JP2975991B2 - 偏光性測定方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、試料に光が照射されたことにより発生す
る蛍光やラマン散乱光の偏光性を測定する偏光性測定装
置および方法に関するものである。

背景技術 試料に光を照射すると、その光と同一波長の光が反射
光や散乱光として生じるが、その他にも、その照射光の
波長とは異なる波長の光（例えば、蛍光、ラマン散乱
光）も発生する場合がある。この蛍光やラマン散乱光の
強度を測定することにより、その試料に関する有益な情
報が得られるが、これらの偏光性を測定することによっ
ても、試料に関する有益な情報が得られる。

例えば、蛍光プローブを含む試料に励起光を照射し、
その試料から発生する蛍光の偏光解消を測定することに
より、ターゲットに結合した蛍光プローブが存在するか
否かを知ることができる。すなわち、蛍光プローブを含
む試料に直線偏光のパルス励起光が照射されると、その
蛍光プローブから蛍光が発生する。その蛍光の偏光状態
は、励起光照射当初は略直線偏光であるが、蛍光プロー
ブがブラウン運動により不規則な回転を行うと、励起さ
れた蛍光プローブの分子軸が乱れ、そのために、時間の
経過とともに蛍光の偏光性は解消され、遂には非偏光状
態となる。この偏光解消の速度は、蛍光プローブがター
ゲットに結合している場合と、フリーな場合とでは異な
るので、その偏光解消の速度の差異を利用して、ターゲ
ットに結合した蛍光プローブの存否を知ることができ
る。

したがって、顕微鏡下で、この蛍光の偏光解消の度合
いの２次元像を測定することができれば、ターゲットに
結合した蛍光プローブが存在する位置を特定することが
でき、また、試料中のターゲットの挙動等を解析するこ
とができるので、例えば、細胞における諸機能の解明に
貢献し得るものとして期待されている。同様に、顕微鏡
下でラマン散乱光の偏光性の２次元像を測定することに
よっても、試料に関する有益な情報が得られるものと期
待されている。

ところで、蛍光の偏光状態の２次元像を観察する技術
が、D.Axelrod,"Carbocyanine Dye Orientation in Red
Cell Membrane studied by Microscopic Fluorescence
Polarization",Biophys.J.,Vol.26,pp.557−574（197
9）およびK.Suzuki,et al,"Spatiotemporal Relationsh
ips Among Early Events of Fertilization in Sea Urc
hin Eggs Revealed by Multiview Microscopy",Biophy
s.J.,Vol.68,pp.739−748（1995）に記載されている。

Ｄ・Axelrodの論文に記載されている技術は、顕微鏡
下で定常光（直線偏光の励起光）照射により発生した蛍
光の偏光状態を測定することにより、生体膜に導入され
た蛍光色素の配向および運動性を調べるものである。こ
こで用いられている光検出器は光電子増倍管であり、蛍
光像面上の絞りを走査することにより２次元的な蛍光偏
光像を得ている。このような蛍光の偏光を測定するに際
して問題となるのが、異なる偏光方位に対して偏光素子
以外の光学系および光検出器が異なった応答を示すこと
により生じる測定誤差である。この論文に記載の技術で
は、全くの非偏光の光を受光光学系（試料から光検出器
までの光学系）および光検出器に通すことにより、その
測定誤差を補正（偏光応答補正）している。

K.Suzukiの論文に記載されている技術は、試料から発
生した蛍光を偏光ビームスプリッタにより互いに直交す
る直線偏光成分それぞれに分岐し、その２分岐された蛍
光の像それぞれを単一のカメラにより撮像することによ
り、試料の定常的な分子配向を解析するものである。こ
の論文に記載の技術では、均質な試料を非偏光の励起光
で励起し、その試料から発生する蛍光が全く無偏光であ
ることを利用して偏光応答補正を行っている。

しかしながら、D.Axelrodの論文やK.Suzukiの論文に
記載されている技術では、非偏光の光を用いて偏光応答
補正を行っているが、この非偏光の光は本来観察すべき
蛍光とは異なるため補正精度は低く、したがって、偏光
性の測定精度も低い。また、理想的な非偏光の光を作成
するのは容易ではない。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたもので
あり、第１の光束（励起光、照射光）が照射された試料
から発生する第２の光束（蛍光、ラマン散乱光）の偏光
性を精度良く測定することができる偏光性測定方法およ
び装置を提供することを目的とする。

発明の開示 本発明に係る偏光性測定方法は、試料に照射する第１
の光束および試料から発生する第２の光束のうち何れか
一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、第
１の光束を光束分岐手段を経て試料に照射し、該照射に
より試料から発生し光束分岐手段を経た第２の光束の偏
光性を測定する偏光性測定方法であって、（１）第１の
光束を光束分岐手段に対してｐ偏光として試料に照射し
たときに発生する第２の光束のｐ偏光成分の強度I_ppお
よびｓ偏光成分の強度I_psを測定する第１のステップ
と、（２）第１の光束を光束分岐手段に対してｓ偏光と
して試料に照射したときに発生する第２の光束のｐ偏光
成分の強度I_spおよびｓ偏光成分の強度I_ssを測定する第
２のステップと、（３）偏光応答補正因子Ｇを Ｇ＝［（I_pp・I_sp）／（I_ps・I_ss）］^1/2 なる式により求める第３のステップと、（４）偏光応答
補正因子Ｇに基づいて偏光応答補正を行って第２の光束
の偏光性を求める第４のステップと、を備える。

この偏光性測定方法によれば、第１のステップで、第
１の光束は光束分岐手段に対してｐ偏光として試料に照
射され、これに伴い発生した第２の光束のｐ偏光成分の
強度I_ppおよびｓ偏光成分の強度I_psが測定され、また、
第２のステップで、第１の光束は光束分岐手段に対して
ｓ偏光として試料に照射され、これに伴い発生した第２
の光束のｐ偏光成分の強度I_spおよびｓ偏光成分の強度I
_ssが測定される。そして、第３のステップで、偏光応答
補正因子Ｇが上記の式で求められ、第４のステップで、
この偏光応答補正因子Ｇに基づいて偏光応答補正がなさ
れ、第２の光束の偏光性が求められる。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第２のステッ
プで、第１のステップの測定時と同じ配置の試料に対し
て第１の光束を照射する。この場合には、試料中に第２
の光束を発生する物質がランダムに配向している系にお
いて第２の光束の偏光性が測定される。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第１のステッ
プで、所定方向を中心軸とする所定回転角度位置にある
試料に対して第１の光束を照射し、第２のステップで、
中心軸について所定回転角度位置とは90度異なる回転角
度位置にある試料に対して第１の光束を照射する。この
場合には、試料中に第２の光束を発生する物質が一定方
向に配向している系において第２の光束の偏光性が測定
される。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第４のステッ
プで第２の光束の偏光性を P₁（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋Ｇ・I_ps） または、 P₁（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋I_sp） なる式により求めてもよいし、 P₂（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋２・Ｇ・I_ps） または、 P₂（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋２・I_sp） なる式により求めてもよいし、 P₃（ｐ）＝１−Ｇ・（I_ps/I_pp） または、 P₃（ｓ）＝Ｇ−（I_sp/I_ss） なる式により求めてもよいし、 P₄（ｐ）＝（I_pp/I_ps）−Ｇ または、 P₄（ｓ）＝Ｇ・（I_ss/I_sp）−１ なる式により求めてもよい。何れも、第２の光束の偏光
性を表すのに好適なパラメータである。特に、P₃および
P₄は、少ない演算量で求めることができる。

また、本発明に係る偏光性測定方法は、第１の光束
が、試料により多光子吸収され得る波長の光束であり、
第２の光束が、その多光子吸収に伴い発生する光束であ
る。この場合には、第２の光束の偏光性は、高感度かつ
S/N比良く測定される。

本発明に係る偏光性測定装置は、試料に照射する第１
の光束および試料から発生する第２の光束のうち何れか
一方を反射し他方を透過する光束分岐手段を用いて、第
１の光束を光束分岐手段を経て試料に照射し、該照射に
より試料から発生し光束分岐手段を経た第２の光束の偏
光性を測定する偏光性測定装置であって、（１）試料に
照射する直線偏光の第１の光束を出力する光源部と、
（２）光源部から出力された第１の光束の偏光方位を回
転させる偏光方位回転手段と、（３）第１の光束が試料
に照射されて発生した光束のうち光束分岐手段を経た第
２の光束のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強度
を検出する検出手段と、（４）偏光方位回転手段により
光束分岐手段に対してｐ偏光とされた第１の光束が試料
に照射されたときに検出手段により検出された第２の光
束のｐ偏光成分の強度I_ppおよびｓ偏光成分の強度I_ps、
並びに、偏光方位回転手段により光束分岐手段に対して
ｓ偏光とされた第１の光束が試料に照射されたときに検
出手段により検出された第２の光束のｐ偏光成分の強度
I_spおよびｓ偏光成分の強度I_ssに基づいて、 Ｇ＝［（I_pp・I_sp）／（I_ps・I_ss）］^1/2 なる式により偏光応答補正因子Ｇを求める補正因子演算
手段と、（５）偏光応答補正因子Ｇに基づいて偏光応答
補正を行って第２の光束の偏光性を求める偏光性演算手
段と、を備える。

