CN109477955A - 干涉散射显微镜 - Google Patents

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Abstract

通过对输出光进行空间滤波来改造干涉散射显微镜，所述输出光包括在检测输出光之前从样品位置散射的光和从样品位置反射的照明光两者。空间滤波使反射的照明光通过，但是使强度减小，反射的照明光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。这增强了相干照明的成像对比度，特别是对于作为弱散射体的对象而言。

Description

干涉散射显微镜
技术领域
本发明涉及干涉散射显微镜(本文称为iSCAT)。
背景技术
iSCAT已成为具有独特的时空分辨率和低至单分子水平的无标记灵敏度的单个颗粒跟踪的强大方法。例如，在Kukura等人的“High-speed nanoscopic tracking of theposition and orientation of a single virus(单个病毒的位置和方向的高速纳米级跟踪)”，Nature Methods 2009 6：923-935，和Ortega Arroyo等人的“Interferometricscattering microscopy(iSCAT)：new frontiers in ultrafast and ultrasensitiveoptical microscopy(干涉散射显微镜(iSCAT)：超快和超灵敏的光学显微镜的新领域)”，Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14：15625 15636中公开了iSCAT。尽管存在相当大的潜力，但iSCAT的广泛应用受限于定制显微镜、非传统相机和复杂样品照明的需求，其限制了iSCAT对小至单分子的对象进行稳健且准确的检测、成像和表征的能力。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种干涉散射显微镜，干涉散射显微镜包括：样品架，用于将样品保持在样品位置；照明光源，被布置成提供照明光；检测器；光学系统，被布置成将照明光引导到样品位置上并且被布置成收集反射的输出光，输出光包括从样品位置散射的光和从样品位置反射的照明光两者，并且光学系统被布置成将输出光引导到检测器；以及空间滤波器，被定位成对输出光进行滤波，空间滤波器被布置成使输出光通过，但是使强度减小，该输出光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。
尽管显微镜的整体布置可以类似于传统的iSCAT显微镜，但是另外设置了空间滤波器，空间滤波器影响输出光。具体地，空间滤波器使输出光通过，但是使强度减小，该输出光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。因此，空间滤波器通过利用反射的照明光的数值孔径和从样品位置处的样品中的对象散射的光的数值孔径之间的不匹配来选择性地减小照明光相比于散射光的强度。因此，空间滤波器利用了这两种光源的不同方向性。反射的照明光通常具有相对小的数值孔径，而靠近样品表面的亚衍射尺寸的对象优先将光散射到高数值孔径中。因此，通过空间滤波器在低数值孔径处的强度的减小主要影响照明光而对散射光具有最小影响，从而最大化成像对比度。
通过布置空间滤波器使得预定数值孔径与从样品位置反射的照明光的数值孔径相同或相似，可以最大化该效果。
本发明的第一方面涉及一种以反射方式工作的显微镜。在那种情况下，到达检测器的照明光主要从通常是样品和样品架之间的界面的样品表面反射，从而提供与样品中靠近该表面的对象的干涉。这提供了具有高对比度的图像。该效果不同于以透射方式工作的显微镜，其中，到达检测器的照明光透过样品的深度。
