CN115210555A - 光学成像系统 - Google Patents
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Abstract
提出了一种用于对包括纳米级对象的样品进行光学成像的光学系统。该光学系统包括成像透镜、被配置为提供激发光的照明源、检测器和用于支撑样品的基板。当样品被施加在基板上时，被布置成反射激发光的样品界面形成在样品与基板面向样品的第一侧之间。光学成像系统被布置成使得激发光经由成像透镜被发送到基板中并且使得检测器接收参考光和散射光。参考光包括激发光在样品界面处被反射并被成像透镜收集到的部分，而散射光包括激发光被纳米级对象散射并被成像透镜收集到的部分。光学系统被配置为，响应于激发光，通过参考光与散射光之间的干涉图案的光学对比度，使得纳米级对象在检测器处被成像。基板包括设置在基板的第一侧上的光学涂层，使得当样品被施加在基板上时，样品与光学涂层接触。激发光在样品界面处的反射程度使得光学对比度与使用在没有光学涂层的情况下形成的样品界面获得的光学对比度相比更大。
Description
技术领域
本说明书涉及光学成像。
背景技术
干涉散射显微镜(iSCAT)是能够对各个大分子和纳米粒子进行无标记成像的光学技术。iSCAT显微镜可以通过光学信号强度检测溶液中未标记的单分子，光学信号强度是检测到的粒子的质量的特征。各个分子的这种光学质谱可能非常适合用于研究范围广泛的分子组装过程(包括蛋白质-蛋白质相互作用)，因此在诸如医学诊断和药物开发等领域具有潜在应用。iSCAT可用于生物传感，即用于检测和量化样品中的生物标志物。特别地，iSCAT能够实现具有高灵敏度的表面结合事件的检测，并能够基于高度功能化的表面和特异性结合实现新的无标记生化测定。
虽然干涉散射显微镜能够检测和称量未标记的单分子，并为分子组装特性的研究提供便利，但通过将iSCAT与超分辨率单分子荧光显微镜相结合，可以扩展应用范围。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种用于对包括纳米级对象的样品进行光学成像的光学系统。该光学系统包括成像透镜、被配置为提供激发光的照明源、检测器和用于支撑样品的基板。当样品被施加在基板上时，被布置成反射激发光的样品界面形成在样品与基板面向样品的第一侧之间。光学成像系统被布置成使得激发光经由成像透镜被发送到基板中并且使得检测器接收参考光和散射光。参考光包括激发光在样品界面处被反射并被成像透镜收集到的部分，且散射光包括激发光被纳米级对象散射并被成像透镜收集到的部分。光学系统被配置为，响应于激发光，通过参考光与散射光之间的干涉图案的光学对比度，使得纳米级对象在检测器处被成像。基板包括设置在基板的第一侧上的光学涂层，使得当样品被施加在基板上时，样品与光学涂层接触。激发光在样品界面处的反射程度使得光学对比度与使用在没有光学涂层的情况下形成的样品界面获得的光学对比度相比更大。
在一些实现方式中，光学系统还包括第一光学元件，该第一光学元件被配置为将用于激发光束到成像透镜中的路径与用于参考光和散射光到检测器中的路径分开。
在一些实现方式中，第一光学元件被配置为偏振分束器。
在一些实现方式中，光学系统还包括在第一光学元件与成像透镜之间的结构化波片。结构化波片包括被配置为向激发光束赋予第一延迟的内部区域和被配置为向激发光束赋予第二延迟的外部区域。
在一些实现方式中，第一延迟与第二延迟之间的差在0.7π到0.99π之间。
在一些实现方式中，第二延迟为零。
在一些实现方式中，内部区域的面积小于4mm2。
在一些实现方式中，光学系统还包括在第一光学元件与成像透镜之间的四分之一波片。激发光相对于偏振分束器的对准是s偏振的，使得激发光在第一光学元件处基本上被反射到成像透镜中。
在一些实现方式中，照明源包括第一照明源和第二照明源。第一照明源提供处于第一波段内的波长处的第一激发光，第一激发光是用于参考光和散射光的激发光。第二照明源为纳米级对象的荧光激发提供处于第二波段内的波长处的第二激发光。第一光学元件还被配置为将第二激发光与第一激发光组合到成像透镜中，并将荧光光线(fluorescencelight)透射到检测器中，使得通过纳米级对象发射的荧光光线纳米级对象还在检测器处被成像。
在一些实现方式中，纳米级对象包括多组荧光团，每组荧光团具有不同的激发光谱。第二照明源被配置为，为相应组的荧光激发提供处于多个波长处的第二激发光。
在一些实现方式中，第一照明源包括具有快速电流调制的超发光发光二极管或单模二极管激光器。
在一些实现方式中，光学系统被配置为使得干涉图案和荧光光线在检测器的光敏区域的分开的部分上被同时接收。
在一些实现方式中，激发光的入射角被布置成使得激发光到检测器中的杂散反射程度被降低。
在一些实现方式中，光学涂层被配置为使得激发光在样品界面处的反射程度与激发光的杂散反射程度相匹配。杂散反射对应于激发光在除了样品界面之外的形成于光学系统内的界面处被反射并随后到达检测器的部分。
在一些实现方式中，光学涂层被配置为使得激发光在样品界面处的反射程度高于激发光在除了样品界面之外的形成于光学系统内的界面处的杂散反射程度，并且低于激发光在没有光学涂层的情况下在样品界面处的反射程度。
在一些实现方式中，光学涂层包括在基板的第一侧上的中间层和在中间层上的外部层，该外部层被布置成当样品被施加在基板上时接收样品。
在一些实现方式中，中间层包括氧化铝Al2O3、二氧化铪HfO2、五氧化钽Ta2O5、五氧化铌Nb2O5、二氧化钛TiO2和二氧化硅SiO2中的一个或多个。
在一些实现方式中，中间层包括透明导电氧化物，例如，氧化铟锡(ITO)。
在一些实现方式中，中间层包括透明导电氧化物。
在一些实现方式中，外部层包括二氧化硅SiO2。
在一些实现方式中，中间层的厚度在1到20nm之间，外部层的厚度在80到200nm之间。
在一些实现方式中，光学涂层的折射率大于样品的折射率。
根据本发明的另一个方面，提供了一种光学检测包括纳米级对象的样品的方法。该方法包括在基板上提供样品，经由成像透镜在样品上提供激发光。当样品被施加在基板上时，被布置成反射激发光的样品界面形成在样品与基板面向样品的第一侧之间。该方法还包括在检测器处接收参考光和散射光。参考光包括激发光在样品界面处被反射并被成像透镜收集到的部分，散射光包括激发光被纳米级对象散射并被成像透镜收集到的部分。该方法还包括响应于激发光，通过参考光与散射光之间的干涉图案的光学对比度在检测器处对纳米级对象进行成像。基板包括设置在基板的第一侧上的光学涂层，使得当样品被施加到基板时，样品与光学涂层接触。激发光在样品界面处的反射程度使得光学对比度与使用在没有光学涂层的情况下形成的样品界面获得的光学对比度相比更大。
在一些实现方式中，激发光是处于第一波段内的波长处的第一激发光。该方法还包括为样品的荧光激发提供处于第二波段内的波长处的第二激发光，以及通过纳米级对象响应于第二激发光而发射的并被成像透镜收集到的荧光光线在检测器处对纳米级对象进行成像。
在一些实现方式中，纳米级对象包括多组荧光团，每组荧光团具有不同的激发光谱。第二激发光处于多个波长处，用于相应组的荧光激发。
在一些实现方式中，该方法还包括在检测器的光敏区域的分开的部分上同时接收干涉图案和荧光光线。
在一些实现方式中，光学涂层被配置为使得激发光在样品界面处的反射程度与激发光的杂散反射程度相匹配。杂散反射对应于激发光在除了样品界面之外的形成于光学系统内的界面处被反射并随后到达检测器的部分。
在一些实现方式中，光学涂层被配置为使得激发光在样品界面处的反射程度高于激发光在除了样品界面之外的形成于光学系统内的界面处的杂散反射程度，并且低于激发光在没有光学涂层的情况下形成的样品界面处的反射程度。
在一些实现方式中，提供激发光包括提供激发光的光学功率，使得撞击检测器的激发光的光子散粒噪声超越(dominate)检测器的读出噪声，并且使得撞击检测器的激发光的光学功率低于检测器的饱和水平。
在一些实现方式中，样品包括水性溶液。该方法还包括提供样品，提供样品包括将水性溶液施加到基板。
附图说明
现在将参照附图以示例的方式描述本发明的某些实施例，其中：
图1是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
图2a是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
图2b是示出作为样品界面处的反射率的函数的iSCAT检测方案的光学对比度和信噪比的估计的图。
图3a是参考图2a示出用于形成样品界面的光学涂层的示例性实施例的示意图。
图3b示出了光学涂层的反射率的模拟结果。
图4a和图4b示出了使用iSCAT检测方案获得的测量结果。
图5是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
图6a示出了使用iSCAT和荧光检测方案同时获得的测量结果。
图6b示出了用于研究光学涂层对荧光成像的影响的测量结果。
图7示出了说明执行干涉散射显微术的方法的流程图。
图8是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
图9a是示出使用结构化波片的iSCAT检测方案的光学对比度增强的图。
图9b示出了使用结构化波片和不使用结构化波片获得的光学对比度的测量结果的比较。
图9c示出了在具有结构化波片和不具有结构化波片的情况下使用iSCAT检测方案获得的测量结果。
具体实施方式
在iSCAT显微镜中，图像是由两个光场的干涉产生的：散射场和参考场。散射场是被照明体积内的粒子散射的光。部分散射光被物镜收集到并成像到相机上。参考场是入射光被界面(即，在支撑包含粒子的样品的基板与样品的环境之间，例如，玻璃-水界面)反射的部分，该界面通过折射率的不连续性形成。参考光也被引导到检测器上。散射光和参考光通过分束器在空间上与入射光分开。
iSCAT显微镜可能具有一些局限性，影响了该技术的实用性和商业前景。首先，小生物分子的光学对比度可能较低，这使得在技术上难以检测小分子。其次，通过依靠瑞利散射作为对比度模式，iSCAT能够是非特异性成像技术。
在本说明书中，呈现了具有光学涂覆的基板的iSCAT显微镜，用于增强图像的光学对比度。这可以提供经济的方法来实现各个生物分子的高对比度iSCAT成像，并提供一种简单的(重新)配置装置的方法来检测具有最佳的信噪比的各种尺寸的粒子，从而提高该装置的实用性。基于iSCAT显微镜，本说明书还提出了通过使用多向色和偏振相关镜的系统来使来自iSCAT成像和荧光两者的信号能够被成像到同一检测器的不同部分上，将iSCAT成像模式和荧光成像模式结合的设置。
图1是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
光学成像系统100被配置为对包括纳米级对象10的样本或样品20进行检测、成像和研究。
光学成像系统100包括成像透镜110、照明源120、检测器130和光学元件140。
纳米级对象10的示例可以包括大分子、蛋白质、细胞外载体、抗原、脂质、病毒、染料分子、半导体量子点、金属纳米粒子、介电纳米粒子(例如，二氧化硅纳米粒子)和聚合物纳米粒子，但是纳米级对象10不限于这些示例。
样品20可以包括纳米级对象10嵌入其中的以下环境中的一个或多个：水性环境、聚合物基质、有机晶体或半导体、介电材料。样品20的组成不限于这些示例，只要样品20的光学特性允许在照明源120的波长下进行光学成像即可。
照明源120发射激发光束121、122。光学元件140被配置为使得至少部分激发光束121、122在入射在光学元件140上时至少部分地被反射并被引导到成像透镜110。光学元件140还被配置为向从样品20反射的光提供朝向检测器130的光程，该光程与激发光束121、122的光程分开，如下面将更详细解释的。
样品界面150可以由样品和保持要研究的样品20的支撑材料或基板形成。例如，在图1的示例中，样品界面150可以由玻璃-空气界面形成，并且纳米级对象10可以被支撑在玻璃表面上。