この偏光性測定装置によれば、試料に照射される直線
偏光の第１の光束は、光源部より出力され、偏光方位回
転手段により偏光方位が回転され、光束分岐手段を経て
試料に照射される。第１の光束が試料に照射されて発生
した光束のうち光束分岐手段を経た第２の光束は、検出
手段により、ｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強
度が検出される。そして、偏光方位回転手段により光束
分岐手段に対してｐ偏光とされた第１の光束が試料に照
射されたときに検出手段により検出された第２の光束の
ｐ偏光成分の強度I_ppおよびｓ偏光成分の強度I_ps、並び
に、偏光方位回転手段により光束分岐手段に対してｓ偏
光とされた第１の光束が試料に照射されたときに検出手
段により検出された第２の光束のｐ偏光成分の強度I_sp
およびｓ偏光成分の強度I_ssに基づいて、補正因子演算
手段により、上記の式により偏光応答補正因子Ｇが求め
られ、偏光性演算手段により、偏光応答補正因子Ｇに基
づいて偏光応答補正がなされ、第２の光束の偏光性が求
められる。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、補正因子演算
手段が、一定配置にある試料について検出手段により検
出された強度I_pp,I_ps,I_spおよびI_ssそれぞれに基づいて
偏光応答補正因子Ｇを求める。この場合には、試料中に
第２の光束を発生する物質がランダムに配向している系
において第２の光束の偏光性が測定される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、所定方向を中
心軸として試料を回転させる試料回転手段を更に備え、
補正因子演算手段は、中心軸について所定回転角度位置
にある試料について検出手段により検出された強度I_pp
およびI_ps、並びに、試料回転手段により中心軸につい
て所定回転角度位置とは90度異なる回転角度位置に設定
された試料について検出手段により検出された強度I_sp
およびI_ssに基づいて、偏光応答補正因子Ｇを求める。
この場合には、試料中に第２の光束を発生する物質が一
定方向に配向している系において第２の光束の偏光性が
測定される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、偏光性演算手
段が第２の光束の偏光性Ｐを P₁（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋Ｇ・I_ps） または、 P₁（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋I_sp） なる式により求めてもよいし、 P₂（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋２・Ｇ・I_ps） または、 P₂（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋２・I_sp） なる式により求めてもよいし、 P₃（ｐ）＝１−Ｇ・（I_ps/I_pp） または、 P₃（ｓ）＝Ｇ−（I_sp/I_ss） なる式により求めてもよいし、 P₄（ｐ）＝（I_pp/I_ps）−Ｇ または、 P₄（ｓ）＝Ｇ・（I_ss/I_sp）−１ なる式により求めてもよい。何れも、第２の光束の偏光
性を表すのに好適なパラメータである。特に、P₃および
P₄は、少ない演算量で求めることができる。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、光源部が、試
料により多光子吸収され得る波長の光束を第１の光束と
して出力するとともに、検出手段が、その多光子吸収に
伴い発生する光束を第２の光束として検出する。この場
合には、第２の光束の偏光性は、高感度かつS/N比良く
測定される。

また、本発明に係る偏光性測定装置は、（１）試料に
照射する第１の光束を出力する光源部と、（２）第１の
光束を試料に照射し、該照射により試料から発生した第
２の光束を入力し、第１の光束および第２の光束のうち
何れか一方を反射し他方を透過する第１の光束分岐手段
と、（３）第１の光束分岐手段の分光特性と等しい分光
特性を有し、第１の光束分岐手段における第２の光束に
対する入射面と90度異なる入射面を有し、第１の光束分
岐手段から出力された第２の光束を入力する第２の光束
分岐手段と、（４）第２の光束分岐手段を経た第２の光
束のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強度を検出
する検出手段と、（５）検出手段により検出された第２
の光束のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強度に
基づいて第２の光束の偏光性を測定する偏光性演算手段
と、を備える。

この偏光性測定装置によれば、試料に照射される第１
の光束は、光源部より出力され、第１の光束分岐手段を
経て試料に照射される。第１の光束が試料に照射されて
発生した第２の光束は、第１および第２の光束分岐手段
を順次経て、そのｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれ
の強度が検出手段により検出され、そして、これらの強
度に基づいて偏光性が測定される。ここで、第１および
第２の光束分岐手段は、互いに等しい分光特性を有し、
第２の光束に対して互いに90度異なる入射面を有するの
で、第１および第２の光束分岐手段それぞれの分光特性
が相殺され、これらに起因する偏光性測定誤差がなくな
る。

図面の簡単な説明 図１は、０次元（ポイント）の偏光性測定におけるＧ
因子の求め方の説明図である。

図２は、本発明に係る偏光性測定方法および装置にお
けるＧ因子の求め方の説明図である。

図３は、本発明に係る偏光性測定方法および装置にお
いて試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布して
いる場合のＧ因子の求め方の説明図である。

図４は、θ_１の回転相関時間を持つ蛍光分子からの励
起光に平行および垂直な蛍光偏光成分強度の減衰曲線を
示すグラフである。

図５は、θ_２の回転相関時間を持つ蛍光分子からの励
起光に平行および垂直な蛍光偏光成分強度の減衰曲線を
示すグラフである。

図６は、偏光性P₁の減衰曲線を示すグラフである。

図７は、偏光性P₂の減衰曲線を示すグラフである。

図８は、偏光性P₃の減衰曲線を示すグラフである。

図９は、偏光性P₄の減衰曲線を示すグラフである。

図10は、本発明に係る偏光性測定装置の構成図であ
る。

図11は、試料から発生した蛍光の強度を偏光素子を通
さないでそのまま測定したときの減衰曲線（太線）と、
顕微鏡下での装置の応答関数（細線）とを示すグラフで
ある。

図12は、ｐ偏光のパルス励起光で励起したときに発生
した蛍光のｐ偏光成分（太線）およびｓ偏光成分（細
線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。

図13は、Ｇ因子による偏光応答補正を行って得られた
異方性比P₂の減衰曲線（太線）と、偏光応答補正を行わ
ないで得られた異方性比P₂の減衰曲線（細線）とを示す
グラフである。

図14は、本発明に係る偏光性測定装置において偏光応
答補正を行って得られた異方性比P₂の減衰曲線（太線）
と、従来構成の偏光性測定装置において偏光応答補正を
行って得られた異方性比P₂の減衰曲線（細線）とを示す
グラフである。

図15は、ｐ偏光のパルス励起光でHDAF溶液を励起した
ときに発生した蛍光のｐ偏光成分（太線）およびｓ偏光
成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフである。

図16は、ｐ偏光のパルス励起光でHDAF染色NG細胞を励
起したときに発生した蛍光のｐ偏光成分（太線）および
ｓ偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフで
ある。

図17は、HDAF溶液（細線）およびHDAF染色NG細胞（太
線）を励起したときに発生した蛍光についてＧ因子によ
る偏光応答補正を行って得られた異方性比P₂の減衰曲線
を示すグラフである。

図18は、フリーな蛍光プローブ（HDAF溶液）とターゲ
ットに結合した蛍光プローブ（HDAF染色NG細胞）が共存
する試料の模式図である。

図19は、フリー領域とバウンド領域の異方性比P₂の値
とそのコントラストを示す図表である。

図20Aおよび図20Bそれぞれは、多光子励起の場合にも
好適に用いられる偏光性測定装置の蛍光検出光学系の構
成図であり、蛍光検出光学系の光軸に対して垂直であっ
て且つ互いに垂直な２方向それぞれから見た図である。

図21は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて励起確率を示すグラフ
である。

図22は、励起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸の
方位との関係を説明する図である。

図23は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の
蛍光の異方性比P₂の値をθ／τに対してプロットしたグ
ラフである。

図24は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の
蛍光の異方性比P₂のθ／τに対する傾斜をプロットした
グラフである。

図25は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異
方性比P₂および標準偏差σの測定値をまとめた図表であ
る。

図26は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に
対して、蛍光の異方性比P₂の測定値をプロットしたグラ
フである。

図27は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合の10％増に対して、
蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂をまとめた図表である。

図28は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合の
10％増に対して、蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂の値をプ
ロットしたグラフである。

図29は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異
方性比P₂を標準偏差σで割った値（P₂/σ）、および、
蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂を標準偏差σで割った値
（ΔP₂/σ）をまとめた図表である。

図30は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に
対して、蛍光の異方性比P₂を標準偏差σで割った値（P₂
/σ）をプロットしたグラフである。

図31は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合に
対して、蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂を標準偏差σで割
った値（ΔP₂/σ）をプロットしたグラフである。

発明を実施するための最良の形態 以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細
に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には
同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、以
下では、蛍光の偏光性の測定について説明するが、ラマ
ン散乱光の偏光性の測定についても同様である。また、
「偏光性」なる語は、以下に述べるP₁,P₂,P₃およびP₄を
総称したものを表す。

先ず、本発明に係る偏光性測定方法および装置の説明
に先立って、偏光応答補正一般について説明する。偏光
性測定に際して、測定誤差の大きな要因の１つとなるの
が、受光光学系（試料から光検出器までの光学系）およ
び光検出器の偏光特性である。偏光素子以外の受光光学
素子および光検出器は、理想的には、異なる偏光に対し
ても等しく応答すべきであるが、実際には、偏光方位に
よって異なる応答をする。したがって、真の蛍光の偏光
性を求めるには、偏光応答を補正する必要がある。

この偏光応答の補正量は、通常、Ｇ因子（偏光応答補
正因子）と呼ばれ、０次元（ポイント）の偏光性測定に
おいては、以下のように定義されている。図１は、０次
元（ポイント）の偏光性測定におけるＧ因子の求め方の
説明図である。ｐ方位に偏光した直線偏光の励起光を試
料に入射し、蛍光を発生させる。この入射方向に対して
直交する方向から、偏光子を用いてｐ方位（励起光のｐ
方位と平行な方位）およびｓ方位（励起光のｐ方位に垂
直な方位）それぞれの直線偏光成分の蛍光を測定し、そ
れぞれの強度をI_ppおよびI_psとする。そして、蛍光の偏
光性を特徴付けるパラメータとして、偏光度P₁（一般に
は、ｐで表現される）が、 で定義され、また、異方性比P₂（一般には、ｒで表現さ
れる）が、 で定義されている。

