JPH10281876A - 偏光性イメージング装置 - Google Patents
偏光性イメージング装置Info
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- JPH10281876A JPH10281876A JP9110697A JP9110697A JPH10281876A JP H10281876 A JPH10281876 A JP H10281876A JP 9110697 A JP9110697 A JP 9110697A JP 9110697 A JP9110697 A JP 9110697A JP H10281876 A JPH10281876 A JP H10281876A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料のうち所定の領域のみについて照射光
（励起光）の照射に伴って発生した被測定光（蛍光、ラ
マン散乱光）の偏光性を２次元的に測定して、試料中の
分子の状態を高精度に検出する。 【解決手段】 パルスレーザ光源１０から出力され偏光
子１１および１／２波長板１２を経たパルス励起光は、
ｓ偏光の直線偏光とされ、プリズム３０に入射し、励起
側カバーガラス４２と試料４０との境界面で全反射す
る。試料４０中に生じたエバネセント波により励起され
て発生した蛍光は、対物レンズ５０により集光され、偏
光ビームスプリッタ５３によりｐ偏光およびｓ偏光それ
ぞれの直線偏光成分に分岐されて、イメージインテンシ
ファイア６０および６１それぞれにより撮像される。画
像演算部６３により、蛍光異方性比の２次元画像は、撮
像された像に基づいて偏光応答補正がなされて求められ
る。
（励起光）の照射に伴って発生した被測定光（蛍光、ラ
マン散乱光）の偏光性を２次元的に測定して、試料中の
分子の状態を高精度に検出する。 【解決手段】 パルスレーザ光源１０から出力され偏光
子１１および１／２波長板１２を経たパルス励起光は、
ｓ偏光の直線偏光とされ、プリズム３０に入射し、励起
側カバーガラス４２と試料４０との境界面で全反射す
る。試料４０中に生じたエバネセント波により励起され
て発生した蛍光は、対物レンズ５０により集光され、偏
光ビームスプリッタ５３によりｐ偏光およびｓ偏光それ
ぞれの直線偏光成分に分岐されて、イメージインテンシ
ファイア６０および６１それぞれにより撮像される。画
像演算部６３により、蛍光異方性比の２次元画像は、撮
像された像に基づいて偏光応答補正がなされて求められ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、照射光が照射され
た試料から発生する被測定光（蛍光、ラマン散乱光）の
偏光性の２次元画像を検出する偏光性イメージング技術
に関するものである。
た試料から発生する被測定光（蛍光、ラマン散乱光）の
偏光性の２次元画像を検出する偏光性イメージング技術
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】試料に照射光が照射されると、その試料
から蛍光やラマン散乱光等の被測定光が発生し、その被
測定光の偏光性を測定することにより、試料に関する様
々な情報を得ることができる。被測定光が蛍光である場
合、その偏光性を測定することにより、蛍光分子あるい
は蛍光分子が標識された分子の配向や回転ブラウン運動
に関する情報が得られる。例えば、蛍光分子が蛍光プロ
ーブである場合、蛍光プローブがフリーな場合とターゲ
ットに結合した場合とで回転ブラウン運動が異なること
から、その蛍光の偏光性を測定することにより、フリー
な蛍光プローブとターゲットに結合した蛍光プローブと
の識別が可能になる。一方、被測定光がラマン散乱光で
ある場合、その偏光性を測定することにより、試料中の
分子の対称性や配向に関する情報を得ることができる。
から蛍光やラマン散乱光等の被測定光が発生し、その被
測定光の偏光性を測定することにより、試料に関する様
々な情報を得ることができる。被測定光が蛍光である場
合、その偏光性を測定することにより、蛍光分子あるい
は蛍光分子が標識された分子の配向や回転ブラウン運動
に関する情報が得られる。例えば、蛍光分子が蛍光プロ
ーブである場合、蛍光プローブがフリーな場合とターゲ
ットに結合した場合とで回転ブラウン運動が異なること
から、その蛍光の偏光性を測定することにより、フリー
な蛍光プローブとターゲットに結合した蛍光プローブと
の識別が可能になる。一方、被測定光がラマン散乱光で
ある場合、その偏光性を測定することにより、試料中の
分子の対称性や配向に関する情報を得ることができる。
【０００３】従来、蛍光およびラマン散乱光の偏光測定
は、分光光度計タイプ（図７）による測定か、或いは、
落射照明方式（図８）による顕微鏡下での測定であっ
た。分光光度計タイプ（図７）のものは、直線偏光の照
射光（励起光）を試料に照射し、その照射方向とは９０
度異なる受光方向から被測定光（蛍光、ラマン散乱光）
を検出するものである。また、落射照明方式（図８）に
よるものでは、照射光（励起光）は、偏光子１１０およ
び１／２波長板１１１により所定の方位の直線偏光とさ
れた後、ダイクロイックミラー１１２および対物レンズ
１１３を経て、ステージ１２１上の試料１２０に照射さ
れ、試料１２０で発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱
光）は、対物レンズ１１３、ダイクロイックミラー１１
２、照射光カットフィルタ１３０およびバンドパスフィ
ルタ１３１を経た後、偏光ビームスプリッタ１３２によ
りｓ偏光成分およびｐ偏光成分とに分岐され、その被測
定光のｓ偏光成分およびｐ偏光成分それぞれの画像が検
出される。
は、分光光度計タイプ（図７）による測定か、或いは、
落射照明方式（図８）による顕微鏡下での測定であっ
た。分光光度計タイプ（図７）のものは、直線偏光の照
射光（励起光）を試料に照射し、その照射方向とは９０
度異なる受光方向から被測定光（蛍光、ラマン散乱光）
を検出するものである。また、落射照明方式（図８）に
よるものでは、照射光（励起光）は、偏光子１１０およ
び１／２波長板１１１により所定の方位の直線偏光とさ
れた後、ダイクロイックミラー１１２および対物レンズ
１１３を経て、ステージ１２１上の試料１２０に照射さ
れ、試料１２０で発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱
光）は、対物レンズ１１３、ダイクロイックミラー１１
２、照射光カットフィルタ１３０およびバンドパスフィ
ルタ１３１を経た後、偏光ビームスプリッタ１３２によ
りｓ偏光成分およびｐ偏光成分とに分岐され、その被測
定光のｓ偏光成分およびｐ偏光成分それぞれの画像が検
出される。
【０００４】落射照明方式で蛍光の偏光性を顕微鏡下で
測定した例として、D.Axelrod, "Carbocyanine Dye Ori
entation in Red Cell Membrane studied by Microscop
ic Fluorescence Polarization", Biophys.J., Vol.26,
pp.557-574 (1979) およびK.Suzuki, et al, "Spatiot
emporal Relationships Among Early Events of Fertil
ization in Sea Urchin Eggs Revealed by Multiview M
icroscopy", Biophys.J., Vol.68, pp.739-748 (1995)
の報告がある。
測定した例として、D.Axelrod, "Carbocyanine Dye Ori
entation in Red Cell Membrane studied by Microscop
ic Fluorescence Polarization", Biophys.J., Vol.26,
pp.557-574 (1979) およびK.Suzuki, et al, "Spatiot
emporal Relationships Among Early Events of Fertil
ization in Sea Urchin Eggs Revealed by Multiview M
icroscopy", Biophys.J., Vol.68, pp.739-748 (1995)
の報告がある。
【０００５】D.Axelrod の論文に記載されている技術
は、顕微鏡下で直線偏光の定常光を落射照明方式により
試料に照射し、発生した蛍光の偏光性を測定することに
より、生体膜に導入された蛍光プローブの配向および運
動性を調べるものである。ここで用いられている光検出
器は光電子増倍管であり、蛍光像画面上の絞りを走査す
ることにより２次元的な蛍光偏光画像を得ている。ま
た、K.Suzukiの論文に記載されている技術は、非偏光の
定常光を落射照明方式により試料に照射し、発生した蛍
光を偏光ビームスプリッタにより互いに直交する直線偏
光成分に分岐し、その２分岐された蛍光画像を単一のカ
メラにより同時に撮像することにより、卵の受精過程に
おける膜の配向性を解析するものである。
は、顕微鏡下で直線偏光の定常光を落射照明方式により
試料に照射し、発生した蛍光の偏光性を測定することに
より、生体膜に導入された蛍光プローブの配向および運
動性を調べるものである。ここで用いられている光検出
器は光電子増倍管であり、蛍光像画面上の絞りを走査す
ることにより２次元的な蛍光偏光画像を得ている。ま
た、K.Suzukiの論文に記載されている技術は、非偏光の
定常光を落射照明方式により試料に照射し、発生した蛍
光を偏光ビームスプリッタにより互いに直交する直線偏
光成分に分岐し、その２分岐された蛍光画像を単一のカ
メラにより同時に撮像することにより、卵の受精過程に
おける膜の配向性を解析するものである。
【０００６】蛍光およびラマン散乱光の偏光性の測定に
おいて重要になるのは、受光光学系および光検出器の偏
光応答補正である。受光光学系および光検出器は、異な
る偏光方位の光に対しても等しく応答するのが理想であ
るが、実際の光学素子や光電変換面は、異なる偏光方位
の光に対して異なる応答をする。したがって、真の蛍光
やラマン散乱光の偏光性を測定するためには、その補正
が必要となる。
おいて重要になるのは、受光光学系および光検出器の偏
光応答補正である。受光光学系および光検出器は、異な
る偏光方位の光に対しても等しく応答するのが理想であ
るが、実際の光学素子や光電変換面は、異なる偏光方位
の光に対して異なる応答をする。したがって、真の蛍光
やラマン散乱光の偏光性を測定するためには、その補正
が必要となる。
【０００７】従来の分光光度計タイプの偏光測定におい
ては、図７に示すように、水平偏光励起光に対して９０
度方向で受光される蛍光の水平成分強度と垂直成分強度
とは等しくなるべきことから偏光応答補正を行ってい
る。また、顕微鏡下での偏光測定において、D.Axelrod
の論文に記載されている技術では、全くの非偏光の光を
受光光学系（試料から光検出器までの光学系）および光
検出器に通すことにより偏光応答補正を行っている。さ
らに、K.Suzukiの論文に記載されている技術では、均一
で等方的な試料を非偏光の励起光で照射し、その試料か
ら発生する蛍光が全く無偏光であることを利用して偏光
応答補正を行っている。
ては、図７に示すように、水平偏光励起光に対して９０
度方向で受光される蛍光の水平成分強度と垂直成分強度
とは等しくなるべきことから偏光応答補正を行ってい
る。また、顕微鏡下での偏光測定において、D.Axelrod
の論文に記載されている技術では、全くの非偏光の光を
受光光学系（試料から光検出器までの光学系）および光
検出器に通すことにより偏光応答補正を行っている。さ
らに、K.Suzukiの論文に記載されている技術では、均一
で等方的な試料を非偏光の励起光で照射し、その試料か
ら発生する蛍光が全く無偏光であることを利用して偏光
応答補正を行っている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
分光光度計タイプの偏光性の測定では、空間的な分解能
がない。また、上記の落射照明方式による顕微鏡下での
偏光性の測定では、空間分解能はあるものの、落射照明
方式であるため受光光軸方向についての分解能が十分で
はない。すなわち、フォーカス面上の注目している分子
から発生する蛍光またはラマン散乱光だけでなく、デフ
ォーカス領域にある注目していない分子から発生する蛍
光またはラマン散乱光も受光され検出されるため、この
デフォーカス領域にある分子から発生する蛍光またはラ
マン散乱光はノイズとなる。さらに、落射照明方式の場