尽管在图1的示例中，纳米级对象10在样品界面150的上侧，即样品界面150朝向正z方向的一侧，但包括纳米级对象10的样品20可以被沉积在样品界面150的下侧。例如，纳米级对象10可以被沉积在玻璃盖玻片上，并且玻璃盖玻片可以被安装成使得玻璃盖玻片具有纳米级对象10的一侧面向成像透镜110。在这种情况下，样品界面150由空气-玻璃界面提供，其中空气和玻璃的顺序被反转。对于iSCAT检测方案，至少部分激发光束121、122可以在样品界面150处被反射并被引导到检测器130中。
在一些实现方式中，可以沿着入射激发光束121、122的方向、沿着图1中的z方向调整纳米级对象10的位置，使得纳米级对象10或样品界面150靠近成像透镜110在成像透镜110的焦深内或等效地在成像透镜110的焦体积内的焦平面。在这种情况下，纳米级对象10或样品界面150将被称为在成像透镜110的“焦点上”或“焦点处”。
在一些实现方式中，当纳米级对象10由样品界面150支撑时，可以沿着z方向移动样品界面150来调整纳米级对象10的位置。例如，当样品界面150由玻璃-空气界面形成，并且纳米级对象10被支撑在玻璃表面上时，可以通过移动其上沉积有纳米级对象10的玻璃来调整玻璃表面在z方向上的位置。
成像透镜110的示例包括油浸物镜、空气物镜、非球面透镜和消色差透镜，但是成像透镜110不限于这些示例。成像透镜110可以被配置为提供激发光束121、122的紧密聚焦(例如，衍射极限斑点)，并且同时提供对来自纳米级对象10的发射物的有效收集。
在一些实现方式中，照明源120可以被布置成使得当样品界面150在成像透镜110的焦点处时，激发光束121在进入成像透镜110时被聚焦在样品界面150处或附近。
例如，图1中用从照明源120发出的以实线表示的激发光束121被发送到基本上准直的成像透镜110中，使得当样品界面150或纳米级对象10在成像透镜110的焦点处时，激发光束121被聚焦在样品界面150或纳米级对象10处。在这种情况下，激发光束121在xy平面中的宽度在靠近样品界面150或纳米级对象10处被最小化。在本说明书的其余部分中，这种照明模式将被称为共焦照明。
在一些实现方式中，根据成像透镜110的选择，激发光束121的斑点尺寸可以被布置为是衍射极限的。例如，当成像透镜110为油浸物镜，样品界面150由玻璃盖玻片和水性样品形成并且玻璃盖玻片与油浸物镜110之间的空间填充有浸油时，可以获得近衍射极限的焦点。
在一些实现方式中，照明源120可以被布置成使得在图1中表示为虚线的激发光束122被聚焦在成像透镜110的后焦平面111处或附近，并且在进入成像透镜110时照射在样品界面150上的纳米级对象10周围的区域，使得在xy平面中相对较大的区域同时被照射。与共焦照明相比，照明区域的横向尺寸可以是十倍或更大。例如，当激发光束122处于可见波长时，样品界面150处的照明区域可以是大约十微米宽。在这种情况下，激发光束122没有被聚焦在成像透镜110的焦平面处。这种照明模式在本说明书中将被称为宽场照明。
在一些实现方式中，照明源120可以包括一个以上的激发波长以为一个以上的检测方案提供便利。在这种情况下，光学元件140可以被配置为便于具有不止一个的波长的样品20的激发。
在被激发光束121、122激发时，纳米级对象10可以根据检测模式或检测方案发射光。例如，纳米级对象10可以经由荧光、拉曼散射和瑞利散射等发射光。这些方案中的每一个可能需要照明源120、检测器130和光学元件140的不同配置，如稍后将更详细讨论的。
在一些实现方式中，纳米级对象10发射的光可以是偏振的，并且纳米级对象10的偶极发射图案可以被改变，因为纳米级对象10被定位成靠近样品界面150。在一些实现方式中，由纳米级对象10发射的光可以是各向同性的，基本上均匀分布。
由纳米级对象10发射的至少部分光可以被成像透镜110收集。在一些实现方式中，收集效率可能取决于样品界面150、成像透镜110的数值孔径(numerical aperture)、纳米级对象10的偶极跃迁(dipolar transition)的方向等。
光学元件140可以被配置为适应于一个或多个检测方案。
例如，当纳米级对象10是荧光分子并且要通过荧光检测方案被检测时，光学元件140可以被配置为二向色或多向色，该二向色或多向被配置为反射入射在光学元件140上处于激发光束121、122的波长的光并透射处于从纳米级对象10发射的荧光光线的波长中的至少一个波长的光。由成像透镜110收集到的荧光光线可以在光学元件140处被透射后到达检测器130。
又例如，当纳米级对象10是散射纳米粒子并且要通过iSCAT检测方案被检测时，光学元件140可以被配置为处于激发光束121、122和来自纳米级对象10的散射光的波长的分束器或偏振分束器。反射激发光束121、122和散射光两者都可以在光学元件140处被透射后到达检测器130。
在样品界面150处的包括纳米级对象10的样品20在处于成像透镜110的焦点时，被光学成像到检测器130上。可以理解的是，除了图1中描述的组件，还可以根据需要引入用于成像的附加的光学器件。例如，当成像透镜110被无限大校正时，管透镜被包括在检测器130内或被包括在光学元件140与检测器之间的光束路径中，使得样品界面150和纳米级对象10被光学地成像在检测器130上。
在一些实现方式中，检测器130可以是单像素检测器，例如，雪崩光电二极管(APD)、光电倍增管(PMT)或超导纳米线单光子检测器(SNSPD)。由成像透镜110收集并透射到检测器130的所有光都可以用检测器130的单个有效区域来检测。这种类型的检测器可以与激发光束121紧密地被聚焦在样品界面150上的纳米级对象10上的共焦照明一起使用。
纳米级对象10的物理尺寸可以小于由成像透镜110提供的激发光束121、122的衍射极限斑点。在这种情况下，如果成像透镜110被如此配置，则纳米级对象10在检测器130上被成像为衍射极限斑点。
在一些实现方式中，检测器130可以是多像素检测器或多阵列检测器，例如，CCD、EMCCD、CCD和sCMOS。这种类型的检测器可以与宽场照明一起使用，在宽场照明中，激发光束122在宽广的区域上照射在样品界面150上的纳米级对象10上，并且在照明区域上收集到的光在多个像素上被光学成像到检测器130上。
在一些实现方式中，当关注的信号包括从纳米级对象10发射的、波长偏离激发光束121、122的波长的光时，处于激发光束121的波长的光在到达检测器130之前被拒绝(reject)。例如，如果关注的信号是来自纳米级对象10的荧光光线，则激发光束121、122可以从样品界面150反射或被样品20散射并朝检测器130被透射。
在一些实现方式中，可以通过将光学元件140配置为反射或吸收处于激发光束121、122的波长的光来主要在光学元件140处实现拒绝。
或者，在一些实现方式中，附加的光学器件可以被放置在光束路径中，例如，在光学元件140与检测器130之间，以进一步拒绝处于激发光束121、122的波长的光。
在一些实现方式中，当关注的信号的波长范围已知时，可以引入附加的光学器件以进一步拒绝关注的信号的波长范围之外的光。
当关注的信号处于与激发光束121、122的波长不同的波长处时，当信号超过背景计数时，记录该信号。背景计数可以包括激发光束121、122来自形成在光学系统100内的各种界面的杂散反射、来自样品20的杂散发射，其在光学元件140处未被拒绝和过滤，并到达检测器130。例如，当成像透镜110为物镜时，物镜内反射会从物镜内部的若干表面产生。尽管这些表面涂覆有AR，但每个表面在激发光束121、122的波长下具有大约0.1％的反射率。因此，杂散反射对应于通过在除了样品界面150之外的形成于光学系统内的界面处被反射而产生的、并随后到达检测器130的激发光束121、122部分。
背景计数还包括检测器130的读出噪声、暗计数或偏移计数，即使没有光撞击检测器130，这些也可能存在。因此，在这种类型的检测中，关注的信号被记录在非理想的杂散背景计数之上，并且信噪比(SNR)可以通过以下方式来改善：最大化成像透镜110处的收集效率，抑制背景计数(即，拒绝除了包括关注的信号的光之外的所有到达检测器130的光)，并且最小化检测器130处的杂散计数。在本说明书中，这种类型的检测方案将被称为基于发射的检测方案。例如，荧光检测方案是基于发射的检测方案的示例。
在一些实现方式中，除了基于发射的检测方案，光学成像系统100还可以被配置用于干涉散射显微术(iSCAT)方案。在该方法中，纳米级对象10通过来自纳米级对象10的散射光与在样品界面150处反射的反射激发光束121、122之间的干涉图案来检测。来自iSCAT方案的信号是由两个光场之间的干涉产生的：散射光11的电场和参考光123的电场。散射光11是被焦体积内部处于成像透镜110的焦点处的纳米级对象10散射的光。部分散射光被成像透镜110收集并被成像到检测器130上。在本说明书的其余部分中，在样品界面处反射的反射激发光束121、122将被称为参考光123。
在iSCAT方案中，散射光11(关注的信号)和反射激发光束121、122(参考光123)处于同一波长。因此，光学元件140被配置为用作分束器。使散射光11和参考光123遵循不同的路径，因此通过分束器与激发光束121、122分开。
在检测器130上检测到的光学信号是由来自纳米级对象10的散射光11与参考光123之间的干涉引起的干涉信号。在检测器130处的强度由下式给出：
等式1：
Einc是入射电场，对应于激发光束121、122在样品界面150处的电场。s是与样品界面150的粒子散射截面和光学特性相关的无量纲参数。r2是样品界面150的反射率。
是检测器130处的参考光与散射光之间的相位差。当纳米级对象10是诸如纳米粒子和生物标志物等弱散射体时，与s2成比例的项小到可以忽略不计。在本说明书的其余部分中，除非另有说明，纳米级对象10将被视为弱散射体，使得与s2成比例的项在使用光学成像系统100的iSCAT测量中可以忽略不计。
弱散射体的信号背景比或光学对比度C被限定为
等式2：
当s＝0时，Idet如Eq1中给出的，而Ibg是Eq1中给出的Idet。
以上描述适用于激发光束121、122的两种情况，即，共焦照明和宽场照明。对于宽场照明的情况，可以考虑检测器130处的单个像素。
当样品界面150和待被检测成像的纳米级对象10均在焦点上并且彼此紧密靠近时，散射光11和参考光123的光程长度差被最小化为小于成像透镜110在激发波长下的焦深。
然而，当来自纳米级对象10的散射光11失焦时，它仍可能与参考光发生干涉，因为激发光束121、122的相干长度可能比所得到的光程长度差更长。此外，激发光束121、122可以被除了样品界面150之外形成于光学成像系统100内的其他界面反射，并且与自纳米级对象的散射光发生干涉。这些杂散干涉信号或假信号可能导致信噪比或轴向分辨率的劣化。
为了解决该问题，在一些实现方式中，可以选择或配置照明源120，使得激发光束121、122的相干长度短于杂散反射与激发光束121、122之间的路径长度差。例如，如果杂散反射与激发光束121、122之间的路径长度差大于一毫米，则照明源120可以被配置为使得其相干长度短于100微米。这可以减轻散射光与杂散反射之间的干涉，并且在检测器130处检测到的杂散干涉仅作为非相干背景而不是作为假信号起作用。
因此，虽然根据等式2，随着r减小，可以使光学对比度C任意大，但实际上，由于光学成像系统100中的缺陷(例如，到达检测器130的激发光束121、122的杂散反射)，情况并非如此。这些仍然对检测器130上的背景水平有贡献，并且对应的波动对噪声水平有贡献。因此，如果要提高光学对比度C，则需要考虑非理想性或缺陷来调整样品界面150处的反射率。
通过对应地配置照明源120和光学元件140，光学成像系统100可以被配置为适应除iSCAT检测方案之外的其他检测方法，例如基于发射的检测之一。在这种情况下，对于其他检测方案或由于光学元件140的缺陷，可能存在来自激发光束121的杂散反射的杂散光。
例如，如果荧光检测方案与iSCAT方法同时使用，则光学元件140可以被布置成用作iSCAT模式的分束器并且同时用作荧光模式的二向色镜。从纳米级对象10发射的荧光光线在光学元件140处被透射，并且反射激发光束121、122在光学元件140处被反射或吸收。反射激发光束121、122的拒绝程度可能不完美，在这种情况下，光学元件可能允许一些反射激发光121、122到达检测器130。这对荧光检测方案的背景噪声有贡献。