しかし、実際に測定される蛍光強度は、受光光学系お
よび光検出器を経て得られるため、それらの異方性を反
映したものとする。すなわち、受光光学系および光検出
器のｐ偏光に対する応答をT_pとし、ｓ偏光に対する応答
をT_sとすると、実際に測定される蛍光強度I_pp′およびI
_ps′それぞれは、真の蛍光強度I_ppおよびI_psそれぞれと
の間に、 I_pp′＝T_p・I_pp、I_ps′＝T_s・I_ps …（３） なる関係がある。したがって、偏光度P₁および異方性比
P₂それぞれと実測蛍光強度I_pp′,I_ps′との間の関係
は、（３）式を（１）式および（２）式それぞれに代入
して、 なる関係式で表される。ここで、（４）式および（５）
式それぞれに現れるＧは、Ｇ因子と呼ばれる偏光応答補
正因子であり、ｐ偏光に対する応答T_pとｓ偏光に対する
応答T_sとの比 で表される。

このＧ因子は、以下のようにして求める。ｓ偏光の励
起光を試料に照射して、発生した蛍光のｐ偏光およびｓ
偏光それぞれの直線偏光成分の蛍光を測定し、それぞれ
の強度をI_sp′およびI_ss′とする。これらは真の蛍光強
度I_spおよびI_ssそれぞれとの間に、（３）式と同様に、 I_sp′＝T_p・I_sp、I_ss′＝T_s・I_ss …（７） なる関係がある。そして、ｓ偏光の励起光に対して発生
する蛍光のｐ偏光成分の強度I_spとｓ偏光成分の強度I_ss
とは相等しいと考えられるので、（７）式から、 が得られ、したがって、（６）式で表されるＧ因子は、
実測された蛍光強度I_sp′およびI_ss′を用いて、 で求められる。すなわち、このＧ因子による偏光応答補
正を行うことにより、偏光度P₁および異方性比P₂を高精
度に求めることができる。

以上に述べた偏光応答補正は、０次元（ポイント）の
偏光性測定装置についてのものであるが、本発明に係る
偏光性測定方法および装置のような顕微鏡下では、試料
に対して励起光を照射する方向と蛍光を観察する方向と
が同一であるので、上述した方法ではＧ因子を求めるこ
とはできない。そこで、この場合には、偏光応答補正を
以下のようにして行う。図２は、本発明に係る偏光性測
定方法および装置におけるＧ因子の求め方の説明図であ
る。なお、以下では、Ｇ因子の求め方を、試料中の蛍光
プローブの分子軸が配向しておらず全くランダムに分布
している場合と、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向
して分布している場合とに分けて説明する。

先ず、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向しておら
ず全くランダムに分布している場合におけるＧ因子の求
め方について説明する。

光束分岐手段であるダイクロイックミラーに対してｐ
偏光の励起光の試料照射により発生した蛍光のｐ偏光成
分およびｓ偏光成分それぞれの強度（真値）をI_pp,I_ps
とし、光検出器により検出される実測値をI_pp′,I_ps′
とする。また、ダイクロイックミラーに対してｓ偏光の
励起光の試料照射により発生した蛍光のｐ偏光成分およ
びｓ偏光成分それぞれの強度（真値）をI_sp,I_ssとし、
光検出器により検出される実測値をI_sp′,I_ss′とす
る。このとき、これらの量と、受光光学系および光検出
器のｐ偏光に対する応答T_pと、ｓ偏光に対する応答T_sと
の間には、 I_pp′＝T_p・I_pp、I_ps′＝T_s・I_ps …（10） I_sp′＝T_p・I_sp、I_ss′＝T_s・I_ss …（11） なる関係がある。

また、ｐ偏光の励起光の照射について得られる異方性
比P₂（ｐ）は、 なる式で表され、ｓ偏光の励起光の照射について得られ
る異方性比P₂（ｓ）は、 なる式で表される。また、Ｇ因子は、 なる式で表されるから、（12）式および（13）式それぞ
れは、 で表される。

試料中の蛍光プローブの分子軸が全くランダムに分布
している場合には、ｐ偏光の励起光の照射について得ら
れる異方性比P₂（ｐ）と、ｓ偏光の励起光の照射につい
て得られる異方性比P₂（ｓ）とは相等しく、 P₂（ｐ）＝P₂（ｓ） …（17） となる。この（17）式に（15）式および（16）式を代入
することにより、Ｇ因子は、 Ｇ＝［（I_pp′・I_sp′）／（I_ps′・I_ss′）］^1/2 …（18） で与えられることになる。

すなわち、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して
おらず全くランダムに分布している場合におけるＧ因子
は、ｐ偏光およびｓ偏光それぞれの励起光の試料照射に
より発生する蛍光のｐ偏光強度およびｓ偏光強度を測定
し、これらの強度に基づいて（18）式により求められ
る。そして、このようにして得られたＧ因子による偏光
応答補正を行うことにより、蛍光の偏光度P₁ならびに異
方性比P₂を高精度に求めることができる。

次に、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布
している場合におけるＧ因子の求め方について説明す
る。なお、実際の測定対象はこのような系に近い場合が
多い。

この場合において、前述の試料中の蛍光プローブの分
子軸が配向しておらず全くランダムに分布している場合
におけるＧ因子の求め方を適用すると、偏光素子を除く
受光光学素子や光検出器が偏光について異方性を有して
いない場合であっても、あたかも異方性を有しているか
のように蛍光が測定されることになる。したがって、試
料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布している場
合には、（17）式の仮定は成り立たず、ｐ偏光の励起光
の照射について得られる異方性比P₂（ｐ）と、ｓ偏光の
励起光の照射について得られる異方性比P₂（ｓ）とは一
般には異なり、 P₂（ｐ）≠P₂（ｓ） …（19） である。

すなわち、ｐ偏光の励起光の照射により試料から発生
する蛍光のうちのｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれ
の強度をI_ppおよびI_psとし、ｓ偏光の励起光の照射によ
り試料から発生する蛍光のうちのｐ偏光成分およびｓ偏
光成分それぞれの強度をI_spおよびI_ssとすると、試料中
の蛍光プローブの分子軸が全くランダムに分布している
場合には、 であるが、蛍光プローブの分子軸が配向して分布してい
る場合には、 である。

そこで、蛍光プローブの分子軸が配向して分布してい
る場合には、Ｇ因子を以下のようにして求める。すなわ
ち、ｐ偏光の励起光の照射により試料から発生する蛍光
のうちのｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強度
（真値）をI_pp（０）およびI_ps（０）とし、光検出器に
より検出される実測値をI_pp（０）′およびI_ps（０）′
とする。また、図３に示すように励起光照射方向を中心
軸として試料を90度回転した後において、ｓ偏光の励起
光の照射により試料から発生する蛍光のうちのｐ偏光成
分およびｓ偏光成分それぞれの強度（真値）をI_sp（9
0）およびI_ss（90）とし、光検出器により検出される実
測値をI_sp（90）′およびI_ss（90）′とする。このと
き、これらの量と、受光光学系および光検出器のｐ偏光
に対する応答T_pと、ｓ偏光に対する応答T_sとの間には、 I_pp（０）′＝T_p・I_pp（０）、I_ps（０）′＝T_s・I_ps
（０） …（22） I_sp（90）′＝T_p・I_sp（90）、I_ss（90）′＝T_s・I_ss
（90） …（23） なる関係がある。

また、試料を回転する前における異方性比P₂（p,0）
は、 なる式で表され、試料を90度回転した後における異方性
比P₂（s,90）は、 なる式で表される。ここで、（14）式で表されるＧ因子
を用いると、（24）式および（25）式それぞれは、 で表される。

試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布してい
る場合には、励起光照射方向を中心軸として試料を90度
回転した後においてｓ偏光の励起光の照射について得ら
れる異方性比P₂（s,90）は、試料を回転する前において
ｐ偏光の励起光の照射について得られる異方性比P₂（p,
0）と相等しい。すなわち、 P₂（s,90）＝P₂（p,0） …（28） である。したがって、（26）式と（27）式とを（28）式
に代入して、 が得られ、これを解いて、Ｇ因子を表す式として、 Ｇ＝［（I_pp（０）′・I_sp（90）′ ／（I_ps（０）′・I_ss（90）′）］^1/2 …（30） が得られる。

すなわち、試料中の蛍光プローブの分子軸が配向して
分布している場合におけるＧ因子は、励起光照射方向を
中心軸とする試料の回転角度をｐ偏光およびｓ偏光それ
ぞれの励起光の試料照射の場合で互いに90度異なるもの
とし、これらｐ偏光およびｓ偏光それぞれの励起光の試
料照射により発生する蛍光のｐ偏光強度およびｓ偏光強
度を測定し、これらの強度に基づいて（30）式により求
められる。そして、このようにして得られたＧ因子によ
る偏光応答補正を行うことにより、偏光度P₁ならびに異
方性比P₂を高精度に求めることができる。

さらに、本発明に係る偏光性測定方法および装置で
は、上述の偏光度P₁および異方性比P₂とは別に、偏光性
を表す量として、 で表される偏光性を定義する。この偏光性P₃およびP
₄は、偏光度P₁および異方性比P₂と比較的よい一致を示
す量である。すなわち、いま蛍光寿命τが同じで回転相
関時間θ（回転ブラウン運動の速さを特徴付ける量）の
異なる２種類の蛍光分子を考える。図４および図５は、
２種類の蛍光分子からの蛍光をそれぞれ別にパルス光励
起によりＧ＝１の系で測定したときの励起光の偏光方位
に平行な蛍光偏光成分強度I_pp′と垂直な蛍光偏光成分
強度I_ps′をシミュレーションした結果である。但し、
θ_１をτの0.1倍、θ_２をθ_１の10倍として計算した。
このデータをもとに、偏光性P₁を（４）式により、P₂を
（５）式により、P₃を（31）式により、P₄を（32）式に
より求めた結果が図６〜図９である。図から判るよう
に、偏光性P₁,P₂,P₃およびP₄は、時間およびθの変化に
対して略一致した減衰パターンをとっている。

