KR20190028448A

KR20190028448A - 간섭계 산란 현미경

Info

Publication number: KR20190028448A
Application number: KR1020197002376A
Authority: KR
Inventors: 필립 쿠쿠라; 알렉산더 바이겔
Original assignee: 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2019-03-18
Also published as: EP3923054A1; US20230359009A1; JP7260467B2; GB2552195A; CN109477955B; LT3485309T; US20200386975A1; CN109477955A; WO2018011591A1; EP3485309A1; GB201612182D0; ES2845077T3; US20190004299A1; EP3485309B1; KR102402863B1; JP2019520612A; US10775597B2

Abstract

간섭계 산란 현미경은 출력광의 공간 필터링을 수행하도록 맞춰져 있는데, 출력광의 감지에 앞서서 샘플 위치에서 산란된 광 및 샘플 위치에서 반사된 조명광을 두 가지를 포함한다. 공간 필터링은 반사된 조명광을 통과시키지만 기설정된 개구수 이내에서 큰 개구수 보다 더 큰 강도가 감소된다. 이로써 간섭광에 대한 이미지 콘트라스트를 개선하고, 특히 약한 산란체들에 있어서 개선한다.

Description

간섭계 산란 현미경

본 발명은 간섭계 산란 현미경 (본원에서 iSCAT로 지칭함)에 관한 것이다.

iSCAT은 고유한 시공간 해상도로 단일 입자 추적 및 단일 분자 수준까지 무표지 감도에 대해 강력한 접근방식으로 실현되어 왔다. iSCAT은 예를 들어 Kukura et al., "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935, 및 Ortega-Arroyo et al. "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636에 개시된다. 상당한 잠재력에도 불구하고 사용자 맞춤 현미경, 새로운 카메라, 및 복잡한 샘플 조명에 대한 요구로 인해 iSCAT의 광범위한 사용이 제한되어 왔고, iSCAT의 단일 분자 수준의 소형 대상물의 강력하고 정확한 검출, 특성화 및 이미지화에 대한 역량을 제한해왔다.

본 발명의 제1양태에 따르면, 샘플 위치에 샘플을 거치하는 샘플 홀더; 조명광을 제공하도록 배치된 조명원; 검출기; 조명광을 상기 샘플 위치를 향하게 하도록 배치되고 반사된 출력광을 수집하도록 배치되고, 상기 출력광은 상기 샘플 위치에서 산란된 광 및 상기 샘플 위치에서 반사된 조명광 두 가지를 포함하고, 상기 검출기로 상기 출력광을 향하게 하도록 배치된 광학 시스템; 및 상기 출력광을 필터링하도록 배치된 공간 필터이되, 상기 공간 필터는 기설정된 개구수 내에서 더 큰 개구수 보다 더 큰 강도 감소를 갖는 출력광을 통과시키도록 배치되는 것을포함하는 간섭계 산란 현미경이 제공된다.

현미경의 전체적 배열은 종래의 iSCAT 현미경과 유사할 수 있지만, 출력광에 영향을 주는 공간 필터가 추가적으로 구비된다. 상세하게는, 상기 공간 필터는 더 큰 개구수 보다 큰 기설정된 개구수 내에서 강도를 감소시켜서 출력광을 통과시킨다. 결과적으로, 반사된 조명광의 개구수 및 샘플 위치에서 샘플에 있는 대상물로부터 산란된 광의 개구수 사이의 불일치를 이용하여, 공간 필터는 산란광에 대한 조명광의 강도를 선택적으로 감소시킨다. 따라서, 공간 필터는 상기 두 개의 광원의 상이한 방향성들을 이용한다. 반사된 조명광은 일반적으로 상대적으로 낮은 개구수를 갖고, 반면 샘플의 표면에 가까운 서브-회절 크기를 갖는 대상물은 광을 높은 개구수로 우선적으로 산란한다. 따라서, 낮은 개구수에서 공간 필터에 의한 강도 감소는 주로 조명광에 영향을 주고, 산란광에 대한 영향을 최소화하여, 이미징 콘트라스트를 최대화한다.

상기 효과는 기설정된 개구수가 샘플 위치로부터 반사된 조명광의 개구수와 동일하거나 유사하도록 공간 필터를 배치함으로써 최대화 될 수 있다.

본 발명의 제1 양태는 반사하여 동작하는 현미경에 관한 것이다. 이 경우, 검출기에 도달하는 조명광은 주로 샘플의 표면, 일반적으로 샘플 및 샘플 홀더 사이의 계면으로부터 반사되어서, 상기 표면에 가까운 샘플에 있는 대상물과의 간섭을 제공한다. 이로써 높은 콘트라스트의 이미지가 제공된다. 이러한 효과는 검출기에 도달하는 조명광이 샘플의 깊이까지 투과하는 것을 특징으로 하는 투과하여 동작하는 현미경과 상이하다.

반사 동작은 고 성능 검출 및 약한 산란 대상물의 정량화를 함께 가능하게 하는 여러 장점들을 갖는다. 첫 번째로, 일반적으로 0.5%밖에 안 되는 상대적으로 적은 양의 조명광이 일반적으로 채택되는 유리-물 계면에서 반사되고, 반면 계면에서의 나노 대상물에 의해 산란되는 일반적으로 90% 이상인 현저히 높은 양의 조명광은 조명 방향을 향해 다시 산란된다. 이는 본질적으로 산란된 광 필드 및 반사된 광 필드 사이의 비율을 전송 지오메트리(geometry)에 비해 1000배 이상 향상시켜서 더 높은 간섭계 콘트라스트를 만든다. 결과적으로, 특정 산란체, 조도 및 노출 시간 하에서 동일한 명목상 신호-대-노이즈를 달성하기 위해 산탄 잡음 (shot noise)이 제한된 경우에서 3 배 더 작은 세기의 광자가 검출된다. 두 번째로, 반사에 있어서, 용액 내에 존재하는 큰 산란체들에는 전방 산란으로서 검출이 훨씬 덜 민감하고, 조명광과의 간섭은 검출되지 않아 보다 배경 배제 (background rejection)를 더 많이 하게 만든다.