当前的iSCAT检测方案可以在以下方面被改进：
可以进一步增强光学对比度。生物分子的粒子散射截面取决于分子质量；因此，iSCAT对比度的测量结果可用于确定关注的粒子的分子量。由于散射的强度是纳米级对象10的质量的特征，因此iSCAT方法能够对各个大分子和纳米粒子进行无标记成像。当参考光123是从包括玻璃-水界面或玻璃-空气界面的样品界面150获得时，对于小的生物分子，光学对比度可能很小。由于在iSCAT检测方案中，不同的分子只能通过它们的光学对比度(即，通过它们的质量)来区分，更高的光学对比度可能导致生物分子的检测中更高的特异性。
检测器130的饱和水平可能限制激发光束121、122的光学功率，这可能限制可实现的信噪比。与上面讨论的基于发射的检测方案相比，在iSCAT检测方案中，关注的信号被记录为与参考光123的功率水平的偏差(增大或减小)。因此，为了增大信噪比(SNR)，撞击检测器130的参考光123的功率水平可能足够高，使得来自杂散光、杂散反射、检测器读出噪声的检测信号的贡献由撞击检测器130的参考光123主导。然而，参考光123的功率水平应该充分低于检测器130的饱和水平。
适用于基于发射的检测的检测器130可能不适用于iSCAT检测方案。当光学成像系统100被配置为适应不止一个的检测方案(包括iSCAT检测方案和基于发射的检测方案(例如，荧光检测)中的一个或多个)时，可能需要用于iSCAT检测和用于基于发射的检测的专用检测器130。这是因为，为了在低功率水平的信号的情况下实现高信噪比，基于发射的检测通常采用具有低饱和水平的检测器130，这可能与iSCAT检测方案的参考光123的功率水平不兼容。
当前说明书提供了解决以上讨论的问题的光学成像系统100。特别地，在光学成像系统100中，样品界面150处的反射率被配置为使得参考光123被降低到iSCAT方案与用于基于发射的检测方案的检测器130兼容的水平。因此，一个检测器130可用于iSCAT检测方案和基于发射的检测方案(例如，荧光检测)两者。
随着样品界面150的反射率减小，撞击检测器130的参考光123的功率水平也降低。与样品界面150未经处理的情况(例如，玻璃-水界面)相比，这导致改善的光学对比度。
此外，在样品界面150处的反射率减小的情况下，可以提高iSCAT检测方案的信噪比，因为可以在不会使检测器130饱和的情况下使用激发光束121、122的更大的功率。因此，考虑到激发光束121、122的可用功率和撞击检测器130的参考光123的对应的功率水平，可以确定样品界面150的反射率以优化信噪比。这在稍后将被更详细地讨论。
作为说明上述概念的具体示例，下面将描述为iSCAT检测方案和荧光检测方案的并行操作提供便利的光学成像系统100。将讨论确定样品界面150的反射率的程序。之后将讨论样品界面150上的光学涂层和光学元件140的设计。
图2a是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
光学成像系统200包括成像透镜210、照明源220、检测器230、光学元件240。如下所讨论的，光学成像系统200可以被配置用于iSCAT检测方案和荧光检测方案。
在一些实现方式中，检测器230可以是多像素检测器或多阵列检测器，例如，CCD、EMCCD、CCD和sCMOS。在一些实现方式中，一个且同一个检测器230可用于iSCAT检测方案和荧光检测方案两者。
在一些实现方式中，成像透镜210可以是高放大率、高数值孔径的透镜或透镜系统，例如，油浸物镜、空气物镜、非球面透镜和消色差透镜。在该示例中，成像透镜210可以是高NA油浸物镜。
样品40可以包括一个或多个纳米级对象30。例如，样品40可以是被沉积和支撑在基板251(例如，玻璃盖玻片)上的水性溶液。基板251可以包括在从纳米级对象30发射的激发的波长和关注的信号的波长下基本上透明的材料。
为了说明的目的，图2a仅示出了样品40内的一个纳米级对象30(水性溶液)。然而，应当理解，样品40可以根据需要包含任意数量的纳米级对象30。
基板251在面向样品40的一侧上包括光学涂层252，使得光学涂层252被设置在基板251与样品40之间。光学涂层252可以与水性溶液直接接触。光学涂层252可以被直接沉积在基板251的一侧上。
样品界面250可以被形成在光学涂层252与样品40之间。由于样品界面250的折射率的布置，样品界面250可能导致入射光的反射。
例如，如果样品40是水性溶液并且基板251是没有任何光学涂层252的玻璃盖玻片，则样品界面250可以对应于玻璃-水界面。在这种情况下，反射是由于玻璃-水界面处的菲涅耳反射。
又例如，光学涂层252可以是包括多个介电层的布拉格反射器，其设计考虑到基板251和样品40的折射率。
除了光学涂层252的设计，如稍后将描述的，确定激发光束221的反射程度的样品界面250还可以根据基板251和样品40的材料选择而变化。
在一些实现方式中，基板251与成像透镜210之间的空间可以被布置成使得导致菲涅耳反射的界面的数量最小化，并且减轻剩余界面处的菲涅耳反射。例如，基板251与成像透镜210之间的间隙可以填充浸油211以用于折射率匹配。
如果样品40包括水性溶液，则当样品界面250被定位在成像透镜210的焦点处时，纳米级对象30可以在样品40的水性溶液内四处移动，并且可以在它们移动到靠近样品界面250和照明区域或等效地在照明体积或焦体积内时被检测到。
在一些实现方式中，照明源220可包括多个光源或多个激发波长以便于不止一个的检测方案或便于不止一种类型的纳米级对象30发射处于不同波长的光。
在该示例中，照明源220包括用于iSCAT检测方案和荧光检测方案的激发源。对于荧光检测方案，照明源220可包括不止一个的激发波长以便于使用具有不同荧光光谱的多个荧光团进行多色荧光检测。
同样在该示例中，照明提供激发光221，使得样品30通过将激发光221聚焦在成像透镜(油浸物镜)的后焦平面212处的宽场照明而被激发。在照明源220包括多个光源的情况下，多个光束可以被布置成遵循图2a中描述的激发光221的基本上相同的路径，该路径由样品40处的宽场照明的虚线表示。
在样品界面250处，从照明源220发出的激发光束221被反射。参考光222是激发光束221被样品界面250反射的部分。反射程度可能取决于光学涂层252、基板251的折射率和样品40的折射率。
当样品界面250被定位在成像透镜210的焦点附近时，参考光222被引导朝向检测器230。
当纳米级对象30在成像透镜210的焦体积内和激发光束221的照明区域内移动时，由成像透镜210收集到的从纳米级对象30发出的散射光31和发射光32被引导朝向检测器230。
在一些实现方式中，散射光31可以包括由于散射过程而产生的光。对于诸如激发光束221的瑞利散射或米氏散射等散射过程，散射光31可以处于与激发光束221相同的波长。尽管对于诸如拉曼散射等散射过程，散射光31可以处于与激发光束221不同的波长。除非另有说明，否则在本说明书中，散射光31被认为处于与激发光束221相同的波长。
在一些实现方式中，发射光32可以包括响应于吸收部分激发光束221源于纳米级对象30的光物理过程的光。发射光32可能不会与激发光束221保持相干的相位关系，因此可能不会导致与参考光222的任何干涉图案。例如，发射光32可包括经由荧光、磷光的发射或由电子-空穴复合产生的发射。为简单起见，在本说明书中，发射光32将用作荧光光线32，或与荧光光线32互换使用。然而，荧光光线32用于指来自纳米级对象30的发射中不会导致与激发光束221的干涉图案的部分。因此，荧光光线32例如包括来自胶体量子点的红移发射(red-shifted emission)或来自荧光分子的磷光。
当样品界面250被定位在成像透镜210的焦点处，并且纳米级对象30在成像透镜210的焦体积内时，参考光222、散射光31和发射光32遵循基本上相同的光程，该光程从样品界面250开始到检测器230。在这种情况下，参考光222与散射光31之间或参考光222与发射光32之间的光程长度差可能小于参考光222的相干长度的长度。
iSCAT检测方案的光学对比度和信噪比将根据描述光学成像系统200的各种参数来呈现。基于这些描述，将推导出样品界面250用于优化iSCAT检测方案的信噪比的目标反射率。
在检测器230的像素处记录的检测事件的数量通过下式估计：
等式3：
Texp：曝光时间；典型值：1μs至1s；
Ninc：每秒入射到样品上的光子数(单位：[光子/s/m2])；光学功率的典型范围：0.1到100kW/cm2；
η：光学吞吐量(包括光学系统从玻璃基板到相机的透射以及检测器130、230的量子效率)；典型值：0.25；
Parea：CMOS相机像素区域；典型值：100μm2；
M：显微镜的放大率；典型值：100；
ε：散射光的收集效率；典型值：0.35；
s：与粒子散射截面相关的无量纲参数；典型值：对于150kDA蛋白质为4×10-5；
α：由iSCAT照明光引起的杂散反射；典型值：10-5；
β：来自iSCAT照明光以外的光源的杂散光；典型值：100[计数/秒]；
γ：检测器230的读出偏移计数；典型值：400[计数/秒]。
根据等式3，可以通过比较在有和没有纳米级对象30的情况下检测到的光子的数量来计算光学对比度或信号背景比。光学对比度或信号背景比通过下式给出：
等式4：C＝(Ndet-Nbg)/Nbg。
Nbg是当纳米级对象30未存在于样品40内的体积内时检测到的光子数(即，s＝0情况下的等式3)，该体积由成像透镜210的焦体积和激发光束221在样品界面250处的照明区域的重叠来限定。关于信噪比，噪声源于每个像素上的强度波动，例如由相机读出噪声和光子散粒噪声引起。这些波动的标准偏差由等式3中给出的Ndet的平方根来估计。
等式5：σdet＝sqrt(Ndet)和σbg＝sqrt(Nbg)。
Sqrt(x)在本说明书中表示x的平方根。信噪比(SNR)通过下式来估计：
等式6：SNR＝(Ndet–Nbg)/sqrt(σ2 det+σ2 bg)。
因此，为了推导出样品界面250的最佳反射率，需要考虑光学涂层252的设计、光学成像系统200的光学布置的细节以及检测器的噪声特性。
图2b是示出作为样品界面处的反射率的函数的iSCAT检测方案的光学对比度和信噪比的估计的图。
使用等式4来评估光学对比度，而使用等式6来评估信噪比。在评估中，假设纳米级对象30是IgG抗体，其重量约为150kDA，对应于s＝4×10-5。除了使用的光学功率对应于Ninc为3kW/cm2外，其余参数被设置为等式3中给出的典型值。
特别地，在评估图2b中示出的光学对比度和信噪比评估中，检测器230(CMOS相机)的饱和水平每帧或每曝光时间30×103个光电子和照明源220的最大可用输入功率在450nm下10mW还被认为是评估中的约束。样品界面250处的照明区域具有大约10微米的直径。
左侧面板(left panel)280示出了在左侧的垂直轴282中表示信噪比的曲线图，作为在水平轴281中表示的样品界面250处的反射率的函数。
对于反射率的每个值，假设调整照明强度使得检测器230接近饱和地操作。例如，在较高的反射率下，例如接近10-2，照明功率在进入成像透镜210之前从照明源220处10mW的可用功率被最大程度地衰减以不使检测器230饱和。
入射激光功率在左侧面板280中以虚线绘制并且在右侧的垂直轴283中表示。在第一范围284中，从样品界面250处大约10-5或更高的反射率开始，激光功率被衰减以避免检测器230的饱和。第一范围284中在样品界面250的每个反射率处被调整的入射激光功率遵循随着反射率增加而减小的曲线。同样在第一范围284中，撞击检测器230的光221的强度接近检测器230的饱和。因此，光子散粒噪声可能超越其他噪声源，使得iSCAT检测的信噪比接近散粒噪声极限。
左侧面板280中的曲线图还示出了，信噪比在约为2×10-5的反射率下最高，并且随着反射率进一步减小而再次降低。这是由于以下事实：在第二范围285中，从大约2×10-5和更低的反射率开始，即使激发光束221的10mW的全功率被发送到成像透镜210中，检测器230因参考光222而未在接近饱和的情况下操作。因此，对于第二范围285中的反射率，iSCAT检测的信噪比可以不受参考光222的光子散粒噪声的限制，并且，如上面在等式6中讨论的那样，其他噪声源对噪声σdet有贡献。由于样品界面250处激发光束221的强度该反射率范围(从大约2×10-5的反射率到更小的反射率)内使用10mW的全功率是固定的，因此信噪比降低。