合、図８に示すようにダイクロイックミラー１１２およ
び対物レンズ１１３を照明光が通過するため、それらに
より散乱光および自家蛍光が発生し、これらがバックグ
ラウンドノイズとなる。
分光光度計タイプの偏光性の測定では、空間的な分解能
がない。また、上記の落射照明方式による顕微鏡下での
偏光性の測定では、空間分解能はあるものの、落射照明
方式であるため受光光軸方向についての分解能が十分で
はない。すなわち、フォーカス面上の注目している分子
から発生する蛍光またはラマン散乱光だけでなく、デフ
ォーカス領域にある注目していない分子から発生する蛍
光またはラマン散乱光も受光され検出されるため、この
デフォーカス領域にある分子から発生する蛍光またはラ
マン散乱光はノイズとなる。さらに、落射照明方式の場
合、図８に示すようにダイクロイックミラー１１２およ
び対物レンズ１１３を照明光が通過するため、それらに
より散乱光および自家蛍光が発生し、これらがバックグ
ラウンドノイズとなる。
【０００９】さらに、D.Axelrod の論文や K.Suzuki の
論文に記載されている技術では、装置の偏光応答補正に
おいて非偏光の光を用いているが、この非偏光の光は本
来観察すべき被測定光とは異なっており補正精度が低
い。また、理想的な非偏光の光を作成するのは困難であ
る。
論文に記載されている技術では、装置の偏光応答補正に
おいて非偏光の光を用いているが、この非偏光の光は本
来観察すべき被測定光とは異なっており補正精度が低
い。また、理想的な非偏光の光を作成するのは困難であ
る。
【００１０】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、試料のうち所定の領域のみについて、
照射光の照射に伴って発生した被測定光（蛍光、ラマン
散乱光）の偏光性を２次元的に測定して、試料中の分子
の状態を高精度に検出することができる偏光性イメージ
ング装置を提供することを目的とする。
れたものであり、試料のうち所定の領域のみについて、
照射光の照射に伴って発生した被測定光（蛍光、ラマン
散乱光）の偏光性を２次元的に測定して、試料中の分子
の状態を高精度に検出することができる偏光性イメージ
ング装置を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明に係る偏光性イメ
ージング装置は、(1) 直線偏光の照射光を出力する光源
部と、(2) 試料に接して配される透明部材と、(3) 照射
光を透明部材の側から透明部材と試料との境界面へ第１
の入射面に沿ってｓ偏光入射させて境界面で全反射さ
せ、試料をエバネセント照射する照射光学系と、(4) 境
界面に垂直な入射光軸を有し、エバネセント照射された
試料から発生した被測定光を入力し、第１の入射面と平
行な第１の偏光方位およびこれに直交する第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分に分岐して、互いに異なる第
１および第２の結像面それぞれに結像する受光光学系
と、(5) 第１の結像面に結像された被測定光の第１の偏
光方位の直線偏光成分を撮像する第１の撮像手段と、
(6) 第２の結像面に結像された被測定光の第２の偏光方
位の直線偏光成分を撮像する第２の撮像手段と、(7) 第
１および第２の撮像手段それぞれにより撮像された被測
定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分の画像に基づいて、被測定光の偏光性の２次元画像を
求める画像演算手段と、を備えることを特徴とする。
ージング装置は、(1) 直線偏光の照射光を出力する光源
部と、(2) 試料に接して配される透明部材と、(3) 照射
光を透明部材の側から透明部材と試料との境界面へ第１
の入射面に沿ってｓ偏光入射させて境界面で全反射さ
せ、試料をエバネセント照射する照射光学系と、(4) 境
界面に垂直な入射光軸を有し、エバネセント照射された
試料から発生した被測定光を入力し、第１の入射面と平
行な第１の偏光方位およびこれに直交する第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分に分岐して、互いに異なる第
１および第２の結像面それぞれに結像する受光光学系
と、(5) 第１の結像面に結像された被測定光の第１の偏
光方位の直線偏光成分を撮像する第１の撮像手段と、
(6) 第２の結像面に結像された被測定光の第２の偏光方
位の直線偏光成分を撮像する第２の撮像手段と、(7) 第
１および第２の撮像手段それぞれにより撮像された被測
定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分の画像に基づいて、被測定光の偏光性の２次元画像を
求める画像演算手段と、を備えることを特徴とする。
【００１２】この偏光性イメージング装置によれば、光
源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光およびパ
ルス光の何れでもよい）は、照射光学系により、試料に
接して配される透明部材の側から透明部材と試料との境
界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射され、その境界
面で全反射され、これに伴い、試料はエバネセント照射
される。エバネセント照射された試料から発生した被測
定光（蛍光、ラマン散乱光）は、その境界面に垂直な入
射光軸を有する受光光学系に入力し、第１の入射面と平
行な第１の偏光方位およびこれに直交する第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分に分岐されて、互いに異なる
第１および第２の結像面それぞれに結像される。その結
像された被測定光の第１および第２の偏光方位それぞれ
の直線偏光成分は、第１および第２の撮像手段それぞれ
により撮像され、被測定光の偏光性の２次元画像は、画
像演算手段により、その画像に基づいて求められる。
源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光およびパ
ルス光の何れでもよい）は、照射光学系により、試料に
接して配される透明部材の側から透明部材と試料との境
界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射され、その境界
面で全反射され、これに伴い、試料はエバネセント照射
される。エバネセント照射された試料から発生した被測
定光（蛍光、ラマン散乱光）は、その境界面に垂直な入
射光軸を有する受光光学系に入力し、第１の入射面と平
行な第１の偏光方位およびこれに直交する第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分に分岐されて、互いに異なる
第１および第２の結像面それぞれに結像される。その結
像された被測定光の第１および第２の偏光方位それぞれ
の直線偏光成分は、第１および第２の撮像手段それぞれ
により撮像され、被測定光の偏光性の２次元画像は、画
像演算手段により、その画像に基づいて求められる。
【００１３】また、さらに、(1) 光源部は照射光として
パルス光を出射するとともに、(2)パルス光の出射タイ
ミングに同期して第１および第２の撮像手段それぞれの
撮像タイミングを制御する制御手段を更に備える、こと
を特徴とする。この場合には、第１および第２の撮像手
段それぞれの撮像タイミングは、制御手段により、光源
部から照射光として出射されるパルス光の出射タイミン
グに同期して制御される。
パルス光を出射するとともに、(2)パルス光の出射タイ
ミングに同期して第１および第２の撮像手段それぞれの
撮像タイミングを制御する制御手段を更に備える、こと
を特徴とする。この場合には、第１および第２の撮像手
段それぞれの撮像タイミングは、制御手段により、光源
部から照射光として出射されるパルス光の出射タイミン
グに同期して制御される。
【００１４】また、さらに、(1) 照射光が第１の入射面
に沿って入射したときに発生する被測定光の第１および
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏
光応答補正因子を算出する偏光応答補正因子獲得手段を
更に備え、(2) 画像演算手段は被測定光の偏光性の２次
元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正して
求める、ことを特徴とする。この場合には、速やかに偏
光解消する等方的な試料について、偏光応答補正因子獲
得手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射した
ときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分に基づいて偏光応答補正因子が算
出され、画像演算手段により、被測定光の偏光性の２次
元画像は、偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正さ
れて求められる。
に沿って入射したときに発生する被測定光の第１および
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏
光応答補正因子を算出する偏光応答補正因子獲得手段を
更に備え、(2) 画像演算手段は被測定光の偏光性の２次
元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正して
求める、ことを特徴とする。この場合には、速やかに偏
光解消する等方的な試料について、偏光応答補正因子獲
得手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射した
ときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分に基づいて偏光応答補正因子が算
出され、画像演算手段により、被測定光の偏光性の２次
元画像は、偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正さ
れて求められる。
【００１５】また、さらに、照射光学系は、第１の入射
面に直交する第２の入射面を更に有し、第１および第２
の入射面のうちの選択された一方の面に沿って照射光を
ｓ偏光入射させる、ことを特徴とする。この場合には、
第１および第２の入射面それぞれに沿ってｓ偏光入射し
た照射光によりエバネセント照射された試料から発生し
た被測定光の偏光性の２次元画像が得られる。
面に直交する第２の入射面を更に有し、第１および第２
の入射面のうちの選択された一方の面に沿って照射光を
ｓ偏光入射させる、ことを特徴とする。この場合には、
第１および第２の入射面それぞれに沿ってｓ偏光入射し
た照射光によりエバネセント照射された試料から発生し
た被測定光の偏光性の２次元画像が得られる。
【００１６】また、さらに、(1) 照射光が第１の入射面
に沿って入射したときに発生する被測定光の第１および
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分、ならびに、照
射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する被
測定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分に基づいて、偏光応答補正因子を算出する偏光応答
補正因子獲得手段を更に備え、(2) 画像演算手段は、被
測定光の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づ
いて偏光応答補正して求める、ことを特徴とする。この
場合には、等方的な試料について、偏光応答補正因子獲
得手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射した
ときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分、ならびに、照射光が第２の入射
面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１およ
び第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、
偏光応答補正因子が算出され、画像演算手段により、被
測定光の偏光性の２次元画像は、偏光応答補正因子に基
づいて偏光応答補正されて求められる。
に沿って入射したときに発生する被測定光の第１および
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分、ならびに、照