상기 요인들은 이미지 품질을 향상시켜서 약한 산란체들의 높은 콘트라스트 검출을 가능하게 한다.

상기 이점들은 특히 다른 기술들을 통한 정확하고 정밀한 이미지화가 불가능한 약한 광 산란체의 이미지화에 적용된다. 예를 들어, 본 발명은 5000 kDa 이하의 질량을 갖는 대상물에 특히 적합하다.

이와 유사하게, 본 발명은 10^-17 m² 이하의 조명광에 대해 산란 단면을 갖는 대상물을 포함하는 샘플에 유리하게 적용될 수 있다. 일반적으로 이러한 대상물들은 10^-26 m² 이상, 즉 10^-17 m²부터 10^-26 m² 범위 내의 조명광에 대해 산란 단면을 또한 가질 수 있다. 연구되는 대상물들의 예시는 단백질 또는 이의 작은 응집체들을 포함한다.

매우 약한 산란체를 이미지화하기 위해, 공간 필터는 입사 강도의 10^-2 이하의 기설정된 개구수 내에서 강도 감소를 갖는 출력광을 통과시키도록 배치된다. 일반적으로, 공간 필터는, 입사 강도의 10^-4 이상, 예를 들어 입사 강도의 10^-2 내지 10^-4 의 범위 내에서, 기설정된 개구수 내에서 강도 감소를 갖는 출력광을 통과시키도록 배치될 수 있다.

조명광은 예를 들어 레이저를 광원으로 사용하여 공간적 및 시간적으로 간섭성일 수 있다. 현미경에서의 광시야 조명은 일반적으로 이미징 대상물의 후 초점면에 평행하게 된 레이저 광선을 집중시켜, 전반적인 이미징 성능에 최소한의 영향을 미치면서 현미경 안팎으로 효율적으로 결합 될 수 있음을 의미한다.

현미경은 기존의 상업적 현미경일 수 있으며, 공간 필터를 결합하여 적용된다. 기존의 iSCAT 현미경과 대조적으로, 이러한 적용은 매우 저렴하고 간단히 수행될 수 있는데, 예를 들어 광학 테이블, 또는 고가의 복잡한 광학 장치, 전자 장치 및 전문 작업에 대한 요구조건들을 포함하여 요구되는 감도를 제공하기 위해 복잡한 고가의 광학 및 전자 장치를 갖고, 이러한 요구조건들은 기존의 상업적 현미경에 공간 필터를 결합함으로써 현저히 감소되거나 없어진다. 이는 본 발명이 매우 비용 효율적인 방식으로 구현되도록 한다. 예를 들어, 복잡한 스캐닝 장치 없이 더 큰 시야가 제공될 수 있고 이미징 성능 또는 감도의 손실 없이 저비용 이미징 카메라의 사용이 가능해진다.

이와 같이 본 발명은 매우 비용 효율적인 방식으로 구현되는 것이 가능해진다. 예를 들어, 복잡한 스캐닝 배치 없이 더 큰 시야가 제공될 수 있고, 이미지 성능 또는 감도의 손실 없이 저가의 이미징 카메라의 사용이 가능해진다.

본 발명의 제2양태에 따르면, 간섭계 산란 현미경의 출력광을 필터링하기 위한 공간 필터가 제공되며, 상기 공간 필터는 제1양태의 공간 필터와 유사한 기능을 갖는다.

본 발명의 제3양태에 따르면, 출력광의 공간 필터링을 수행함으로써 간섭계 산란 현미경을 적응시키는 방법이 제공되며, 상기 공간 필터링은 제1양태에서 수행되는 것과 유사하다.

도1은 iSCAT현미경의 개략도이다;
도2는 iSCAT 현미경에 의해 캡쳐된 이미지이다;
도3 내지 6은 변경된 iSCAT 현미경들의 개략도들이다;
도7은 도6에 도시된 현미경을 사용하여 획득된 일련의 단백질들에 대한 서열 분자량에 대해 산란 콘트라스트의 플롯이다;
도8 및 9는 도6에 도시된 현미경을 사용하여 획득된 각각 비오틴 (biotin)의 존재 및 부재 하에 아비딘 (avidin)에 대한 질량 히스토그램들이다; 및
도10은 도6에 도시된 현미경을 사용하여 획득된 소 혈청 알부민에 대한 질량 히스토그램이다.

보다 이해를 돕기 위해, 본 발명의 실시예들이 첨부된 도면을 참조하여 비제한적인 예시로서 설명될 것이다.

본원에 기술된 현미경 및 방법에 있어서, 사용되는 광은: 자외선 (10nm 내지 380nm 범위의 파장을 갖는 것으로 본원에서 정의 될 수 있음); 가시광선 (380nm 내지 740nm 범위의 파장을 갖는 것으로 본원에서 정의 될 수 있음); 적외선 (740nm 내지 300μm 범위의 파장을 갖는 것으로 본원에서 정의 될 수 있음) 일 수 있다. 광은 여러 파장이 혼합된 것일 수 있다. 본 명세서에서, '광학의' 및 '광학'은 일반적으로 본 방법이 적용되는 광을 지칭하는데 사용된다.

도1은 하기와 같이 배치된 iSCAT현미경 (1)을 도시한다.

상기 현미경 (1)은 하기에 더 상세하게 기술되는 공간 필터 이외에는, 현미경 분야에서 종래의 기술 구성을 갖는 하기의 구성 요소들을 포함한다.