右侧面板290示出了在垂直轴292中表示的光学对比度或信号背景比的曲线图，作为在水平轴291中表示的样品界面250处的反射率的函数。特别地，由于关注的信号被记录为强度相对于背景水平的降低，如上面所讨论的，光学对比度被绘制为负值。例如，0的光学对比度，垂直轴292中的最高点表示没有任何干涉信号的背景水平。
对于反射率的每个值，假设调整照明强度使得检测器230接近饱和地操作。如上面针对左侧面板280所讨论的，从大约2×10-5的反射率开始，激发光束221的10mW的全功率可以被发送到成像透镜210中而不会使检测器230饱和。
右侧面板290中的曲线图示出了光学对比度在10-5的反射率下最高。根据等式3，当噪声被光子散粒噪声超越时，与Ninc不成比例的项(例如，等式3中的Texp*β+γ)是可忽略不计的。在该限制下，根据等式5，当样品界面250处的反射率等于α时，光学对比度被最大化，α是表示激发光束221来自除了样品界面250之外的沿着光束路径的界面的杂散反射的无量纲数，并在该评估中被设置为10-5。
因此，在一些实现方式中，当撞击检测器230的反射激发光的光子散粒噪声(例如，等式3中与Ninc成比例的项)超越本底噪声(noise floor)时，光学对比度的限制因素之一可以是由激发光束221引起的杂散反射程度(由等式3中的α表示)。
考虑以下考虑因素来确定样品界面250处的最佳反射率或目标反射率。
根据等式2，当样品界面250处的反射率减小时，光学对比度增加。还可以表明，在同一条件下，信噪比与Ninc的平方根成比例。然而，这些对应于理想化的情况，其中不考虑对背景有贡献的其他杂散源，例如杂散反射程度α。
当来自等式3的与Ninc成比例的项(即，与Nincr2成比例的参考光222和与Nincα成比例的杂散反射)超越噪声时，光学对比度和信噪比两者均在样品界面250处的反射率与杂散反射程度α相匹配时被最大化。
假设激光功率被调整为在样品界面250处的反射率的每个值下在检测器230的饱和值附近操作，可以表明，当样品界面250处的反射率被选择为匹配杂散反射程度α时，信噪比和光学对比度两者被最大化，如下所述。
在样品界面处的每个反射率r下，Ninc被设置为以接近但避免检测器230的饱和的最大可能强度运行，即，
等式7：Ninc＝Nsat/((TexpηParea/M2)(r2+α))，
其中，Nsat是检测器230在没有明显饱和效应的情况下可以检测到的最大光子数。
假设散粒噪声极限操作，背景Nbg被样品界面250处的反射Ninc r2和杂散反射Nincα超越。
在这种情况下，信号背景比或光学对比度通过下式给出：
等式8：
并且信噪比通过下式给出：
等式9：
根据等式8和9，当r2＝α时，光学对比度和信噪比两者都被最大化。因此，在一些实现方式中，如果激发光束221的功率可以被调整为在接近但避免检测器250的饱和的最大可能强度下操作，则样品界面250处的反射率可以被选择为匹配杂散反射程度α。例如，如果杂散反射程度α小于由源于样品40与基板251之间的折射率对比的菲涅耳反射提供的反射率，则可以减小样品界面250处的反射率以匹配杂散反射程度α，从而增强光学对比度，或信号背景比和信噪比。
从杂散反射程度α开始，考虑以下方面来进一步确定或修改样品界面250处的反射程度或最佳反射率：
样品界面250处的反射率可以根据照明源220的可用光学功率来确定，使得参考光222的功率或撞击检测器230的反射激发光束221的功率低于检测器230的饱和水平但足够高。这使得参考光222的光子散粒噪声占主导或显著地大于其他噪声源，其他噪声源包括检测器230的读出偏移计数(表示为γ)、来自其他光源的杂散光(表示为β)。此外，可以确定样品界面250处的反射率，使得样品处的照明光的强度足够低以避免损坏样品，这会导致生物样品中的光毒性。
在图2b中，相比于右侧面板290中的光学对比度，在左侧面板280中，信噪比在不同的反射率值2×10-5处被最大化。如上面所解释的，这是由于以下事实：在与杂散反射程度α匹配的反射率值10-5处，入射激光功率不够强。在这种情况下，即使以光学对比度为代价，可以选择样品界面250的反射率以及对应的激发光束221的光学功率以最大化信噪比，即，在该示例中反射率约为2×10-5。然而，低于没有光学涂层情况下的反射率且高于或等于优化信噪比的反射率的任何反射率都是有益的，并提高成像灵敏度。因此，在一些实现方式中，样品界面250处的反射率可以被选择为高于杂散反射程度α且低于没有光学涂层252情况下的样品界面250处的反射率。
一旦确定了样品界面250处的最佳反射率或目标反射率，就可以设计要沉积在基板251上以提供目标反射率的光学涂层252。
图3a是参考图2a示出用于形成样品界面的光学涂层的示例性实施例的示意图。
在已经标识出最佳目标反射率的情况下，考虑附加的实验参数(例如，激发光束221的波长、基板251的折射率、样品30的折射率、激发光束221的入射角和材料的生物相容性)设计光学涂层252、300。
在一些实现方式中，波长可以在400到800nm之间。例如，波长可以是450nm。
在一些实现方式中，基板251的材料可以包括硼硅酸盐玻璃。例如，基板251可以是硼硅酸盐玻璃显微镜盖玻片。在这种情况下，成像透镜210(例如，油浸物镜)可以针对基板251的厚度和折射率被光学校正。再例如，基板251可以是微流体通道的一部分，其包括在激发光束221的波长下光学透明的材料。又例如，基板251可以是在激发波长下透明的弹性体材料或热塑性材料。又例如，基板251可以是玻璃显微镜载玻片、光纤或棱镜或微量滴定板的一部分。又例如，基板251可以包括光学透明聚合物。
样品界面250、350可以形成在基板251面向样品40的表面与沉积在基板251上的光学涂层252、300之间。特别地，样品界面250、350可以确定激发光束221朝向检测器230的反射程度，从而确定参考光222的强度或功率。
光学涂层252、300可以包括一个或多个层，每一层具有预定的折射率。光学涂层252、300中的每一层可以设置为基本上平行于基板251面向样品30的面。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以包括具有均匀折射率的单层。
光学涂层252、300中与基板251接触的层可以具有与基板251的折射率不同的折射率。在没有光学涂层252、300的情况下，激发光束121、122、221可以主要通过基板251与样品40之间的折射率对比经由菲涅耳反射被反射。在这种情况下，样品界面可以由基板251和样品40形成。
因此，样品界面250、350可以通过由具有两个不同的折射率的两种材料之间的折射率对比限定的平面提供。或者，样品界面可以通过待成像的纳米级对象30附近的光学布置提供，当纳米级对象30在焦点上时，这有助于激发光束221在样品40的纳米级对象30的位置附近的反射程度。在图2a的示例中，确定反射程度的光学布置由光学涂层252(例如，图3a中呈现的光学涂层300)提供。
光学涂层252、300的第一侧252-1可以直接与基板251的表面接触。或者，在第一侧252-1与基板251之间，可以存在粘合剂层，该粘合剂层用于将光学涂层252、300附着到基板251。光学涂层252不与基板251的表面接触的第二侧252-2可朝向样品40暴露，使得当样品40被施加时，光学涂层252的第二侧252-2与样品40直接接触。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以被制造在基板251上。例如，包括在光学涂层252、300中的层可以经由一种或多种制造技术(包括离子束溅射、溅射沉积(例如，物理气相沉积)、原子层沉积或旋涂)被沉积在基板251上。用于形成介电层或有机/无机层的任何已知的技术都可以用于在基板251上制造光学涂层252、300。
或者，光学涂层252、300可以与基板251分开制造，例如，光学涂层252、300可以被制造在单独的基板上，并且随后被转移到基板251的表面上。在这种情况下，光学涂层252、300可以经由范德华结合(van der Waals bonding)或使用薄粘合剂层被附着到基板。
光学涂层252、300可以具有不同于样品40和基板251的折射率或有效折射率。光学涂层252、300可以根据由基板251和样品40形成的样品界面250、350给出的反射率改变例如在正z方向上行进的入射在基板251上的激发光束221在样品界面250、350处的反射率。
激发光束221的入射角可以相对于成像透镜210的中心轴沿着z方向偏离0度，并且可以小于10度。可以选择激发光束221的入射角以通过减少杂散反射与参考光222之间的重叠来减轻杂散反射(在上面被量化为α)。在一些实现方式中，可以考虑激发光束221的入射角来设计光学涂层252、300。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以包括两个或更多个层310、320。在这种情况下，可以选择层的数量和层310、320的折射率，使得反射率由于层310、320的干涉效应而被调整为接近目标反射率。
在一些实现方式中，可以考虑基板251和样品40的折射率来设计光学涂层252、300。
在一些实现方式中，可以考虑基板251的物理尺寸(例如，厚度)来设计光学涂层252、300。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以被设计成在样品界面250、350处实现0.1％到0.001％(例如，0.01％)的反射率。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以被设计成在样品界面250、350处实现反射率等于杂散反射程度(在上面被量化为α)。
在一些实现方式中，光学涂层252、300可以包括第一层310和第二层320。通过包括两个层310、320，涂层252、300可以保持简单、廉价和薄，同时可以针对特定波长和特定入射角范围实现反射率的减小。
在一些实现方式中，第一层310可以包括介电材料或金属氧化物，例如，Al2O3、HfO2、Ta2O5、Nb2O5、SiO2和TiO2中的一个或多个。
在一些实现方式中，中间层包括透明导电氧化物，例如，氧化铟锡(ITO)。
在一些实现方式中，第一层310的厚度t1可以在1nm到20nm之间。例如，第一层310可以是6nm。
在一些实现方式中，第二层320可以包括无毒且高度生物相容的材料。由于第二层320可以与样品40接触，所以第二层320的材料可以被选择为与生物样品和生物医学测定相容并且适合样品界面250、350上的表面功能化化学。例如，第二层320可以包括SiO2。然而，包括Al2O3、HfO2、Ta2O5、Nb2O5和TiO2的表面也可以被功能化和处理为生物相容的。
在一些实现方式中，第二层320的厚度t2可以在80nm到200nm之间。例如，第一层310可以包括厚度为4nm的Ta2O5，第二层320包括厚度为106nm的SiO2。
在一些实现方式中，当第一层310包括五氧化二钽(Ta2O5)并且第二层320包括二氧化硅(SiO2)时，第一层310的厚度可以在1到10nm之间，第二层320的厚度可以在80到200nm之间。
基板251上的光学涂层252、300的示例如下：基板251可以是由厚度为No.1.5H(表示厚度公差为170μm±5μm)的硼硅酸盐玻璃D263制成的高精度盖玻片。经由离子束溅射，在基板251的一侧上，硼硅酸盐玻璃Ta2O5被沉积为具有4nm厚度的第一层310，SiO2被沉积为具有106nm厚度的第二层320。采用离子束溅射，因为其允许精确的厚度控制。
进一步考虑关于材料的适用性的上述限制，使用用于光学涂层252、300的设计的既定工具来设计涂层，即，层数、层厚度和层材料。该设计(例如，数值优化)和光学涂层252、300的制造可以类似于那些用于抗反射涂层的设计和制造。因此，只要可以在样品界面250、350处实现期望的反射率，光学涂层252、300的实现方式不限于玻璃盖玻片上的两层结构，如图3a的示例所示。
