JPH11230907A - 極微小顕微鏡分光装置 - Google Patents

極微小顕微鏡分光装置

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JPH11230907A
JPH11230907A JP10029362A JP2936298A JPH11230907A JP H11230907 A JPH11230907 A JP H11230907A JP 10029362 A JP10029362 A JP 10029362A JP 2936298 A JP2936298 A JP 2936298A JP H11230907 A JPH11230907 A JP H11230907A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は，簡便にしかも調整部分がほとんど
なく安定に動作する極めて小型の極微小顕微鏡分光装置
を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明の極微小顕微鏡分光装置は、被測
定試料の単一分子，単一量子点／量子線，クラスター／
会合体等の極微小構造物の発光分光，散乱分光等により
スペクトルを計測する光学装置において，信号光の集光
光学系としては傾斜型屈折率分布をもったロッド型レン
ズを用い，かつ該ロッド型レンズの一方の端面を被測定
試料を載せる透明基板として使用すると共に，該ロッド
レンズの他端からレーザー光を入射させ，該ロッドレン
ズの前記一方の端面で集光させる。このように試料基板
として直接用いるロッド型レンズの端面と反対側の端面
から励起用レーザー光を入射することにより，試料との
境界領域で集光されるビームウエスト領域を微小空間と
して利用することを特徴とする新しいタイプの超小型極
微小顕微鏡分光装置が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高分解能波長可変レ
ーザー等を用いる発光・散乱並びに吸収分光計測が可能
な極微小顕微鏡分光装置であって，機能性色素分子，発
光中心，量子箱，量子線等のミクロな単一の量子構造物
あるいは溶液中の分子や細胞等の実時間の運動等を観測
する極微小顕微鏡分光装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】単一分子分光は，近年その原理的可能性
が実証されて以来，その極限的な分光計測の特徴を発揮
してミクロな相互作用の本質的な解明に着々と成果を収
めつつあるが，信号強度，計測装置手法が未開拓のため
計測感度が不十分で，検出可能な分子種が極めて限定さ
れている状況にある。
【０００３】単一分子分光では，固体媒質に埋め込まれ
た個々の分子からの蛍光励起スペクトルを単色性の高い
波長可変レーザーを用いて極低温で観測する。これに
は，レーザーで励起される分子の数を極限的に減らすこ
とが本質的に必要である。単一モードファイバー端面に
直接試料を取り付けたり，小型レンズで励起光を収束さ
せたり，ピンホールの後方に試料を置くことで実現され
ている。
【０００４】さらに試料の濃度も10-7〜10-8 mol/l の
程度に希釈されなければならない。これらの光学系で
は，単一分子からの発光を集光する光学系が放物面鏡や
楕円鏡，あるいは顕微鏡の対物レンズによってなされ，
サイズが大きく実効的な効率も必ずしも高くない嫌いが
あり，試料のマウントに高い熟練が必要であったり，取
扱いも微妙で難しいと言う欠点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前記従来技術の問題点
を克服するために，本発明者らは，先に、提案を行った
（特願平８−２１６２０７号）。これは、傾斜型屈折率
分布をもった超小型ロッド型レンズを用いることで反射
鏡並に光学部品の境界面の数を減らし，対物レンズ等の
持つ多数のレンズ表面の存在による損失を減らすと同時
に，該ロッド型レンズの端面を試料基板として直接使用
することで更に信号光の集光効率を高め，基本的に１個
の光学素子で必要な機能の集積実現を図る事を骨子とし
た装置を発明した。
【０００６】この発明と既存の手法との性能比較を可能
とするために発光効率に優れた縮合多環式化合物の一種
であるテリレン分子を計測対象の分子種として用い，直
鎖アルカン分子による結晶性媒質(i.e.シュポルスキー
媒質)に分散ドープしたものを試料に用い，例えばピッ
チ0.25，直径1.8 mmの該ロッド型レンズの一方の端面に