상기 현미경 (1)은 샘플 위치에 샘플 (3)을 거치하기 위한 샘플 홀더 (2)를 포함한다. 상기 샘플 (3)은 이미지화 되는 대상물을 포함하는 액체 샘플일 수 있고, 하기에 더 상세하게 기술된다. 상기 샘플 홀더 (2)는 샘플 (3)을 거치하기에 적절한 임의의 형태가 될 수 있다. 일반적으로, 상기 샘플 홀더 (2)는 샘플 홀더 (2) 및 샘플 (3) 사이의 계면을 형성하는 표면에 샘플 (3)을 거치 한다. 예를 들어, 샘플 홀더 (2)는 커버 슬립일 수 있고 또는 커버 슬립이거나 유리로 제조될 수 있다. 샘플 (3)은 예를 들어 마이크로 피펫을 사용하는 것처럼 직접적 방식으로 샘플 홀더 (2)에 제공될 수 있다.

현미경 (1)은 광원 (4) 및 검출기 (5)를 추가적으로 포함한다.

광원 (4)은 조명광을 제공하도록 배치된다. 상기 조명광은 간섭 광일 수 있다. 예를 들어, 광원 (4)은 레이저일 수 있다. 조명광의 파장은 샘플 (3)의 성질 및/또는 조사되는 특성들에 따라서 선택될 수 있다. 일 실시예에서, 조명광은 405nm의 파장을 갖는다.

선택적으로, 조명광은 조명 및 레이저 노이즈의 간섭성 (coherent nature)으로부터 발생하는 스펙클 패턴 (speckle patterns)을 제거하기 위해 공간적으로 변조 될 수 있고, 예를 들어 Kukura 외, "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935에 기술된 바와 같다.

검출기 (5)는 샘플 위치로부터 반사된 출력광을 수용한다. 일반적으로, 현미경 (1)은 광-필드 모드로 작동할 수 있고, 이 경우 검출기 (5)는 샘플 (3)의 이미지를 캡쳐하는 이미지 센서 일 수 있다. 현미경 (1)은 대안적으로 공초점 모드로 동작 할 수 있으며, 이 경우 검출기 (5)는 이미지 센서 일 수 있거나 포토 다이오드와 같은 점형 검출기 일 수 있으며, 이 경우 스캐닝 배열이 샘플 (3)의 영역을 스캔하여 이미지를 형성하는데 사용될 수 있다. 검출기 (5)로 채택될 수 있는 이미지 센서들의 예시들은 CMOS 이미지 센서 또는 CCD를 포함한다.

현미경 (1)은 샘플 홀더 (2), 조명원 (4) 및 검출기 (5) 사이에 배치된 광학 시스템 (10)을 더 포함한다. 상기 광학 시스템 (10)은 샘플 (3)을 밝히기 위해 조명광이 샘플 위치를 향하게 하기와 같이 배치되고, 샘플 위치로부터 반사된 출력광을 수집하고 출력광이 검출기 (5)로 향하게 한다.

광학 시스템 (10)은 샘플 홀더 (2)의 전방에 배치된 렌즈 시스템인 대물 렌즈 (11)를 포함한다. 또한 광학 시스템 (10)은 집광 렌즈 (12) 및 튜브 렌즈 (13)를 포함한다.

집광 렌즈 (12)는 광원 (11) 으로부터의 조명광을 (도 1에서 실선으로 도시 됨) 대물 렌즈 (11)를 통해 샘플 위치의 샘플 (3) 상에 집광한다.

대물 렌즈 (11)는 (a) 샘플 위치로부터 반사된 조명광 (도 1에 실선으로 도시) 및 (b) 샘플 위치에서 샘플 (3)로부터 산란된 광 (도 1에 점선으로 도시)를 포함하는 출력광을 수집한다. 반사된 광은 샘플 홀더 (2)와 샘플 (3) 사이의 계면으로부터 주로 반사된다. 일반적으로 이는 비교적 약한 반사, 예를 들어 유리-물 반사이다. 예를 들어, 반사 조명광의 강도는 입사 조명광의 강도의 약 0.5 % 일 수 있다. 산란광은 샘플 (3)의 대상물에 의해 산란된다.

종래의 iSCAT과 유사한 방식으로, 샘플의 표면 또는 근방의 대상물로부터의 산란광은 반사광을 구조적으로 방해하고 이는 검출기 (5)에 의해 캡쳐된 이미지에서 볼 수 있다. 이 효과는 검출기에 도달하는 조명광이 샘플의 깊이로 투과되어 더 작은 이미징 콘트라스트를 초래하는 투과성으로 동작하는 현미경과는 다르다.

도 1에 도시 된 바와 같이, 반사 조명광과 산란광은 다른 방향성을 갖는다. 특히, 반사된 조명광은 광원 (4) 및 광학 시스템 (6)에 의해 출력된 광 빔의 지오메트리(geometry)에 기인하여 개구수를 갖는다. 산란광은 넓은 각도 범위에 걸쳐 산란되어 반사된 조명광 보다 더 큰 개구수를 충족한다.

튜브 렌즈 (13)는 대물 렌즈 (11)로부터의 출력광을 검출기 (5) 상에 집속시킨다.

또한, 광학 시스템 (6)은 광원 (4)으로부터의 조명광에 대한 광 경로와 검출기 (5)로 향하는 출력광을 분리하도록 배치된 빔 스플리터 (14)를 포함한다. 후술하는 바와 같은 공간 필터의 제공을 제외하고, 빔 스플리터 (14)는 입사광의 부분 반사 및 부분 투과를 제공하는 종래의 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 빔 스플리터 (14)는 일반적으로 금속 또는 유전체 일 수 있는 필름이 구비된 플레이트 일 수 있으며, 광 경로에 대해 45 °로 배치된다. 대안적으로, 빔 스플리터 (14)는 프리즘들 사이의 계면에서 부분 반사 필름을 갖는 정합된 한 쌍의 프리즘에 의해 형성된 큐브 빔 스플리터 일 수 있다. 대안적으로, 빔 스플리터 (14)는 빔 스플리터 (14)와 샘플 (3) 사이의 쿼터 파장 판과 결합하여 사용되는 편광 빔 스플리터 일 수 있다.

