ES2845077T3

ES2845077T3 - Microscopía de dispersión interferométrica

Info

Publication number: ES2845077T3
Application number: ES17742521T
Authority: ES
Inventors: Philipp Kukura; Alexander Weigel
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: EP3923054A1; EP3485309A1; GB2552195A; KR102402863B1; US20200386975A1; LT3485309T; US20230359009A1; CN109477955A; EP3485309B1; JP7260467B2; CN109477955B; GB201612182D0; JP2019520612A; US20190004299A1; US10775597B2; KR20190028448A; WO2018011591A1

Abstract

Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común que comprende: un portamuestras (2) para contener una muestra en una ubicación de muestra; una fuente (4) de iluminación dispuesta para proporcionar luz de iluminación; un detector (5); y un sistema (10) óptico que está dispuesto para dirigir la luz de iluminación sobre la ubicación de la muestra y está dispuesto para recoger la luz de salida en reflexión, la luz de salida comprende tanto la luz dispersada desde la ubicación de la muestra como la luz de iluminación reflejada desde la ubicación de la muestra, y para dirigir la luz de salida al detector; y caracterizado por un filtro (14) espacial posicionado para filtrar la luz de salida, estando dispuesto el filtro espacial para dejar pasar la luz de salida pero con una reducción en la intensidad que es mayor dentro de una apertura numérica predeterminada que en aperturas numéricas más grandes.

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopía de dispersión interferométrica

La presente invención se refiere a la microscopía de dispersión interferométrica (denominada en el presente documento iSCAT).

La iSCAT se ha materializado como un enfoque poderoso para el seguimiento de partículas individuales con una resolución espacio-temporal única y una sensibilidad sin etiquetas hasta el nivel de una sola molécula. La iSCAT está descrita, por ejemplo, en Kukura et al., "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 20096:923-935, y en Ortega-Arroyo et al. "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636. A pesar del considerable potencial, la aplicación generalizada de iSCAT se ha visto limitada por el requisito de microscopios hechos a medida, cámaras no convencionales e iluminación de muestras complejas, lo que limita las capacidades de iSCAT para la detección, obtención de imágenes y caracterización robustas y precisas de objetos tan pequeños como moléculas individuales. Un aparato iSCAT adicional se conoce de Andrecka et al., "Direct Observation and Control of Supported Lipid Bilayer Formation with Interferometric Scattering Microscopy", Vol. 7, No. 12, 10662 10670, ACS Nano.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un microscopio de dispersión interferométrica de trayectoria común que comprende: un portamuestras para sujetar una muestra en una ubicación de muestra; una fuente de iluminación dispuesta para proporcionar luz de iluminación; un detector; y el sistema óptico está dispuesto para dirigir la luz de iluminación hacia la ubicación de la muestra y está dispuesto para recoger la luz de salida en la reflexión, comprendiendo la luz de salida tanto la luz dispersada desde la ubicación de la muestra como la luz de iluminación reflejada desde la ubicación de la muestra, y dirigir la luz de salida al detector; en donde un filtro espacial está posicionado para filtrar la luz de salida, estando el filtro espacial dispuesto para dejar pasar la luz de salida pero con una reducción en la intensidad que es mayor dentro de una apertura numérica predeterminada que en aperturas numéricas más grandes.

Si bien la disposición general del microscopio puede ser similar a la de un microscopio iSCAT convencional, también se proporciona un filtro espacial, que afecta la luz de salida. Específicamente, el filtro espacial deja pasar la luz de salida pero con una reducción de intensidad que es mayor dentro de una apertura numérica predeterminada que en aperturas numéricas más grandes. Como resultado, el filtro espacial reduce selectivamente la intensidad de la luz iluminadora sobre la luz dispersa, aprovechando el desajuste entre la apertura numérica de la luz iluminadora reflejada y la luz dispersa de los objetos en una muestra en la ubicación de la muestra. Así, el filtro espacial aprovecha las diferentes direccionalidades de estas dos fuentes de luz. La luz de iluminación reflejada tendrá típicamente una apertura numérica relativamente pequeña, mientras que los objetos del tamaño de una subdifracción cerca de una superficie de la muestra dispersan la luz preferentemente en aperturas numéricas altas. Por lo tanto, la reducción de la intensidad por el filtro espacial en aperturas numéricas bajas afecta predominantemente a la luz de iluminación y tiene un efecto mínimo sobre la luz dispersa, maximizando así el contraste de la imagen.

Este efecto puede maximizarse disponiendo el filtro espacial de modo que la apertura numérica predeterminada sea idéntica o similar a la apertura numérica de la luz de iluminación reflejada desde la ubicación de la muestra.

El primer aspecto de la presente invención se refiere a un microscopio que opera en reflexión. En ese caso, la luz de iluminación que llega al detector se refleja predominantemente desde una superficie de la muestra, típicamente una interfaz entre la muestra y el portamuestras, proporcionando así interferencia con los objetos de la muestra cercanos a esa superficie. Esto proporciona una imagen con alto contraste. Este efecto difiere de un microscopio que opera en transmisión en donde la luz iluminadora que llega al detector se transmite a través de la profundidad de la muestra.