射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する被
測定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分に基づいて、偏光応答補正因子を算出する偏光応答
補正因子獲得手段を更に備え、(2) 画像演算手段は、被
測定光の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づ
いて偏光応答補正して求める、ことを特徴とする。この
場合には、等方的な試料について、偏光応答補正因子獲
得手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射した
ときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分、ならびに、照射光が第２の入射
面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１およ
び第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、
偏光応答補正因子が算出され、画像演算手段により、被
測定光の偏光性の２次元画像は、偏光応答補正因子に基
づいて偏光応答補正されて求められる。
【００１７】また、さらに、(1) 試料を境界面に平行な
面上で回転させる回転手段を更に備え、(2) 偏光応答補
正因子獲得手段は、照射光が第１の入射面に沿って入射
したときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分、ならびに、回転手段により
試料が９０度回転された後に照射光が第２の入射面に沿
って入射したときに発生する被測定光の第１および第２
の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応
答補正因子を算出する、ことを特徴とする。この場合に
は、非等方的な試料についても、偏光応答補正因子獲得
手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射したと
きに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位それ
ぞれの直線偏光成分、ならびに、回転手段により境界面
に平行な面上で試料が９０度回転された後に照射光が第
２の入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の
第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基
づいて、偏光応答補正因子が算出され、画像演算手段に
より、被測定光の偏光性の２次元画像は、偏光応答補正
因子に基づいて偏光応答補正されて求められる。
面上で回転させる回転手段を更に備え、(2) 偏光応答補
正因子獲得手段は、照射光が第１の入射面に沿って入射
したときに発生する被測定光の第１および第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分、ならびに、回転手段により
試料が９０度回転された後に照射光が第２の入射面に沿
って入射したときに発生する被測定光の第１および第２
の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応
答補正因子を算出する、ことを特徴とする。この場合に
は、非等方的な試料についても、偏光応答補正因子獲得
手段により、照射光が第１の入射面に沿って入射したと
きに発生する被測定光の第１および第２の偏光方位それ
ぞれの直線偏光成分、ならびに、回転手段により境界面
に平行な面上で試料が９０度回転された後に照射光が第
２の入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の
第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基
づいて、偏光応答補正因子が算出され、画像演算手段に
より、被測定光の偏光性の２次元画像は、偏光応答補正
因子に基づいて偏光応答補正されて求められる。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。また、本発明は、蛍光の偏光性イメージングだ
けでなく、ラマン散乱光の偏光性イメージングにも適用
可能であるが、以下では前者の場合について説明する。
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。また、本発明は、蛍光の偏光性イメージングだ
けでなく、ラマン散乱光の偏光性イメージングにも適用
可能であるが、以下では前者の場合について説明する。
【００１９】先ず、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の構成の説明に先立って、本発明に係る偏光性イ
メージング装置が採用する蛍光偏光解消法について説明
する。蛍光偏光解消法は、蛍光分子または蛍光分子によ
り標識された分子（例えば、蛋白など）の運動を知る上
で有効な手段である。すなわち、励起光により励起され
た蛍光分子が蛍光を発生するまでの励起寿命中に回転ブ
ラウン運動により不規則な回転を行うと、その励起され
た蛍光分子の分子軸が乱れ、発生する蛍光の偏光性が解
消される。
グ装置の構成の説明に先立って、本発明に係る偏光性イ
メージング装置が採用する蛍光偏光解消法について説明
する。蛍光偏光解消法は、蛍光分子または蛍光分子によ
り標識された分子（例えば、蛋白など）の運動を知る上
で有効な手段である。すなわち、励起光により励起され
た蛍光分子が蛍光を発生するまでの励起寿命中に回転ブ
ラウン運動により不規則な回転を行うと、その励起され
た蛍光分子の分子軸が乱れ、発生する蛍光の偏光性が解
消される。
【００２０】この蛍光偏光解消の度合いは、蛍光分子ま
たは蛍光分子により標識された分子のブラウン運動の速
さによって決まるので、逆に蛍光偏光解消の度合いから
蛍光分子の励起寿命つまり蛍光寿命を時間基準として蛍
光分子または蛍光分子により標識された分子の運動を知
ることができる。例えば、ターゲットに結合している蛍
光プローブとフリーな蛍光プローブとを考えたとき、フ
リーな蛍光プローブは、ターゲットに結合した蛍光プロ
ーブより速いブラウン運動を行うので、偏光解消が速
い。したがって、蛍光偏光解消法により、ターゲットに
結合した蛍光プローブとフリーな蛍光プローブとの識別
が可能となる。すなわち、蛍光プローブが結合している
ターゲットのみを検出することが可能となる。
たは蛍光分子により標識された分子のブラウン運動の速
さによって決まるので、逆に蛍光偏光解消の度合いから
蛍光分子の励起寿命つまり蛍光寿命を時間基準として蛍
光分子または蛍光分子により標識された分子の運動を知
ることができる。例えば、ターゲットに結合している蛍
光プローブとフリーな蛍光プローブとを考えたとき、フ
リーな蛍光プローブは、ターゲットに結合した蛍光プロ
ーブより速いブラウン運動を行うので、偏光解消が速
い。したがって、蛍光偏光解消法により、ターゲットに
結合した蛍光プローブとフリーな蛍光プローブとの識別
が可能となる。すなわち、蛍光プローブが結合している
ターゲットのみを検出することが可能となる。
【００２１】この蛍光偏光解消法の考え方に基づいて、
定常光（ＣＷ光）励起により発生した蛍光の偏光解消を
測定することで蛍光プローブがターゲットに結合してい
るか否かを識別することも可能であるが、フリーな蛍光
プローブの数がターゲットに結合した蛍光プローブの数
に比べて圧倒的に多い場合（これは極めて一般的な場合
である）には検出感度が悪い。
定常光（ＣＷ光）励起により発生した蛍光の偏光解消を
測定することで蛍光プローブがターゲットに結合してい
るか否かを識別することも可能であるが、フリーな蛍光
プローブの数がターゲットに結合した蛍光プローブの数
に比べて圧倒的に多い場合（これは極めて一般的な場合
である）には検出感度が悪い。
【００２２】そこで、以下に述べる本実施形態に係る偏
光性イメージング装置では、図１に示すように、フリー
な蛍光プローブがターゲットに結合した蛍光プローブよ
り速く偏光解消を起こすことを利用して、パルス励起光
を照射して発生した蛍光のうち偏光解消の速い成分を時
間ゲート法により取り除いて光検出器により撮像するこ
とにより、フリーな蛍光プローブの数がターゲットに結
合した蛍光プローブの数に比べて圧倒的に多い場合であ
っても、ターゲットに結合した蛍光プローブの存在する
試料中の位置を検出するものである。なお、本発明は、
定常光（ＣＷ光）照射の場合にも適用可能である。
光性イメージング装置では、図１に示すように、フリー
な蛍光プローブがターゲットに結合した蛍光プローブよ
り速く偏光解消を起こすことを利用して、パルス励起光
を照射して発生した蛍光のうち偏光解消の速い成分を時
間ゲート法により取り除いて光検出器により撮像するこ
とにより、フリーな蛍光プローブの数がターゲットに結
合した蛍光プローブの数に比べて圧倒的に多い場合であ
っても、ターゲットに結合した蛍光プローブの存在する
試料中の位置を検出するものである。なお、本発明は、
定常光（ＣＷ光）照射の場合にも適用可能である。
【００２３】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の構成について、図２および図３を参照しながら
説明する。図２は、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の全体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４
０との境界面に平行な方向）から見た構成図であり、図
３は、本実施形態に係る偏光性イメージング装置のうち
の光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラス
４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構成
図である。
グ装置の構成について、図２および図３を参照しながら
説明する。図２は、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の全体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４
０との境界面に平行な方向）から見た構成図であり、図
３は、本実施形態に係る偏光性イメージング装置のうち
の光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラス
４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構成
図である。
【００２４】試料４０中の蛍光プローブを励起する直線
偏光のパルス励起光を出力する光源部は、パルスレーザ
光源１０、偏光子１１および１／２波長板１２を備えて
構成される。すなわち、パルスレーザ光源１０は、試料
４０中の蛍光プローブを励起し得る波長のパルス励起光
を一定繰り返し周波数で出射する。偏光子１１は、その
パルス励起光を直線偏光とし、１／２波長板１２は、そ
の直線偏光とされたパルス励起光をｓ偏光とする。な
お、パルス励起光について言うｓ偏光とは、後述する励
起側カバーガラス４２と試料４０との境界面でパルス励
起光が全反射する際に、そのパルス励起光の偏光方位が
入射面に垂直であることを意味する。
偏光のパルス励起光を出力する光源部は、パルスレーザ
光源１０、偏光子１１および１／２波長板１２を備えて
構成される。すなわち、パルスレーザ光源１０は、試料
４０中の蛍光プローブを励起し得る波長のパルス励起光
を一定繰り返し周波数で出射する。偏光子１１は、その
パルス励起光を直線偏光とし、１／２波長板１２は、そ
の直線偏光とされたパルス励起光をｓ偏光とする。な
お、パルス励起光について言うｓ偏光とは、後述する励
起側カバーガラス４２と試料４０との境界面でパルス励
起光が全反射する際に、そのパルス励起光の偏光方位が
入射面に垂直であることを意味する。
【００２５】１／２波長板１２から出射されたパルス励
起光をプリズム３０に入射させる照射光学系は、光路切
替ミラー２０、ミラー２１，２２およびステアリングミ
ラー２３，２４を備えて構成される。すなわち、１／２
波長板１２から出射されたパルス励起光は、先ず、光路
切替ミラー２０に入射する。この光路切替ミラー２０
は、着脱自在のものであって、装着されているか否かに
依ってパルス励起光のその後の光路を切り換えるもので
ある。すなわち、パルス励起光は、光路切替ミラー２０
が装着されているときには、光路切替ミラー２０により