도 1에 도시된 예에서는 광원 (4)이 대물 렌즈 (11)의 광 경로로부터 오프셋되어 광원 (4)으로부터의 조명광이 빔 스플리터 (14)에 의해 대물 렌즈 (11)로 반사되고, 반대로 검출기 (5)는 대물 렌즈 (11)의 광 경로와 정렬되어, 샘플 위치로부터의 출력광은 빔 스플리터 (14)를 통해 검출기 (5)를 향해 전송된다.

종래의 구성일 수 있는 전술된 구성요소들 이외에, 현미경 (1)은 공간 필터 (20)를 포함한다. 도 1에 도시 된 예에서, 공간 필터 (20)는 빔 스플리터 (14) 상에 형성되어, 대물 렌즈 (11)의 후방 개구 및 대물 렌즈 (11)의 후방 초점면 (15) 바로 뒤에 배치된다. 따라서, 공간 필터 (20)는 위상 콘트라스트 현미경에서와 같이 대물 렌즈에 들어가지 않고 구현 될 수 있다. 공간 필터를 접합면이 아닌 대물 렌즈의 입구 개구 바로 뒤에 배치하는 것은 (예를 들어, 하기에서 설명하는 바와 같음) 높은 개구수 현미경 대물 렌즈 내에서 수 많은 렌즈로부터 유래된 후방 반사를 강력하게 억제하는 뚜렷한 이점을 갖는다. 이는 이미지 노이즈를 줄이고 비 간섭성 배경을 낮추며, 실험 복잡성, 광학 장치 수 및 광 경로 길이를 줄여 광학 구조의 안정성 및 이미지 품질을 향상시킨다.

그러나, 상기 위치는 필수적이지 않고 동등한 기능을 갖는 공간 필터는 후술되는 바와 같이 기타 위치에 구비될 수 있다.

이에 따라, 공간 필터 (20)는 검출기 (5)로 통과하는 출력광을 필터링하도록 배치된다. 검출기 (5)가 대물 렌즈 (11)의 광 경로와 정렬되는 도 1에 도시 된 예에서, 공간 필터 (20)는 따라서 투과성이다.

공간 필터 (20)는 부분적으로 투과성이어서, 반사된 조명광을 포함하는 출력광을 통과시키지만, 강도가 감소된다. 공간 필터 (20)는 또한 광축과 정렬되고 기설정된 개구를 가지므로 기설정된 개구수 내에서 강도의 감소를 제공한다. 여기서, 개구수는 통상적인 방식으로, 출력광이 시작되는 샘플 위치에 대한 각도 범위를 특징 짓는 무차원 양으로 정의된다. 구체적으로, 개구수 (NA)는 방정식 NA=n·sin(θ) 로 정의될 수 있으며, 여기서 θ는 수집의 반각이고, n은 출력광이 통과하는 재료의 굴절률이다 (예를 들어, 광학 시스템 (6)의 구성 요소 물질).

공간 필터 (20)는 기설정된 개구수 이외의 경우에는 강도 감소시키지 않는다. 원칙적으로, 바람직하지는 않더라도 공간 필터 (20)는 그 개구수 이외의 경우에 강도의 감소를 제공할 수 있지만, 기설정된 개구수 내에서 강도의 감소 보다 작은 강도의 감소를 제공 할 수 있다.

공간 필터 (20)는 일반적으로 증착된 물질의 층을 포함하는 임의의 적절한 방식으로 형성 될 수 있다. 재료는 예를 들어 은과 같은 금속 일 수 있다. 증착은 임의의 적절한 기술을 사용하여 수행 될 수 있다.

계면 근처의 서브-회절 크기의 대상물은 반사된 조명광보다 큰 개구수로 우선적으로 광을 산란시키므로, 공간 필터 (20)에 의해 제공되는 강도의 감소는 산란광에 대한 반사된 조명광의 검출 강도를 우선적으로 감소시킨다. 따라서, 낮은 개구수에서 공간 필터 (20)에 의한 강도 감소는 반사된 조명광에 주로 영향을 미치고, 산란광에 대한 영향을 최소화하여, 캡쳐 이미지의 콘트라스트를 최대화한다. 강화된 이미징 콘트라스트는 약한 산란체의 높은 콘트라스트 검출을 가능하게 한다.

콘트라스트 개선은 하기와 같이 이해될 수 있다. 공간 필터 (20)가 기설정된 개구수 에서 출력광의 일부를 통과시키며 (즉, 본 예시에서는 부분적으로 투과성임), 조명광 및 산란광의 일부들이 검출기에 도달하고 충분히 간섭성인 조명원에 간섭하게 된다. 검출기I_det 에 도달하는 광 강도는 I_det = |E _inc |²{r ² t ²+|s|²+2rt|s|cosΦ}이고, 여기서 E _inc 는 입사광 필드, r ²은 계면 반사율, t ² 는 공간 필터 (20)의 투과도, s 는 대상물의 산란 진폭, Φ 는 투과된 조명광 및 산란광 사이의 위상차이다. 따라서, 검출된 광자의 총수를 희생 시키더라도 산란 콘트라스트는 향상된다.

따라서, 종래의 iSCAT과 유사한 방식으로 콘트라스트가 제공되지만, 공간 필터의 투과성에 의해 추가적으로 조절된다. 이는 표준 iSCAT에서와 같이 유리-물 계면의 반사성으로 고정된 것과 반대로 공간 필터 (20)의 투과성 t ²을 직접 선택하여 기준 필드의 크기를 맞출 수 있는 능력을 제공한다. 공간 필터 (20)가 증착된 물질층인 경우, 투과성 t ² 는 물질 및/또는 층 두께에 의해서 선택될 수 있다. 이러한 맞춤 과정은 예를 들어 대상물의 산란, 카메라 풀 웰 (full well) 용량 및 배율에 따라서 수행될 수 있다.

iSCAT 의 이러한 유리한 효과들을 최대화하기 위해, 기설정된 개구수는 출력광 내의 반사된 조명광의 개구수가 될 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 유사한 특성의 이점은 기설정된 개구수가 반사된 조명광의 개구수 보다 약간 작거나 또는 큰 경우에 달성될 수 있다.