また、（31）式および（32）式を、偏光度P₁および異
方性比P₂それぞれの定義式である（４）式および（５）
式と比較すれば判るように、偏光性P₃およびP₄は、偏光
度P₁および異方性比P₂を求める演算よりも少ない演算量
で求めることができる。したがって、（31）式および
（32）式を用いた演算による偏光性P₃およびP₄の算出
は、偏光性の変化をリアルタイムに測定する場合や、２
次元の大量のデータについて偏光性を求める場合のよう
に、短時間に偏光性を求めたいときに極めて有効であ
る。また、演算量が減少することから、演算時の誤差も
低減される。

次に、本発明に係る偏光性測定装置の構成について説
明する。図10は、本発明に係る偏光性測定装置の構成図
である。

パルス励起光源１は、試料７中の蛍光プローブを励起
するパルス励起光（第１の光束）を出力するものであ
る。パルス励起光源１から出力されたパルス励起光は、
偏光子２により直線偏光とされた後に、1/2波長板（偏
光方位回転手段）３に入射して、ダイクロイックミラー
（光束分岐手段）５に関してｐ偏光方位およびｓ偏光方
位の何れかに回転させられる。そして、ｐ偏光またはｓ
偏光とされたパルス励起光は、対物レンズ６により試料
７に照射される。すなわち、パルス励起光は、励起光導
入光学系４により所定の光束径および形状にされ、ダイ
クロイックミラー５により反射され、対物レンズ６によ
り集光されて、試料ステージ（試料回転手段）８に置か
れた試料７上の観察領域に照射される。この試料ステー
ジ８は、試料７に入射するパルス励起光の光軸を中心と
して試料７を回転させることができるものである。

試料７にパルス励起光が照射されると、試料７中の蛍
光プローブから蛍光（第２の光束）が発生する。その蛍
光の強度分布は、検出手段により、励起光照射方向と同
じ方向に出たものがｐ偏光とｓ偏光とに分離されて測定
される。すなわち、試料７から発した蛍光のうち対物レ
ンズ６に入射した光束は、対物レンズ６を通過し、ダイ
クロイックミラー５を透過し、バンドパスフィルタ９を
透過し、偏光ビームスプリッタ10によりｐ偏光成分とｓ
偏光成分とに分岐され、そのｐ偏光成分およびｓ偏光成
分それぞれの蛍光偏光像が結像レンズ11および12それぞ
れによりゲート機能付イメージインテンシファイア13お
よび14それぞれの撮像面に結像され、そして、ゲート機
能付イメージインテンシファイア13および14それぞれに
より強度分布が測定される。

ここで、バンドパスフィルタ９は、蛍光を透過させる
ものであるが、試料７で生じたパルス励起光の散乱光を
吸収するものであり、偏光ビームスプリッタ10は、蛍光
のｐ偏光成分を通過させ、ｓ偏光成分を反射させるもの
である。ゲート機能付イメージインテンシファイア13お
よび14それぞれは、ゲートコントローラ15から出力され
たゲート信号に基づいてゲートを開閉し、ゲートが開い
ているときに撮像面に結像された蛍光偏光像を撮像する
ものである。また、ゲートコントローラ15は、パルス励
起光源１からパルス励起光が出力されるタイミングを基
準時刻として、時刻t₀から時間Δｔの間だけゲート機能
付イメージインテンシファイア13および14それぞれのゲ
ートを開くよう指示するゲート信号を出力する。

ゲート機能付イメージインテンシファイア13および14
それぞれにより撮像されたｐ偏光成分およびｓ偏光成分
それぞれの栄光偏光画像は、画像演算部16に入力され
る。画像演算部16は、これらの蛍光偏光画像に基づい
て、偏光応答補正を行い、偏光性（P₁,P₂,P₃,P₄）の２
次元画像を求める。

次に、この偏光性測定装置を用いて偏光応答補正のな
された蛍光の異方性比P₂の２次元画像を取得する方法に
ついて説明する。偏光度P₁,P₂およびP₃それぞれの２次
元画像も同様にして求められる。この偏光応答補正およ
び蛍光の異方性比P₂の２次元画像は、画像演算部16にお
ける演算によって求められるものである。なお、以下で
は、試料７中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず
全くランダムに分布している場合と、試料７中の蛍光プ
ローブの分子軸が配向して分布している場合とに分けて
説明する。

試料７中の蛍光プローブの分子軸が配向しておらず全
くランダムに分布している場合には、異方性比P₂の２次
元画像は以下のようにして取得される。

この場合、1/2波長板３の光学軸を適切に設定して、
パルス励起光源１から出力されたパルス励起光をｐ偏光
として試料７に照射する。このとき、ゲートコントロー
ラ15からのゲート信号の指示により、時刻t₀から時間Δ
ｔの間にゲート機能付イメージインテンシファイア13お
よび14それぞれにより撮像されたｐ偏光およびｓ偏光そ
れぞれの蛍光画像を、I_pp（t₀,Δｔ）およびI_ps（t₀,Δ
ｔ）とする。

同様にして、1/2波長板３の光学軸を適切に設定し
て、パルス励起光源１から出力されたパルス励起光をｓ
偏光として試料７に照射する。このとき、ゲートコント
ローラ15からのゲート信号の指示により、ゲート機能付
イメージインテンシファイア13および14それぞれにより
撮像されたｐ偏光およびｓ偏光それぞれの蛍光画像を、
I_sp（t₀,Δｔ）およびI_ss（t₀,Δｔ）とする。

そして、偏光応答補正に関するＧ因子を、 Ｇ＝［（I_pp（t₀,Δｔ）・I_sp（t₀,Δｔ）） ／（I_ps（t₀,Δｔ）・I_ss（t₀,Δｔ））］^1/2 …（33） で求め、異方性比P₂（p,t₀,Δｔ）を、 で求める。なお、蛍光画像I_pp（t₀,Δｔ）,I_ps（t₀,Δ
ｔ）,I_sp（t₀,Δｔ）およびI_ss（t₀,Δｔ）、Ｇ因子な
らびに異方性比P₂（p,t₀,Δｔ）は、全て、試料７に照
射されるパルス励起光の光軸に垂直な面上の座標（x,
y）の関数である。このようにして、試料中の蛍光プロ
ーブから発生した蛍光の異方性比P₂の２次元画像を高精
度に測定することができる。

試料７中の蛍光プローブの分子軸が配向して分布して
いる場合には、異方性比P₂の２次元画像は以下のように
して取得される。

この場合、1/2波長板３の光学軸を適切に設定して、
パルス励起光源１から出力されたパルス励起光をｐ偏光
として試料７に照射する。このとき、ゲートコントロー
ラ15からのゲート信号の指示により、時刻t₀から時間Δ
ｔの間にゲート機能付イメージインテンシファイア13お
よび14それぞれにより撮像されたｐ偏光およびｓ偏光そ
れぞれの蛍光画像を、I_pp（0,t₀,Δｔ）およびI_ps（0,t
₀,Δｔ）とする。

続いて、試料ステージ８の回転により試料７を90度回
転させた後、同様にして、1/2波長板３の光学軸を適切
に設定して、パルス励起光源１から出力されたパルス励
起光をｓ偏光として試料７に照射する。このとき、ゲー
トコントローラ15からのゲート信号の指示により、ゲー
ト機能付イメージインテンシファイア13および14それぞ
れにより撮像されたｐ偏光およびｓ偏光それぞれの蛍光
画像を、I_sp（90,t₀,Δｔ）およびI_ss（90,t₀,Δｔ）と
する。

そして、偏光応答補正に関するＧ因子を、 Ｇ＝［（I_pp（0,t₀,Δｔ）・I_sp（90,t₀,Δｔ）） ／（I_ps（0,t₀,Δｔ）・I_ss（90,t₀,Δｔ））］
^1/2 …（35） で求め、ｐ偏光の励起光の試料照射時における蛍光の異
方性比P₂（p,t₀,Δｔ）を、 で求める。なお、蛍光画像I_pp（0,t₀,Δｔ）,I_ps（0,
t₀,Δｔ）、I_sp（90,t₀,Δｔ）およびI_ss（90,t₀,Δ
ｔ）,G因子ならびに異方性比P₂（p,t₀,Δｔ）は、全
て、試料７に照射されるパルス励起光の光軸に垂直な面
上の座標（x,y）の関数である。このようにして、ター
ゲットに結合した蛍光プローブから発生した蛍光の異方
性比P₂の２次元画像を高精度に測定することができる。

次に、本発明に係る偏光性測定装置における偏光応答
補正について行った実験の結果について説明する。ここ
で用いた偏光性測定装置の具体的な構成は以下のとおり
である。パルス励起光源１は、モード同期チタンサファ
イアレーザ光源であり、試料７に照射されるパルス励起
光としては、これから出力される第２高調波（波長400n
m、パルス幅200フェムト秒、繰り返し周波数100kHz）を
用いた。偏光子２は、グランレーザプリズムであり、1/
2波長板３は、フレネルロム1/2波長板である。なお、ゲ
ート機能付イメージインテンシファイア13および14それ
ぞれに替えて、ここでは、マイクロチャンネルプレート
内蔵型光電子増倍管を用いて、時間相関光子計数法（TC
PC法）により蛍光強度を測定した。試料７として、FITC
（Fluorescein isothiocyanate）で標識された17merDNA
を用いた。この試料７中では、蛍光プローブの分子軸は
配向しておらず全くランダムに分布している。したがっ
て、Ｇ因子を（18）式で求め、蛍光の異方性比P₂を（1
5）式で求めた。

図11は、試料から発生した蛍光の強度を偏光素子を通
さずそのまま測定したときの減衰曲線（太線）と、顕微
鏡下での装置の応答関数（細線）とを示すグラフであ
る。図12は、ｐ偏光のパルス励起光で励起したときに試
料７から発生した蛍光のｐ偏光成分（太線）およびｓ偏
光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフであ
る。なお、この図12では、ｓ偏光成分（細線）の減衰曲
線は、実測値にＧ因子を掛けた値で表示されている。