El funcionamiento en reflexión tiene varias ventajas, que en conjunto permiten una detección y cuantificación de alto rendimiento de objetos de dispersión débil. En primer lugar, una cantidad relativamente pequeña, normalmente sólo el 0.5%, de la luz de iluminación se refleja en la interfaz vidrio-agua comúnmente empleada, mientras que una cantidad significativamente mayor, normalmente superior al 90%, de luz dispersada por un objeto nanoscópico en la interfaz es dispersos hacia la dirección de iluminación. Esto mejora intrínsecamente la relación entre los campos de luz dispersos y reflejados más de 1000 veces en comparación con una geometría de transmisión, lo que da como resultado un mayor contraste interferométrico. Como resultado, es necesario detectar tres órdenes de magnitud de fotones menos en el caso de ruido de disparo limitado para lograr la misma relación señal/ruido nominal dado un dispersor, intensidad de iluminación y tiempo de exposición específicos. En segundo lugar, en la reflexión, la detección es mucho menos sensible a los grandes dispersores presentes en la solución, ya que la dispersión hacia adelante y su interferencia con la luz de iluminación no se detecta, lo que provoca un mayor rechazo del fondo.

Estos factores mejoran la calidad de la imagen y, por lo tanto, permiten la detección de alto contraste de objetos que se dispersan débilmente.

Estas ventajas se aplican particularmente a la obtención de imágenes de objetos que dispersan la luz tan débilmente que es imposible obtener imágenes exactas y precisas con otras técnicas. Por ejemplo, la presente invención es particularmente adecuada para objetos que tienen una masa de 5000 kDa o menos.

De manera similar, la presente invención se puede aplicar con ventaja a una muestra que comprende objetos que tienen una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-17 m2 o menos. Típicamente, tales objetos también pueden tener una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10 26 m2 o más, es decir, dentro de un rango de 10-17 m2 desde 10-26 m2 Los ejemplos de objetos que pueden estudiarse incluyen proteínas o pequeños agregados de las mismas.

Para obtener imágenes de objetos que son dispersores muy débiles, el filtro espacial está dispuesto para dejar pasar la luz de salida con una reducción de intensidad dentro de la apertura numérica predeterminada a 10-2 de la intensidad incidente o menos. Normalmente, el filtro espacial puede estar dispuesto para dejar pasar la luz de salida con una reducción de intensidad dentro de la apertura numérica predeterminada a 10-4 de la intensidad incidente o más, por ejemplo en el rango de 10-2 a 10-4 de la intensidad incidente.

La luz de iluminación puede ser espacial y temporalmente coherente, por ejemplo, utilizando un láser como fuente de luz. La iluminación de campo amplio en un microscopio se logra comúnmente enfocando un rayo láser colimado en el plano focal posterior del objetivo de imagen, lo que implica que se puede acoplar de manera eficiente dentro y fuera del microscopio mientras afecta mínimamente el rendimiento general de la imagen.

El microscopio puede ser un microscopio comercial existente, que se adapta incorporando el filtro espacial. Dicha adaptación se puede realizar de forma muy económica y sencilla, a diferencia de los microscopios iSCAT existentes, que tienen configuraciones ópticas y electrónicas complejas y costosas para proporcionar la sensibilidad requerida, por ejemplo, incluidos los requisitos para una mesa óptica, o componentes ópticos y electrónicos costosos y complejos y operación experta, cuyos requisitos se reducen significativamente o se evitan por completo incorporando un filtro espacial en un microscopio comercial existente. Eso permite que la presente invención se implemente de una manera extremadamente rentable. Por ejemplo, se pueden proporcionar campos de visión más grandes sin configuraciones de exploración complejas y se permite el uso de cámaras de imágenes de bajo coste sin pérdida de rendimiento o sensibilidad de imágenes.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para adaptar un microscopio de dispersión interferométrica de trayectoria común realizando un filtrado espacial de la luz de salida, siendo el filtrado espacial similar al realizado en el primer aspecto.

Para permitir una mejor comprensión, las realizaciones de la presente invención se describirán ahora a modo de ejemplo no limitativo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es un diagrama esquemático de un microscopio iSCAT;

La Figura 2 es una imagen capturada por el microscopio iSCAT; y

Las Figuras 3 a 6 son diagramas esquemáticos de microscopios iSCAT modificados;

La Figura 7 es un gráfico del contraste de dispersión frente al peso molecular de la secuencia para una serie de proteínas derivadas utilizando el microscopio mostrado en la Figura 6 ;

Figuras 8 y 9 son histogramas de masas para avidina en ausencia y presencia de biotina, respectivamente, obtenidos usando el microscopio mostrado en la Figura 6 ; y

La Figura 10 es un histograma de masas para la albúmina de suero bovino derivada usando el microscopio mostrado en la Figura 6.