공간 필터 (20)를 사용하는 것이 특정 대상물에 의해 산란하는데 달성될 수 있는 감도 한계 또는 SNR (신호 대 잡음비), 입사광 강도 및 노출 시간을 근본적으로 변화시키지 않는다. 그러나, 콘트라스트를 향상시키고 전반적으로 검출된 광자 플럭스를 감소시킴으로써, 기설정된 감도 또는 SNR을 달성하기 위해 iSCAT의 구현을 급격하게 단순화한다. 기존의 iSCAT현미경은 예를 들어 광학 테이블, 또는 고가의 복잡한 광학 장치, 전자 장치 및 전문 작업 필요에 대한 요구와 같은 복잡한 고가의 구성 요소를 갖는다. 공간 필터 (20)를 사용함으로써 이러한 필요요건들이 크게 완화된다. 예를 들어 전술된 복잡한 고가의 구성요소들을 갖지 않는 기존의 상업적 현미경에 공간 필터 (20)를 단순히 추가함으로써 기존 iSCAT 현미경과 동등한 수행이 달성될 수 있다. 공간 필터 (20) 자체는 물론 간단하고 저렴한 구성요소 이다. 또한, 공간 필터 (20)는 이미징 감도의 소실 없이 낮은 풀 웰 (full well) 용량으로 표준CMOS 또는 CCD 카메라의 사용을 가능하게 한다.

따라서, 현미경 (1)은 공간 필터 (20)를 결합하여 맞춰진 기존의 상업적 현미경일 수 있다. 이러한 적용은 매우 저렴하고 간단히 수행될 수 있다. 상기 적용은 기존 상업적 현미경의 부속품 슬롯에 수용되도록 구비된 어댑터 내에 공간 필터를 형성하여 수행될 수 있고, 예를 들어 현미경 내에 미러를 결합하는데 사용되는 특허 문헌 제 WO 2015/092778 호에 개시된 어댑터와 유사한 방식이다.

대안적으로, 현미경 (1)은 구체적으로 공간 필터 (20)와 함께 사용되기 위해 설계될 수 있다.

도2는 현미경 (1)의 예시를 활용하여 획득된 이미지를 도시한다. 본 예시에서, 간섭성 명시야 조명광이 제공되고 퓨즈 실리카 상에 3.5 mm지름으로180 nm두께로 증착된 실버 층에 포함되어 1Х10^-2 의 반사광 강도를 전달하도록 하는 공간 필터 (20)이다. 이는 단일 395 kDa 단백질에 1%의 산란 콘트라스트를 만들고, 10 의 SNR을 만든다 (10 프레임 s^-1의 이미지 캡쳐 속도, 및 10 kW/cm²의 조명광 강도). 도2는 검출기 (5)로 저가의 CMOS 카메라를 사용하여 캡쳐된 이미지이다. 도시된 바와 같이, 높은 콘트라스트 이미지가 획득된다. 또한, 명시야 조명은 일반적으로 대물 렌즈에서 비롯된 가장 강한 불필요한 역-반사가 검출기 (5)로부터 멀어지는 방향을 향하게 하고, 이미징 배경을 최소화하면서 조명 광선의 복잡한 스캐닝 없이도 넓은 시야를 확보하게 한다.

개선된 콘트라스트의 이점은 광을 너무 약하게 산란하여 기타 기술로는 이미지화가 어려운 대상물의 이미지화를 가능하게 한다. 예를 들어, 본 발명은 5000 kDa 이하의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플에 유리하게 적용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 10 kDa 이상의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플에 유리하게 적용될 수 있고, 예를 들어 10 kDa 내지 5000 kDa 범위 내의 질량을 갖는 대상물이다.

또한 대안적으로, 본 발명은 10^-12 m² 이하, 또는 보다 바람직하게는 10^-17 m² 이하의 조명광에 대한 산란 단면을 갖는 대상물에 적용될 수도 있다. 일반적으로 이러한 대상물들은 조명광에 대한 산란 단면을 또한 가질 수 있다. 일반적으로 이러한 대상물들은 10^-20 m²의 조명광, 보다 바람직하게는 10^-26 m² 이상, 예를 들어 10^-17 m²부터 10^-26 m²의 범위 내의 조명광에 대한 산란 단면을 또한 가질 수 있다. 산란 단면은 측정에 사용되는 기술과 무관하게, 특정 파장의 입사광에 대한 대상물의 유효 크기와 관련된 기본적이고 측정 가능한 속성이다. 예를 들어 산란 단면들은 암시야 현미경(dark field microscopy)에 의해 측정될 수 있다.

본 발명이 적용될 수 있는 대상의 예로는 단백질 또는 이의 소형 응집물 또는 이들의 결합 파트너들을 포함한다.

상대적으로 약한 산란체들의 이미지화를 위해서, 공간 필터 (20)는 기설정된 개구수 내에서 입사 강도의 10^-2 내지10^-4의 범위의 강도로 강도를 감소시켜 반사된 조명광을 통과시키도록 배치될 수 있다 (이 경우, 공간 필터 (20)에 입사되는 출력광의 강도).

그 밖에, 현미경 (1)은 공간 필터 (20)를 참조하지 않고 설계 및 동작될 수 있다. 예를 들어, 시야는 조명광의 초점 조건을 변화시켜서 조절 가능하다. 유사하게, 광섬유가 조명광을 전달하는데 사용되는 경우, 멀티-컬러 이미징은 추가적인 레이저원을 단일 모드 광섬유에 연계하는 것 이상을 요구하지 않는다. 일반적으로, 현미경 (1)은 예를 들어 Kukura 외, "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935 및 Ortega-Arroyo 외, "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636에 개시된 바와 같이 iSCAT에 공지된 기술 및 기타 구성요소를 사용하도록 맞춰질 수 있다.