タングステン薄膜を蒸着した中央に直径４μm程度の開
口を設け，その内部に上記試料を詰めたものを用いて，
温度1.7Kで良好な単一分子からの発光スペクトル信号を
観測できることを見出した。
【０００７】これらのスペクトルは，例えば励起光強度
の増加にともなう飽和によるスペクトル拡がりの振る舞
いを定量的に計測することにより，他の方式で得られた
定数と良い一致を示すことから，単一分子からの信号で
あることを確認している。また，背景ノイズは既存の方
法によるものと概ね同レベルである一方，実効的に同水
準の信号のS/N比を与える励起光強度は，既存の集光方
式比べて著しく低減でき，大きな効率向上の潜在的可能
性を確認した。
【０００８】同装置を実際に使用し，高効率化を進めて
いく過程において，微小空間の確保について，金属薄膜
のコートとその中央に直径数ミクロン程度のピンホール
を開口して得られる空間を利用したり，単一モード光フ
ァイバーを接近させ，この単一モードファイバーとその
ロッド型レンズの間に生じる隙間と単一モードファイバ
ーのコアーとで形成される微小空間を用いる他に，背面
照射モードでの動作も可能であり，しかもそれが信号光
に重畳する背景ノイズを低減するのに優れた手法である
ことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて発明
されたものである。
【０００９】それ故、本発明の目的は，上記のような欠
点を除去し，簡便にしかも調整部分がほとんどなく安定
に動作する極めて小型の単一分子分光計測装置を提供す
るとともに，その趣旨でなされた前発明の一部を本質的
に改良補完し，より高効率の顕微鏡装置を提供すること
を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の極微小顕微鏡分
光装置は、被測定試料の単一分子，単一量子点／量子
線，クラスター／会合体等の極微小構造物の発光分光，
散乱分光等によりスペクトルを計測する光学装置におい
て，信号光の集光光学系としては傾斜型屈折率分布をも
ったロッド型レンズを用い，かつ該ロッド型レンズの一
方の端面を被測定試料を載せる透明基板として使用する
と共に，該ロッドレンズの他端からレーザー光を入射さ
せ，該ロッドレンズの前記一方の端面で集光させること
を特徴としている。
【００１１】また、本発明の極微小顕微鏡分光装置は、
前記入射するレーザー光の入射角を変化させることによ
り，集光点を前記一方の端面上で２次元的に走査させる
事を特徴としている。
【００１２】また、本発明の極微小顕微鏡分光装置は、
前記入射するレーザー光のダイバージェンスを変化させ
ることにより，集光点を端面と垂直の深さ方向にも変化
させ，３次元的に試料空間内を走査させることを特徴と
している。
【００１３】また、本発明の極微小顕微鏡分光装置は、
信号光の検出器としてＣＣＤ等の２次元検出器を用いる
ことにより，上記走査領域を２次元画像として同時にあ
るいは実時間で取得することを特徴としている。
【００１４】また、本発明の極微小顕微鏡分光装置は、
深さ方向も変化させた３次元画像を取得することを特徴
としている。
【００１５】また、本発明の極微小顕微鏡分光装置は、
試料内の３次元的な特定領域において各種の分光計測を
可能にすることを特徴としている。
【００１６】本発明の極微小顕微鏡分光装置では、レー
ザー光を照射する代わりに又はレーザー光を照射するこ
とに加えて、ロッド型レンズの一方側の端面に、該一方
側から照明光を照射してもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明を適用
する極微小顕微鏡分光装置の一例を示し、背面照射型の
光学系と２次元ないし３次元走査機構の構造例を例示し
ている。図１において、１は傾斜型屈折率分布をもった
ロッド型レンズ、３は試料、５及び６はレンズ、７は平
面鏡、８はビームスプリッターある。励起レーザ光路を
点線で示し、試料の場所からの信号光を実線で示してい
る。平面鏡７と２つのレンズ５、６は、角度操作機構を
構成している。
【００１８】本発明の極微小顕微鏡分光装置は上記のよ
うな構成であり、実際の使用に際しては、試料３の微小
体積空間を種々の方法により選択限定して波長可変の高
波長分解能レーザー８を照射し、この照射により生じる
分子種からの蛍光発光を信号光としてビームスプリッタ
ーから取り出し、この信号光の励起スペクトルを計測す
る。
【００１９】特に、本発明では、ロッド型レンズ１の一