図13は、Ｇ因子による偏光応答補正を行って得られた
異方性比P₂の減衰曲線（太線）と、偏光応答補正を行わ
ないで得られた異方性比P₂の減衰曲線（細線）とを示す
グラフである。すなわち、太線は、ｐ偏光およびｓ偏光
それぞれのパルス励起光で励起したときに試料７から発
生した蛍光の偏光測定の結果に基づいてＧ因子を求め、
ｐ偏光のパルス励起光で励起したときに試料７から発生
した蛍光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの強度
の測定値についてＧ因子による偏光応答補正を行って得
られた異方性比P₂の減衰曲線を示している。一方、細線
は、実測値が真値であるとの仮定に下に、Ｇ因子による
偏光応答補正を行うことなく求めた異方性比P₂の減衰曲
線を示している。Ｇ因子の値は、1.076であった。な
お、この装置において、ダイクロイックミラー５がＧ因
子に主に寄与しているものと考えられる。

図14は、本発明に係る偏光性測定装置のような顕微鏡
下（図２の構成）において偏光応答補正を行って得られ
た異方性比P₂の減衰曲線（太線）と、従来構成の偏光性
測定装置（図１の構成）において偏光応答補正を行って
得られた異方性比P₂の減衰曲線（細線）とを示すグラフ
である。この図に示すように、両者は良い一致を示して
いる。すなわち、本発明に係る偏光性測定装置のような
顕微鏡下においても偏光応答補正を行うことにより正確
な異方性比P₂を測定することできることが確認できた。

次に、本発明に係る偏光性測定装置を用いた蛍光偏光
性の測定結果について説明する。ここで用いた偏光性測
定装置の具体的な構成は以下のとおりである。パルス励
起光源１は、モード同期チタンサファイアレーザ光源で
あり、試料７に照射されるパルス励起光としては、これ
から出力される第２高調波（波長465nm、パルス幅200フ
ェムト秒、繰り返し周波数100kHz）を用いた。偏光子２
は、グランレーザプリズムであり、1/2波長板３は、フ
レネルロム1/2波長板である。なお、蛍光の減衰曲線を
測定するときには、ゲート機能付イメージインテンシフ
ァイア13および14それぞれに替えて、マイクロチャンネ
ルプレート内蔵型光電子増倍管を用いて、時間相関光子
計数法（TCPC法）により蛍光強度を測定した。

試料７は、NG細胞（NG108−15）であり、蛍光プロー
ブは、細胞膜に特異的に結合するHDAF（５−（Ｎ−hexa
decanoyl）aminofluorescein）であり、染色濃度は10μ
Ｍであり、染色時間は30分であった。この試料７中で
は、蛍光プローブの分子軸は受光光軸に垂直な面では配
向しておらず全くランダムに分布している。したがっ
て、Ｇ因子を（18）式で求め、異方性比P₂を（15）式で
求めた。

図15は、ｐ偏光のパルス励起光でフリーな蛍光プロー
ブ（HDAF溶液）を励起したときに発生した蛍光のｐ偏光
成分（太線）およびｓ偏光成分（細線）それぞれの減衰
曲線を示すグラフである。なお、この図で、ｓ偏光成分
（細線）の減衰曲線は、実測値にＧ因子を掛けた値で表
示されている。図16は、ｐ偏光のパルス励起光でターゲ
ットに結合した蛍光プローブ（HDAF染色NG細胞）を励起
したときに発生した蛍光のｐ偏光成分（太線）およびｓ
偏光成分（細線）それぞれの減衰曲線を示すグラフであ
る。なお、この図でも、ｓ偏光成分（細線）の減衰曲線
は、実測値にＧ因子を掛けた値で表示されている。

図17は、HDAF溶液（細線）およびHDAF染色NG細胞（太
線）を励起したときに発生した蛍光についてＧ因子によ
る偏光応答補正を行って得られた異方性比P₂の減衰曲線
を示すグラフである。すなわち、細線は、蛍光プローブ
がフリーな状態であるときの異方性比P₂の減衰曲線であ
り、太線は、蛍光プローブがターゲットに結合している
状態であるときの異方性比P₂の減衰曲線である。図から
判るように、フリーな蛍光プローブは、ターゲットに結
合した蛍光プローブに比べて速く偏光性が低下している
（速く偏光解消している）。したがって、偏光解消の度
合いを測定することにより、ターゲットに結合した蛍光
プローブとフリーな蛍光プローブの分離が可能となる。

そこで、図18の模式図に示すようにフリーな蛍光プロ
ーブ（HDAF溶液）とターゲットに結合した蛍光プローブ
（HDAF染色NG細胞）が共存する試料において蛍光の偏光
性を２次元的に解析した。まず。試料からの蛍光を偏光
素子を通さずにそのまま測定したときの蛍光強度の２次
元分布（通常の蛍光画像）は、蛍光プローブがフリーに
存在している領域（フリー領域）で平均値Ｉ（Ｆ）＝36
655（標準偏差σ（Ｆ）＝1863）、蛍光プローブがター
ゲットに結合している領域（バウンド領域）で平均値Ｉ
（Ｂ）＝43864（標準偏差σ（Ｂ）＝3378）であった。
これらの値から、コントラストＣ（Ｉ）を により計算すると0.09であり非常に低く、また励起光強
度の２次元的なムラもあってフリー領域とバウンド領域
の差が明確ではなかった。次に、試料からの蛍光異方性
比P₂の２次元画像をゲート機能付イメージインテンシフ
ァイア13および14のゲートを常に開いた状態で測定した
（DC測定）。その結果、図19に示すように異方性比P₂の
値は、フリー領域で平均値P₂（Ｆ）＝0.044、バウンド
領域で平均値P₂（Ｂ）＝0.086であった、これらの値か
らコントラストＣ（P₂）を により計算すると0.32であり、フリー領域とバウンド領
域が明確に区別できるようになった。さらに、試料から
の蛍光の異方性比P₂をゲート機能付イメージインテンシ
ファイア13および14のゲートを時刻t₀＝2ns（パルス光
により励起された時刻を0nsとし、フリーな蛍光プロー
ブの偏光性が十分解消した時刻に設定した）から時間3n
sの間だけ開いて測定した（時間分解測定）。その結
果、図19に示すように異方性比P₂の値は、フリー領域で
平均P₂＝0.016、バウンド領域で平均P₂＝0.069であっ
た。これらの値からコントラストを（38）式により計算
すると0.62になった。すなわち、異方性比P₂の２次元画
像において、時間分解測定をすることによりフリー領域
とバウンド領域のコントラストがDC測定に比べて向上し
た。以上のことから、顕微鏡下で蛍光の偏光性の２次元
画像を測定することにより、ターゲットに結合した蛍光
プローブが存在する位置を特定できることが分かる。

次に、本発明に係る偏光性測定装置における偏光応答
補正因子に主に寄与していると考えられるダイクロイッ
クミラー５の偏光特性を物理的（光学的）に相殺する方
法について述べる。

図20Aおよび図20Bそれぞれは、ダイクロイックミラー
５の偏光特性を相殺するための偏光性測定装置の検出光
学系の構成図であり、検出光学系の光軸に対して垂直で
あって且つ互いに垂直な２方向それぞれから見た図であ
る。図20Aおよび図20Bに示す検出光学系は、図10に示す
偏光性測定装置における試料ステージ８から偏光ビーム
スプリッタ10に到るまでの検出光学系に相当するもので
あり、同一要素には同一符号が付されている。なお、こ
の検出光学系以外の部分の構成は、図10に示す偏光性測
定装置において相当するものと同様の構成である。

図20Aおよび図20Bに示す検出光学系は、図10に示す偏
光性測定装置の検出光学系において、第１のダイクロイ
ックミラー５とバンドパスフィルタ９との間の光路上
に、第２のダイクロイックミラー17を挿入したものであ
る。この第２のダイクロイックミラー17は、第１のダイ
クロイックミラー５と同一特性のものであって、第１の
ダイクロイックミラー５を光軸の回りに90度回転させた
方位に配置されている。

この検出光学系によれば、ダイクロイックミラー５に
対してｐ偏光またはｓ偏光の直線偏光の励起光は、第１
のダイクロイックミラー５に入射して反射され、対物レ
ンズ６を経て、試料ステージ８上の試料７に照射され
る。励起光の照射により、試料７で発生した蛍光は、対
物レンズ６を経て、ダイクロイックミラー５および17そ
れぞれ順次透過し、バンドパスフィルタ９に到達する。
ここで、ダイクロイックミラー５および17それぞれの特
性は同一であるから、ダイクロイックミラー５および17
それぞれにおけるｐ偏光に対する応答T_pは互いに等し
く、また、ダイクロイックミラー５および17それぞれに
おけるｓ偏光に対する応答T_sも互いに等しい。

したがって、試料７で発生し対物レンズ６を通過した
蛍光のｐ偏光成分（ダイクロイックミラー５を基準）の
強度をI_p（０）とすると、この偏光成分が第１のダイク
ロイックミラー５を透過した後の強度I_p（１）は、 I_p（１）＝T_p・I_p（０） …（39） であり、さらに第２のダイクロイックミラー17を透過し
た後の蛍光のｐ偏光成分の強度I_p（２）は、 I_p（２）＝T_s・I_p（１）＝T_s・T_p・I_p（０）…（40） である。

一方、試料７で発生し対物レンズ６を通過した蛍光の
ｓ偏光成分（ダイクロイックミラー５を基準）の強度を
I_s（０）とすると、この偏光成分が第１のダイクロイッ
クミラー５を透過した後の強度I_s（１）は、 I_s（１）＝T_s・I_s（０） …（41） であり、さらに第２のダイクロイックミラー17を透過し
た後の蛍光のｓ偏光成分の強度I_s（２）は、 I_s（２）＝T_p・I_s（１）＝T_p・T_s・I_s（０）…（42） である。