以反射方式工作具有几个优点，它们共同使得能够进行弱散射对象的高性能检测和量化。首先，在通常使用的玻璃-水界面处反射相对少量的照明光，通常仅0.5％，而在界面处由纳米级对象散射的显著较大量的光，通常大于90％，朝向照明方向散射回来。这本质上改善了散射光场和反射光场之间的比率，与透射几何相比超过1000倍，从而导致更大的干涉对比度。因此，在散粒噪声限制的情况下需要检测三个数量级的较小光子，以在给定特定散射体、照明强度和曝光时间的情况下实现相同的标称信噪比。其次，以反射方式的检测对溶液中存在的大散射体的敏感性远低于前向散射，并且未检测到其与照明光的干涉，导致更高的背景抑制。
这些因素提高了图像质量，从而实现了弱散射对象的高对比度检测。
这些优点尤其适用于对以下对象成像，该对象对光的散射如此微弱以至于通过其他技术进行准确和精确的成像是不可能的。例如，本发明特别适用于质量为5000kDa或小于5000kDa的对象。
类似地，本发明可以有利地应用于包括以下对象的样品，该对象相对于照明光的散射截面为10-17m2或小于10-17m2。通常，这样的对象相对于照明光的散射截面还可以为10- 26m2或大于10-26m2，即在10-17m2至10-26m2的范围内。可以研究的对象的示例包括蛋白质或蛋白质的小聚集体。
为了对作为非常弱的散射体的对象成像，空间滤波器被布置成使输出光以如下方式通过：在预定数值孔径内的强度减小到入射强度的10-2或小于10-2。通常，空间滤波器可以被布置成使输出光以如下方式通过：在预定数值孔径内的强度减小到入射强度的10-4或大于10-4，例如在入射强度的10-2到10-4的范围内。
照明光可以是在空间上和时间上相干的，例如使用激光作为光源。显微镜中的宽场照明通常通过将准直激光束聚焦到成像物镜的后焦平面中来实现，这意味着它可以有效地耦合进出显微镜，同时最小地影响整体成像性能。
显微镜可以是现有的商用显微镜，商用显微镜通过结合空间滤波器而被改造。与现有的iSCAT显微镜相比，这种改造可以非常便宜和简单地进行，现有的iSCAT显微镜具有复杂且昂贵的光学和电子设置以提供所需的灵敏度，例如包括对光学平台、或昂贵且复杂的光学器件、电子器件以及专业操作的需求，通过将空间滤波器结合到现有的商用显微镜中，可以显著减少或完全避免这些要求。这使得本发明能够以极其经济的方式实施。例如，可以在没有复杂扫描布置的情况下提供更大的视场，并且能够使用低成本成像相机而不损失成像性能或灵敏度。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于对干涉散射显微镜的输出光进行滤波的空间滤波器，该空间滤波器具有与第一方面类似的功能。
根据本发明的第三方面，提供了一种通过执行输出光的空间滤波来改造干涉散射显微镜的方法，该空间滤波类似于在第一方面中执行的空间滤波。
附图说明
为了更好地理解，现在将参考附图通过非限制性示例描述本发明的实施例，在附图中：
图1是iSCAT显微镜的示意图；
图2是iSCAT显微镜捕获的图像；
图3至图6是修改的iSCAT显微镜的示意图；
图7是使用图6所示的显微镜得到的一系列蛋白质的散射对比度与序列分子量的关系图；
图8和9分别是在不存在生物素的情况下和在存在生物素的情况下使用图6所示的显微镜得到的抗生物素蛋白的质量直方图；以及
图10是使用图6所示的显微镜得到的牛血清白蛋白的质量直方图。
具体实施方式
在本文所述的显微镜和方法中，所使用的光可以是：紫外光(在本文中可以定义为具有10nm至380nm范围内的波长)；可见光(在本文中可定义为具有380nm至740nm范围内的波长)；红外光(在本文中可定义为具有740nm至300μm范围内的波长)。光可以是波长的混合。这里，术语“光学的(optical)”和“光学(optics)”通常用于指代应用该方法的光。
图1示出了iSCAT显微镜1，其布置如下。
显微镜1包括以下部件，除了下面更详细描述的空间滤波器之外，这些部件具有在显微镜领域中常规的结构。
显微镜1包括用于将样品3保持在样品位置的样品架2。样品3可以是包括待成像的对象的液体样品，其在下面更详细地描述。样品架2可以采用适于保持样品3的任何形式。通常，样品架2将样品3保持在表面上，该表面形成样品架2和样品3之间的界面。例如，样品架2可以是盖玻片和/或可以由玻璃制成。样品3可以以简单的方式例如使用微型移液管提供在样品架2上。
显微镜1还包括照明源4和检测器5。