图3b示出了光学涂层的反射率的模拟结果。
在图3b示出的模拟结果中，假设光学涂层252、300包括作为第一层310的厚度为4nm的五氧化二钽(Ta2O5)和作为第二层320的厚度为106nm的二氧化硅(SiO2)。假设水与SiO2层接触，并且玻璃盖玻片包括硼硅酸盐玻璃D。
上侧面板360示出了一幅图，该图示出了在0度入射角(AOI)下的反射率，其作为未经处理的玻璃盖玻片(标记为“未经涂覆的玻璃”)上和包含光学涂层252、300的玻璃盖玻片(标记为“经涂覆的玻璃”)上的波长的函数。在iSCAT检测方案的激发光束221的大约450nm波长处，反射率为0.01％。如上面所解释的，可以确定0AOI下的反射率以增强光学对比度和信噪比。在该示例中，光学涂层252、300被沉积在基板251上以将反射率从0.43减小到0.01％。从大约600nm和更高的波长开始，经涂覆的玻璃盖玻片的反射率接近未经涂覆的玻璃盖玻片的反射率。
下侧面板370示出了一幅图，该图示出了在40度入射角(AOI)下的反射率，其作为未经处理的玻璃盖玻片(标记为“未经涂覆的玻璃”)上和包含光学涂层252、300的玻璃盖玻片(标记为“经涂覆的玻璃”)上的波长的函数。在具有混合偏振的40度AOI下，在iSCAT检测方案中的激发光束221的大约450nm波长处，反射率约为0.8％。从大约550nm和更高的波长开始，经涂覆的盖玻片的反射率和未经涂覆的盖玻片的反射率彼此接近。
当第一层310包括五氧化二钽(Ta2O5)并且第二层320包括二氧化硅(SiO2)时，为了实现光学涂层252、300在400到800nm之间的波长处的最小反射率，第一层310的厚度可以在1到10nm之间，第二层320的厚度可以在80到200nm之间。
图4a和图4b示出了使用iSCAT检测方案获得的测量结果。
图4a和图4b中示出的实验结果是使用图2a中描述的具有以下规格的光学成像系统200获得的：
成像透镜210是高数值孔径的油浸物镜。
基板251是由厚度为No.1.5H(表示厚度公差为170μm±5μm)的硼硅酸盐玻璃D263制成的高精度盖玻片。术语“盖玻璃”和“盖玻片”可以互换使用。
对于基板251上的光学涂层252、300，Ta2O5被沉积为厚度为4nm的第一层310，SiO2被沉积为厚度为106nm的第二层320。利用这种光学涂层252、300，对于450nm的照明波长下，与玻璃-水界面相比，样品界面150、250处的反射率获得了大约50倍的减小。这对应于参考光123、222的幅度减小了大约sqrt(50)＝7。
在图4a和图4b中呈现的每个测量结果中，包括纳米级对象30的水性样品40被施加到盖玻片251(无论是经涂覆的还是未经涂覆的)的顶部，以观察在光学对比度和信噪比中的差异。
在本说明书中，短语“经涂覆的盖玻片”将用于表示上述盖玻片251和光学涂层252、300。除非另有说明，否则短语“未经涂覆的盖玻片”或“未经处理的玻璃”将用于表示上述盖玻片251。
如上面所解释的，在“经涂覆的盖玻片”的情况下，样品界面250由基板251、光学涂层250和样品40的布置形成，在该样品界面250处，激发光束221被反射以为iSCAT检测方案提供参考光222。在“未经涂覆的盖玻片”的情况下，样品界面250由基板251和样品40的折射率对比(换言之，玻璃-水界面)形成。
对于图4a和图4b中的测量，使用的典型样品浓度为几nM，相同的体积为几uL。
实验方案如下：
1.将基板251(即，盖玻片)安装在显微镜样品台上；
2.将50uL纯缓冲液移取到基板251上；
3.使盖玻片的表面(即，样品界面150、250)成为成像系统的焦点；
4.将几uL的样品溶液添加到盖玻片上的初始缓冲液；
5.打开照明源220；
6.在检测器230处开始采集(通常以每秒300帧)；
7.数据后处理：划分后续相机帧以进行背景抑制；此外，对帧进行平均以进一步减小噪声。经后处理的图像示出粒子与盖玻片表面的结合事件。
图4a示出了在基板251上沉积和未沉积光学涂层252、300的情况下获得的光学对比度的测量结果的比较。
在图4a的左上侧面板410中，纳米级对象30是具有10nm的标称平均直径的金纳米粒子。分别使用经涂覆的玻璃盖玻片和未经涂覆的玻璃盖玻片记录的两个图像包括200×200个像素，对应于样品界面250、350上的6μm×6μm。利用经涂覆的玻璃盖玻片拍摄的上侧图像平均100帧，每帧以每秒250帧的积分时间拍摄。利用未经涂覆的盖玻片拍摄的下侧图像平均100帧，每帧以每秒1000帧的积分时间拍摄。
测量结果表明，对于未经涂覆的盖玻片，光学对比度为1-2％，而对于经涂覆的盖玻片，光学对比度为8-10％。
图4a的右上面板420示出了两个直方图(左侧直方图421和右侧直方图422)，这些直方图示出了使用金纳米粒子作为纳米级对象30获得的光学对比度的测量结果。
左侧直方图421示出了利用平均直径为5nm的金粒子进行的测量的统计数据。对于作为基板251的未经处理的玻璃，平均光学对比度约为0.45％。
利用未经处理的玻璃盖玻片测量的粒子数为227。对于作为基板的经涂覆的玻璃，平均光学对比度约为3.1％。利用经涂覆的玻璃盖玻片测量的粒子数为185。测量数据表明，当使用经涂覆的玻璃盖玻片时，光学对比度的增强约为7倍。
右侧直方图422示出了利用平均直径为20nm的金粒子进行的测量的统计数据。对于作为基板251的未经处理的玻璃，平均光学对比度约为7.8％。利用未经处理的玻璃盖玻片测量的粒子数为114。对于作为基板的经涂覆的玻璃，平均光学对比度约为62％。利用经涂覆的玻璃盖玻片测量的粒子数为186。测量数据表明，当使用经涂覆的玻璃盖玻片时，光学对比度的增强约为8倍。
对于右上面板420中呈现的测量结果，所使用的成像透镜210是具有NA1.40和111的放大倍数的高数值孔径油浸物镜。
在图4a的左下面板430中，纳米级对象30是质量为340kDa的纤维蛋白原。分别使用经涂覆的玻璃盖玻片和未经涂覆的玻璃盖玻片记录的两个图像包括160×160个像素，对应于样品界面250、350上的4.7μm×4.7μm。利用经涂覆的玻璃盖玻片拍摄的上侧图像平均100帧，每帧以每秒250帧的积分时间拍摄。利用未经涂覆的盖玻片拍摄的下侧图像平均1000帧，每帧以每秒1000帧的积分时间拍摄。
测量结果表明，对于未经涂覆的盖玻片，光学对比度约为0.08％，而对于经涂覆的盖玻片，光学对比度约为0.6％。在图4a的右下面板440中，纳米级对象30是质量为660kDa的甲状腺球蛋白。分别使用经涂覆的玻璃盖玻片和未经涂覆的玻璃盖玻片记录的两个图像包括200×200个像素，对应于样品界面250、350上的6μm×6μm。利用经涂覆的玻璃盖玻片拍摄的上侧图像平均100帧，每帧以每秒250帧的积分时间拍摄。利用未经涂覆的盖玻片拍摄的下侧图像平均100帧，每帧以每秒1000帧的积分时间拍摄。
测量结果表明，对于未经涂覆的盖玻片，光学对比度约为0.2％，而对于经涂覆的盖玻片，光学对比度约为1.5％。
对于左上面板410、左下面板430和右下面板440中呈现的测量结果，所使用的成像透镜210是具有NA＝1.40和200的放大倍数的高数值孔径油浸物镜。图4a的测量结果表明，与样品界面150、250由基板251与样品20、40之间的界面形成的情况相比，设置在基板251上的作为样品界面150、250的一部分的光学涂层252、300增强了光学对比度。
图4b示出了在基板251上沉积和未沉积光学涂层252、300的情况下获得的光学对比度和信噪比的的测量结果的比较。
在图4b的左侧面板450中，纳米级对象30是质量为840kDa的GroEL蛋白。使用经涂覆的玻璃盖玻片和未经涂覆的玻璃盖玻片记录的两个图像包括240×240个像素，对应于样品界面250、350上的14μm×14μm。利用经涂覆的玻璃盖玻片拍摄的上侧图像平均150帧，每帧以每秒500帧的积分时间拍摄。利用未经涂覆的盖玻片拍摄的下侧图像平均150帧，每帧以每秒500帧的积分时间拍摄。测量结果表明，对于未经涂覆的盖玻片，150帧平均后的光学对比度为0.24％，而对于经涂覆的盖玻片，150帧平均后的光学对比度为1.67％。为了估计信噪比，通过整个图像的标准偏差来评估噪声。在经涂覆的盖玻片的情况下图像的标准偏差为0.13％，而在未经涂覆的盖玻片的情况下图像的标准偏差为0.11％。尽管噪声水平略有提高，信噪比提高了5.9倍。在图4b的右侧面板460中，直方图示出了在纳米级对象30为质量为840kDa的GroEL蛋白的情况下，在基板251上有和没有光学涂层252、300的情况下获得的光学对比度的统计数据。
对于作为基板251的未经处理的玻璃，平均光学对比度约为0.24％。利用未经处理的玻璃盖玻片测量的粒子数为79。对于作为基板的经涂覆的玻璃，平均光学对比度约为1.67％。利用经涂覆的玻璃盖玻片测量的粒子数为128。因此，当使用经涂覆的玻璃盖玻片时，光学对比度的增强约为7倍。
对于左侧面板450和右侧面板460中呈现的测量结果，所使用的成像透镜210是具有NA＝1.40和111的放大倍数的高数值孔径油浸物镜。
图4b的测量结果表明，与样品界面150、250由基板251与样品20、40之间的界面形成的情况相比，设置在基板251上的作为样品界面150、250的一部分的光学涂层252、300增强了信噪比。
除了iSCAT检测方案的光学对比度和信噪比增强之外，通过在基板上沉积光学涂层252、300来减小样品界面150、250处的反射率还可以实现iSCAT检测方案和荧光检测方案在同一设置上使用一个多阵列检测器的同时操作，如下面将要讨论的。
图5是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
在图5的示例中，光学成像系统500被配置为便于iSCAT检测方案和荧光检测方案两者，其用于包括一个或多个纳米级对象50的样品60的光学研究。
光学成像系统包括成像透镜510、照明源520、检测器530和第一光学元件540。
在一些实现方式中，纳米级对象50可以包括若干组不同的荧光团或纳米粒子，它们可以用于不同的检测方案和不同的激发/检测波长。例如，对于iSCAT检测方案，纳米级对象50的示例可以包括大分子或金纳米粒子。对于荧光检测方案，纳米级对象50可以包括若干种类型的荧光团，每种荧光团具有不同的激发和荧光光谱，例如以用于多色荧光成像。
在一些实现方式中，对于作为纳米级对象50的特定类型的纳米粒子或荧光团，可以经由iSCAT检测方案和荧光检测方案两者来检测纳米级对象50的一个种类。例如，可以经由荧光检测方案和iSCAT检测方案两者对荧光珠、荧光标记的蛋白质或CdSe/ZnS半导体量子点进行成像。
成像透镜510的示例可以包括高数值孔径(NA)油浸物镜和高数值孔径(NA)空气物镜。对于下面的讨论，除非另有说明，成像透镜510被认为是高数值孔径油浸物镜。然而，其他类型的成像光学器件可以用于光学成像系统500的成像透镜510。
在一些实现方式中，照明源520可以包括多个照明源，这些照明源被布置成提供多种波长的激发光，以便于不止一个的检测方案或便于具有不同颜色的多种荧光团的使用。
在图5的示例中，照明源520包括第一照明源521和第二照明源522。
第一照明源521为iSCAT检测方案提供第一激发光束521a。例如，第一照明源521可以是处于450nm波长的激光器，用于经由iSCAT检测方案检测纳米级对象50(例如，金纳米粒子)。
在一些实现方式中，第一激发光束521a可以是线性偏振的。例如，第一激发光束521a可以从保持偏振的光纤523发射。又例如，第一照明源521可以从第一照明源521的固有配置输出偏振的第一激发光束521a。
在一些实现方式中，第一照明源521可以包括低相干光源。例如，第一照明源521可以包括耦合到保持偏振的光纤的紧凑的高功率超发光发光二极管。又例如，第一照明源521可以包括具有快速电流调制(例如，调制频率为300MHz)的单模二极管激光器。如上面所解释的，在iSCAT检测方案中，纳米级对象10、30、50通过参考光123、222与散射光11、31之间的干涉图案的光学对比度被成像。因此，可以使第一激发光束521a的相干长度尽可能短，或者可以选择具有短相干长度的第一照明源521，使得散射光11、31与杂散反射之间的干涉可以减轻，因为是杂散反射对非相干噪声背景有贡献，而不是杂散干涉图案。
