CN109030454A - 一种高分辨生物检测成像方法 - Google Patents

一种高分辨生物检测成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高分辨生物检测成像方法，将激光聚焦到第一显微镜物镜的后焦面；将第一显微镜物镜出射的平行光经过匹配油层；将经过匹配油层的光线耦合进入到SPR传感芯片，SPR传感芯片背向光线的一侧放置有待测样品；将激光经过SPR传感芯片耦合到待测样品一侧，待测样品在激光的作用下产生拉曼散射信号；SPR传感芯片反射光线；将拉曼散射信号经过第二显微镜物镜，被拉曼光谱仪接收；SPR传感芯片反射光线，通过第一显微物镜出射，被反射图像传感器接收；将拉曼光谱仪和反射图像传感器的成像共同使用进行定量和定性分析。本发明既可以利用表面等离子体共振技术实现目标分子的定量分析，又可以利用表面增强拉曼光谱技术实现目标分子的定性分析。

Description

一种高分辨生物检测成像方法
技术领域
本发明涉及一种成像方法，更具体的说是涉及一种高分辨生物检测成像方法。
背景技术
表面等离子体共振(SPR)技术在免疫检测、药物代谢、及其蛋白质动力学、医疗诊断、生物检测、纳米科技等领域有着非常重要的应用。现有基于表面等离子体共振技术的检测设备具有免标记、高分辨、快速实时检测等优点。但是大部分基于表面等离子体共振技术的检测设备都是通过旋转电机实现大角度的光入射到一个棱镜的表面，进而满足波矢匹配条件得到表面等离子体共振，再利用这种技术进行检测。而这种结构的缺点就是体积庞大笨重，且无法实现高分辨的成像检测。同时单纯的表面等离子体共振技术检测设备只能检测物质折射率的变化，却不能定性分析物质的成分，使得这种设备的应用极其有限。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一个高数值孔径的显微物镜，结合了表面等离子体共振和表面增强拉曼光谱技术，可以利用该设备实现细胞内分子高分辨实时检测成像，既可以利用表面等离子体共振技术实现目标分子相互作用及定量分析，又可以利用表面增强拉曼光谱技术实现目标分子的定性分析。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种高分辨生物检测成像方法，包括下述步骤：
步骤一：将激光聚焦到第一显微镜物镜的后焦面；
步骤二：将第一显微镜物镜出射的平行光经过配油层；
步骤三：将经过配油层的光线耦合进入到表面等离子体共振芯片，表面等离子体共振芯片背向光线的一侧放置有待测样品；
步骤四：将激光经过表面等离子体共振芯片耦合到待测样品一侧，待测样品在激光的作用下产生拉曼散射信号；表面等离子体共振芯片反射光线；
步骤五：将拉曼散射信号经过第二显微镜物镜，被拉曼光谱仪接收；表面等离子体共振芯片反射光线，通过第一显微物镜出射，被反射图像传感器接收；
步骤六：将拉曼光谱仪和反射图像传感器的成像共同使用进行定量和定性分析。通过上述技术方案，激光聚焦在第一显微镜物镜的后焦面，之后通过配油层，经过配油层的光线平行入射到表面等离子体共振芯片上，表面等离子体共振芯片一部分光被反射，反射的部分被反射图像传感器接收，同时激光耦合到待测样品激发产生出拉曼散射信号，拉曼散射信号经过第二显微镜物镜的放大被拉曼光谱仪接收，这样就一次性获得了拉曼成像和SPR成像的图像，从而可以更加准确的对样品进行定性和定量的分析。
作为本发明的进一步改进，
步骤一中，激光经过入射角调整组件和分束器后聚焦于显微镜物镜的后焦面上，所述入射角调整组件包括偏振片、设置于偏振片光路前端的准直透镜、设置于偏振片光路后端的聚光透镜，来调整和聚焦激光，同时可以调整激光的入射角度，然后进入到分束器中，分束器反射光线到第一显微物镜中。
通过上述技术方案，通过将激光先经过入射角度调整组件，通过改变偏振片、准直透镜和聚光透镜的距离，调整激光的聚焦位置，入射光经过入射角调整组件和分束器后聚焦于光学显微物镜的后聚焦面上。而分束器一方面反射激光至传感芯片上，另一方面从传感芯片反射回来的光束经过分束器，被反射图形传感器接收。
作为本发明的进一步改进，
所述的入射角调整组件整体置于移动平台上。
通过上述技术方案：能够调节入射到等离子共振传感芯片上的入射光的入射角满足表面等离子体共振角。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤二中所述的匹配油的折射率范围为1.515～1.780。
作为本发明的进一步改进，
步骤五所述的反射图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。
作为本发明的进一步改进，
所述的偏振片天然的双折射晶体或人造的偏振片。
作为本发明的进一步改进，
所述第一显微镜物镜和第二显微镜物镜的放大倍数在40～100倍之间，第一显微物镜数值孔径范围为1.40～1.69，第二显微物镜数值空间范围为0.5～1.69.。