照明源4被布置成提供照明光。照明光可以是相干光。例如，照明源4可以是激光器。可以根据样品3的性质和/或待检查的性质来选择照明光的波长。在一个示例中，照明光具有405nm的波长。
可选地，可以在空间上调制照明光，以去除由照明和激光噪声的相干性质引起的散斑图案，例如在Kukura等人的“High-speed nanoscopic tracking of the positionand orientation ofa single virus(单个病毒的位置和方向的高速纳米级跟踪)”，Nature Methods 2009 6：923-935中详述的那样。
检测器5接收从样品位置反射的输出光。通常，显微镜1可以以宽场模式操作，在这种情况下，检测器5可以是捕获样品3的图像的图像传感器。显微镜1可以替代地以共焦模式操作，在这种情况下，检测器5可以是图像传感器或者可以是点状检测器，例如光电二极管，在这种情况下，扫描装置可以用于扫描样品3的区域以构建图像。可以用作检测器5的图像传感器的示例包括CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器或CCD(电荷耦合器件)。
显微镜1还包括布置在样品架2、照明源4和检测器5之间的光学系统10。光学系统10被如下布置：将照明光引导到样品位置上以对样品3进行照明、收集从样品位置反射的输出光并将输出光引导到检测器5。
光学系统10包括物镜11，物镜11是设置在样品架2前面的透镜系统。光学系统10还包括聚光透镜12和镜筒透镜13。
聚光透镜12将来自光源11的照明光(在图1中用实线示出)通过物镜11会聚到样品位置处的样品3上。
物镜11收集输出光，该输出光包括(a)从样品位置反射的照明光(在图1中用实线示出)和(b)从样品位置处的样品3散射的光(在图1中用虚线示出)。反射光主要从样品架2和样品3之间的界面反射。通常，这是相对弱的反射，例如玻璃-水反射。例如，反射的照明光的强度可以是入射照明光的强度的大约0.5％。散射光被样品3中的对象散射。
以与传统iSCAT类似的方式，来自样品表面处或样品表面附近的对象的散射光与反射光相长地干涉，因此在由检测器5捕获的图像中可看见。这种效果不同于以透射方式工作的显微镜，其中，到达检测器的照明光透过样品的深度，导致小得多的成像对比度。
如图1所示，反射的照明光和散射光具有不同的方向性。特别地，反射的照明光具有由光源4输出的光束的几何形状和光学系统6产生的数值孔径。散射光跨较大范围的角度而散射，因此填充了比反射的照明光更大的数值孔径。
镜筒透镜13将来自物镜11的输出光聚焦到检测器5上。
光学系统6还包括分束器14，分束器14被布置成分开来自光源4的照明光和被引导到检测器5的输出光的光路。除了规定如下所述的空间滤波器之外，分束器14可以具有传统的结构，该结构对入射在其上的光提供部分反射和部分透射。例如，分束器14可以是通常设置有膜、与光路成45°布置的板，该膜可以是金属性的或介电性的。或者，分束器14可以是由一对匹配的棱镜形成的立方体分束器，所述棱镜在棱镜之间的界面处具有部分反射膜。或者，分束器14可以是与分束器14和样品3之间的四分之一波片组合使用的偏振分束器。
在图1所示的示例中，光源4偏离物镜11的光路，使得来自光源4的照明光被分束器14反射到物镜11中，相反，检测器5与物镜11的光路对准，使得来自样品位置的输出光透过分束器14朝向检测器5行进。
除了上述的可以是传统结构的部件之外，显微镜1还包括空间滤波器20。在图1所示的示例中，空间滤波器20形成在分束器14上，从而位于物镜11的后孔径的后面，并且因此在物镜11的后焦平面15的正后面。因此，空间滤波器20可以在如相差显微镜中不进入物镜的情况下实现。将空间滤波器放置在物镜的入口孔径的正后面而不是在共轭平面中(例如，如下所述)具有明显的优点，即强烈抑制源自高数值孔径显微镜物镜内的众多透镜的背反射。这反过来降低了成像噪声，降低了非干涉背景并降低了实验复杂性、光学器件数量和光程长度，从而提高了光学装置的稳定性，进而提高了图像质量。
然而，该位置不是必需的，并且具有等效功能的空间滤波器可以设置在别处，如下所述。
由此定位空间滤波器20以对传递到检测器5的输出光进行滤波。在图1所示的示例中，检测器5与物镜11的光路对准，因此空间滤波器20是透射式的。