すなわち、 であり、ダイクロイックミラー５および17の応答は、蛍
光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分の何れに対しても相等
しい。

図10図に示す偏光性測定装置の受光光学系（試料から
光検出器に到るまでの光学系）では、ｐ偏光およびｓ偏
光の蛍光（ダイクロイックミラー５を基準）それぞれに
対する応答の相違は、主にダイクロイックミラー５に起
因する。しかし、図20Aおよび図20Bに示す検出光学系を
有する偏光性測定装置の受光光学系では、ダイクロイッ
クミラー５および17におけるｐ偏光およびｓ偏光の蛍光
（ダイクロイックミラー５を基準）それぞれに対する応
答は相等しいので、受光光学系全体においてｐ偏光およ
びｓ偏光の蛍光それぞれに対する応答の相違は小さくな
る。

したがって、図20Aおよび図20Bに示す検出光学系を有
する偏光性測定装置では、第１のダイクロイックミラー
５に加えて第２のダイクロイックミラー17を備えたこと
により、受光光学系の偏光応答特性が改善され、また、
Ｇ因子に基づく偏光応答補正を行うので、高精度に蛍光
の偏光性を測定することができる。

以上に説明した偏光性測定方法および装置は、１光子
励起および多光子励起の何れの場合にも適用され得るも
のである。しかし、１光子励起の場合と比較して、多光
子励起の場合には更に顕著なる効果を奏する。そこで、
次に、１光子励起の場合と比較しつつ、２光子励起の場
合について説明する。

偏光性測定は、直線偏光の励起光を試料に照射するこ
とにより、試料中の蛍光プローブのうちで特定の方位に
分子軸を有するものを選択的に励起し、これにより生じ
る蛍光の偏光性を測定するものであり、この偏光性に基
づいて蛍光プローブの回転ブラウン運動の速さ等を検出
するものである。したがって、励起光の偏光方位に平行
な方位に分子軸を有する蛍光プローブのみが励起される
のが望ましい。しかし、実際には、励起光の偏光方位と
異なる方位に分子軸を有する蛍光プローブも或る確率で
励起される。

励起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸方位とがな
す角度をαとすると、蛍光プローブの分子軸方位の励起
光の振幅成分はcosαに比例する。したがって、１光子
励起の場合に、蛍光プローブが励起される確率（励起確
率）p_1pは、その蛍光プローブの分子軸方位の励起光の
強度（すなわち、振幅の２乗）に比例するので、 p_1p（α）＝p₀ ^1p・cos²α …（44） で表される。ここで、p₀ ^1pは、１光子励起の場合におい
て、励起光の偏光方位に平行な方位（α＝０）に分子軸
を有する蛍光プローブの励起確率である。一方、２光子
励起の場合の励起確率p_2pは、その蛍光プローブの分子
軸方位の励起光の強度の２乗に比例するので、 p_2p（α）＝p₀ ^2p・cos⁴α …（45） で表される。ここで、p₀ ^2pは、２光子励起の場合におい
て、励起光の偏光方位に平行な方位（α＝０）に分子軸
を有する蛍光プローブの励起確率である。

図21は、１光子励起の場合の励起確率p_1p（α）およ
び２光子励起の場合の励起確率p_2p（α）それぞれを示
すグラフである。ここでは、α＝０のときの励起確率で
あるp₀ ^1pおよびp₀ ^2pそれぞれの値を１に規格化してあ
る。この図に示すように、１光子励起の場合よりも、２
光子励起の場合の方が、角度αの絶対値が大きくなるに
従い、励起確率は急激に減少している。すなわち、励起
光の偏光方位に平行な方位（α＝０）に分子軸を有する
蛍光プローブの励起確率に対して、励起光の偏光方位と
異なる方位（α≠０）に分子軸を有する蛍光プローブの
励起確率は、１光子励起の場合よりも、２光子励起の場
合の方が小さい。したがって、試料中で蛍光プローブの
分子軸の方位がランダムに配向している系において偏光
性測定を行う場合には、１光子励起の場合よりも、２光
子励起の場合の方が、励起光の偏光方位に平行な分子軸
を有する蛍光プローブは、より選択的に励起される。

次に、１光子励起の場合および２光子励起の場合それ
ぞれについて、上記の励起確率で励起された蛍光プロー
ブから発生する蛍光の異方性比P₂を求める。図22は、励
起光の偏光方位と蛍光プローブの分子軸の方位との関係
を説明する図である。xyz直交座標系を設定し、励起光
の伝搬方向をｘ方向とし、励起光の偏光方位Ｐをｚ方向
とする。蛍光プローブの分子軸の方位Ａおよび蛍光の偏
光方位Ｅは、互いに同一であって、ｚ軸と角度αをな
し、xy平面への投影がｘ軸と角度βをなすものとする。
また、蛍光プローブの分子軸の方位はランダムに配向し
ているものとする。

この場合、蛍光プローブから発生する蛍光の強度をｋ
とすると、その蛍光のｚ軸方位の成分の強度i_z、ｘ軸方
位の成分の強度i_xおよびｙ軸方位の成分の強度i_yそれぞ
れは、 i_z＝ｋ・cos²α …（46a） i_x＝ｋ・sin²α・cos²β …（46b） i_y＝ｋ・sin²α・sin²β …（46c） で表される。

また、分子軸の方位Ａがαとα＋ｄαとの間およびβ
とβ＋ｄβとの間にある蛍光プローブの数は、 sinα・ｄα・ｄβ …（47） に比例する。したがって、励起光により励起された蛍光
プローブのうちで、分子軸の方位Ａ（すなわち、蛍光の
偏光方位Ｅ）がαとα＋ｄαとの間およびβとβ＋ｄβ
との間にある蛍光プローブの数は、（44）式、（45）式
および（47）式より、１光子励起の場合には、 cos²α・sinα・ｄα・ｄβ≡Ω_1p（α）・ｄα・ｄ
β …（48） に比例し、２光子励起の場合には、 cos⁴α・sinα・ｄα・ｄβ≡Ω_2p（α）・ｄα・ｄ
β …（49） に比例する。

また、一般に、励起光照射により励起された蛍光プロ
ーブのうちで分子軸の方位Ａがｚ軸に対し角度αである
蛍光プローブの分布をΩ（α）とすると、蛍光プローブ
の集団である試料から発生する蛍光のｚ軸方位の成分の
強度I_z、ｘ軸方位の成分の強度I_xおよびｙ軸方位の成分
の強度I_yそれぞれは、（46a），（46b），（46c）式よ
り、 で表され、また、 I_z≠I_x＝I_y …（51） である。なお、Ｋは、比例定数である。

さらに、一般に、蛍光の異方性比P₂は、励起光の偏光
方位に平行な蛍光偏光成分の強度I_zと励起光の偏光方位
に垂直な蛍光偏光成分の強度I_xまたはI_yとの差を、全蛍
光量I_x＋I_y＋I_zで割ったものであり、 P₂＝（I_z−I_x）／（I_z＋2I_x） …（52） で表される。この（52）式に（50a），（50b），（50
c）式を代入すると、 P₂＝（３・＜cos²α＞−１）/2 …（53） が得られる。ただし、 である。

以上より、１光子励起の場合、励起直後（すなわち、
蛍光プローブの回転ブラウン運動により偏光解消を受け
る前）の蛍光の異方性比P₂ ^1p（０）の値は、（48）式の
Ω_1p（α）を（54）式のΩ（α）に代入して（53）式よ
り得られ、 P₂ ^1p（０）＝2/5＝0.4 …（55） である。一方、２光子励起の場合、励起直後の蛍光の異
方性比P₂ ^2p（０）の値は、（49）式のΩ_2p（α）を（5
4）式のΩ（α）に代入して（53）式より得られ、 P₂ ^2p（０）＝4/7≒0.57 …（56） である。

このように、１光子励起の場合よりも、２光子励起の
場合の方が、蛍光の異方性比の初期値P₂（０）は、1.43
倍（＝0.57/0.4）だけ大きい。したがって、励起された
蛍光プローブが回転ブラウン運動していると、蛍光プロ
ーブから発生する蛍光の異方性比P₂の値は、上記（55）
式または（56）式で示される初期値から次第に小さくな
っていくので、１光子励起の場合よりも、２光子励起の
場合の方が、偏光性測定のダイナミックレンジは、1.43
倍広い。また、定常光励起の場合も同様である。

次に、１光子励起の場合および２光子励起の場合それ
ぞれにおける偏光性測定の感度について検討する。励起
直後において、励起光の偏光方位と平行な蛍光偏光成分
の強度I_p（＝I_z）と、励起光の偏光方位に垂直な蛍光偏
光成分の強度I_s（＝I_y）との比は、（50a），（50b），
（50c）式より、 で表される。１光子励起の場合には、（48）式のΩ
_1p（α）を（57）式のΩ（α）に代入して、 I_s/I_p＝1/3 …（58） が得られ、２光子励起の場合には、（49）式のΩ
_2p（α）を（57）式のΩ（α）に代入して、 I_s/I_p＝1/5 …（59） が得られる。したがって、励起された蛍光プローブが回
転ブラウン運動することにより、比I_s/I_pは、１光子励
起の場合には1/3から１まで変化するのに対して、２光
励起の場合には1/5から１まで変化するので、１光子励
起の場合よりも、２光子励起の場合の方が、偏光性測定
の感度は高い。