作为本发明的进一步改进，
所述分束器是棱镜、分色镜、薄膜分束器或半片全反射镜中的一种。
作为本发明的进一步改进，
表表面等离子体共振芯片由基底材料和金属层构成，其中基底材料为镧玻璃、BK7玻璃、普通玻璃、塑料基片中的一种，在该基底材料上先蒸镀一层2nm±1的金属铬，再蒸镀一层厚度为40～60nm的金、银、铜、铝、铂的一种或多种材料的复合层，所述复合层为单一薄膜结构或纳米阵列结构。
作为本发明的进一步改进，
所述分束器向反射图像传感器之间的反射光路上还设置有透镜。
第二显微物镜用来聚焦收集拉曼散射信号，可采用共聚焦的技术来收集拉曼信号，可以提高拉曼散射信号的收集效率，同时有可以过滤掉杂散光的噪音。这样可以利用拉曼光谱检测技术，实现对样品在分子层面上的定性分析。
本发明的有益效果，本发明提供了一个高数值孔径的显微物镜，结合了表面等离子体共振和表面增强拉曼光谱技术，可以利用该设备实现细胞内分子高分辨实时检测成像，既可以利用表面等离子体共振技术实现目标分子的定量分析，又可以利用表面增强拉曼光谱技术实现目标分子的定性分析。
利用高数值孔径物镜所能提供一个足够大的光入射角，从而激发在金属和电介质交界面的表面等离子体共振，同时激光也会和样品物质发生相互作用产生拉曼散射，而且表面等离子体共振有能够增强拉曼散射信号。同时通过共聚焦的方式，可以滤除其他的杂散光，使输入到拉曼光谱仪的拉曼散射信号的信噪比更好。因此利用这种方式可以探测到增强的拉曼拉曼光谱信号，从而实现样品的定性分析。
附图说明
图1棱镜耦合型SPR检测设备示意图；
图2所示为本发明的高分辨检测成像设备原理示意图；
图3金纳米颗粒的表面等离子体共振谱图；
图4对巯基苯甲酸拉曼光谱图；
图5利用高分辨检测成像设备所检测到的金纳米颗粒成像图；
图6所示为从CCD相机一个像素点上探测到反射光强度随入射角变化的改变图。
附图标记：
1、激光发生器；2、光纤；3、移动平台；4、准直透镜；5、偏振片；6、聚光透镜；7、第一分束器；8、第一显微镜物镜；9、匹配油；10、表面等离子体共振芯片；11、待测样品；12、第一透镜；13、反射图像传感器；14、第二显微镜物镜；15、分束器；16、图像传感器；17、第二透镜；18、光阑；19、第三透镜；20、拉曼光谱仪；21、电脑。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
参阅图2所示结构示意图，按照光路次序各个部件依次为激光发生器1，光纤2，移动平台3，准直透镜4，偏振片5，聚光透镜6，第一分束器7，第一显微镜物镜8，匹配油9，表面等离子体共振芯片10，待测样品11，第一透镜12，反射图像传感器13，第二显微镜物镜14，分束器15，图像传感器16，第二透镜17，光阑18，第三透镜19，拉曼光谱仪20，电脑21。
在实施例中，首先激光发生器发出激光，激光在经过光纤后，依次经过准直透镜、偏正片、聚光透镜中，在此过程中，可以通过移动平台调整角度，通过准直透镜、偏正片、聚光透镜对激光的矫正、除杂、聚光作用之后，射入到第一分束器中，第一分束器先是对光纤进行一个反射作用，反射光之后经过第一显微镜物镜，进行一个放大作用，之后经过第一显微镜物镜的光线经过匹配油被折射，直接射入到放置有待测样品的表面等离子体共振芯片上，表面等离子体共振芯片将一部分光线经过反射回第一显微镜物镜，再透过第一分束器，之后通过第一透镜进入到反射图像传感器中成像，这样就完成了SPR反射光谱和成像检测；同时，在表面等离子体共振芯片发生共振时，产生了拉曼散射，拉曼散射经过第二显微镜物镜的扩大后，经过第二分束器，扩大后的拉曼散射一部分经过第二分束器的反射，一次经过第二透镜、光阑、第三透镜，射入到拉曼光谱仪中成像，得到拉曼光谱，拉曼光谱和SPR反射光谱被输入到同一台电脑中，进行物质的定性分析。被扩大的拉曼散射穿过第二分束器，直接成像到图形传感器上，通过这一图形传感器，可以直接观察样品的位置，方便调整。
以利用SPR显微镜检测一个直径为80nm的金纳米颗粒为例，来说明使用SPR显微镜进行检测的实验步骤：
(1)表面等离子体共振芯片制备，选BK7玻璃作为基底，在该玻璃片先蒸镀一层2nm的金属铬，第二层蒸镀厚约47nm的金层，在金芯片表面自组装一层直径为80nm的金纳米颗粒。
(2)打开激光发生器，调节光路，使得反射图像传感器(优选为CCD相机)上接收到较强的信号。
(3)参阅图2，调节移动平台在x方向移动来线性调节入射光到第一显微镜物镜的位置，使得从第一显微镜物镜出来的光束到表面等离子体共振芯片的入射角发生变化，获得SPR角度光谱图，并获得能激发SPR的入射角度如图3所示。
(4)如图5所示，在反射图像传感器上观测到的图像，其中亮点部分是所放置的其中一个80nm大小的金纳米颗粒，其灰度图如图3所示，其半峰宽(FWHM)大概在650nm左右。