空间滤波器20是部分透射式的，因此使输出光通过，但是使强度减小，该输出光包括反射的照明光。空间滤波器20也与光轴对准并具有预定的孔径，使得空间滤波器20在预定数值孔径内提供强度的减小。这里，数值孔径以其正常方式定义为无量纲量，表征相对于输出光起源自的样品位置的角度范围。具体地，数值孔径NA可以由等式NA＝n·sin(θ)定义，其中θ是收集的半角，n是输出光透过的材料(例如，光学系统6的部件的材料)的折射率。
空间滤波器20不在预定数值孔径之外提供强度减小。原则上，空间滤波器20可以替代地在其预定孔径之外提供强度的减小，但是强度的减小小于预定数值孔径内的强度的减小，尽管这是不太期望的。
空间滤波器20可以以任何合适的方式形成，通常包括沉积材料层。该材料可以是例如银等金属。可以使用任何合适的技术进行沉积。
由于在界面附近的亚衍射尺寸的对象优先将光散射到比反射的照明光的数值孔径更大的数值孔径中，因此相对于散射光，空间滤波器20提供的强度的减小优先减小了反射的照明光的检测强度。因此，通过空间滤波器20在低数值孔径处的强度的减小主要影响反射的照明光并且对散射光具有最小影响，从而最大化捕获图像的对比度。增强的成像对比度使得能够对作为弱散射体的对象进行高对比度检测。
对比度增强可以理解如下。当空间滤波器20使处于预定数值孔径的输出光的一部分通过(即在该示例中空间滤波器20是部分透射的)时，针对充分相干的照明源，照明光场和散射光场的一部分到达检测器并干涉。到达检测器Idet的光强度由Idet＝|Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}给出，其中Einc是入射光场，r2是界面的反射率，t2是空间滤波器20的透射率，s是对象的散射幅度，Φ是透射的照明光和散射光之间的相位差。因此，散射对比度增强，尽管以检测到的光子总数为代价。
因此，以与传统iSCAT类似的方式提供对比度，但另外通过空间滤波器的透射率来控制对比度。这提供了通过选择空间滤波器20的透射率t2来直接调整参考场的幅度的能力，而不是像标准iSCAT那样被玻璃-水界面的反射率固定。在空间滤波器20是沉积材料层的情况下，可以通过选择层的材料和/或厚度来选择透射率t2。可以根据例如关注的散射对象、相机全阱容量和放大率来执行这种调整。
为了使对iSCAT的这些有益效果最大化，预定数值孔径可以是输出光中的反射的照明光的数值孔径，但这不是必需的。例如，如果预定数值孔径略小于或大于反射的照明光的数值孔径，则可以实现类似性质的益处。
空间滤波器20的使用不会从根本上改变由给定对象、入射光强度和曝光时间形成散射可达到的灵敏度极限或SNR(信噪比)。然而，通过改善对比度并降低检测到的总光子通量，确实大大简化了iSCAT的实现，以实现给定的灵敏度或SNR。现有的iSCAT显微镜具有复杂且昂贵的部件，例如需要光学平台、昂贵且复杂的光学器件、电子器件以及需要专业操作。通过使用空间滤波器20可以极大地放松这些需求。例如，可以简单地通过将空间滤波器20添加到不具有上述复杂且昂贵的部件的现有的商用显微镜上来实现与现有iSCAT显微镜等效的性能。空间滤波器20本身当然是简单且便宜的部件。另外，空间滤波器20使得能够使用具有低的全阱容量的标准CMOS或CCD相机而不损失成像灵敏度。
因此，显微镜1可以是现有的商用显微镜，商用显微镜通过结合空间滤波器20而被改造。这种改造可以非常便宜且简单地进行。可以通过在适配器中形成空间滤波器来执行改造，该适配器被布置成例如以与WO-2015/092778中公开的、用于将镜子包括到显微镜中的适配器类似的方式容置在现有的商用显微镜的附件槽中。
或者，显微镜1可以针对使用空间滤波器20而专门设计。
使用显微镜1的示例获得的图像在图2中示出。在该示例中，提供了相干明场照明光，并且空间滤波器20由厚度为180nm的银层构成，沉积在具有3.5mm直径的熔融石英上以透过反射光强度的1×10-2。这导致单个395kDa蛋白质的散射对比度为1％，SNR为10(图像捕获率为10帧每秒，并且照明光强度为10kW/cm2)。图2是使用低成本CMOS相机作为检测器5捕获的图像。可以看出，实现了高对比度图像。此外，明场照明确保通常源自物镜的最强的不需要的背反射被引导远离检测器5，使得成像背景最小化并且能够实现大视场而无需复杂地扫描照明光束。