端面の試料基板３に反対側の端面から励起用レーザー光
８を入射することにより，試料３との境界領域で集光さ
れるビームウエスト領域を微小空間として利用すること
を特徴として、これにより超小型単一分子分光計測装置
の実現を図るものである。
【００２０】このように、本発明では、試料の微小体積
空間を確保する手段により，金属薄膜をコートし，湿式
プロセスないし集束イオンビームによる乾式プロセスに
よる直径数ミクロン程度の開口を設けるプロセスが省略
され，装置使用上の利便性が格段に向上している点を特
徴としている。
【００２１】又、励起用レーザービームの入射角を走査
することにより，境界面領域で集光点を２次元的に走査
し，信号光の計測値と集光点の位置情報とをコンピュー
タ上で組み合わせることにより，走査型の２次元画像と
して計測結果を取得できる。本発明による入射角の走査
は，例えばステージ等を直接駆動して走査をする方式に
比べ，拡大率が任意に可変であるため，簡単な走査機構
で高い分解能が容易に実現できる利点がある。
【００２２】本発明に依れば，上記光学配置において画
像計測によって得られた画像内の特定の場所を改めて選
定し，その点における個別ないし単一の微視的構造物の
スペクトルを計測する事が可能である。単一分子分光計
測装置として，特定のスペクトルを得た上で，その観測
点の周辺の空間構造に関する情報を走査により得る事も
可能である。
【００２３】本発明は、また，光ファイバー等に比べれ
ば格段に短いロッド型レンズ１を用いることから，励起
レーザー光８に短パルス光を用いた時間分解分光計測も
可能である。
【００２４】本発明は、試料の形態が液体であっても、
本質的に相性よく使用でき，ロッドレンズ１の一端を直
接試料溶液中に導入し，適当なチャンネルないし流れを
与えること等により，セル-ソーター的な動作から，蛍
光プローブを施した生体関連高分子や細胞等を対象とし
た，光化学的ないし光物理的振る舞いのin-vivo観測等
も可能である。
【００２５】本発明に依れば，上記の光学配置におい
て，入射レーザー光のダイバージェンスを変化させる事
により，空間的には３次元的に分解された情報を取り出
すことが可能である。
【００２６】更に本発明に依れば，ロッドレンズ１を量
子構造を形成した半導体基板表面に置くだけで，半導体
集積回路，光集積回路等の構造評価を光応答特性ないし
光物性的な特性の観点から非破壊で行うことが可能であ
る。化合物半導体に依るものが発光効率の点で都合がよ
いが，VI族系半導体の量子構造やモノリシック構造化さ
れたもの等多くの形態で発光・散乱分析は必要であり，
これに限られる必要はない。
【００２７】なお、本発明における微小光学系と背面照
射配置は，平面端面を持つ半球面レンズ，超球面レンズ
等の形態でも可能であり，ロッド型レンズに限られるも
のではない。
【００２８】図２は、本発明の極微小顕微鏡分光装置の
実施の形態を示す別の例であり、１０は傾斜型屈折率分
布をもったロッド型レンズ、１１は試料、１２は結像レ
ンズ、１３はＣＣＤ２次元検出器を示している。
【００２９】この例では、試料に背面から照明光１４を
照射し、空間に分布する場所毎の分子種からの蛍光発光
を結像レンズ１２により信号光としてＣＣＤ２次元検出
器１３上に結像し、同時ないし実時間で２次元画像計測
を可能とした。この例による極微小顕微鏡分光装置も、
図１に示す例と同様の上記作用を有する。
【００３０】なお、図２は、照明光１４を試料１１に照
射しているが、照明光１４の代わりに、図１同様にビー
ムスプリッターを介して、レーザー光を前方から照射し
てもよいし、あるいは、照明光１４及びレーザー光の両
方を照射してもよい。
【００３１】（実施例１）ロッド型レンズとして日本板
ガラス製セルフォックレンズ(W20-S25-063N; 直径2.0m
m, ピッチ0.25, 中心開口角26.6度)を用い，厚さ0.15mm
のカバーグラスの表面に，テリレン分子をドデカンに10
-8 モル/l 程度溶解したものを微小量滴下したものを試
料として，該ロッドレンズの一方の端面を軽く圧接し，
そこに形成される厚さ数〜数十ミクロン程度の薄膜状の
空間を試料空間に，そこに挟まれてレンズ端面に密着し
ている該溶液を被測定試料として1.7Kに冷却固化し，波
長570nmの領域の単一モード色素レーザー(波長幅≦2.3M
Hz)を励起光源に波長をスキャンして蛍光励起スペクト
ルを観測したところ，最小半値幅〜40MHzで大きいもの
では100Mhzを越えるところまで様々に分布する良好な単