第二照明源522为荧光检测方案提供第二激发光束522a。例如，第二照明源522可以是具有与样品60内的纳米级对象50的激发光谱或吸收光谱重叠的波长的激光器。在这种情况下，纳米级对象50可以是荧光标签或荧光团，例如，有机染料分子、荧光蛋白、胶体量子点或荧光珠。
在一些实现方式中，第二照明源522可以包括多个光源，每个光源能够发射与多个荧光标签或荧光团的相应的激发光谱相关的预选波段内的激发光，使得可以执行多色荧光成像。如果选择荧光标签或荧光团使得利用第二照明源内的光源之一激发每个荧光团，则可以执行多个荧光团的同时成像。
例如，第二照明源522可以包括多个光源，每个光源能够发射具有不同波长(例如，405nm、488nm、561nm和640nm)的输出光，以便于使用至少四种不同类型的荧光标签，每个荧光标签能够用其中一种波长来激发。
在图5中，虚线表示激发光束521a和522a以及参考光527的光程。参考光527是激发光束521a、522a在样品界面550处被反射的部分。
从第一照明源521发射的第一激发光束521a和从第二照明源522发射的第二激发光束522a可以在被引导到成像透镜510中之前被组合以形成激发光束525。
在图5的描述中，激发光束525将用于指代第一激发光束521a和第二激发光束522a的组合。第一激发光束521a和第二激发光束522a将用于指代在朝向样品60的整个激发路径中用于iSCAT检测方案和荧光检测方案的激发光束525相应的光谱部分。
在一些实现方式中，第一激发光束521a和第二激发光束522a被组合以在组合光学器件526处形成激发光束525。组合光学器件526的示例可以包括分束器、偏振分束器和二向色镜，但是组合光学器件526的实现方式不限于这些示例。
在一些实现方式中，当第一激发光束521a和第二激发光束522a的波长分开足够远以允许使用二向色镜时，组合光学器件526可以是二向色镜。又例如，组合光学器件526可以是偏振分束器，并且第一激发光束521a和第二激发光束522a的偏振可以被布置成使得它们在偏振分束器的输出处被组合。如果照明源520的可用光学功率大于测量所需的功率，使得一些光学功率可能在组合光学器件526处损失，则能够进行部分反射和部分透射的任何光学器件都可以用于组合光学器件526。
在一些实现方式中，在第二照明源522包括多个光源的情况下，根据荧光标签的选择，一个或多个光源可能不进行操作。例如，一些光源可能被关闭或被物理遮挡。
在图5的示例中，宽场照明用于激发样品60和纳米级对象50，以用于iSCAT检测方案和荧光检测方案两者。在激发光束521a、522a、525基本上准直的情况下，可以使用宽场透镜524将激发光束521a、522a、525聚焦到成像透镜510的后焦平面上。在图5的示例中，在组合光学器件526之前，两个宽场透镜524设置在第一照明源521和第二照明源522的前面。
宽场照明的实现方式不限于图5中示出的配置。例如，单个宽场透镜524可以被放置在用于组合的激发光束525的组合光学器件526之后。或者，各个宽场透镜可以被放置在第二照明源522中的一些或所有光源的前面。
在激发光束521a、522a、525基本上准直的情况下，在没有宽场透镜524的情况下，可以实现共焦照明。
激发光束525通过第一光学元件540被引导到成像透镜510中。
第一光学元件540可以被配置为将激发光束525引导到成像透镜510中并且被配置为将从纳米级对象50发射的至少部分光与激发路径(来自照明源520的激发光束525到样品60的路径)分开，使得发射的光被引导到检测器530。
在一些实现方式中，从第二照明源522发射的激发光束522a可以被配置为执行全内反射荧光(TIRF)显微术作为荧光检测方案。从宽场照明的对准开始，从第二照明源522发射的激发光束522a可以平移地远离成像透镜510的光轴位移。换句话说，激发光束522a的光程可以被移置成平行于成像透镜510的光轴。
在图5中，成像透镜510的光轴或中心轴沿着z轴，通过包括在成像透镜510中的一个或多个透镜在xy平面中的横截面的中心。因此，来自第二照明源522的激发光束522a的位移可以在xy平面内的任何方向上以实现TIRF照明。
激发光束522a的位移导致样品界面550附近的倾斜(angled)照明。如果激发光束522a的照明角度超过样品界面550处(特别地，在光学涂层552与样品60之间的界面处)的全内反射的角度，则实现所谓的基于物镜的TIRF照明或通过物镜的TIRF照明。
由于由从第二照明源522发射的激发光束522a提供的激发在样品界面550处形成消逝场(evanescent field)，因此样品50仅在距样品界面550的z方向上大约100nm高度内被激发。这使得能够在背景计数减少的情况下进行荧光检测。
可以通过为激发光束522a布置光程来为从第二照明源522发射的激发光束522a的平移移动提供便利，其中，反射激发光束522a的反射镜之一被安装在平移台上。然而，激发光束522a在xy平面内位移的方式不限于使用平移台。只要激发光束522a可以在平行于中心轴的同时从成像透镜的中心轴移位，可以采用任何其他装置或布置。
在iSCAT检测方案中，纳米级对象50散射激发光束525，从而发射散射光51。在荧光检测方案中，纳米级对象50在激发时发射荧光光线52。散射光51和荧光光线52的光程在图5中被表示为实线。
在一些实现方式中，第一光学元件540可以被配置为用于激发光束525(特别地，用于从第一照明源521发出的第一激发光束521a)的偏振分束器以用于iSCAT检测方案。在这种情况下，第一激发光束521a可以被偏振，使得第一激发光束521a基本上在第一光学元件540处被反射。这降低了在经由成像透镜510从第一照明源521到样品60的激发路径中iSCAT检测光束的第一激发光束521a的功率损失。
对于来自第一照明源521的激发光束521a的波长，第一光学元件540可以被配置为基本上反射入射在第一光学元件540上的具有s偏振的光。例如，当大约450nm波长的第一激发光束521a以45度的入射角s偏振入射到第一光学元件540上时，超过94％的功率可能在第一光学元件540处被反射并被发送到成像透镜510中。而且，大约450nm波长的第一光学元件540可以被配置为以高于0.9的透射率基本上透射以45度的入射角入射在第一光学元件540上的具有p偏振的光。
在一些实现方式中，光学成像系统500还可以包括设置在第一光学元件540与成像透镜510之间的四分之一波片560，使得第一激发光束521a在穿过四分之一波片560之后进入成像透镜510。当入射在样品60上的第一激发光束521a在样品界面550处被反射时，第一激发光束521a的反射部分(即，参考光527)在朝向第一光学元件540行进时再次穿过四分之一波片560。
如果四分之一波片560的光轴相对于第一光学元件540的对准而被对准，即，相对于第一激发光束521a的偏振成45度，则由四分之一波片560提供的延迟导致第一激发光521a在第二次穿过四分之一波片560后的90度的偏振旋转。换言之，当第一激发光束521a到达第一光学元件时，s偏振的第一激发光束521a在进入成像透镜510的途中变为p偏振的。
由于第一激发光束521a的反射部分(即，参考光527)在入射到第一光学元件540上时是p偏振的，所以参考光527的大部分(例如，90％)功率在第一光学元件540处被朝向检测器530透射。
如上面所讨论的，随着样品界面550处的反射率减小，可以使第一激发光束521a的光学功率更高，因为撞击检测器530的参考光的强度降低。第一光学元件540被配置为偏振分束器的并且在第一光学元件540与成像透镜510之间设置四分之一波片560可以防止激发光束521a的光学功率的不必要的损失，从而便于iSCAT检测方案在就光学对比度和/或信噪比而言的最佳操作点处的操作。
在一些实现方式中，除了被配置为用于第一激发光束521a的波段的偏振分束器之外，第一光学元件540还可以被配置为用于第二激发光束522a和要由第二激发光束522a激发的荧光团的荧光光谱的二向色镜。换言之，如果第一荧光团可在第一波长处利用第二照明源522的光源中的一个激发，并且在激发时发射处于第二波长的荧光光线，则第一光学元件540可以被配置为在第一波长处反射而在第二波长处透射。例如，当荧光团的荧光光谱包括波长分布时，第一光学元件可以被配置为以第二波长透射至少部分荧光光谱。
在一些实现方式中，除了被配置为用于第一激发光束221a的偏振分束器之外，第一光学元件540还可以被配置为第二激发光束522a和要由第二照明源522的多个光源激发的相应的荧光团的荧光光谱的每一个波长处的二向色镜。
在这种情况下，第一光学元件540可以被称为多向色偏光镜，因为光学元件540充当用于iSCAT检测方案的偏振分束器和用于荧光检测方案的多个荧光团的多向色镜。
作为示例，定制制造了具有以下规格的第一光学元件540(即，多向色偏光镜)：
对于在从440到456nm的波长下的iSCAT检测方案，
-入射角：45度，
-在440–456nm的波长下，反射率(s偏振)高于94％，
-在440–456nm的波长下，透射率(p偏振)高于90％。
对于在四种激发波长405nm、488nm、561nm、640nm下的荧光检测方案，
-在370-410、470-493、555-565、630-650和820-860nm的波段上，反射率(随机偏振)平均高于94％，
-在505-545、575-620和660-800nm的波段上，透射率(随机偏振)平均高于90％。
作为第一光学元件540的多向色偏光镜可以使光学成像系统500紧凑，同时便于多种检测方案和多种荧光团。例如，通过使用多向色偏光镜，便于iSCAT检测方案和荧光检测方案两者的光学成像系统500可以被集成到紧凑型显微镜中，例如US10,330,904B2中所描述的。
当在纳米级对象50处发射的并被成像透镜510收集到的荧光光线52可以是线性偏振的，但是当荧光光线52穿过四分之一波片560时，这可以被去偏振。由于第一光学元件540被配置为用于每个纳米级对象50的二向色分束器，每个荧光团，至少部分荧光光线52(例如，高于90％的功率)可以在第一光学元件540处被透射，而不管荧光光线52的偏振如何。
在一些实现方式中，当光学成像系统500便于iSCAT检测方案和荧光检测方案两者时，纳米级对象50发射的散射光51和荧光光线52在第一光学元件540处被透射之后入射在长通镜570上。长通镜570可以被配置为将散射光51和荧光光线52的光程分开。例如，在截止波长处于620nm的情况下，长通镜570可以被配置为透射具有超过620nm的波长的光束，反射具有低于620nm的波长的光束。如果散射光51处于450nm，并且第一激发光束521a和荧光光线52的波长在660-710nm的光谱内，则散射光51和参考光527在长通镜570处被反射，而荧光光线52在长通镜570处被透射。
在一些实现方式中，散射光51、参考光527和荧光光线52可以被引导到一个多阵列检测器530。特别地，iSCAT检测和荧光检测可以在同一检测器530的光敏区域的不同部分上执行。例如，散射光51和参考光527可以被引导为撞击多像素检测器530(例如，CMOS相机或CCD相机)的光敏区域的第一部分530-1，而荧光光线52可以被引导为撞击多像素检测器530的光敏区域的第二部分530-2。
因此，样品界面550附近的样品60的纳米级对象50可以经由散射光51和参考光527形成的iSCAT检测方案的干涉图案和荧光检测方案的荧光光线52两者在同一个检测器530处被成像。
一旦通过相应地配置光学涂层552来调整样品界面550处的反射率以提高光学对比度，就也可以使参考光527的光学功率在适合于荧光检测方案的检测器530的饱和强度内。因此，检测器530既可以用于iSCAT检测方案，也可以用于荧光检测方案。
经由iSCAT检测方案和荧光检测方案使用同一个检测器530的不同部分进行的同时成像具有以下优势：确保两个图像同时在焦点上并因此产生固有的稳健且紧凑的装置。