현미경 (1)에 대한 구체적인 변경의 일부 예시가 도3 내지 도5를 참조하여 기술되고, 이러한 예시들이 제한적인 것은 아니다. 후술되는 변경과 별도로, 현미경 (1)은 상술된 바와 동일한 구조 및 동작을 갖는다. 간결성을 위해, 공통된 구성요소는 동일한 참조번호가 부여되고, 상기 설명은 반복되지 않는다.

도3은 대물 렌즈 (11)의 후방 개구 뒤에 있는 것이 아닌, 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)의 공초점면 (21)에 공간 필터 (20)를 배치하는 경우의 현미경 (1)을 도시 한다. 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)의 공초점면 (21)은 튜브 렌즈 (13) 후방에 배치된 한 쌍의 망원 렌즈들 (22, 23) 사이에 형성된다. 광 경로 내의 제1망원 렌즈 (22)는 공초점면 (21)을 형성하도록 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)을 이미지화하고, 제2 망원 렌즈 (23)는 공초점면 (21)을 검출기 (5) 상에 이미지화 한다.

공간 필터 (20)는 공초점면 (21)에 구비되고 투명판 (24) 상에 형성된다. 공간 필터 (20)의 구성 및 동작은 도1을 참조하여 전술된 바와 동일하며, 예를 들어 광학 축에 정렬되고 기설정된 개구를 가지므로 그 이내에서 강도를 감소시키고, 상술된 바와 같이 기설정된 개구수를 갖는다 (단, 공간 필터 (20)는 광 경로에 45º 를 이루기 보다는 광 경로에 거의 수직하다).

도4는 공간 필터 (20)가 투과성이지 않고 반사성인 경우의 현미경 (1)을 도시한다. 상기 경우에, 광원 (4) 및 검출기 (5)의 위치들은 반대로 되어서 광원 (4)으로부터의 조명광은 빔 스플리터 (14)를 통해 대물 렌즈 (11)로 투과되고, 반대로 샘플 위치로부터의 출력광은 빔 스플리터 (14)에 의해 검출기 (5)를 향해 반사된다.

공간 필터 (20)는 빔 스플리터 (14) 상에 형성되지만, 광원 (4) 및 검출기 (5)가 반전 되는 관점에서, 공간 필터 (20)는 반사성이다. 반사성에도 불구하고, 공간 필터 (20)는 전술된 바와 동일한 방식으로 동작하도록 배치된다. 즉, 공간 필터 (20)는 검출기 (5)를 통과하는 출력광을 필터링하고 출력광을 통과시키지만, 강도를 감소시킨다. 상기 경우는 부분적으로 반사되는 것으로 달성되지만, 공간 필터 (20)의 구성 및 동작은 이외에는 동일하고, 예를 들어 전술된 바와 같이 광축과 정렬되고 기설정된 개구를 가지므로 기설정된 개구수 내에서 강도를 감소시킨다.

도5는 도3과 유사한 변경을 갖는 현미경 (1)을 도시하는데, 공간 필터 (20)를 대물 렌즈 (11)의 후방 개구 뒤가 아닌 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)의 공초점면 (25)에 위치시키고, 추가적인 변경은 공간 필터 (20)가 투과성이지 않고 반사성인 것이다. 도3의 경우와 같이, 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)의 공초점면 (21)은 튜브 렌즈 (13) 후방에 배치된 한 쌍의 망원 렌즈들 (22, 23) 사이에 형성된다. 그러나, 반사판 (26)은 망원 렌즈들 (22, 23) 사이 공 초점면(25)에 구비되지만, 광 경로를 45도로 배치하여 반사판 (26)에서의 반사가 90도로 광 경로를 변경하도록 한다. 공간 필터 (20)는 반사판 (26) 상에 형성되어 공초점면(25)에 구비되고, 따라서 투과성이지 않고 반사성이다. 반사성인 것에도 불구하고, 공간 필터 (20)는 상술된 바와 같은 방식으로 운영되도록 배치되고, 이는 도4의 경우와 유사한 방식이다.

도6은 공간 필터 (20)를 대물 렌즈 (11)의 후방 개구 뒤가 아닌 대물 렌즈 (11)의 후 초점면의 공초점면 (21)에 위치시키도록 변경된 현미경 (1)을 도시한다. 대물 렌즈 (11)의 후 초점면 (15)의 공초점면(21)은 도3의 변형과 같은 방식으로 튜브 렌즈 (13) 뒤에 배치된 한 쌍의 망원 렌즈들 (22, 23) 사이에 형성된다. 그러나, 도3의 변경과 비교하면, 하기와 같은 추가적인 변형이 또한 있을 수 있고, 도6의 각 변경들은 상호간에 독립적으로 적용될 수 있다.

음향-광학 변환기 (32)는 광원 (4) 후에 배치되는데, 조명광을 스캐닝하기 위해서이다. 음향-광학 변환기 (32)는 샘플 (3)의 영역을 스캔하여 이미지를 생성하고/생성하거나, 전술된 바와 같이 광원의 간섭성 및 레이저 노이즈로 인해 발생하는 스페클 패턴을 제거하기 위해서 공간 변조를 제공한다.

집광 렌즈 (12)는 이미지 대상물의 후 초점면으로 음향-광학 변환기 (32)에서 빔 경로에 대한 임의의 변경을 영상화하는 기능을 수행하는 한 쌍의 텔레센트릭 렌즈 (30, 31)로 교체될 수 있다.

광원 (3) 및 검출기 (5)의 위치들은 도4에 나타난 변경과 유사한 방식으로 반전되어, 광원 (4)으로부터의 조명광이 빔 스플리터 (14)를 통해 대물 렌즈 (11)로 전달되고, 역으로 샘플 위치로부터의 출력광은 빔 스플리터 (14)에 의해 검출기 (5)를 향해 반사된다.