反射されてミラー２１に入射するが、光路切替ミラー２
０が装着されていないときには、ミラー２２に入射す
る。
起光をプリズム３０に入射させる照射光学系は、光路切
替ミラー２０、ミラー２１，２２およびステアリングミ
ラー２３，２４を備えて構成される。すなわち、１／２
波長板１２から出射されたパルス励起光は、先ず、光路
切替ミラー２０に入射する。この光路切替ミラー２０
は、着脱自在のものであって、装着されているか否かに
依ってパルス励起光のその後の光路を切り換えるもので
ある。すなわち、パルス励起光は、光路切替ミラー２０
が装着されているときには、光路切替ミラー２０により
反射されてミラー２１に入射するが、光路切替ミラー２
０が装着されていないときには、ミラー２２に入射す
る。
【００２６】ミラー２１に入射したパルス励起光は、ミ
ラー２１により反射され、ステアリングミラー２３に入
射する。このステアリングミラー２３は、パルス励起光
をプリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の
進行方向を変えるものである。ステアリングミラー２４
も同様に、ミラー２２により反射されたパルス励起光を
プリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の進
行方向を変えるものである。
ラー２１により反射され、ステアリングミラー２３に入
射する。このステアリングミラー２３は、パルス励起光
をプリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の
進行方向を変えるものである。ステアリングミラー２４
も同様に、ミラー２２により反射されたパルス励起光を
プリズム３０に入射させるべく、そのパルス励起光の進
行方向を変えるものである。
【００２７】ここで、光路切替ミラー２０、ミラー２
１，２２およびステアリングミラー２３，２４からなる
照射光学系は、ステアリングミラー２３で反射され試料
４０の境界面に入射するパルス励起光の入射面と、ステ
アリングミラー２４で反射され試料４０の境界面に入射
するパルス励起光の入射面とが互いに直交するよう配さ
れる。
１，２２およびステアリングミラー２３，２４からなる
照射光学系は、ステアリングミラー２３で反射され試料
４０の境界面に入射するパルス励起光の入射面と、ステ
アリングミラー２４で反射され試料４０の境界面に入射
するパルス励起光の入射面とが互いに直交するよう配さ
れる。
【００２８】ステアリングミラー２３および２４の何れ
かにより反射されたパルス励起光が入射するプリズム３
０は、その底面が励起側カバーガラス４２と実質的に接
しており、また、この励起側カバーガラス４２は、試料
４０と接している。ステアリングミラー２３および２４
の何れかにより反射されたパルス励起光は、プリズム３
０の側面に入射し、さらに励起側カバーガラス４２に入
射し、この励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面で全反射する。このようにパルス励起光が試料４０の
境界面で全反射すると、境界面近傍の試料４０の領域に
エバネセント波が生じる。このエバネセント波の強度分
布は、境界面からの距離に依存して指数関数的に減衰
し、その深さ（境界面からの距離）は、パルス励起光の
波長における励起側カバーガラス４２および試料４０そ
れぞれの屈折率ならびに入射角度に応じた値である。こ
のエバネセント波が生じ得る試料４０中の領域がエバネ
セント励起され、その領域にある蛍光プローブから蛍光
が生じる。
かにより反射されたパルス励起光が入射するプリズム３
０は、その底面が励起側カバーガラス４２と実質的に接
しており、また、この励起側カバーガラス４２は、試料
４０と接している。ステアリングミラー２３および２４
の何れかにより反射されたパルス励起光は、プリズム３
０の側面に入射し、さらに励起側カバーガラス４２に入
射し、この励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面で全反射する。このようにパルス励起光が試料４０の
境界面で全反射すると、境界面近傍の試料４０の領域に
エバネセント波が生じる。このエバネセント波の強度分
布は、境界面からの距離に依存して指数関数的に減衰
し、その深さ（境界面からの距離）は、パルス励起光の
波長における励起側カバーガラス４２および試料４０そ
れぞれの屈折率ならびに入射角度に応じた値である。こ
のエバネセント波が生じ得る試料４０中の領域がエバネ
セント励起され、その領域にある蛍光プローブから蛍光
が生じる。
【００２９】また、プリズム３０、励起側カバーガラス
４２および試料４０は、回転ステージ３１に配置されて
いる。回転ステージ３１は、中央部に開口が設けられ、
後述する対物レンズ５０の光軸に直交する平面上に、プ
リズム３０、励起側カバーガラス４２および試料４０等
を配置するものであり、また、対物レンズ５０の光軸を
中心にして回転自在なものである。なお、プリズム３０
は、回転ステージ３１により光軸を中心として９０度回
転しても、回転前と同一形状となることが好ましい。す
なわち、プリズム３０は、例えば底面形状が正方形であ
る立方体、直方体あるいは正四角錐であって、その底面
の中心点が回転ステージ３１の回転中心線上にあること
が好ましい。
４２および試料４０は、回転ステージ３１に配置されて
いる。回転ステージ３１は、中央部に開口が設けられ、
後述する対物レンズ５０の光軸に直交する平面上に、プ
リズム３０、励起側カバーガラス４２および試料４０等
を配置するものであり、また、対物レンズ５０の光軸を
中心にして回転自在なものである。なお、プリズム３０
は、回転ステージ３１により光軸を中心として９０度回
転しても、回転前と同一形状となることが好ましい。す
なわち、プリズム３０は、例えば底面形状が正方形であ
る立方体、直方体あるいは正四角錐であって、その底面
の中心点が回転ステージ３１の回転中心線上にあること
が好ましい。
【００３０】エバネセント励起された試料４０から発生
する蛍光は、対物レンズ５０、励起光カットフィルタ５
１、バンドパスフィルタ５２、偏光ビームスプリッタ５
３および結像レンズ５４，５５を備えて構成される受光
光学系により、撮像手段であるゲート機能付きイメージ
インテンシファイア６０，６１それぞれの受光面に結像
される。すなわち、対物レンズ５０は、試料４０につい
てプリズム３０と反対側に配されており、その視野内で
発生した蛍光を入力する。励起光カットフィルタ５１
は、対物レンズ５０から出力された蛍光を透過させる一
方、パルス励起光の散乱成分を遮断し、バンドパスフィ
ルタ５２は、励起光カットフィルタ５１を透過した蛍光
の波長を含む所定帯域の光のみを透過させ、偏光ビーム
スプリッタ５３は、バンドパスフィルタ５２を透過した
蛍光をｓ偏光成分とｐ偏光成分とに分岐する。結像レン
ズ５４は、蛍光のｐ偏光成分を入力して、ゲート機能付
きイメージインテンシファイア６０の撮像面に結像す
る。結像レンズ５５は、蛍光のｓ偏光成分を入力して、
ゲート機能付きイメージインテンシファイア６１の撮像
面に結像する。なお、蛍光について言うｐ偏光およびｓ
偏光それぞれは、偏光ビームスプリッタ５３の偏光膜へ
蛍光が入射する際における入射面に平行および垂直それ
ぞれを意味する。
する蛍光は、対物レンズ５０、励起光カットフィルタ５
１、バンドパスフィルタ５２、偏光ビームスプリッタ５
３および結像レンズ５４，５５を備えて構成される受光
光学系により、撮像手段であるゲート機能付きイメージ
インテンシファイア６０，６１それぞれの受光面に結像
される。すなわち、対物レンズ５０は、試料４０につい
てプリズム３０と反対側に配されており、その視野内で
発生した蛍光を入力する。励起光カットフィルタ５１
は、対物レンズ５０から出力された蛍光を透過させる一
方、パルス励起光の散乱成分を遮断し、バンドパスフィ
ルタ５２は、励起光カットフィルタ５１を透過した蛍光
の波長を含む所定帯域の光のみを透過させ、偏光ビーム
スプリッタ５３は、バンドパスフィルタ５２を透過した
蛍光をｓ偏光成分とｐ偏光成分とに分岐する。結像レン
ズ５４は、蛍光のｐ偏光成分を入力して、ゲート機能付
きイメージインテンシファイア６０の撮像面に結像す
る。結像レンズ５５は、蛍光のｓ偏光成分を入力して、
ゲート機能付きイメージインテンシファイア６１の撮像
面に結像する。なお、蛍光について言うｐ偏光およびｓ
偏光それぞれは、偏光ビームスプリッタ５３の偏光膜へ
蛍光が入射する際における入射面に平行および垂直それ
ぞれを意味する。
【００３１】ゲート機能付きイメージインテンシファイ
ア６０は、その撮像面に結像された蛍光のｐ偏光成分の
画像を、また、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６１は、その撮像面に結像された蛍光のｓ偏光成分
の画像を、それぞれ、ゲートコントローラ６２から出力
されるゲート信号が指示するタイミングで撮像する。ゲ
ートコントローラ６２は、パルスレーザ光源１０から出
力されるパルス励起光出射タイミングを示すタイミング
信号を入力し、そのタイミング信号に同期して、パルス
励起光出射時刻を基準として或時刻ｔから或時刻ｔ＋Δ
ｔまでの一定時間Δｔを示すゲート信号を出力する。し
たがって、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０および６１それぞれは、ゲートコントローラ６２か
ら出力されるゲート信号の指示に基づいて、時刻ｔから
の一定時間Δｔだけ、それぞれの撮像面に結像されてい
る蛍光を撮像する。
ア６０は、その撮像面に結像された蛍光のｐ偏光成分の
画像を、また、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６１は、その撮像面に結像された蛍光のｓ偏光成分
の画像を、それぞれ、ゲートコントローラ６２から出力
されるゲート信号が指示するタイミングで撮像する。ゲ
ートコントローラ６２は、パルスレーザ光源１０から出
力されるパルス励起光出射タイミングを示すタイミング
信号を入力し、そのタイミング信号に同期して、パルス
励起光出射時刻を基準として或時刻ｔから或時刻ｔ＋Δ
ｔまでの一定時間Δｔを示すゲート信号を出力する。し
たがって、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０および６１それぞれは、ゲートコントローラ６２か
ら出力されるゲート信号の指示に基づいて、時刻ｔから
の一定時間Δｔだけ、それぞれの撮像面に結像されてい
る蛍光を撮像する。
【００３２】画像演算部６３は、ゲート機能付きイメー
ジインテンシファイア６０および６１それぞれにより撮
像されたｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの蛍光画
像を入力する。そして、画像演算部６３は、これらの蛍
光画像に基づいて、蛍光異方性比の２次元画像を求め、
更に偏光応答補正を行い、試料４０における偏光性の２
次元画像を獲得する。蛍光異方性比および偏光応答補正
については後述する。
ジインテンシファイア６０および６１それぞれにより撮
像されたｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの蛍光画
像を入力する。そして、画像演算部６３は、これらの蛍
光画像に基づいて、蛍光異方性比の２次元画像を求め、
更に偏光応答補正を行い、試料４０における偏光性の２
次元画像を獲得する。蛍光異方性比および偏光応答補正
については後述する。
【００３３】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置におけるプリズム３０、回転ステージ３１および
対物レンズ５０等について、図４に示す断面図を参照し
て詳細に説明する。この図に示すように、試料４０は、
スペーサ４４を挟んで互いに平行に配された励起側カバ
ーガラス４２と受光側カバーガラス４３との間の空隙に
満たされた外液４０Ａ中にあって、励起側カバーガラス
４２に接している。励起側カバーガラス４２の上面は、
プリズム３０の底面と対向しており、これらの面の間に
はオイル４１が満たされている。このオイル４１は、プ
リズム３０の底面と励起側カバーガラス４２の上面との
間に空気層が存在すると、プリズム３０の底面でパルス
励起光が全反射するので、これを防止するために設けら
れたものである。また、受光側カバーガラス４３の下方
に、対物レンズ５０が配されている。
グ装置におけるプリズム３０、回転ステージ３１および
対物レンズ５０等について、図４に示す断面図を参照し
て詳細に説明する。この図に示すように、試料４０は、
スペーサ４４を挟んで互いに平行に配された励起側カバ