增强对比度的优点使得能够对以下对象成像，该对象对光的散射如此微弱以至于难以通过其他技术成像。例如，本发明可以有利地应用于包括质量为5000kDa或小于5000kDa的对象的样品。通常，本发明可以应用于包括质量为10kDa或大于10kDa的对象的样品，例如质量在10kDa至5000kDa范围内的对象。
替选地或者同样地，本发明可以应用于包括相对于照明光的散射截面为10-12m2或小于10-12m2，或更优选为10-17m2或小于10-17m2的对象的样品。通常，这种对象也可以具有相对于照明光的散射截面。通常，这种对象相对于照明光的散射截面也可以为10-20m2，或更优选为10-26m2或大于10-26m2，例如在10-17m2至10-26m2的范围内。散射截面是与对象对特定波长的入射光的有效尺寸有关、与用于测量它的技术无关的、基本的、可测量的性质。散射截面可以例如通过暗场显微镜来测量。
可以应用本发明的对象的示例包括蛋白质或蛋白质的小聚集体，或它们的结合伴侣。
为了对作为相对弱的散射体的对象成像，空间滤波器20可以被布置成使反射的照明光通过且使强度减小，该强度在预定数值孔径内减小到入射强度(在上下文中，入射在空间滤波器20上的输出光的强度)的10-2到10-4范围内的强度。
另外，可以在不参考空间滤波器20的情况下设计和操作显微镜1。例如，视场通过改变对照明光的聚焦条件是可调节的。类似地，如果使用单模光纤来传递照明光，则多色成像仅需要将附加激光源耦合到单模光纤中。一般而言，可以改造显微镜1以使用已知用于iSCAT的其他部件和技术，例如，如Kukura等人的“High-speed nanoscopic tracking ofthe position and orientation of a single virus(单个病毒的位置和方向的高速纳米级跟踪)”，Nature Methods 2009 6：923-935，以及Ortega Arroyo等人的“Interferometric scattering microscopy(iSCAT)：new frontiers in ultrafast andultrasensitive optical microscopy(干涉散射显微镜(iSCAT)：超快和超灵敏的光学显微镜的新领域)”，Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14：15625-15636中所公开的。
现在将参考图3至图5描述可以对显微镜1进行的具体修改的一些示例，尽管这些示例是没有限制的。除了下面描述的修改之外，显微镜1具有与上述相同的结构和操作。为简洁起见，对共同的部件给出相同的附图标记，并且不重复其上述说明。
图3示出了显微镜1，修改之处在于将空间滤波器20定位在物镜11的后焦平面15的共轭焦平面21处，而不是在物镜11的后孔径的后面。物镜11的后焦平面15的共轭焦平面21形成在位于镜筒透镜13后面的一对望远镜透镜22和23之间。光路中的第一望远镜透镜22对物镜11的后焦平面15进行成像以形成共轭焦平面21，第二望远镜透镜23将共轭焦平面21成像到检测器5上。
空间滤波器20设置在共轭焦平面21上并形成在透明板24上。对空间滤波器20的配置和操作与上面参照图1描述的相同，例如与光轴对准并具有预定孔径，使得空间滤波器20在与上述预定数值孔径相同的数值孔径内提供强度的减小(尽管空间滤波器20现在几乎垂直于光路，而不是相对于光路成45°)。
图4示出了显微镜1，修改之处在于空间滤波器20是反射式的，而不是透射式的。在该修改中，光源4和检测器5的位置被调换，使得来自光源4的照明光透过分束器14达到物镜11中，相反地，来自样品位置的输出光由分束器14朝向检测器5反射。
空间滤波器20形成在分束器14上，但是考虑到光源4和检测器5的调换，空间滤波器20是反射式的。尽管是反射式的，但空间滤波器20被布置成以与上述相同的方式操作。也就是说，空间滤波器20对传输至检测器5的输出光进行滤波，使输出光通过，但是使强度减小。虽然在这种情况下通过部分反射来实现，但对空间滤波器20的配置和操作在其他方面是相同的，例如如上所述与光轴对准并具有预定的孔径，使得空间滤波器20在预定数值孔径内提供强度的减小。