一分子からの0-0遷移発光スペクトルを観測した。
【００３２】図３は、ドデカン結晶性媒質中のテリレン
分子一つ一つから得られる蛍光励起スペクトルの計測例
を示すグラフである。縦軸で２００未満の信号は概ねノ
イズであるが、それ以外はいずれも本来の信号で、内図
はその内の３ＧＨｚ付近のものを示したもので、スペク
トル幅４２ＭＨｚのローレンツ型（実線）のスペクトル
が得られている。同じく，媒質を，テトラデカン，ヘキ
サデカンにしたもので同様に実施した。
【００３３】（実施例２）ロッド型レンズとして日本板
ガラス製セルフォックレンズ(W20-S25-063N; 直径2.0m
m, ピッチ0.25, 中心開口角26.6度)を用い，レンズの一
方の端面上に有機色素の擬イソシアニン沃化物(PIC)を
ドープしたポリビニルスルフォネート薄膜をオフセット
したスピンコート法で直接作成し，実施例と同様のレー
ザー及び計測系を用いて77Kないし1.6Kで空間走査によ
る発光強度変化の測定を行ったところ，PICのフィブリ
ル状の会合体の形状を示す信号を得た。フィブリルの配
向方向に垂直な方向に行った１次元走査で，フィブリル
の直径が〜1ミクロン程度である事とともに空間分解能
もそれ以下であることを示す結果を得た。
【００３４】（実施例３）ロッド型レンズとして日本板
ガラス製セルフォックレンズ(H18-S25-063N; 直径1.8m
m, ピッチ0.25, 中心開口角36.7度)を用い，厚さ0.15mm
のカバーグラスの表面に，テリレン分子をドデカンに10
-8 モル/l 程度溶解したものを微小量滴下したものを試
料として，該ロッドレンズの一方の端面を軽く圧接し，
そこに形成される厚さ数〜数十ミクロン程度の薄膜状の
空間を試料空間に，そこに挟まれてレンズ端面に密着し
ている該溶液を被測定試料として1.6Kに冷却固化し，上
記実施例と同様の光学系を用い，単一分子分光と２次元
空間走査を組み合わせて発光信号の検出を試みたとこ
ろ，数ミクロン程度の空間領域で孤立した単一分子の状
態から，クラスター状に集まって擬似的にスペクトルの
統計的微細構造に近い状態まで識別し，単一分子の場合
から，ほとんど無調整の状態でも空間分解能として約50
0nmを切る性能が簡便に実現可能であることを確認した
(図４)。
【００３５】図４は、ドデカン結晶性媒質中のテリレン
分子一個について得られた２次元画像の断面強度分布を
示している。ガウス分布曲線（太い実線）をあてはめる
と、空間分解能は４９０ｎｍを達成している。
【００３６】同じく，媒質を，テトラデカン，ヘキサデ
カンにしたもので同様に実施した。単一分子の計測にお
いて，励起レーザー光のビーム広がりの微調整から，回
折限界を越えるニア・フィールド動作を確認した。
【００３７】（比較例１）本発明と比較するため、ロッ
ド型レンズとして日本板ガラス製セルフォックレンズを
用い，試料として文書記録済みのマイクロフィルムを用
いてフィルムの画像面をレンズ端面に密着させたもの
を，同一の無限鏡筒長の結像光学系を用いて通常の光学
顕微鏡の対物レンズと性能を比較したところ，上記の直
径2.0mm，中心開口角26.6度のもので100倍の対物レンズ
(Olympus,MOlan;×100)と同等ないしそれ以上，直径1.8
mm，中心開口角36.7度のものではそれを大きく越える性
能を確認した。密着性に問題の残るマイクロフィルムを
試料とした場合においてさえも，SIL対物レンズの動作
原理をほとんど無調整で実現できることを実証した。
【００３８】（比較例２）さらに、本発明と比較するた
め、ロッド型レンズとして日本板ガラス製セルフォック
レンズ(H18-S25-063N; 直径1.8mm, ピッチ0.25, 中心開
口角36.7度)を用い，結像光学系として1:1のものを用
い，光検出器をCCD素子を用いることにより，実時間２
次元画像計測の可能性を実証した。この光学系では端面
上10ミクロンの物体がCCD面上で約1.36mmの実像に転送
され，単純倍率1450倍を実現している。例えばピクセル
寸法6.8ミクロンの素子を用いるとそれは200ピクセルに
対応し，１ピクセル当たりに換算すれば50nmと余裕を持
った性能がある。
【００３９】
【発明の効果】本発明の単一分子分光装置ならびに顕微
鏡装置は，ロッド型レンズのような平面端面を持つ微小
光学系に試料基板，微小試料空間の形成，励起光及び信
号光の集光走査光学系を集積し，無調整で小型簡便かつ
高い汎用性を有する分光計測装置を提供することに特徴
がある。