ーガラス４２と受光側カバーガラス４３との間の空隙に
満たされた外液４０Ａ中にあって、励起側カバーガラス
４２に接している。励起側カバーガラス４２の上面は、
プリズム３０の底面と対向しており、これらの面の間に
はオイル４１が満たされている。このオイル４１は、プ
リズム３０の底面と励起側カバーガラス４２の上面との
間に空気層が存在すると、プリズム３０の底面でパルス
励起光が全反射するので、これを防止するために設けら
れたものである。また、受光側カバーガラス４３の下方
に、対物レンズ５０が配されている。
【００３４】したがって、プリズム３０およびオイル４
１を経て励起側カバーガラス４２に入射したｓ偏光のパ
ルス励起光は、励起側カバーガラス４２と試料４０との
間の境界面に所定の入射角度で入射して、その境界面で
全反射する。パルス励起光の全反射の際に生じたエバネ
セント波により、境界面近傍の試料４０はエバネセント
励起され、試料４０から発生した蛍光は、受光側カバー
ガラス４３を透過して、対物レンズ５０に入射する。
１を経て励起側カバーガラス４２に入射したｓ偏光のパ
ルス励起光は、励起側カバーガラス４２と試料４０との
間の境界面に所定の入射角度で入射して、その境界面で
全反射する。パルス励起光の全反射の際に生じたエバネ
セント波により、境界面近傍の試料４０はエバネセント
励起され、試料４０から発生した蛍光は、受光側カバー
ガラス４３を透過して、対物レンズ５０に入射する。
【００３５】次に、励起側カバーガラス４２と試料４０
との境界面におけるパルス励起光の全反射に伴い発生す
るエバネセント波の偏光状態について、図５を参照して
説明する。ｓ偏光の直線偏光のパルス励起光が励起側カ
バーガラス４２側から境界面に入射して全反射する際に
は、試料４０中に発生するエバネセント波はｓ偏光成分
のみである（図５（ａ））。しかし、ｐ偏光の直線偏光
のパルス励起光が励起側カバーガラス４２側から境界面
に入射して全反射する際には、試料４０中に発生するエ
バネセント波は、その電場ベクトルが入射面に平行な面
上にある楕円偏光となる（図５（ｂ））。したがって、
偏光性イメージングに際しては、励起光が受光光軸に垂
直な面内にのみ偏光成分をもつ直線偏光であることが望
ましいから、図５（ａ）に示すようにパルス励起光をｓ
偏光入射させる必要がある。
との境界面におけるパルス励起光の全反射に伴い発生す
るエバネセント波の偏光状態について、図５を参照して
説明する。ｓ偏光の直線偏光のパルス励起光が励起側カ
バーガラス４２側から境界面に入射して全反射する際に
は、試料４０中に発生するエバネセント波はｓ偏光成分
のみである（図５（ａ））。しかし、ｐ偏光の直線偏光
のパルス励起光が励起側カバーガラス４２側から境界面
に入射して全反射する際には、試料４０中に発生するエ
バネセント波は、その電場ベクトルが入射面に平行な面
上にある楕円偏光となる（図５（ｂ））。したがって、
偏光性イメージングに際しては、励起光が受光光軸に垂
直な面内にのみ偏光成分をもつ直線偏光であることが望
ましいから、図５（ａ）に示すようにパルス励起光をｓ
偏光入射させる必要がある。
【００３６】なお、図２および図３で、パルス励起光が
ステアリングミラー２３により反射されて境界面にｓ偏
光入射すると、これに伴い試料４０中に発生するエバネ
セント波は、偏光ビームスプリッタ５３に関してｓ偏光
となる。このようにして試料４０を励起することを、ｓ
偏光励起という。一方、パルス励起光がステアリングミ
ラー２４により反射されて境界面にｓ偏光入射すると、
これに伴い試料４０中に発生するエバネセント波は、偏
光ビームスプリッタ５３に関してｐ偏光となる。このよ
うにして試料４０を励起することを、ｐ偏光励起とい
う。
ステアリングミラー２３により反射されて境界面にｓ偏
光入射すると、これに伴い試料４０中に発生するエバネ
セント波は、偏光ビームスプリッタ５３に関してｓ偏光
となる。このようにして試料４０を励起することを、ｓ
偏光励起という。一方、パルス励起光がステアリングミ
ラー２４により反射されて境界面にｓ偏光入射すると、
これに伴い試料４０中に発生するエバネセント波は、偏
光ビームスプリッタ５３に関してｐ偏光となる。このよ
うにして試料４０を励起することを、ｐ偏光励起とい
う。
【００３７】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置の動作を説明するとともに、蛍光異方性比の２次
元画像を取得する方法について説明する。
グ装置の動作を説明するとともに、蛍光異方性比の２次
元画像を取得する方法について説明する。
【００３８】光路切替ミラー２０を装着して、直線偏光
のパルス励起光を、光路切替ミラー２０、ミラー２１お
よびステアリングミラー２３により順次反射させてプリ
ズム３０に入射させ、試料４０の境界面で全反射させ
て、試料４０をｓ偏光励起する。これにより試料４０の
境界面近傍で発生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成
分の画像を、ゲート機能付きイメージインテンシファイ
ア６０および６１それぞれにより、ゲートコントローラ
６２から出力されるゲート信号の指示のもとに時刻ｔか
ら一定時間Δｔに亘り撮像する。このようにして得られ
たｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、Ｉ
spおよびＩssそれぞれで表す。
のパルス励起光を、光路切替ミラー２０、ミラー２１お
よびステアリングミラー２３により順次反射させてプリ
ズム３０に入射させ、試料４０の境界面で全反射させ
て、試料４０をｓ偏光励起する。これにより試料４０の
境界面近傍で発生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成
分の画像を、ゲート機能付きイメージインテンシファイ
ア６０および６１それぞれにより、ゲートコントローラ
６２から出力されるゲート信号の指示のもとに時刻ｔか
ら一定時間Δｔに亘り撮像する。このようにして得られ
たｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、Ｉ
spおよびＩssそれぞれで表す。
【００３９】また、光路切替ミラー２０を取り外して、
直線偏光のパルス励起光を、ミラー２２およびステアリ
ングミラー２４により順次反射させてプリズム３０に入
射させ、試料４０の境界面で全反射させて、試料４０を
ｐ偏光励起する。これにより試料４０の境界面近傍で発
生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分の画像を、ゲ
ート機能付きイメージインテンシファイア６０および６
１それぞれにより、ゲートコントローラ６２から出力さ
れるゲート信号の指示のもとに時刻ｔから一定時間Δｔ
に亘り撮像する。このようにして得られたｐ偏光蛍光画
像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、ＩppおよびＩpsそ
れぞれで表す。
直線偏光のパルス励起光を、ミラー２２およびステアリ
ングミラー２４により順次反射させてプリズム３０に入
射させ、試料４０の境界面で全反射させて、試料４０を
ｐ偏光励起する。これにより試料４０の境界面近傍で発
生した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分の画像を、ゲ
ート機能付きイメージインテンシファイア６０および６
１それぞれにより、ゲートコントローラ６２から出力さ
れるゲート信号の指示のもとに時刻ｔから一定時間Δｔ
に亘り撮像する。このようにして得られたｐ偏光蛍光画
像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、ＩppおよびＩpsそ
れぞれで表す。
【００４０】画像演算部６３は、このようにして撮像さ
れた蛍光画像Ｉsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsを入力し、こ
れらに基づいて、ｓ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒs
を、 rs＝(Iss−Isp)／(Iss＋2Isp) …(1a) なる式で、また、ｐ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒp
を、 rp＝(Ipp−Ips)／(Ipp＋2Ips) …(1b) なる式で、それぞれ求める。この蛍光異方性比ｒsおよ
びｒpそれぞれは、試料４０上の位置変数および時間変
数ｔの関数であり、偏光性の２次元画像を表すものであ
る。
れた蛍光画像Ｉsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsを入力し、こ
れらに基づいて、ｓ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒs
を、 rs＝(Iss−Isp)／(Iss＋2Isp) …(1a) なる式で、また、ｐ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒp
を、 rp＝(Ipp−Ips)／(Ipp＋2Ips) …(1b) なる式で、それぞれ求める。この蛍光異方性比ｒsおよ
びｒpそれぞれは、試料４０上の位置変数および時間変
数ｔの関数であり、偏光性の２次元画像を表すものであ
る。
【００４１】しかし、実際には、受光光学系（対物レン
ズ５０からゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれの撮像面に到るまでの光学系）およ
びゲート機能付きイメージインテンシファイア６０，６
１は、蛍光の偏光方位に依って異なる応答を示す。すな
わち、試料４０で発生する真の蛍光画像をＩsp，Ｉss，
ＩppおよびＩpsで表し、また、受光光学系を経てゲート
機能付きイメージインテンシファイア６０，６１それぞ
れにより実際に撮像される蛍光画像をＩsp'，Ｉss'，Ｉ
pp'およびＩps'で表すと、 Isp'＝Tp・Isp …(2a) Iss'＝Ts・Iss …(2b) Ipp'＝Tp・Ipp …(2c) Ips'＝Ts・Ips …(2d) なる関係が成立する。
ズ５０からゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれの撮像面に到るまでの光学系）およ
びゲート機能付きイメージインテンシファイア６０，６
１は、蛍光の偏光方位に依って異なる応答を示す。すな
わち、試料４０で発生する真の蛍光画像をＩsp，Ｉss，
ＩppおよびＩpsで表し、また、受光光学系を経てゲート
機能付きイメージインテンシファイア６０，６１それぞ
れにより実際に撮像される蛍光画像をＩsp'，Ｉss'，Ｉ
pp'およびＩps'で表すと、 Isp'＝Tp・Isp …(2a) Iss'＝Ts・Iss …(2b) Ipp'＝Tp・Ipp …(2c) Ips'＝Ts・Ips …(2d) なる関係が成立する。
【００４２】ここで、Ｔp は、対物レンズ５０からゲー
ト機能付きイメージインテンシファイア６０の撮像面に
到るまでの受光光学系およびゲート機能付きイメージイ
ンテンシファイア６０のｐ偏光の蛍光に対する応答を表
し、また、Ｔs は、対物レンズ５０からゲート機能付き
イメージインテンシファイア６１の撮像面に到るまでの
受光光学系およびゲート機能付きイメージインテンシフ
ァイア６１のｓ偏光の蛍光に対する応答を表す。
ト機能付きイメージインテンシファイア６０の撮像面に
到るまでの受光光学系およびゲート機能付きイメージイ
ンテンシファイア６０のｐ偏光の蛍光に対する応答を表
し、また、Ｔs は、対物レンズ５０からゲート機能付き
イメージインテンシファイア６１の撮像面に到るまでの
受光光学系およびゲート機能付きイメージインテンシフ
ァイア６１のｓ偏光の蛍光に対する応答を表す。
【００４３】したがって、蛍光異方性比ｒsおよびｒpそ
れぞれは、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれにより実際に撮像された蛍光画像Ｉ
sp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'で表すと、 rs＝(G・Iss'−Isp')／(G・Iss'＋2Isp') …(3a) rp＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋2G・Ips') …(3b) で表される。ここで、Ｇは、 G＝Tp／Ts …(4) で定義される偏光応答補正因子である。すなわち、画像