图5示出了显微镜1，类似于图3的修改之处在于将空间滤波器20定位在物镜11的后焦平面15的共轭焦平面25处，而不是在物镜11的后孔径的后面，并且进一步的修改之处在于空间滤波器20是反射式的，而不是透射式的。物镜11的后焦平面15的共轭焦平面25以与图3的修改中的方式相同的方式形成在位于镜筒透镜13后面的一对望远镜透镜22和23之间。然而，反射板26被设置在望远镜透镜22和23之间的共轭焦平面25处，但是以45°布置以偏转光路，使得反射板26处的反射使光路偏转90°。空间滤波器20通过形成在反射板26上而设置在共轭焦平面25处，因此是反射式的而不是透射式的。尽管是反射式的，空间滤波器20被布置成以与上述相同的方式操作，即以与图4的修改类似的方式操作。
图6示出了显微镜1，修改之处在于将空间滤波器20定位在物镜11的后焦平面的共轭焦平面21处，而不是在物镜11的后孔径的后面。物镜11的后焦平面15的共轭焦平面21以与图3的修改中的方式相同的方式形成在位于镜筒透镜13后面的一对望远镜透镜22和23之间。然而，与图3的修改相比，还进行了以下进一步的修改，注意图6中的每个修改可以彼此独立地应用。
声光偏转器32布置在光源4之后，以提供照明光的扫描。声光偏转器32可以被操作成扫描样品3的区域以构建图像和/或提供空间调制以去除由照明和激光噪声的相干性质引起的散斑图案，如上面提到的。
聚光透镜12由一对远心透镜30和31代替，远心透镜30和31执行将声光偏转器32处的光束路径的任何修改成像到成像物镜的后焦平面中的功能。
光源4和检测器5的位置以与图4的修改类似的方式被调换，使得来自光源4的照明光透过分束器14达到物镜11中，相反地，来自样品位置的输出光由分束器14朝向检测器5反射。
分束器14是偏振分束器，并且四分之一波片33被布置在分束器14和样品3之间，使得分束器14分离光。
镜子34被布置成使由分束器14反射的输出光偏转。这仅仅是为了提供显微镜1的更紧凑的布置。
显微镜1可用于执行iSCAT以用于广泛的应用，包括单分子检测。通常，对比度增强是有益的，并且可以应用于对亚衍射和弱散射对象的所有成像。特定应用是弱散射体的无标记成像，其中关注的对象必须总是在大背景上检测到，这降低了成像对比度。显微镜1可用于广泛的研究和测量，例如测量折射率的任何变化，其包括例如：单分子结合/解除结合、相变、聚类、组装/解体、聚集、蛋白质/蛋白质相互作用、蛋白质/小分子相互作用、高灵敏度无标记成像。
因此，显微镜1具有许多应用，应用的范围从基础研究到工业应用，例如制药工业。特别是，它将iSCAT打开到当前执行iSCAT所需的复杂实验设置所排除的领域。例如，iSCAT是目前世界上最灵敏的无标记单分子成像生物传感器，例如可能对表面等离子体共振传感市场产生重大影响。此外，它还用作准确、精确和高分辨率的单分子质谱仪的解决方案，在研究和工业中有许多应用。
示例
准确度、分辨率和精确度的重要性能参数已经在具有图6所示配置的显微镜中使用一系列蛋白质样品量化，如下所述。
通过记录在标准PBS缓冲液中以10nM浓度溶解的一系列蛋白质的散射对比度来进行确定分子量的仪器准确度的量化(蛋白质是链霉抗生物素蛋白-53kDa、牛血清白蛋白-66kDa、醇脱氢酶-～146kDa、β-淀粉酶-224kDa、HSP16.5-395kDa、用HALO标签修饰的非肌肉肌球蛋白IIb-598kDa、甲状腺球蛋白-669kDa、GroEL-802kDa)。结果显示在图7中，图7是散射对比度与序列分子量和相关误差条的关系图。鉴于iSCAT对比度与对象的体积的线性相关性以及所有蛋白质均由相同的氨基酸池制成，而这些氨基酸池又具有共同的折射率并因此具有共同的散射截面的事实，结果表现出预期的高线性行为。观察到的预期分子量和测量分子量之间的变化平均约为待确定的质量的3％。这证明了使用显微镜1确定单个蛋白质分子的分子量的高度准确性。
可以预期，显微镜1能够量化与单个蛋白质一样小的对象的质量，精确度优于其质量的5％，而不管它们在氨基酸、脂质或碳水化合物方面的组成如何。
