加相同的刺激，释放多巴胺的量增加，但不会影响钙的信号。同步检测的数据有效的帮助我们实时了解多种细胞信号，并对不同信号之间的关联进行研究。这种方法不仅在生理过程的动态研究中有重要的应用，并为解开各种信号转导通路的相互作用提供了机会。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，其特征在于：所述检测仪包括有纳米探针、光源单元、微操系统、电学检测单元、细胞定位系统、光子探测单元和数据采集及分析单元，纳米探针最内层为光纤层，在光纤层外壁包裹有纳米环电极层，在纳米环电极层外壁包裹有绝缘层；

光源单元，用于生成波长和强度均可调的光线，并通过光纤层发射至待测细胞；

微操系统，用于移动纳米探针，纳米探针安装在微操系统的动力输出端；

电学检测单元，包括有信号发生器和检测信号接收与分析器，电学检测单元的信号发生器通过纳米环电极层与电学检测单元的检测信号接收与分析器； 

细胞定位系统，包括有用于承载待测细胞的载台和用于移动及定位待测细胞的移动载台定位装置；

光子探测单元，包括有用于接收通过待测细胞光信号的传感器和检测装置，传感器接收到的信号通过滤波器和倒置显微镜发送至检测装置，检测装置用于检测光信号的强度；

数据采集及分析单元，控制微操系统和细胞定位系统，接收并分析电学检测单元和光子探测单元的数据信号。

2.如权利要求1所述的基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，其特征在于：所述纳米探针为一个。

3.如权利要求1所述的基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，其特征在于：所述纳米探针为多个，多个纳米探针固定一起作为一个探针组，并安装在微操系统的动力输出端，电学检测单元包括有多组信号发射、接收端，每组信号发射、接收端均与一个纳米探针相对应，每个纳米探针均由光源单元提供光信号。

4.如权利要求1所述的基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，其特征在于：所述纳米探针绝缘层外壁还包裹有外纳米环电极层Ⅰ，在外纳米环电极层Ⅰ的外壁包裹有外绝缘层Ⅰ，我外绝缘层Ⅰ的外壁包裹有外纳米环电极层Ⅱ，纳米环电极层Ⅱ的外壁包裹有外绝缘层Ⅱ，外纳米环电极层Ⅰ和外纳米环电极层Ⅱ均与电学检测单元的信号发射端信号接收端连接。

5.如权利要求1所述的检测仪的探针制作方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）采用激光加热的方法将多模光纤拉制成纳米探针；

2）在纳米探针的侧壁溅射上金涂层作为纳米环电极层； 

3）在纳米环电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成一层绝缘层；

4）对步骤3）处理后得到的样品通过聚焦离子束进行处理。

6.如权利要求5所述的基于纳米光纤探针的单细胞检测仪的探针制作方法，其特征在于，在步骤4）后进行以下处理：

5）在绝缘层外壁溅射上金涂层作为外纳米环电极层Ⅰ；

6）在外纳米环电极层Ⅰ的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成外绝缘层Ⅰ；

7）在绝缘层Ⅰ外壁溅射上金涂层作为外纳米环电极层Ⅱ；

8）在外纳米环电极层Ⅱ的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成外绝缘层Ⅱ。

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