次に、１光子励起の場合および２光子励起の場合それ
ぞれにおいて、一定の強度で連続的に励起されている蛍
光プローブから発生する蛍光の偏光性の測定感度につい
て検討する。蛍光寿命をτとし、蛍光プローブの回転相
関時間をθとし、蛍光の異方性比の最大値（（55）式ま
たは（56）式で与えられる値）をP₂（０）とすると、蛍
光の異方性比P₂は、 で表される。ここで、回転相関時間θは、蛍光プローブ
の回転ブラウン運動の速さを特徴付ける量であり、ター
ゲットに結合している蛍光プローブとフリー状態にある
蛍光プローブとでは異なる値となる。回転相関時間θ
は、蛍光プローブが球状粒子である場合には、蛍光プロ
ーブの体積をＶとし、溶媒の絶対温度をＴとし、溶媒の
粘度をηとし、ボルツマン定数をｋとすると、 で表される。

図23は、１光子励起の場合（細線）および２光子励起
の場合（太線）それぞれについて、定常光励起の場合の
蛍光の異方性比P₂（（60）式）の値をθ／τに対してプ
ロットしたグラフである。また、第24図は、１光子励起
の場合（細線）および２光子励起の場合（太線）それぞ
れについて、定常光励起の場合の蛍光の異方性比P
₂（（60式）のθ／τに対する傾斜をプロットしたグラ
フである。これらの図から判るように、１光子励起の場
合（細線）よりも、２光子励起の場合（太線）の方が、
蛍光の異方性比P₂の値は大きく、また、蛍光の異方性比
P₂のθ／τに対する傾斜も大きい。したがって、１光子
励起の場合よりも、２光子励起の場合の方が、蛍光の異
方性比P₂は、θ／τの変化に対して敏感である。

上記（60）式をθに関して微分すると、 が得られる。１光子励起の場合と２光子励起の場合とで
蛍光寿命τが同一であれば、（55）式および（56）式よ
り P₂ ^2p（０）＞P₂ ^1p（０） …（63） であるので、 となる。すなわち、１光子励起の場合よりも、２光子励
起の場合の方が、蛍光の異方性比P₂は回転相関時間θの
変化に対して感度が高い。

次に、１光子励起の場合および２光子励起の場合それ
ぞれにおいて、蛍光の偏光性測定値のS/N比について検
討する。蛍光の異方性比P₂の平均値を＜P₂＞で表し、異
方性比P₂の標準偏差をσとし、励起光の偏光方位と平行
な蛍光偏光成分の光検出器への入射光子数を＜n_p＞と
し、励起光の偏光方位に垂直な蛍光偏光成分の光検出器
への入射光子数を＜n_s＞とし、光検出器の光電変換面の
量子効率をεとすると、蛍光の偏光性測定値のS/N比
は、 で与えられる。定常光励起の場合、 であるから、（65）式は、 となる。

したがって、１光子励起の場合と２光子励起の場合と
で同一光子数の蛍光が得られれば、１光子励起の場合よ
り、２光子励起の場合の方が、S/N比は1.43倍大きい。
また、１光子励起の場合と２光子励起の場合とで、τ／
θの同一値に対して同一のS/N比を得る為に必要な光子
数の比は、 である。すなわち、１光子励起の場合と比較して、２光
子励起の場合には、τ／θの同一値に対して同一のS/N
比を得る為に必要な光子数は、1/2でよい。

次に、１光子励起の場合および２光子励起の場合それ
ぞれにおいて、偏光性測定値の標準偏差（ノイズ）σが
与えられたときの蛍光プローブの回転相関時間θの検出
限界について検討する。回転相関時間の値θに対する平
均異方性比を＜P₂（θ）＞とし、回転相関時間に値θ＋
Δθに対する平均異方性比を＜P₂（θ＋Δθ）＞とし、
回転相関時間θの検出限界をΔθとすれば、 ＜P₂（θ＋Δθ）＞−＜P₂（θ）＞＝σ …（69） が成り立つ。これより、回転相関時間θの検出限界Δθ
を表す式として、 が得られる。（63）式および（70）式より、１光子励起
の場合よりも、２光子励起の場合の方が、同一ノイズの
条件の下では回転相関時間θの検出限界Δθは高い。

以上では、蛍光の異方性比P₂について、１光子励起の
場合と２光子励起の場合それぞれについて述べたが、他
の偏光性（P₁,P₃,P₄）についても同様である。また、２
光子励起の場合であっても、１光子励起の場合と同様
に、Ｇ因子に基づく偏光応答補正を行うことにより、蛍
光の偏光性の２次元画像を顕微鏡下で高精度に測定する
ことができる。２光子励起の場合には、これに加えて、
励起光の偏光方位に平行な分子軸を有する蛍光プローブ
は選択的に励起されるので、偏光性（P₁,P₂,P₃,P₄）の
初期値は大きく、偏光性測定のダイナミクレンジは広
く、偏光性測定の回転相関時間θに対する感度は高く、
偏光性測定値のS/N比は大きく、同一のS/N比を得る為に
必要な光子数は少なくてよく、また、回転相関時間θの
検出限界Δθは高く、１光子励起の場合よりも更に優れ
た効果を奏する。

以上の理論を検証するため、以下のような実験を行っ
た。蛍光プローブとしてBODIPY色素を用い、このBODIPY
色素をエタノールおよいグリセロールを含む溶液中に溶
かした溶液を試料とした。この蛍光プローブの回転相関
時間θすなわち回転ブラウン運動の速さの調整は、溶液
の粘度ηすなわちグリセロールの割合を調整することに
より行った。なお、回転ブラウン運動の速さは、溶液の
粘度ηに反比例する。

ここで用いた偏光性測定装置は、図10に示した構成と
し、顕微鏡下で偏光性の測定を行った。パルス励起光源
１としてモード同期チタンサファイアレーザ光源が用い
られ、２光子励起の場合には、このレーザ光源から出力
されたレーザ光（波長920nm、パルス幅200フェムト秒、
繰り返し周波数76MHz）が励起光として用いられ、１光
子励起の場合には、その第２高調波（波長460nm、繰り
返し周波数100kHz）が励起光として用いられた。対物レ
ンズ６として、倍率20倍のものが用いられた。また、ゲ
ート機能付イメージインテンシファイア13,14のゲート
が常に開いている状態で用いられた。

図25は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異
方性比P₂および標準偏差σの測定値をまとめた図表であ
る。また、第26図は、１光子励起の場合（細線）および
２光子励起の場合（太線）それぞれについて、グリセロ
ール割合に対して、蛍光の異方性比P₂の測定値をプロッ
トしたグラフである。これらの図から判るように、１光
子励起の場合および２光子励起の場合の何れも、グリセ
ロール割合が多いほど、すなわち、溶液の粘度ηが大き
く回転相関時間θが大きいほど、蛍光の異方性比P₂が大
きい。また、１光子励起の場合よりも、２光子励起の場
合の方が、蛍光の異方性比P₂が大きい。これらは、上述
した理論に合致するものである。さらに、１光子励起の
場合に対する２光子励起の場合の蛍光の異方性比P₂の比
は、グリセロール割合50％で1.15であり、60％で1.19で
あり、70％で1.41であり、80％で1.40であり、90％で1.
31であり、グリセロール割合70％および80％では理論値
1.43に近い値が得られた。

図27は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合の10％増に対して、
蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂をまとめた図表である。ま
た、図28は、１光子励起の場合（細線）およい２光子励
起の場合（太線）それぞれについて、グリセロール割合
の10％増に対して、蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂の値を
プロットしたグラフである。これらの図から判るよう
に、１光子励起の場合よりも、２光子励起の場合の方
が、蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂が大きい。これらは、
上述した理論に合致するものである。さらに、１光子励
起の場合に対する２光子励起の場合の蛍光の異方性比P₂
の増分ΔP₂の比は、平均1.42であり、理論値1.43に近い
値が得られた。

図29は、１光子励起の場合および２光子励起の場合そ
れぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異
方性比P₂を標準偏差σで割った値（P₂/σ）、および、
蛍光の異方性比P₂の増分ΔP₂を標準偏差σで割った値
（ΔP₂/σ）をまとめた図表である。図30は、１光子励
起の場合（細線）および２光子励起の場合（太線）それ
ぞれについて、グリセロール割合に対して、蛍光の異方
性比P₂を標準偏差σで割った値（P₂/σ）をプロットし
たグラフである。また、図31は、１光子励起の場合（細
線）および２光子励起の場合（太線）それぞれについ
て、グリセロール割合に対して、蛍光の異方性比P₂の増
分ΔP₂を標準偏差σで割った値（ΔP₂/σ）をプロット
したグラフである。これらの図から判るように、１光子
励起の場合よりも、２光子励起の場合の方が、S/N比
（＝P₂/σ）は良く、また、回転相関時間θの検出限界
Δθ（ΔP₂/σ）も高い。

次に、２光子励起の場合に好適に用いられ得る偏光性
測定装置の構成について説明する。

図10に示した構成の偏光性測定装置は、２光子励起の
場合にも用いられ得るものである。しかし、上述の理論
および実験結果で示したように、２光子励起により励起
された試料中の蛍光プローブから発生する蛍光の偏光性
測定は優れた効果を奏するものであるが、２光子励起の
場合には、励起光は非常に強力である必要であり、１光
子励起の場合と同程度の蛍光強度を得る為には、１光子
励起の場合の約100倍の励起光強度が必要である。それ
故、図10に示した構成では、試料７で反射・散乱されダ
イクロイックミラー５を透過してゲート機能付イメージ
インテンシファイア13,14に達する励起光は、１光子励
起の場合よりも強く、無視し得ない場合がある。そこ
で、図10に示した構成に加えて、ダイクロイックミラー
５とゲート機能付イメージインテンシファイア13,14そ
れぞれとの間の光路上に、励起光を遮断するフィルタを
追加して挿入するのが好適である。

また、より好適には、図20Aおよび図20Bに示す検出光
学系を有する偏光性測定装置が２光子励起の場合に用い
られ得る。すなわち、ダイクロイックミラー17は、ダイ
クロイックミラー５のもつ偏光特性を相殺するだけでな
く、強力な励起光の反射・散乱光を遮断するフィルタと
しても機能し、偏光測定のS/N比が改善される。