可以预期，显微镜1能够量化比现有技术更小的对象的质量的变化，例如具有低于5000kDa且低至10kDa的质量的对象。仪器精度的量化如下进行。使用本文描述的方法确定对象的质量的精度在统计上受到确定散射对比度的分布中心的能力的限制。鉴于所记录的分布表现出对于散粒噪声限制过程所预期的高斯分布，众所周知精度为sN-1/2，其中s是关注的分布的标准偏差，N是采用的样品的数量。结果，质量测量的精度不受分辨率或准确度的限制，但原则上可以通过增加测量的次数来任意增加。为了说明这一点，在溶液中不存在饱和生物素(6839个事件)和存在饱和生物素(6609个事件)的情况下记录抗生物素蛋白的质量直方图，结果分别显示在图8和9中。与对于结合的四种生物素分子的预期970Da相比，测量了在存在生物素时为950±330Da的质量增加。
通过使用从图6中所示的牛血清白蛋白的结果获得的校准而记录质量直方图来进行仪器分辨率，特别是分辨率极限的量化。得到的直方图显示在图10中，并显示溶液中单体、二聚体和三聚体的各个可辨别的峰，其中单体峰的fwhm为28kDa，分辨率为34kDa。该值是检测到的光子总数的函数，因此可以通过使用更高的光强度来改善。这证明了显微镜1的高质量分辨率。总之，这些结果表明显微镜1能够量化与小分子的结合所诱导的质量差异一样小的质量差异，以及通过极化率准确和精确地表征对象质量。目前，这使得能够检测低至40kDa的单个蛋白质并准确确定其分子量在其序列质量的5％以内(图7)。此外，高SNR能够表征质量的变化，例如通过结合事件和仅受检测到的分子的数量限制的精确度，目前达到250Da(图8和图9)。此外，高可实现的SNR能够清晰检测溶液中蛋白质的不同寡聚状态，从而能够对蛋白质聚集体进行详细表征(图10)。

Claims (29)

1.一种干涉散射显微镜，包括：
样品架，用于将样品保持在样品位置；
照明光源，被布置成提供照明光；
检测器；
光学系统，被布置成将照明光引导到所述样品位置上并且被布置成收集反射的输出光，所述输出光包括从所述样品位置散射的光和从所述样品位置反射的照明光两者，并且所述光学系统被布置成将所述输出光引导到所述检测器；以及
空间滤波器，被定位成对所述输出光进行滤波，所述空间滤波器被布置成使输出光通过，但是使强度减小，所述输出光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。
2.根据权利要求1所述的干涉散射显微镜，其中，所述预定数值孔径是从所述样品位置反射的、包括在所述输出光中的所述照明光的数值孔径。
3.根据权利要求1或2所述的干涉散射显微镜，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-2或小于10-2。
4.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-4或大于10-4。
5.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述预定数值孔径小于1，优选地小于0.5。
6.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述照明光在空间上和时间上是相干的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述光学系统包括分束器，所述分束器被布置成分离所述照明光和所述输出光的光路，所述空间滤波器是所述分束器的一部分。
8.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述空间滤波器是透射式的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述空间滤波器是反射式的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述光学系统包括物镜，并且所述空间滤波器位于所述物镜的后孔径的正后面。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述光学系统包括物镜，并且所述空间滤波器位于所述物镜的后焦平面的共轭焦平面处。