演算部６３は、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６０および６１それぞれにより実際に撮像された蛍
光画像に基づいて、 (4)式で定義される偏光応答補正因
子Ｇを用い、(3a)式および(3b)式により蛍光異方性比ｒ
sおよびｒpの偏光応答補正を行うことで、真の偏光性の
２次元画像を求めることができる。
れぞれは、ゲート機能付きイメージインテンシファイア
６０，６１それぞれにより実際に撮像された蛍光画像Ｉ
sp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'で表すと、 rs＝(G・Iss'−Isp')／(G・Iss'＋2Isp') …(3a) rp＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋2G・Ips') …(3b) で表される。ここで、Ｇは、 G＝Tp／Ts …(4) で定義される偏光応答補正因子である。すなわち、画像
演算部６３は、ゲート機能付きイメージインテンシファ
イア６０および６１それぞれにより実際に撮像された蛍
光画像に基づいて、 (4)式で定義される偏光応答補正因
子Ｇを用い、(3a)式および(3b)式により蛍光異方性比ｒ
sおよびｒpの偏光応答補正を行うことで、真の偏光性の
２次元画像を求めることができる。
【００４４】次に、本実施形態に係る偏光性イメージン
グ装置における偏光応答補正因子Ｇの算出方法を説明す
る。最も好適には、この偏光応答補正因子Ｇの算出に際
して、本来の偏光性イメージングを測定しようとする試
料に標識される蛍光プローブと同一の蛍光プローブの溶
液を標準試料として用意し、これを試料４０として用い
る。
グ装置における偏光応答補正因子Ｇの算出方法を説明す
る。最も好適には、この偏光応答補正因子Ｇの算出に際
して、本来の偏光性イメージングを測定しようとする試
料に標識される蛍光プローブと同一の蛍光プローブの溶
液を標準試料として用意し、これを試料４０として用い
る。
【００４５】このような標準試料を用いれば、本来の蛍
光標識された試料から発生する蛍光と同一スペクトルの
蛍光が発生することに加え、さらに、蛍光プローブがフ
リーな状態で存在するために蛍光の偏光性が速く解消す
るので、図６に示すようにゲート機能付きイメージイン
テンシファイア６０および６１それぞれにおいてゲート
を開く時間を十分に長くすることができ、したがって、
精度のよい偏光応答補正因子Ｇを求めることができるの
で好適である。
光標識された試料から発生する蛍光と同一スペクトルの
蛍光が発生することに加え、さらに、蛍光プローブがフ
リーな状態で存在するために蛍光の偏光性が速く解消す
るので、図６に示すようにゲート機能付きイメージイン
テンシファイア６０および６１それぞれにおいてゲート
を開く時間を十分に長くすることができ、したがって、
精度のよい偏光応答補正因子Ｇを求めることができるの
で好適である。
【００４６】また、光路切替ミラー２０を取り外して、
パルス励起光をミラー２２およびステアリングミラー２
４を経てプリズム３０に入射させ、試料４０の境界面で
パルス励起光を全反射させて、試料４０をｐ偏光励起す
る。ゲートコントローラ６２は、試料４０から発生した
蛍光の偏光性が十分に解消された時刻ｔから始まるゲー
ト時間Δｔを示すゲート信号を出力する（図６）。
パルス励起光をミラー２２およびステアリングミラー２
４を経てプリズム３０に入射させ、試料４０の境界面で
パルス励起光を全反射させて、試料４０をｐ偏光励起す
る。ゲートコントローラ６２は、試料４０から発生した
蛍光の偏光性が十分に解消された時刻ｔから始まるゲー
ト時間Δｔを示すゲート信号を出力する（図６）。
【００４７】このとき、試料４０は等方的であるので、
時刻ｔから時間Δｔの間に試料４０から発生する真の蛍
光のｐ偏光成分Ｉppおよびｓ偏光成分Ｉpsそれぞれは互
いに等しく、 Ipp＝Ips …(5) なる関係が成立する。したがって、偏光応答補正因子Ｇ
は、 G＝Ipp'／Ips' …(6) なる式で得られ、また、真の蛍光異方性比ｒsおよびｒp
すなわち真の偏光性の２次元画像は、この (6)式で表さ
れる偏光応答補正因子Ｇを(3a)式または(3b)式に代入し
て得られる。このようにして、偏光性の２次元画像を高
精度に検出することができ、蛍光プローブが結合したタ
ーゲットを高精度に検出することができる。
時刻ｔから時間Δｔの間に試料４０から発生する真の蛍
光のｐ偏光成分Ｉppおよびｓ偏光成分Ｉpsそれぞれは互
いに等しく、 Ipp＝Ips …(5) なる関係が成立する。したがって、偏光応答補正因子Ｇ
は、 G＝Ipp'／Ips' …(6) なる式で得られ、また、真の蛍光異方性比ｒsおよびｒp
すなわち真の偏光性の２次元画像は、この (6)式で表さ
れる偏光応答補正因子Ｇを(3a)式または(3b)式に代入し
て得られる。このようにして、偏光性の２次元画像を高
精度に検出することができ、蛍光プローブが結合したタ
ーゲットを高精度に検出することができる。
【００４８】以上のように、偏光応答補正因子Ｇの算出
に際して標準試料を用いる場合、照射光学系は、パルス
励起光をプリズム３０に対して１方向のみから入射させ
るだけでよく、光路切替ミラー２０、ミラー２１および
ステアリングミラー２３は不要である。
に際して標準試料を用いる場合、照射光学系は、パルス
励起光をプリズム３０に対して１方向のみから入射させ
るだけでよく、光路切替ミラー２０、ミラー２１および
ステアリングミラー２３は不要である。
【００４９】しかし、このような蛍光の偏光性が速く解
消し且つ等方的な理想的な標準試料ではなく、一般の試
料（測定対象である試料）を用いてより高精度に偏光応
答補正因子Ｇを求める場合には、上記の求め方は採用で
きない。このような場合には、以下のようにして偏光応
答補正因子Ｇを求める。以下では、偏光応答補正因子Ｇ
の求め方を、試料４０中の蛍光プローブの分子軸が配向
しておらず全くランダムに分布している場合と、試料４
０中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場
合とに分けて説明する。
消し且つ等方的な理想的な標準試料ではなく、一般の試
料（測定対象である試料）を用いてより高精度に偏光応
答補正因子Ｇを求める場合には、上記の求め方は採用で
きない。このような場合には、以下のようにして偏光応
答補正因子Ｇを求める。以下では、偏光応答補正因子Ｇ
の求め方を、試料４０中の蛍光プローブの分子軸が配向
しておらず全くランダムに分布している場合と、試料４
０中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場
合とに分けて説明する。
【００５０】試料４０中の蛍光プローブの分子軸が配向
しておらず全くランダムに分布している場合における偏
光応答補正因子Ｇは以下のようにして求める。この場合
には、試料４０が等方的であるので、ｐ偏光励起により
発生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比
は、ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssと
ｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく、 Ips／Ipp＝Isp／Iss …(7) となる。そして、この (7)式および(2a)式乃至(2d)式か
ら、偏光応答補正因子Ｇを表す式として、 G＝[(Ipp'・Isp')／(Ips'・Iss')]1/2 …(8) が得られる。
しておらず全くランダムに分布している場合における偏
光応答補正因子Ｇは以下のようにして求める。この場合
には、試料４０が等方的であるので、ｐ偏光励起により
発生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比
は、ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssと
ｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく、 Ips／Ipp＝Isp／Iss …(7) となる。そして、この (7)式および(2a)式乃至(2d)式か
ら、偏光応答補正因子Ｇを表す式として、 G＝[(Ipp'・Isp')／(Ips'・Iss')]1/2 …(8) が得られる。
【００５１】また、試料４０中の蛍光プローブの分子軸
が配向して分布している場合における偏光応答補正因子
Ｇは以下のようにして求める。なお、細胞膜等、実際の
測定対象はこのような系に近い場合が多い。この場合に
は、ｐ偏光励起時における試料４０の方位とｓ偏光励起
時における試料４０の方位とを、回転ステージ３１を回
転させることにより、９０度異なるものとする。このよ
うにすれば、試料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起
により試料４０中に発生するエバネセント波と、回転ス
テージ３１により試料４０を９０度回転した後にｓ偏光
励起により試料４０中に発生するエバネセント波とは、
試料４０中では同一の偏光方位となる。したがって、試
料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起により発生する
蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比は、試料
４０を９０度回転した後にｓ偏光励起により発生する蛍
光のｓ偏光成分Ｉssとｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく
なり、結局、 (7)式と同様の関係式が成り立ち、偏光応
答補正因子Ｇは (8)式で表される。
が配向して分布している場合における偏光応答補正因子
Ｇは以下のようにして求める。なお、細胞膜等、実際の
測定対象はこのような系に近い場合が多い。この場合に
は、ｐ偏光励起時における試料４０の方位とｓ偏光励起
時における試料４０の方位とを、回転ステージ３１を回
転させることにより、９０度異なるものとする。このよ
うにすれば、試料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起
により試料４０中に発生するエバネセント波と、回転ス
テージ３１により試料４０を９０度回転した後にｓ偏光
励起により試料４０中に発生するエバネセント波とは、
試料４０中では同一の偏光方位となる。したがって、試
料４０が或方位にあるときにｐ偏光励起により発生する
蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比は、試料
４０を９０度回転した後にｓ偏光励起により発生する蛍
光のｓ偏光成分Ｉssとｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく
なり、結局、 (7)式と同様の関係式が成り立ち、偏光応
答補正因子Ｇは (8)式で表される。
【００５２】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態では、試料４０に照射する励起光はパルス励起光とし
たが、これに限られるものではなく、励起光は定常光
（ＣＷ光）であってもよい。この場合には、その定常光
である励起光をｓ偏光入射させて境界面で全反射させ
て、蛍光をも定常的に発生させる。そして、その蛍光の
偏光方位に応じて２分岐し、ｐ偏光成分およびｓ偏光成
分それぞれの画像を撮像する。このようにして得られた
ｐ偏光成分とｓ偏光成分との比は、偏光解消の度合いに
応じたものとなり、したがって、蛍光プローブが結合さ
れたターゲットを検出することができる。なお、この場
合には、ゲートコントローラは不要であり、撮像手段は
ゲート機能付きである必要はない。
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態では、試料４０に照射する励起光はパルス励起光とし
たが、これに限られるものではなく、励起光は定常光
（ＣＷ光）であってもよい。この場合には、その定常光
である励起光をｓ偏光入射させて境界面で全反射させ
て、蛍光をも定常的に発生させる。そして、その蛍光の
偏光方位に応じて２分岐し、ｐ偏光成分およびｓ偏光成
分それぞれの画像を撮像する。このようにして得られた
ｐ偏光成分とｓ偏光成分との比は、偏光解消の度合いに
応じたものとなり、したがって、蛍光プローブが結合さ
れたターゲットを検出することができる。なお、この場
合には、ゲートコントローラは不要であり、撮像手段は
ゲート機能付きである必要はない。
【００５３】また、上記実施形態では、偏光性を示す指
標として蛍光異方性比ｒを用いたが、これに限られるも