以上のように、本発明に係る偏光性測定方法および装
置によれば、蛍光プローブを含む試料から発生した蛍光
の偏光性（P₁,P₂,P₃,P₄）の２次元画像を顕微鏡下で得
ることができる。しかも、本発明に係る偏光性測定装置
のような顕微鏡下であっても、偏光応答補正を行うこと
で高精度な偏光性の測定を行うことができる。

なお、以上の実施形態の説明においては、偏光解消イ
メージングを例にして偏光性測定について説明したが、
２次元（イメージング）に限られるものではなく、０次
元（ポイント）や１次元の偏光性測定にも本発明は適用
可能であり、また、偏光解消の測定に限られるものでは
ない。また、試料に励起光を照射して発生した蛍光の偏
光性の測定について述べたが、ラマン散乱光の偏光性の
測定についても全く同様である。

産業上の利用可能性 以上のように、本発明に係る偏光性測定方法および装
置は、試料に第１の光束（励起光、照射光）が照射され
て発生した第２の光束（蛍光、ラマン散乱光）の偏光性
の２次元画像を顕微鏡下で測定することができる。した
がって、例えば、本発明が蛍光偏光解消イメージングに
用いられる場合には、ターゲットに結合した蛍光プロー
ブが存在する位置を高精度に特定することができ、試料
中のターゲットの挙動等を解析することができるので、
例えば細胞における諸機能の解明に貢献し得るものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−109949（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−12881（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−182341（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−209343（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−117439（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01J 4/00 ＪＯＩＳ

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料に照射する第１の光束および前記試料
   から発生する第２の光束のうち何れか一方を反射し他方
   を透過する光束分岐手段を用いて、前記第１の光束を前
   記光束分岐手段を経て前記試料に照射し、該照射により
   前記試料から発生し前記光束分岐手段を経た前記第２の
   光束の偏光性を測定する偏光性測定方法であって、 前記第１の光束を前記光束分岐手段に対してｐ偏光とし
   て前記試料に照射したときに発生する前記第２の光束の
   ｐ偏光成分の強度I_ppおよびｓ偏光成分の強度I_psを測定
   する第１のステップと、 前記第１の光束を前記光束分岐手段に対してｓ偏光とし
   て前記試料に照射したときに発生する前記第２の光束の
   ｐ偏光成分の強度I_spおよびｓ偏光成分の強度I_ssを測定
   する第２のステップと、 偏光応答補正因子Ｇを Ｇ＝［（I_pp・I_sp）／（I_ps・I_ss）］^1/2 なる式により求める第３のステップと、 前記偏光応答補正因子Ｇに基づいて偏光応答補正を行っ
   て前記第２の光束の偏光性を求める第４のステップと、 を備えることを特徴とする偏光性測定方法。
2. 【請求項２】前記第２のステップは、前記第１のステッ
   プの測定時と同じ配置の前記試料に対して前記第１の光
   束を照射する、ことを特徴とする請求の範囲第１項記載
   の偏光性測定方法。
3. 【請求項３】前記第１のステップは、前記所定方向を中
   心軸とする所定回転角度位置にある前記試料に対して前
   記第１の光束を照射し、 前記第２のステップは、前記中心軸について前記所定回
   転角度位置とは90度異なる回転角度位置にある前記試料
   に対して前記第１の光束を照射する、 ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の偏光性測定方
   法。
4. 【請求項４】前記第４のステップは、前記第２の光束の
   偏光性Ｐを P₁（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋Ｇ・I_ps） または、 P₁（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋I_sp） なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第１
   項記載の偏光性測定方法。
5. 【請求項５】前記第４のステップは、前記第２の光束の
   偏光性Ｐを P₂（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋２・Ｇ・I_ps） または、 P₂（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋２・I_sp） なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第１
   項記載の偏光性測定方法。
6. 【請求項６】前記第４のステップは、前記第２の光束の
   偏光性Ｐを P₃（ｐ）＝１−Ｇ・（I_ps/I_pp） または、 P₃（ｓ）＝Ｇ−（I_sp/I_ss） なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第１
   項記載の偏光性測定方法。
7. 【請求項７】前記第４のステップは、前記第２の光束の
   偏光性Ｐを P₄（ｐ）＝（I_pp/I_ps）−1G または、 P₄（ｓ）＝Ｇ・（I_ss/I_sp）−１ なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第１
   項記載の偏光性測定方法。
8. 【請求項８】前記第１の光束は、前記試料により多光子
   吸収され得る波長を光束であり、前記第２の光束は、そ
   の多光子吸収に伴い発生する光束である、ことを特徴と
   する請求の範囲第１項記載の偏光性測定方法。
9. 【請求項９】試料に照射する第１の光束および前記試料
   から発生する第２の光束のうち何れか一方を反射し他方
   を透過する光束分岐手段を用いて、前記第１の光束を前
   記光束分岐手段を経て前記試料に照射し、該照射により
   前記試料から発生し前記光束分岐手段を経た前記第２の
   光束の偏光性を測定する偏光性測定装置であって、 試料に照射する直線偏光の第１の光束を出力する光源部
   と、 前記光源部から出力された前記第１の光束の偏光方位を
   回転させる偏光方位回転手段と、 前記第１の光束が前記試料に照射されて発生した光束の
   うち前記光束分岐手段を経た前記第２の光束のｐ偏光成
   分およびｓ偏光成分それぞれの強度を検出する検出手段
   と、 前記偏光方位回転手段により前記光束分岐手段に対して
   ｐ偏光とされた前記第１の光束が前記試料に照射された
   ときに前記検出手段により検出された前記第２の光束の
   ｐ偏光成分の強度I_ppおよびｓ偏光成分の強度I_ps、並び
   に、前記偏光方位回転手段により前記光束分岐手段に対
   してｓ偏光とされた前記第１の光束が前記試料に照射さ
   れたときに前記検出手段により検出された前記第２の光
   束のｐ偏光成分の強度I_spおよびｓ偏光成分の強度I_ssに
   基づいて、 Ｇ＝［（I_pp・I_sp）／（I_ps・I_ss）］^1/2 なる式により偏光応答補正因子Ｇを求める補正因子演算
   手段と、 前記偏光応答補正因子Ｇに基づいて偏光応答補正を行っ
   て前記第２の光束の偏光性を求める偏光性演算手段と、 を備えることを特徴とする偏光性測定装置。
10. 【請求項１０】前記補正因子演算手段は、一定配置にあ
    る前記試料について前記検出手段により検出された前記
    強度I_pp,I_ps,I_spおよびI_ssそれぞれに基づいて、前記偏
    光応答補正因子Ｇを求める、ことを特徴とする請求の範
    囲第９項記載の偏光性測定装置。
11. 【請求項１１】前記所定方向を中心軸として前記試料を
    回転させる試料回転手段を更に備え、 前記補正因子演算手段は、前記中心軸について所定回転
    角度位置にある前記試料について前記検出手段により検
    出された前記強度I_ppおよびI_ps、並びに、前記試料回転
    手段により前記中心軸について前記所定回転角度位置と
    は90度異なる回転角度位置に設定された前記試料につい
    て前記検出手段により検出された前記強度I_spおよびI_ss
    に基づいて、前記偏光応答補正因子Ｇを求める、ことを
    特徴とする請求の範囲第９項記載の偏光性測定装置。
12. 【請求項１２】前記偏光性演算手段は、前記第２の光束
    の偏光性Ｐを P₁（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋Ｇ・I_ps） または、 P₁（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋I_sp） なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第９
    項記載の偏光性測定装置。
13. 【請求項１３】前記偏光性演算手段は、前記第２の光束
    の偏光性Ｐを P₂（ｐ）＝（I_pp−Ｇ・I_ps）／（I_pp＋２・Ｇ・I_ps） または、 P₂（ｓ）＝（Ｇ・I_ss−I_sp）／（Ｇ・I_ss＋２・I_sp） なる式による求める、ことを特徴とする請求の範囲第９
    項記載の偏光性測定装置。
14. 【請求項１４】前記偏光性演算手段は、前記第２の光束
    の偏光性Ｐを P₃（ｐ）＝１−Ｇ・（I_ps/I_pp） または、 P₃（ｓ）＝Ｇ−（I_sp/I_ss） なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第９
    項記載の偏光性測定装置。
15. 【請求項１５】前記偏光性演算手段は、前記第２の光束
    の偏光性Ｐを P₄（ｐ）＝（I_pp/I_ps）−Ｇ または、 P₄（ｓ）＝Ｇ・（I_ss/I_sp）−１ なる式により求める、ことを特徴とする請求の範囲第９
    項記載の偏光性測定装置。
16. 【請求項１６】前記光源部は、前記試料により多光子吸
    収され得る波長の光束を前記第１の光束として出力する
    とともに、前記検出手段は、その多光子吸収に伴い発生
    する光束を前記第２の光束として検出する、ことを特徴
    とする請求の範囲第９項記載の偏光性測定装置。
17. 【請求項１７】試料に照射する第１の光束を出力する光
    源部と、 前記第１の光束を前記試料に照射し、該照射により前記
    試料から発生した第２の光束を入力し、前記第１の光束
    および前記第２の光束のうち何れか一方を反射し他方を
    透過する第１の光束分岐手段と、 前記第１の光束分岐手段の分光特性と等しい分光特性を
    有し、前記第１の光束分岐手段における前記第２の光束
    に対する入射面と90度異なる入射面を有し、前記第１の
    光束分岐手段から出力された前記第２の光束を入力する
    第２の光束分岐手段と、 前記第２の光束分岐手段を経た前記第２の光束のｐ偏光
    成分およびｓ偏光成分それぞれの強度を検出する検出手
    段と、 前記検出手段により検出された前記第２の光束のｐ偏光
    成分およびｓ偏光成分それぞれの強度に基づいて前記第
    ２の光束の偏光性を測定する偏光性演算手段と、 を備えることを特徴とする偏光性測定装置。