在一些实现方式中，为了在检测器530处对成像透镜510的焦平面进行成像，检测器530还可以包括另外的光学器件，例如管透镜531。
在一些实现方式中，光学成像系统500还可以在适当的位置处包括反射镜510，以引导光线。
在一些实现方式中，光学成像系统500可以在用于iSCAT检测方案和荧光检测方案的分开的检测路径中在长通光学镜之后包括滤光器511。例如，在从长通光学镜570透射的荧光的光程中，滤光器511-1可以被配置为使例如在660-710nm波长范围内的荧光光线52通过。又例如，在从长通光学镜570反射的用于iSCAT检测的光程中，滤光器511-2可以被配置为第一激发光束521a、散射光51以及参考光527的波长附近(例如，大约450nm)的带通滤波器。
在一些实现方式中，当第一照明源521被关闭或遮挡从而禁用iSCAT检测方案时，放置在用于iSCAT检测的光程中的滤光器511-1可用于荧光检测方案。在这种情况下，光学成像系统500用作双通道荧光显微镜。
例如，在用于iSCAT检测方案的光程中的滤光器511-1可以透射大约450nm、500到550nm和570到620nm。在用于荧光检测方案的光程中的滤光器511-2可以透射大约660到710nm。
被配置为便于iSCAT和荧光检测方案两者的光学成像系统500提供两种检测方案之间的相关测量。光学成像系统500不损害显微镜的点扩散功能，兼容高精度定位荧光成像。
虽然iSCAT显微镜能够检测和称重未标记的单分子，并便于研究分子组装特性，但通过将iSCAT与超分辨率单分子荧光显微镜相结合，可以增大应用范围。因此，图5中示出的相关设置除了提供紧凑且高效的设置，还可以大大增大应用范围。
图6a示出了使用iSCAT检测方案和荧光检测方案同时获得的测量结果。
图6a中示出的实验结果是使用图5中描述的具有图4a和图4b中提供的规格的光学成像系统500获得的。然而，与图4a和图4b不同，图6a示出了未经进一步数据处理的原始数据。
纳米级对象50是直径为100nm的荧光珠。可以经由iSCAT检测方案和荧光检测方案两者来检测荧光珠。
图6a的左侧面板610示出了利用iSCAT检测方案拍摄的图像。图6a的右侧面板620示出了利用荧光检测方案拍摄的图像。
左侧面板610和右侧面板620中示出的图像是利用同一个相机同时拍摄的，该相机是科学互补金属氧化物半导体(CMOS)相机。
这些结果表明光学涂层552与高分辨率荧光成像兼容，因为点扩散功能在荧光检测方案中不失真。这可能与采用空间滤波来增强光学对比度的其他方法形成对比，这些其他方法可能影响光学成像系统的点扩散功能。
图6b示出了用于研究光学涂层对荧光成像的影响的测量结果。
为了进一步研究光学涂层522对荧光检测方案的收集效率和点扩散功能的影响，利用在基板521上具有和不具有光学涂层522的光学成像系统500来测量荧光珠。直径为100nm的荧光珠被测量。
来自第二照明源522的激发光束522a的波长为640nm。对从珠发射的荧光光线进行滤波，并收集665nm到705nm之间的发射光。使用宽场照明经由荧光检测方案测量来自利用未经涂覆的玻璃盖玻片制成的四个不同样品的4600个荧光珠和来自利用经涂覆的盖玻片制成的五个不同样品的3500个荧光珠。所使用的成像透镜510是1.4NA油物镜。
上侧面板630示出了通过将高斯曲线拟合到所采集的各个荧光珠的图像而获得的半峰全宽(FWHM)的直方图。在经涂覆的玻璃盖玻片和未经涂覆的盖玻片上进行测量的FWHM的两个分布在很大程度上彼此重叠。这表明光学涂层552不会显著地扭曲通过荧光成像获得的点扩散功能。
下侧面板640示出了作为从第二照明源552发射的激发光束552a在xy平面中的横向位移的函数的荧光珠的平均亮度的测量结果。每个珠的亮度是从高斯拟合的峰值高度获得的。0轴向光束位移的位置表示激发光束552a通过成像透镜510的光轴以0度AOI入射到样品界面550上。如上面所解释的，随着轴向光束位移增大，AOI也相应地增大，从而导致宽场照明的倾斜入射。在大约3mm的轴向光束位移处，相对亮度达到峰值，这表明满足TIRF条件。对于较大的位移，部分激发光束552a被成像透镜510的光圈遮挡。成像透镜510(1.4NA油物镜)支持的最大角度约为69度，而满足TIR条件的角度约为61度。
下侧面板中的数据表明表示作为在经涂覆的盖玻片和未经涂覆的盖玻片上的荧光珠的轴向光束位移的函数的相对亮度的曲线在很大程度上彼此一致。每条曲线的高度被重新缩放，使最大值对应于为1的相对亮度。未经涂覆的盖玻片的最大亮度比经涂覆的盖玻片的最大亮度大17％。这些数据表明TIRF角度和第二照明源522的激发光束522a的强度不受涂覆的显著影响。
图7示出了说明执行干涉散射显微术的方法的流程图。
在步骤710处，在基板251、551上提供样品20、40、60。当样品20、40、60包括水性溶液时，可以将水性溶液施加到基板251、551。
在步骤720处，经由成像透镜110、210、510在样品20、40、60上提供激发光。当将样品施加在基板251、551上时，可以在样品20、40、60与基板面向样品的第一侧252-1之间形成样品界面150、250、350、550，该样品界面150、250、350、550被布置成反射激发光121、122、221、521a、522a。
在步骤730处，在检测器130、230、530处接收参考光123、222、527和散射光11、31、51。参考光123、222、527包括激发光121、122、221、521a、522a在样品界面150、250、350、550处被反射并被成像透镜110、210、510收集到的部分，而散射光11、31、51包括激发光121、122、221、521a、522a被纳米级对象10、30、50散射并被成像透镜110、210、510收集到的部分。
在步骤740处，响应于激发光121、122、221、521a、522a，通过参考光123、222、527与散射光11、31、51之间的干涉图案的光学对比度，在检测器130、230、530处对纳米级对象110、210、510进行成像。基板251、551可以包括设置在基板的第一侧252-1上的光学涂层252、300、552，使得当将样品施加到基板251、551上时，样品20、40、60与光学涂层接触。激发光121、122、221、521a、522a在样品界面150、250、350、550处的反射程度使得光学对比度与在没有光学涂层252、300、552的情况下形成的样品界面获得的光学对比度相比更大。
图8是示出光学成像系统的示例性实施例的示意图。
光学成像系统800包括成像透镜810、照明源820、检测器830、光学元件840。光学成像系统800可以被配置用于纳米级对象80的iSCAT检测和荧光检测，如在图1或图2a中所讨论的。
在图8中描述的光学成像系统800的实施例中，光学元件840包括偏振分束器并且光学成像系统800还包括结构化波片845。
在图8的示例中，光学成像系统800被配置为iSCAT显微镜并且照明源820被配置为通过将激发光束821聚焦在成像透镜810的后焦平面811处，使得激发光束821或激发光821在样品界面850处产生宽场照明。
结构化波片845被设置在光学元件840或偏振分束器840与成像透镜810之间。例如，在成像透镜810包括物镜的情况下，结构化波片845可以被设置在物镜810的孔径与偏振分束器840之间。
在到达成像透镜810之前，激发光束821在偏振分束器840处被反射，在这种情况下，只有激发光束821的s偏振分量被发送到成像透镜中。在图8的示例中，激发光束821在x方向上的偏振分量在偏振分束器840处被反射并经由结构化波片845被引导到成像透镜810，并且激发光束821在y方向上的偏振分量在偏振分束器840处被透射。
如图8的右侧面板所示，结构化波片845包括内部区域845-1和外部区域845-2。
内部区域845-1包括在激发光束821的波长处引入延迟的波片。内部区域845-1向激发光束821平行于波片的光轴或快轴的偏振分量引入延迟。
结构化波片845被设置在光学成像系统800内，使得内部区域845-1的波片的光轴位于基本上垂直于激发光束821的传播的平面上。在图8的示例中，结构化波片845被定位成平行于xy平面并且内部区域845-1的光轴在xy平面上。
结构化波片845被设置在光学成像系统800内，使得大部分激发光束821穿过内部区域845-1。内部区域845-1的面积被布置成大于激发光束821在结构化波片845的位置处的横截面。
在图8的示例中，在x方向上偏振的激发光束221在偏振分束器840处被反射后，穿过内部区域845-1并被引导到成像透镜810。结构化波片845可以被设置成使得内部区域845-1的光轴可以被旋转到期望的角度。例如，内部区域845-1的光轴可以被定位成与x轴成45度角。
如图1和图2a中所解释的，激发光束221在样品界面850处被部分反射并朝向检测器830被反射。激发光束821的反射部分在到达检测器830之前再次穿过结构化波片845的内部区域845-1和偏振分束器840。激发光束221穿过偏振分束器840并被引导到检测器830的部分用作iSCAT检测方案的参考光823并与散射光81发生干涉。
由成像透镜810收集到的大部分散射光81穿过外部区域845-2。结构化波片845的外部区域845-2包括具有与内部区域845-1不同程度的延迟的基板。
在一些实现方式中，外部区域845-2包括透明基板，该透明基板在激发光束821和散射光束81的波长下光学透明。例如，外部区域845-2可以包括诸如熔融石英的标准玻璃。
结构化波片845的面积被布置成大于从成像透镜810收集到的光的横截面。
例如，在成像透镜810是如图8的示例中描绘的无限大校正物镜的情况下，离开物镜810的孔径的收集到的散射光81形成基本上准直的光束，其横截面积与孔径的大小相当。结构化波片845的面积可以被布置成与成像透镜810的孔径面积相当或比其更大。
如上所述，内部区域845-1的面积被布置成大于激发光束821在结构波片845的位置处的横截面的面积。内部区域845-1的面积也被布置成基本上小于结构化波片845的面积，使得只有一小部分的散射光81穿过内部区域845-1。
例如，当物镜810的通光孔径的直径为9mm，并且激发光束821在结构化波片450的位置处的直径为200微米时，内部区域845-1的直径可以被设置为400微米，外部区域845-2的直径可以被设置为9mm或更大。在这种情况下，内部区域845-1的面积小于总面积的0.2％。只有散射光81落在内部区域845-1的面积内的部分经历内部区域845-1的波片的延迟。
琼斯矩阵方法(Jones matrix formalism)可以用于估计散射光81和参考光823在检测器830处的相对强度。激发光束821在入射到结构化波片845之前在偏振分束器840处被反射之后可以是通过二分量向量来描述：
等式10：
在图8的示例中，激发光束821在x方向上偏振并且二分量向量pin的基是x方向和y方向上的单位向量。
结构化波片845的波片845-1的作用由两个参数(快轴或光轴相对于偏振方向pin(在图8的示例中，为x方向)的角度θ和诱导延迟η)确定。激发光821在穿过结构化波片845之后的偏振状态由琼斯矩阵J(θ,η)和输入向量pin的矩阵相乘给出。
假设散射光81具有与激发光束821相同的偏振，并且如上所解释的，散射光81不受波片845-1的影响，散射光81在偏振分束器处的偏振状态840也通过下式给出，
等式12：psc＝J(θ,η)pin。
穿过偏振分束器840的分量(在图8的示例中，为y分量)的强度为：
等式13：Isc＝[2sin(η/2)cos(θ)sin(θ)]2。
参考光823是照明光束821按顺序在偏振分束器840处被反射、穿过结构化波片845、在样品界面850处被反射、穿过结构化波片845并被透射通过偏振分束器840的部分。参考光823的强度为，
等式14：Iref＝[2cos(η/2)]2×[2sin(η/2)cos(θ)sin(θ)]2＝2Isc×[1+cos(η)]。
如等式2和等式4中所讨论的，iSCAT检测方案的光学对比度是由于对象的存在而引起的强度的相对变化。
等式15：
因此，对于结构化波片845，光学对比度取决于延迟η。波片845-1将光学对比度改变以下倍数：
等式16：