(5)利用反射图像传感器测从等离子共振传感芯片反射回来的光强，可以发现当表面等离子体共振芯片上入射光的角度在某个值的时候，反射到反射图像传感器的光强最弱，此时说明已经发生表面等离子体共振，入射光的一部分能量转化为了表面等离子体波的能量。图6所示为图像传感器一个像素点上当光入射角度变化时，反射光强度随之发生的变化。可见，一个像素约160nm×160nm的大小范围，也能测出SPR角度光谱图。由此为之后在一个像素的小面积上分析分子的相互作用成为可能，甚至为单分子检测成为可能。
(6)通过扫描入射光的入射角度，从反射图像传感器上可以探测到反射光的光强随之变化，而获得SPR角度光谱图。如图3所示，在单个80nm的金纳米颗粒吸附在金片上后，SPR角度增加了约2°。通过表面等离子共振图像的变化和SPR角度的变化，可以计算出待测样品的属性，包括含量、折射率，甚至质量等信息。
(7)在载物台上加入对巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoic acid，4-MBA)，通过图像传感器(如CCD相机)，可以观察样品在载物平台上的位置，通过调节载物台，使得第二显微镜物镜对准待测样品，通过共聚焦的方法来检测样品的拉曼光谱信号。
(8)当光的入射角度处于共振角位置时，表面等离子共振传感芯片上金纳米颗粒的电磁强度会明显增加，通过拉曼光谱仪来测对巯基苯甲酸的拉曼光谱信号，我们发现此时的拉曼光谱信号和不处于共振角位置且没有金纳米颗粒时所测到的拉曼光谱信号相比有明显的增强(如图4所示)。这就是利用本设备通过拉曼光谱技术可以直接定性分析出样品的物质属性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：包括下述步骤：
步骤一：将激光聚焦到第一显微镜物镜的后焦面；
步骤二：将第一显微镜物镜出射的平行光经过匹配油层；
步骤三：将经过匹配油层的光线耦合进入到表面等离子体共振芯片，表面等离子体共振芯片背向光线的一侧放置有待测样品；
步骤四：将激光经过表面等离子体共振芯片耦合到待测样品一侧，待测样品在激光的作用下产生拉曼散射信号；表面等离子体共振芯片反射光线；
步骤五：将拉曼散射信号经过第二显微镜物镜，被拉曼光谱仪接收；表面等离子体共振芯片反射光线，通过第一显微物镜出射，被反射图像传感器接收；
步骤六：将拉曼光谱仪和反射图像传感器的成像共同使用进行定量和定性分析。
2.根据权利要求1所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：
步骤一中，激光经过入射角调整组件和分束器后聚焦于显微镜物镜的后聚焦面上，所述入射角调整组件包括偏振片、设置于偏振片光路前端的准直透镜、设置于偏振片光路后端的聚光透镜。
3.根据权利要求2所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：
所述的入射角调整组件整体置于移动平台上。
4.根据权利要求1所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：所述步骤二中所述的匹配油的折射率范围为1.515～1.780。
5.根据权利要求1所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：
步骤五所述的反射图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。
6.根据权利要求2所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：所述的偏振片天然的双折射晶体或人造的偏振片。
7.根据权利要求1所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：所述第一显微镜物镜和第二显微镜物镜的放大倍数在40～100倍之间，第一显微物镜其数值孔径范围为1.40～1.69，第二显微物镜数值空间范围为0.5～1.69.。
8.根据权利要求2所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：所述分束器是棱镜、分色镜、薄膜分束器或半片全反射镜中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：表面等离子体共振芯片由基底材料和金属层构成，其中基底材料为镧玻璃、BK7玻璃、普通玻璃、塑料基片中的一种，在该基底材料上先蒸镀一层2nm±1的金属铬，再蒸镀一层厚度为40～60nm的金、银、铜、铝、铂的一种或多种材料的复合层，所述复合层为单一薄膜结构或纳米阵列结构。
10.根据权利要求2所述的一种高分辨生物检测成像方法，其特征在于：所述分束器向反射图像传感器之间的反射光路上还设置有透镜。
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