【００４０】本発明におけるロッド型レンズ等の端面を
試料基板とする方式は，色素分子や会合体，巨大分子，
生体関連物質，及びそれらの溶液を初め，高分子薄膜，
LB膜等から半導体微粒子，さらに半導体量子箱構造，半
導体量子線構造等もその表面に形成することが可能であ
る。
【００４１】以上の点から，本発明によれば，計測調整
に熟練を要せずほとんど無調整で高効率の小型単一分子
分光計測顕微鏡装置が実現される。また，半導体量子箱
構造，半導体量子線構造等の素子評価技術としても特異
な高い潜在能力を有する。さらに，ニア・フィールド動
作による超高密度光メモリーシステムの構築も可能であ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用する極微小顕微鏡分光装置の一例
を示している。
【図２】信号光の検出器としてＣＣＤを用いる本発明の
極微小顕微鏡分光装置の別の例を示している。
【図３】実施例１に基づき、ドデカンによる結晶性媒質
中のテリレン分子の一つ一つから得られる蛍光励起スペ
クトルの計測例である。内部の図は，比較的幅の狭い信
号を拡大したもので，典型的な単一分子のスペクトルで
ある。
【図４】実施例３に基づき得られたドデカンによる結晶
性媒質中の単一のテリレン分子の空間走査２次元画像の
断面を示す。半値幅は490nmを示す。
【符号の説明】
１、１０ 傾斜型屈折率分布をもったロッド型レンズ ３、１１ 試料 ５、６ レンズ ７ 平面鏡 ８ 励起レーザー ９ ビームスプリッター １２ 結像レンズ １３ ＣＣＤ２次元検出器
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】この例では、ロッドレンズの試料を載せた
端面側（図２中の方向）から、試料に照明光１４を照射
し、分子種からの蛍光発光を結像レンズ１２により信号
光としてＣＣＤ２次元検出器１３上に結像し、同時ない
し実時間で２次元画像計測を可能とした。この例による
極微小顕微鏡分光装置も、図１に示す例と同様の上記作
用を有する。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被測定試料の単一分子，単一量子点／
    量子線，クラスター／会合体等の極微小構造物の発光分
    光，散乱分光等によりスペクトルを計測する光学装置に
    おいて，信号光の集光光学系としては傾斜型屈折率分布
    をもったロッド型レンズを用い，かつ該ロッド型レンズ
    の一方側の端面を被測定試料を載せる透明基板として使
    用すると共に，該ロッドレンズの他方側の端面からレー
    ザー光を入射させ，該ロッドレンズの前記一方の端面で
    集光させることを特徴とする極微小顕微鏡分光装置。
  2. 【請求項２】 前記入射するレーザー光の入射角を変
    化させることにより，集光点を前記一方側の端面上で２
    次元的に走査させる事を特徴とする請求項１記載の極微
    小顕微鏡分光装置。
  3. 【請求項３】 前記入射するレーザー光のダイバージ
    ェンスを変化させることにより，集光点を端面と垂直の
    深さ方向にも変化させ，３次元的に試料空間内を走査さ
    せることを特徴とする請求項１記載の極微小顕微鏡分光
    装置。
  4. 【請求項４】 信号光の検出器としてＣＣＤ等の２次
    元検出器を用いることにより，上記走査領域を２次元画
    像として同時にあるいは実時間で取得することを特徴と
    する請求項１〜請求項３のいずれかに記載の極微小顕微
    鏡分光装置。
  5. 【請求項５】 深さ方向も変化させた３次元画像を取
    得することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか
    に記載の極微小顕微鏡分光装置。
  6. 【請求項６】 試料内の３次元的な特定領域において
    各種の分光計測が可能であることを特徴とする請求項１
    〜請求項５のいずれかに記載の極微小顕微鏡分光装置。
  7. 【請求項７】 レーザー光を照射する代わりに又はレ
    ーザー光を照射することに加えて、ロッド型レンズの一
    方側から、被測定試料を載せた上記ロッド型レンズの一
    方側の端面に、照明光を照射することを特徴とする請求
    項１〜請求項６のいずれかに記載の極微小顕微鏡分光装
    置。
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