例如，对于0.9的延迟η，对比度增强了3.2倍。
由于对比度增强仅取决于延迟η而不取决于快轴的角度θ，因此可以通过最大化参考光823的强度来优化信噪比。参考光823的最大强度在θ＝45度时获得。
图9a是示出使用结构化波片的iSCAT检测方案的光学对比度增强的图。
图900中示出的曲线910示出了等式16中给出的作为延迟函数的光学对比度。垂直轴901表示对比度增强因子。水平轴902表示由结构化波片845的内部区域845-1给出的延迟。水平轴902以2π为单位。
在0.9π(θ＝45度)的延迟(由图900中的垂直虚线903标记)处，光学对比度增强了3.1倍。
图9b示出了利用和不利用结构化波片获得的光学对比度的测量结果的比较。
图9b的左上面板921和左下面板923示出了针对在未经涂覆的盖玻片上作为纳米级对象80的标称平均直径为20nm的金纳米粒子获得的图像。平均100帧的两个图像921、923包括256×240个像素并且对应于样品界面150、250、850上的15微米×14微米的面积。图9b的右上面板922和右下面板924示出了根据从标称平均直径为20nm的金纳米粒子获得的光学对比度的测量结果构建的直方图。
左上面板921中的图像和右上面板922中的直方图是使用包含图8中描述的结构化波片845的光学成像系统800获得的。直方图是根据291个纳米粒子的测量结果构建的。已经为结构化波片845制造了定制波片。外部区域845-2(熔融石英基板)具有12.7mm的直径。通过用飞秒激光照射熔融石英基板形成内部区域845-1。或者，在一些实现方式中，内部区域845-1可以包括小的双折射基板，例如石英并且可以被设置在更大的非双折射基板上作为外部区域845-2。内部区域845-1的波片的延迟在450nm波长处约为0.9π。
左下面板923中的图像和右下面板924中的直方图是使用没有结构化波片845但具有代替结构波片845的标准四分之一波片的光学成像系统100、200获得的。直方图是根据165个纳米粒子的测量结果构建的。
在这两种情况下，所使用的成像透镜110、210、810都是具有NA＝1.40和放大倍数为111的高数值孔径油浸物镜。
测量结果表明，当使用结构化波片845时，光学对比度的中值为29％，而当不使用结构化波片845时，光学对比度的中值为8％。这与通过等式16估计的光学对比度增强一致。
图9c示出了在具有和不具有结构化波片的情况下使用iSCAT检测方案获得的测量结果。
纳米级对象80是标称平均直径为5nm的金纳米粒子。在未经涂覆的盖玻片上记录的图像包括256×220个像素，对应于样品界面150、250、850上的15μm×13μm。
上侧面板931、932中示出的实验结果是使用图8中描述的使用结构化波片845的光学成像系统800获得的。
下侧面板933、934中示出的实验结果是使用没有结构化波片845但具有代替结构波片845的标准四分之一波片的光学成像系统100、200获得的。
在这两种情况下，所使用的成像透镜110、210、810都是具有NA＝1.40和放大倍数为111的高数值孔径油浸物镜。
图像931、932平均为400帧，每帧以每秒500帧的积分时间拍摄。
测量结果显示，当使用结构化波片845时，光学对比度为1.1％，而当不使用结构化波片845时，光学对比度为0.38％。
附图中示出和上文中描述的本发明的实施例仅是示例性实施例，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围由下文中的权利要求限定。本文中描述的非互斥特征的任何组合均旨在本发明的范围内。
Claims (29)
1.一种用于对包括纳米级对象的样品进行光学成像的光学系统，包括成像透镜；
照明源，被配置为提供激发光；
检测器；以及
基板，用于支撑所述样品，
其中，当所述样品被施加在所述基板上时，被布置成反射所述激发光的样品界面形成在所述样品与所述基板面向所述样品的第一侧之间，
其中，所述光学成像系统被布置成使得所述激发光经由所述成像透镜被发送到所述基板中并且使得所述检测器接收参考光和散射光，
其中，所述参考光包括所述激发光在所述样品界面处被反射并被所述成像透镜收集到的部分，且所述散射光包括所述激发光被所述纳米级对象散射并被所述成像透镜收集到的部分，
其中，所述光学系统被配置为，响应于所述激发光，通过所述参考光与所述散射光之间的干涉图案的光学对比度，使得所述纳米级对象在所述检测器处被成像，
其中，所述基板包括设置在所述基板的第一侧上的光学涂层，使得当所述样品被施加在所述基板上时所述样品与所述光学涂层接触，并且
其中，所述激发光在所述样品界面处的反射程度使得所述光学对比度与使用在没有所述光学涂层的情况下形成的所述样品界面获得的所述光学对比度相比更大。
2.根据权利要求1所述的光学系统，还包括：
第一光学元件，被配置为将用于所述激发光束到所述成像透镜中的路径与用于所述参考光和所述散射光到所述检测器中的路径分开。
3.根据权利要求2所述的光学系统，
其中，所述第一光学元件被配置为偏振分束器。
4.根据权利要求3所述的光学系统，还包括：
结构化波片，在所述第一光学元件与所述成像透镜之间，
其中，所述结构化波片包括被配置为向所述激发光束赋予第一延迟的内部区域和被配置为向所述激发光束赋予第二延迟的外部区域。
5.根据权利要求4所述的光学系统，
其中，所述第一延迟与所述第二延迟之间的差在0.7π到0.99π之间。
6.根据权利要求4或5所述的光学系统，
其中，所述第二延迟为零。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的光学系统，
其中，所述内部区域的面积小于4mm2。
8.根据权利要求3所述的光学系统，
其中，所述光学系统还包括在所述第一光学元件与所述成像透镜之间的四分之一波片，且
其中，所述激发光相对于所述偏振分束器的对准是s偏振的，使得所述激发光在所述第一光学元件处基本上被反射到所述成像透镜中。
9.根据权利要求3至5中任一项所述的光学系统，
其中，所述照明源包括第一照明源和第二照明源，
其中，所述第一照明源提供处于第一波段内的波长处的第一激发光，所述第一激发光是用于所述参考光和所述散射光的所述激发光，
其中，所述第二照明源为所述纳米级对象的荧光激发提供处于第二波段内的波长处的第二激发光，且
其中，所述第一光学元件还被配置为将所述第二激发光与所述第一激发光组合到所述成像透镜中，并将荧光光线透射到所述检测器中，使得通过所述纳米级对象发射的所述荧光光线所述纳米级对象还在所述检测器处被成像。
10.根据权利要求9所述的光学系统，
其中，所述纳米级对象包括多组荧光团，每组荧光团具有不同的激发光谱，并且
其中，所述第二照明源被配置为，为相应组的荧光激发提供处于多个波长处的第二激发光。
11.根据权利要求9或10所述的光学系统，
其中，所述第一照明源包括具有快速电流调制的超发光发光二极管或单模二极管激光器。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的光学系统，
其中，所述光学系统被配置为使得所述干涉图案和所述荧光光线在所述检测器的光敏区域的分开的部分上被同时接收。
13.根据任一前述权利要求所述的光学系统，
其中，所述激发光的入射角被布置成使得所述激发光到所述检测器中的杂散反射程度被降低。
14.根据任一前述权利要求所述的光学系统，
其中，所述光学涂层被配置为使得所述激发光在所述样品界面处的反射程度与所述激发光的杂散反射程度相匹配，其中，所述杂散反射对应于所述激发光在除所述样品界面之外的形成于所述光学系统内的界面处被反射并随后在所述检测器处被检测到的部分。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的光学系统，
其中，所述光学涂层被配置为使得所述激发光在所述样品界面处的反射程度高于所述激发光在除了所述样品界面之外的形成于所述光学系统内的界面处的杂散反射程度，并且低于所述激发光在没有所述光学涂层的情况下形成的所述样品界面处的反射程度。
16.根据任一前述权利要求所述的光学系统，
其中，所述光学涂层包括：
中间层，在所述基板的第一侧上；以及
外部层，在所述中间层上，被布置成当所述样品被施加在所述基板上时接收所述样品。
17.根据权利要求16所述的光学系统，
其中，所述中间层包括氧化铝Al2O3、二氧化铪HfO2、五氧化钽Ta2O5、五氧化铌Nb2O5、二氧化钛TiO2和二氧化硅SiO2中的一个或多个。
18.根据权利要求16所述的光学系统，
其中，所述中间层包括透明导电氧化物。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的光学系统，
其中，所述外部层包括二氧化硅SiO2。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的光学系统，
其中，所述中间层的厚度在1到20nm之间，所述外部层的厚度在80到200nm之间。
21.根据任一前述权利要求所述的光学系统，
其中，所述光学涂层的折射率大于所述样品的折射率。
22.一种光学检测包括纳米级对象的样品的方法，所述方法包括：
在基板上提供所述样品；
经由成像透镜在所述样品上提供激发光，
其中，当将所述样品施加在所述基板上时，被布置成反射所述激发光的样品界面形成于所述样品与所述基板面向所述样品的第一侧之间；
在检测器处接收参考光和散射光，
其中，所述参考光包括所述激发光在所述样品界面处被反射并被所述成像透镜收集到的部分，且所述散射光包括所述激发光被所述纳米级对象散射并被所述成像透镜收集到的部分；以及
响应于所述激发光，通过所述参考光与所述散射光之间的干涉图案的光学对比度，在所述检测器处对所述纳米级对象进行成像，
其中，所述基板包括设置在所述基板的第一侧上的光学涂层，使得当所述样品被施加到所述基板上时，所述样品与所述光学涂层接触，并且
其中，所述激发光在所述样品界面处的反射程度使得所述光学对比度与使用在没有所述光学涂层的情况下形成的所述样品界面获得的所述光学对比度相比更大。
23.根据权利要求22所述的方法，
其中，所述激发光是处于第一波段内的波长处的第一激发光，
所述方法还包括：
为所述样品的荧光激发提供处于第二波段内的波长处的第二激发光；以及
通过所述纳米级对象响应于所述第二激发光而发射的并被所述成像透镜收集到的荧光光线，在所述检测器处对所述纳米级对象进行成像。
24.根据权利要求23所述的方法，
其中，所述纳米级对象包括多组荧光团，每组荧光团具有不同的激发光谱，并且
其中，所述第二激发光处于多个波长处，用于相应组的荧光激发。
25.根据权利要求24所述的方法，
所述方法还包括：
在所述检测器的光敏区域的分开的部分上同时接收所述干涉图案和所述荧光光线。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，
其中，所述光学涂层被配置为使得所述激发光在所述样品界面处的反射程度与所述激发光的杂散反射程度相匹配，其中，所述杂散反射对应于所述激发光在除所述样品界面之外的形成于所述光学系统内的界面处被反射并随后在所述检测器处被检测到的部分。
27.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，
其中，所述光学涂层被配置为使得所述激发光在所述样品界面处的反射程度高于所述激发光在除了所述样品界面之外的形成于所述光学系统内的界面处的杂散反射程度，并且低于所述激发光在没有所述光学涂层的情况下形成的所述样品界面处的反射程度。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，
其中，提供所述激发光包括：
提供所述激发光的光学功率，使得撞击所述检测器的激发光的光子散粒噪声超越所述检测器的读出噪声，并且使得撞击所述检测器的激发光的光学功率低于所述检测器的饱和水平。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，
其中，所述样品包括水性溶液，
提供所述样品包括将所述水性溶液施加到所述基板。
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