12.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括质量为5000kDa或小于5000kDa的对象。
13.根据权利要求12所述的干涉散射显微镜，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括质量为10kDa或大于10kDa的对象。
14.根据前述权利要求中任一项所述的干涉散射显微镜，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括相对于所述照明光的散射截面为10-17m2或小于10-17m2的对象。
15.根据权利要求12所述的干涉散射显微镜，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括相对于所述照明光的散射截面为10-26m2或大于10-26m2的对象。
16.一种用于对干涉散射显微镜的输出光进行滤波的空间滤波器，所述输出光包括从样品位置散射的光和从所述样品位置反射的照明光两者，在检测所述输出光之前，所述空间滤波器被布置成使所述输出光通过，但是使强度减小，所述输出光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。
17.根据权利要求16所述的空间滤波器，其中，所述预定数值孔径是从所述样品位置反射的、包括在所述输出光中的所述照明光的数值孔径。
18.根据权利要求16或17所述的空间滤波器，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-2或小于10-2。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的空间滤波器，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-4或大于10-4。
20.一种改造干涉散射显微镜的方法，所述方法包括提供空间滤波器，所述空间滤波器对反射的输出光进行空间滤波，所述输出光包括从样品位置处的样品散射的光和从所述样品位置反射的照明光两者，在检测所述输出光之前，所述空间滤波使所述输出光通过，但是使强度减小，所述输出光的强度的减小在预定数值孔径内比在更大的数值孔径处大。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述预定数值孔径是从所述样品位置反射的、包括在所述输出光中的所述照明光的数值孔径。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-2或小于10-2。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，所述空间滤波器被布置成使输出光通过且使强度减小，所述输出光的强度在所述预定数值孔径内减小到入射强度的10-4或大于10-4。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中，所述预定数值孔径小于1，优选地小于0.5。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中，所述照明光在空间上和时间上是相干的。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括质量为5000kDa或小于5000kDa的对象。
27.根据权利要求26所述的干涉散射显微镜，其中，所述样品架保持样品，所述样品包括质量为10kDa或大于10kDa的对象。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中，所述样品包括相对于所述照明光的散射截面为10-12m2或小于10-12m2的对象。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述样品包括相对于所述照明光的散射截面为10-20m2或大于10-20m2的对象。
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