빔 스플리터 (14)는 편광 빔 스플리터고, 쿼터 파장 판(33)은 빔 스플리터 (14) 및 샘플 (3) 사이에 배치되어, 빔 스플리터 (14)가 광을 분리하도록 한다.

미러 (34)는 빔 스플리터 (14)에 의해 반사된 출력광을 굴절시키도록 배치된다. 이는 단순하게 현미경 (1) 배치를 보다 압축적으로 제공하기 위해서이다.

현미경 (1)은 단일 분자 검출을 포함한 광범위한 분야에서 iSCAT을 수행하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 콘트라스트 개선은 유리하고, 서브-회절 및 약한 산란체의 이미지화에 모두 적용될 수 있다. 약한 산란체의 무표지 이미지화가 특정 응용분야이고, 이 때 관심 대상물은 이미지 콘트라스트가 감소하는 큰 배경 위에서 항상 검출되어야 한다. 현미경 (1)은 다양한 연구 및 측정에 사용될 수 있는데, 예를 들어 굴절률의 변화를 측정하는 것으로, 예를 들어: 단일 분자 결합/해체, 상 전이, 클러스터링, 조립/해체, 응집, 단백질/단백질 작용, 단백질/소분자 작용, 고감도 무표지 촬상을 포함한다.

따라서, 기초 연구부터 산업 분야, 예를 들어 의약 산업과 같은 분야에서 현미경 (1)의 다수 응용분야가 있다. 특히, 현재 iSCAT을 수행하는데 필요한 복잡한 실험 설정으로 배제된 분야에 iSCAT을 활용하게 한다. 일례로, iSCAT는 현재 세계적으로 가장 민감한 무표지 단일 분자 이미징 바이오센서이고, 표면 플라즈몬 공명 감지 시장과 같은 분야에 현저한 영향을 줄 수 있다. 또한, 연구 및 산업에서의 많은 응용 분야에서, 정확하고 세밀하고 고해상도인 용액 내의 단일 분자 질량 분광기로서 기능한다.

실시예

정확도, 해상도 및 정밀도와 같은 중요한 성능 파라미터는 하기와 같이 도6에 도시 된 구성을 갖는 현미경에서 일련의 단백질 샘플들을 사용하여 정량화되었다.

표준 PBS버퍼 내에 10 nM 농도로 용해된 일련의 단백질의 산란 콘트라스트를 기록하여 분자량을 결정하는 도구로서 정확도의 정량화를 수행하였다 (단백질은 스트렙타비딘 (Streptavidin)- 53 kDa, 소 혈청 알부민- 66 kDa, 알코올 탈수소효소 (Alcohol Dehydrogenase)- ~146 kDa, β-아밀라제- 224 kDa, HSP 16.5 - 395 kDa, HALO 태그로 변형된 비-근육 미오신(myosin ) IIb- 598 kDa, 티로 글로불린 (Thyroglobulin ), - 669 kDa, GroEL - 802 kDa 이다). 결과는 물체의 체적에 대한 iSCAT 콘트라스트의 선형 의존성과 모든 단백질이 동일한 아미노산 풀에서 만들어 지고 공통적인 반사율 그리고 산란 단면을 갖는다는 것이 예측되어 매우 선형적인 거동을 나타낸다. 도 7은 결과를 도시하는데, 이는 산란 콘트라스트 대 서열 분자량 및 관련 오차 막대의 플롯이다. 예상한대로 결과는 모든 단백질이 공통 굴절률과 그에 따른 교차 단면 갖는 동일한 아미노산 풀로 만들어진다는 사실을 고려할 때 대상물의 체적에 대한 iSCAT 콘트라스트의 선형 의존성에 있어 매우 선형적인 양태를 나타낸다. 분자량의 예상치 및 측정치 사이의 관찰된 편차는 평균 결정되는 질량의3 % 정도이다. 이는 현미경 (1)을 사용하여 단일 단백질 분자의 분자량을 결정하는데 있어서 고도의 정확도를 입증한다.

현미경 (1)은 아미노산, 지질 또는 탄수화물의 조성과 무관하게, 질량의 5 % 이상의 정확도로 단일 단백질만큼 작은 대상물의 질량을 정량 할 수 있다고 예상된다.

현미경 (1)은 예를 들어 5000kDa 미만 및 10kDa 미만의 질량을 갖는 기존 기술보다 작은 대상물의 질량의 변화를 정량 할 수 있는 것으로 예상된다. 기기 정밀도의 정량화는 다음과 같이 수행되었다. 여기에 설명 된 접근법을 사용하여 대상물의 질량을 결정하는 정밀도는 산란 콘트라스트 분포의 중심을 결정하는 능력에 의해 통계적으로 제한된다. 기록된 분포가 산탄 잡음 제한 프로세스에 예상되는 대로 가우스 프로파일을 나타낼 때, 정밀도는 sN^-1/2로 스케일링하는 것으로 잘 알려져 있으며, 여기서 s는 관심 분포의 표준 편차이고 N은 취해진 샘플의 수 이다. 결과적으로, 질량 측정의 정밀도는 해상도나 정확도에 의해 제한되지 않지만, 원칙적으로 측정 횟수를 늘려 임의적으로 증가시킬 수 있다. 이를 설명하기 위해, 아비딘 (avidin)의 질량 히스토그램은 용액 중 포화된 비오틴 (biotin)의 부재 (6839 개의 경우) 및 존재 (6609 개의 경우)에서 기록되었고 결과는 도 8 및 도 9에 각각 도시된다. 4 개의 비오틴 (biotin) 분자가 결합 된 970 Da 와 비교하여 950 ± 330 Da의 비오틴 (biotin) 존재 하에서의 질량 증가가 측정되었다.