のではない。例えば、 p＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋G・Ips') …(9) で定義される偏光度ｐ、あるいは、 q＝(Ipp'／Ips')−G …(10) で定義される偏光度合いｑを用いて、これを偏光性すな
わち偏光解消の度合いを示す指標としてもよい。
標として蛍光異方性比ｒを用いたが、これに限られるも
のではない。例えば、 p＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋G・Ips') …(9) で定義される偏光度ｐ、あるいは、 q＝(Ipp'／Ips')−G …(10) で定義される偏光度合いｑを用いて、これを偏光性すな
わち偏光解消の度合いを示す指標としてもよい。
【００５４】また、上記実施形態は、試料４０に励起光
をエバネセント照射して発生する蛍光の偏光性の２次元
画像を得るものであったが、蛍光検出に限られるもので
はなく、ラマン散乱光の偏光性の２次元画像の獲得にも
適用可能である。この場合にも同様の構成であり同様の
作用である。ただし、その性質上、上述した標準試料を
用いた偏光応答補正因子Ｇの獲得方法は採用できない。
をエバネセント照射して発生する蛍光の偏光性の２次元
画像を得るものであったが、蛍光検出に限られるもので
はなく、ラマン散乱光の偏光性の２次元画像の獲得にも
適用可能である。この場合にも同様の構成であり同様の
作用である。ただし、その性質上、上述した標準試料を
用いた偏光応答補正因子Ｇの獲得方法は採用できない。
【００５５】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、光源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光
およびパルス光の何れでもよい）は、照射光学系によ
り、試料に接して配される透明部材の側から透明部材と
試料との境界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射さ
れ、その境界面で全反射され、これに伴い、試料はエバ
ネセント照射される。エバネセント照射された試料から
発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱光）は、その境界
面に垂直な入射光軸を有する受光光学系に入力し、第１
の入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交する
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐されて、
互いに異なる第１および第２の結像面それぞれに結像さ
れる。その結像された被測定光の第１および第２の偏光
方位それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像
手段それぞれにより撮像され、被測定光の偏光性の２次
元画像は、画像演算手段により、その画像に基づいて求
められる。
れば、光源部から出射された直線偏光の照射光（ＣＷ光
およびパルス光の何れでもよい）は、照射光学系によ
り、試料に接して配される透明部材の側から透明部材と
試料との境界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射さ
れ、その境界面で全反射され、これに伴い、試料はエバ
ネセント照射される。エバネセント照射された試料から
発生した被測定光（蛍光、ラマン散乱光）は、その境界
面に垂直な入射光軸を有する受光光学系に入力し、第１
の入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交する
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐されて、
互いに異なる第１および第２の結像面それぞれに結像さ
れる。その結像された被測定光の第１および第２の偏光
方位それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像
手段それぞれにより撮像され、被測定光の偏光性の２次
元画像は、画像演算手段により、その画像に基づいて求
められる。
【００５６】このような構成としたので、照射光が照射
された試料の特定領域のみから発生する被測定光の偏光
性の２次元画像を検出することができるので、空間分解
能が優れ、また、その特定領域以外の領域から発生する
被測定光が無い或いは微弱であるので、試料中の目的と
するターゲットの位置をＳ／Ｂ比よく特定することがで
きる。また、照射光は境界面で全反射するので直接には
受光光学系に入力せず、受光光学系で自家蛍光が発生し
ないので、この点でもＳ／Ｂ比が優れる。したがって、
試料中のターゲットの挙動等を高分解能かつ高精度に解
析することができるので、例えば細胞における諸機能の
解明に貢献し得るものである。
された試料の特定領域のみから発生する被測定光の偏光
性の２次元画像を検出することができるので、空間分解
能が優れ、また、その特定領域以外の領域から発生する
被測定光が無い或いは微弱であるので、試料中の目的と
するターゲットの位置をＳ／Ｂ比よく特定することがで
きる。また、照射光は境界面で全反射するので直接には
受光光学系に入力せず、受光光学系で自家蛍光が発生し
ないので、この点でもＳ／Ｂ比が優れる。したがって、
試料中のターゲットの挙動等を高分解能かつ高精度に解
析することができるので、例えば細胞における諸機能の
解明に貢献し得るものである。
【００５７】また、特に、照射光としてパルス光を出射
するとともに、第１および第２の撮像手段それぞれの撮
像タイミングをパルス光出射タイミングに同期して制御
する場合には、被測定光の偏光性の検出感度が高い。す
なわち、蛍光の偏光性イメージングの場合には、散乱光
および自家蛍光を除去できるので、偏光画像のコントラ
ストが向上する。一方、ラマン散乱光の偏光性イメージ
ングの場合には、ノイズとなる蛍光成分を除去できるの
で、偏光画像のコントラストが向上するだけでなく、ま
た、短寿命の過渡的状態のラマン偏光性イメージングを
得ることができる。
するとともに、第１および第２の撮像手段それぞれの撮
像タイミングをパルス光出射タイミングに同期して制御
する場合には、被測定光の偏光性の検出感度が高い。す
なわち、蛍光の偏光性イメージングの場合には、散乱光
および自家蛍光を除去できるので、偏光画像のコントラ
ストが向上する。一方、ラマン散乱光の偏光性イメージ
ングの場合には、ノイズとなる蛍光成分を除去できるの
で、偏光画像のコントラストが向上するだけでなく、ま
た、短寿命の過渡的状態のラマン偏光性イメージングを
得ることができる。
【００５８】また、被測定試料とは別に速やかに偏光解
消する等方的な標準試料について、照射光が第１の入射
面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１およ
び第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて偏
光応答補正因子を算出し、被測定試料からの被測定光の
偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光
応答補正して求める場合には、更に精度が良い偏光性イ
メージングが可能となる。
消する等方的な標準試料について、照射光が第１の入射
面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１およ
び第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて偏
光応答補正因子を算出し、被測定試料からの被測定光の
偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏光
応答補正して求める場合には、更に精度が良い偏光性イ
メージングが可能となる。
【００５９】また、照射光学系が第１の入射面に直交す
る第２の入射面を更に有し、第１および第２の入射面の
うちの選択された一方の面に沿って照射光をｓ偏光入射
させる場合には、第１および第２の入射面それぞれに沿
ってｓ偏光入射した照射光によりエバネセント照射され
た試料から発生した被測定光の偏光性の２次元画像が得
られるので、非等方的な試料の測定に好適である。
る第２の入射面を更に有し、第１および第２の入射面の
うちの選択された一方の面に沿って照射光をｓ偏光入射
させる場合には、第１および第２の入射面それぞれに沿
ってｓ偏光入射した照射光によりエバネセント照射され
た試料から発生した被測定光の偏光性の２次元画像が得
られるので、非等方的な試料の測定に好適である。
【００６０】また、被測定試料に対して照射光が第１の
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
照射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する
被測定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出し、被測定光
の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏
光応答補正して求める場合には、等方的な試料について
更に精度の良い偏光性イメージングが可能となる。
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
照射光が第２の入射面に沿って入射したときに発生する
被測定光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出し、被測定光
の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子に基づいて偏
光応答補正して求める場合には、等方的な試料について
更に精度の良い偏光性イメージングが可能となる。
【００６１】また、被測定試料に対して照射光が第１の
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
回転手段により境界面に平行な面上で試料が９０度回転
された後に照射光が第２の入射面に沿って入射したとき
に発生する被測定光の第１および第２の偏光方位それぞ
れの直線偏光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出
し、被測定光の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子
に基づいて偏光応答補正して求める場合には、非等方的
な試料についても更に精度の良い偏光性イメージングが
可能となる。
入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分ならびに
回転手段により境界面に平行な面上で試料が９０度回転
された後に照射光が第２の入射面に沿って入射したとき
に発生する被測定光の第１および第２の偏光方位それぞ
れの直線偏光成分に基づいて偏光応答補正因子を算出
し、被測定光の偏光性の２次元画像を偏光応答補正因子
に基づいて偏光応答補正して求める場合には、非等方的
な試料についても更に精度の良い偏光性イメージングが
可能となる。
【図１】フリーな蛍光プローブおよびターゲットに結合
した蛍光プローブそれぞれの偏光解消の説明図である。
した蛍光プローブそれぞれの偏光解消の説明図である。
【図２】本実施形態に係る偏光性イメージング装置の全
体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面に平行な方向）から見た構成図である。
体を側方（励起側カバーガラス４２と試料４０との境界
面に平行な方向）から見た構成図である。
【図３】本実施形態に係る偏光性イメージング装置のう
ちの光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラ
ス４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構
成図である。
ちの光源部および照射光学系を上方（励起側カバーガラ
ス４２と試料４０との境界面に垂直な方向）から見た構
成図である。
【図４】本実施形態に係る偏光性イメージング装置にお
けるプリズム３０、回転ステージ３１および対物レンズ
５０等の断面図である。
けるプリズム３０、回転ステージ３１および対物レンズ
５０等の断面図である。
【図５】励起側カバーガラス４２と試料４０との境界面
におけるパルス励起光の全反射に伴い発生するエバネセ
ント波の偏光状態の説明図である。