장치 해상도, 특히 해상도 한계의 정량화는 도 6에 도시된 소 혈청 알부민의 결과로부터 얻어진 보정을 사용하여 질량 히스토그램을 기록함으로써 수행 하였다. 결과적 히스토그램이 도 10에 도시되고, 34 kDa의 해상도를 유도하는 28 kDa의 단량체 피크의 fwhm을 갖는 용액 중의 단량체, 이량체 및 삼량체에 대한 개별적인 식별 가능한 피크를 나타낸다. 상기 값은 검출된 광자의 전체 개수의 함수이고, 따라서 더 높은 광 강도를 사용하여 개선될 수 있다. 이는 현미경 (1)의 높은 질량 해상도를 증명한다.

종합적으로, 상기 결과들은 현미경 (1)이 작은 분자의 결합으로 유도된 작은 질량 차이를 정량화하고, 편광성을 통해 대상체 질량의 정확하고 정밀한 특성화를 모두 가능하게 함을 나타낸다. 이는 현재 40 kDa까지 단일 단백질을 검출할 수 있고 서열 질량의 5%이내로 분자량을 정확하게 측정할 수 있게 한다 (도7). 또한, 높은 SNR은 예를 들어 현재 250Da에 달하는 검출된 분자수에 의해서만 제한되는 정밀도로 결합하는 경우를 통해 질량 변화를 특성화할 수 있게 한다 (도8 및 도9). 또한, 달성가능한 높은 SNR은 용액 내 단백질의 상이한 올리고머 상태들을 명확히 감지하는 것을 가능하게 하여 단백질 응집을 상세하게 특성화할 수 있게 한다 (도10).

Claims

샘플 위치에 샘플을 거치하는 샘플 홀더;
조명광을 제공하도록 배치된 조명원;
검출기;
조명광을 상기 샘플 위치를 향하게 하도록 배치되고 반사된 출력광을 수집하도록 배치되고, 상기 출력광은 상기 샘플 위치에서 산란된 광 및 상기 샘플 위치에서 반사된 조명광 두 가지를 포함하고, 상기 검출기로 상기 출력광을 향하게 하도록 배치된 광학 시스템; 및
상기 출력광을 필터링하도록 배치된 공간 필터이되, 상기 공간 필터는 기설정된 개구수 내에서 더 큰 개구수 보다 더 큰 강도 감소를 갖는 출력광을 통과시키도록 배치되는 공간 필터를 포함하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항에 있어서,
상기 기설정된 개구수는 상기 출력광에 포함된 상기 샘플 위치로부터 반사된 상기 조명광의 상기 개구수인 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-2 이하까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-4 이상까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기설정된 개구수는 1 미만, 바람직하게는 0.5 미만인 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조명광은 공간적 및 시간적으로 간섭성인 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 상기 조명광 및 상기 출력광의 광 경로를 분할하도록 배치된 빔 스플리터를 포함하고, 상기 공간 필터는 상기 빔 스플리터의 일부인 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 투과성인 것을 특징으로 하는　간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 반사성인 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 대물 렌즈를 포함하고 상기 공간 필터는 상기 대물 렌즈의 상기 후방 개구 바로 뒤에 배치된 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광학 시스템은 대물 렌즈를 포함하고 상기 공간 필터는 상기 대물 렌즈의 후 초점면의 공초점면에 배치된 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 5000 kDa이하의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 10 kDa 이상의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 10^-17 m² 이하의 상기 조명광에 대해 산란 단면을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.　
제12항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 10^-26 m² 이상의 상기 조명광에 대해 산란 단면을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.　
　간섭계 산란 현미경의 출력광을 필터링하는 공간 필터이되,
출력광은 샘플 위치에서 샘플로부터 산란된 광 및 상기 샘플 위치로부터 반사된 조명광 두 가지를 포함하고, 상기 출력광을 검출하기 전에, 상기 공간 필터는 더 큰 개구수 보다 기설정된 개구수 내에서 더 큰 강도 감소로 상기 출력광을 통과시키도록 배치된 공간 필터.
　제16항에 있어서,
상기 기설정된 개구수는 상기 출력광에 포함된 상기 샘플 위치로부터 반사된 상기 조명광의 상기 개구수인 것을 특징으로 하는 공간 필터.
　제16내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-2 이하까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 공간 필터.
　제16내지 18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-4 이상까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 공간 필터.
간섭계 산란 현미경을 적용하는 방법이되,
상기 방법은 반사된 출력광의 공간 필터링을 수행하는 공간 필터를 제공하는 단계를 포함하는 방법이고, 출력광은 샘플 위치에서 샘플로부터 산란된 광 및 상기 샘플 위치로부터 반사된 조명광 두 가지를 포함하고, 상기 출력광을 검출하기 전에, 상기 공간 필터링은 더 큰 개구수 보다 기설정된 개구수 내에서 더 큰 강도 감소로 상기 출력광을 통과시키는
간섭계 산란 현미경을 활용하는 방법.
　
　제20항에 있어서,
상기 기설정된 개구수는 상기 출력광에 포함된 상기 샘플 위치로부터 반사된 상기 조명광의 상기 개구수인 것을 특징으로 하는 방법.
　제20항 또는 제21항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-2 이하까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 방법.
　제20내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공간 필터는 상기 기설정된 개구수 내에서 상기 입사 강도의 10^-4 이상까지 강도를 감소시켜 출력광을 통과시키도록 배치된 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제20내지 23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기설정된 개구수는1 미만, 바람직하게는 0.5미만인 것을 특징으로 하는 방법.
　제20내지 24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조명광은 공간적 및 시간적으로 간섭성인 것을 특징으로 하는 방법.
　제20내지 25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 5000 kDa이하의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서,
상기 샘플 홀더는 10 kDa 이상의 질량을 갖는 대상물을 포함하는 샘플을 거치하는 것을 특징으로 하는 간섭계 산란 현미경.
　제20내지 27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 10^-12 m² 이하의 상기 조명광에 대해 산란 단면을 갖는 대상물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.　
　제28항에 있어서,
상기 샘플은 10^-20 m² 이상의 상기 조명광에 대해 산란 단면을 갖는 대상물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.