におけるパルス励起光の全反射に伴い発生するエバネセ
ント波の偏光状態の説明図である。
【図６】偏光応答補正因子Ｇの算出方法の説明図であ
る。
る。
【図７】分光光度計タイプの蛍光の偏光性測定装置の構
成図である。
成図である。
【図８】落射照明方式による顕微鏡下での蛍光またはラ
マン散乱光の偏光性測定装置の構成図である。
マン散乱光の偏光性測定装置の構成図である。
１０…パルスレーザ光源、１１…偏光子、１２…１／２
波長板、２０…光路切替ミラー、２１，２２…ミラー、
２３，２４…ステアリングミラー、３０…プリズム、３
１…回転ステージ、４０…試料、４１…オイル、４２…
励起側カバーガラス、４３…受光側カバーガラス、４４
…スペーサ、５０…対物レンズ、５１…励起光カットフ
ィルタ、５２…バンドパスフィルタ、５３…偏光ビーム
スプリッタ、５４，５５…結像レンズ、６０，６１…ゲ
ート機能付イメージインテンシファイア、６２…ゲート
コントローラ、６３…画像演算部。
波長板、２０…光路切替ミラー、２１，２２…ミラー、
２３，２４…ステアリングミラー、３０…プリズム、３
１…回転ステージ、４０…試料、４１…オイル、４２…
励起側カバーガラス、４３…受光側カバーガラス、４４
…スペーサ、５０…対物レンズ、５１…励起光カットフ
ィルタ、５２…バンドパスフィルタ、５３…偏光ビーム
スプリッタ、５４，５５…結像レンズ、６０，６１…ゲ
ート機能付イメージインテンシファイア、６２…ゲート
コントローラ、６３…画像演算部。
Claims (6)
- 【請求項１】 直線偏光の照射光を出力する光源部と、 試料に接して配される透明部材と、 前記照射光を前記透明部材の側から前記透明部材と前記
試料との境界面へ第１の入射面に沿ってｓ偏光入射させ
て前記境界面で全反射させ、前記試料をエバネセント照
射する照射光学系と、 前記境界面に垂直な入射光軸を有し、エバネセント照射
された前記試料から発生した被測定光を入力し、前記第
１の入射面と平行な第１の偏光方位およびこれに直交す
る第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐して、
互いに異なる第１および第２の結像面それぞれに結像す
る受光光学系と、 前記第１の結像面に結像された前記被測定光の前記第１
の偏光方位の直線偏光成分を撮像する第１の撮像手段
と、 前記第２の結像面に結像された前記被測定光の前記第２
の偏光方位の直線偏光成分を撮像する第２の撮像手段
と、 前記第１および前記第２の撮像手段それぞれにより撮像
された前記被測定光の前記第１および前記第２の偏光方
位それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、前記被測
定光の偏光性の２次元画像を求める画像演算手段と、 を備えることを特徴とする偏光性イメージング装置。 - 【請求項２】 前記光源部は、前記照射光としてパルス
光を出射するとともに、 前記パルス光の出射タイミングに同期して前記第１およ
び前記第２の撮像手段それぞれの撮像タイミングを制御
する制御手段を更に備える、 ことを特徴とする請求項１記載の偏光性イメージング装
置。 - 【請求項３】 前記照射光が前記第１の入射面に沿って
入射したときに発生する被測定光の前記第１および前記
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏
光応答補正因子を算出する偏光応答補正因子獲得手段を
更に備え、 前記画像演算手段は、前記被測定光の偏光性の２次元画
像を前記偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正して
求める、 ことを特徴とする請求項１記載の偏光性イメージング装
置。 - 【請求項４】 前記照射光学系は、前記第１の入射面に
直交する第２の入射面を更に有し、前記第１および前記
第２の入射面のうちの選択された一方の面に沿って前記
照射光をｓ偏光入射させる、ことを特徴とする請求項１
記載の偏光性イメージング装置。 - 【請求項５】 前記照射光が前記第１の入射面に沿って
入射したときに発生する被測定光の前記第１および前記
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分、ならびに、前
記照射光が前記第２の入射面に沿って入射したときに発
生する被測定光の前記第１および前記第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分に基づいて、偏光応答補正因子を
算出する偏光応答補正因子獲得手段を更に備え、 前記画像演算手段は、前記被測定光の偏光性の２次元画
像を前記偏光応答補正因子に基づいて偏光応答補正して
求める、 ことを特徴とする請求項４記載の偏光性イメージング装
置。 - 【請求項６】 前記試料を前記境界面に平行な面上で回
転させる回転手段を更に備え、 前記偏光応答補正因子獲得手段は、前記照射光が前記第
１の入射面に沿って入射したときに発生する被測定光の
前記第１および前記第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分、ならびに、前記回転手段により前記試料が９０度
回転された後に前記照射光が前記第２の入射面に沿って
入射したときに発生する被測定光の前記第１および前記
第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に基づいて、偏
光応答補正因子を算出する、 ことを特徴とする請求項５記載の偏光性イメージング装
置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9110697A JP3365474B2 (ja) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | 偏光性イメージング装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9110697A JP3365474B2 (ja) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | 偏光性イメージング装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10281876A true JPH10281876A (ja) | 1998-10-23 |
| JP3365474B2 JP3365474B2 (ja) | 2003-01-14 |
Family
ID=14017284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9110697A Expired - Lifetime JP3365474B2 (ja) | 1997-04-09 | 1997-04-09 | 偏光性イメージング装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3365474B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002047012A2 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Consellation Trid Inc. | Method for polarization data recording/retrieval on luminescent optical data carriers |
| WO2004055503A1 (fr) * | 2002-12-16 | 2004-07-01 | Shifa Wu | Procede et cellule a echantillon ameliores, a diffusion raman et a champ proche |
| JP2005315680A (ja) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Hitachi Chem Co Ltd | 分光装置及び全反射ラマン分光装置 |
| JP2010525313A (ja) * | 2007-04-18 | 2010-07-22 | ザ サイエンス アンド テクノロジー ファシリティーズ カウンシル | 蛍光測定 |
| CN102297854A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-12-28 | 公安部第一研究所 | 高效多模态激光诱导荧光光路激发系统 |
| JP2015197493A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-09 | 学校法人 学習院 | 顕微鏡観察方法及び装置 |
| CN109313119A (zh) * | 2016-06-20 | 2019-02-05 | 普莱尔股份公司 | 用于检测和/或表征流体携带的颗粒的装置和方法 |
| CN110441235A (zh) * | 2019-09-13 | 2019-11-12 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种多模耦合原位显微光谱成像系统 |
| US10987779B2 (en) | 2017-06-28 | 2021-04-27 | Mitsubishi Steel Mfg. Co., Ltd. | Hollow spring and manufacturing method thereof |
-
1997
- 1997-04-09 JP JP9110697A patent/JP3365474B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002047012A2 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Consellation Trid Inc. | Method for polarization data recording/retrieval on luminescent optical data carriers |
| WO2002047012A3 (en) * | 2000-12-07 | 2002-10-10 | Consellation Trid Inc | Method for polarization data recording/retrieval on luminescent optical data carriers |
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| CN100386620C (zh) * | 2002-12-16 | 2008-05-07 | 吴世法 | 激励和接收均用隐失光的拉曼散射近场增强方法 |
| JP2005315680A (ja) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Hitachi Chem Co Ltd | 分光装置及び全反射ラマン分光装置 |
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| JP2015197493A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-09 | 学校法人 学習院 | 顕微鏡観察方法及び装置 |
| CN109313119A (zh) * | 2016-06-20 | 2019-02-05 | 普莱尔股份公司 | 用于检测和/或表征流体携带的颗粒的装置和方法 |
| CN109313119B (zh) * | 2016-06-20 | 2021-11-02 | 普莱尔股份公司 | 用于检测和/或表征流体携带的颗粒的装置和方法 |
| US10987779B2 (en) | 2017-06-28 | 2021-04-27 | Mitsubishi Steel Mfg. Co., Ltd. | Hollow spring and manufacturing method thereof |
| CN110441235A (zh) * | 2019-09-13 | 2019-11-12 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种多模耦合原位显微光谱成像系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3365474B2 (ja) | 2003-01-14 |
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