En los microscopios y métodos descritos en el presente documento, la luz utilizada puede ser: luz ultravioleta (que puede definirse en el presente documento por tener longitudes de onda en el intervalo de 10 nm a 380 nm); luz visible (que puede definirse aquí como que tiene longitudes de onda en el intervalo de 380 nm a 740 nm); luz infrarroja (que puede definirse aquí como que tiene longitudes de onda en el intervalo de 740 nm a 300 pm). La luz puede ser una mezcla de longitudes de onda. Aquí, los términos "óptico" y "óptica" se utilizan para referirse en general a la luz a la que se aplican los métodos.

La Figura 1 ilustra un microscopio iSCAT 1 que está dispuesto como sigue.

El microscopio 1 incluye los siguientes componentes que, a excepción del filtro espacial que se describe con más detalle a continuación, tienen una construcción que es convencional en el campo de la microscopía.

El microscopio 1 comprende un portamuestras 2 para sujetar una muestra 3 en una ubicación de muestra. La muestra 3 puede ser una muestra líquida que comprende los objetos de los que se van a formar imágenes, que se describen con más detalle a continuación. El portamuestras 2 puede adoptar cualquier forma adecuada para contener la muestra 3. Normalmente, el portamuestras 2 sostiene la muestra 3 sobre una superficie, que forma una interfaz entre el portamuestras 2 y la muestra 3. Por ejemplo, el portamuestras 2 puede ser un cubreobjetos y/o puede estar hecho de vidrio. La muestra 3 se puede proporcionar en el portamuestras 2 de una manera sencilla, por ejemplo usando una micropipeta.

El microscopio 1 comprende además una fuente 4 de luz y un detector 5.

La fuente 4 de luz está dispuesta para proporcionar luz de iluminación. La luz que ilumina puede ser luz coherente. Por ejemplo, la fuente 4 de luz puede ser un láser. La longitud de onda de la luz de iluminación puede seleccionarse dependiendo de la naturaleza de la muestra 3 y/o de las propiedades por examinar. En un ejemplo, la luz que ilumina tiene una longitud de onda de 405 nm.

Opcionalmente, la luz de iluminación puede modularse espacialmente, para eliminar los patrones de moteado que surgen de la naturaleza coherente de la iluminación y el ruido del láser, por ejemplo, como se detalla en Kukura et al., "High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 20096:923-935.

El detector 5 recibe luz de salida en reflexión desde la ubicación de la muestra. Normalmente, el microscopio 1 puede funcionar en un modo de campo amplio, en cuyo caso el detector 5 puede ser un sensor de imagen que captura una imagen de la muestra 3. El microscopio 1 puede funcionar alternativamente en un modo confocal, en cuyo caso el detector 5 puede ser un sensor de imagen o puede ser un detector puntual, tal como un fotodiodo, en cuyo caso se puede usar una disposición de exploración para explorar una región de la muestra 3 para construir una imagen. Ejemplos de sensores de imagen que pueden emplearse como detector 5 incluyen un sensor de imagen CMOS (semiconductor complementario de óxido de metal) o un CCD (dispositivo de carga acoplada).

El microscopio 1 comprende además un sistema 10 óptico dispuesto entre el portamuestras 2, la fuente 4 de luz y el detector 5. El sistema 10 óptico está dispuesto de la siguiente manera para dirigir la luz de iluminación sobre la ubicación de la muestra para iluminar la muestra 3, y recoger la luz de salida en reflexión desde la ubicación de la muestra y para dirigir la luz de salida al detector 5.

El sistema 10 óptico incluye una lente 11 objetivo que es un sistema de lentes dispuesto delante del portamuestras 2. El sistema 10 óptico también incluye una lente 12 condensadora y una lente 13 de tubo.

La lente 12 condensadora condensa la luz de iluminación de la fuente 4 de luz (mostrada por líneas continuas en la Figura 1) a través de la lente 11 objetivo sobre la muestra 3 en la ubicación de la muestra.

La lente 11 objetivo recoge la luz de salida que comprende tanto (a) luz de iluminación reflejada desde la ubicación de la muestra (mostrada por líneas continuas en la Figura 1), como (b) luz dispersada desde la muestra 3 en la ubicación de la muestra (mostrada con puntos líneas en la Figura 1). La luz reflejada se refleja predominantemente desde la interfaz entre el portamuestras 2 y la muestra 3. Normalmente, se trata de una reflexión relativamente débil, por ejemplo, una reflexión de vidrio-agua. Por ejemplo, la intensidad de la luz iluminante reflejada puede ser del orden del 0.5% de la intensidad de la luz iluminante incidente. La luz dispersa es dispersada por objetos en la muestra 3.

De manera similar a la iSCAT convencional, la luz dispersa de objetos en o cerca de la superficie de la muestra interfiere de manera constructiva con la luz reflejada y, por lo tanto, es visible en la imagen capturada por el detector 5. Este efecto difiere de un microscopio que opera en transmisión en donde la luz que ilumina que llega al detector se transmite a través de la profundidad de la muestra, lo que genera un contraste de imagen mucho menor.

Como se muestra en la Figura 1, la luz de iluminación reflejada y la luz dispersa tienen diferentes direccionalidades. En particular, la luz de iluminación reflejada tiene una apertura numérica resultante de la geometría del haz de luz emitida por la fuente 4 de luz y el sistema 6 óptico. La luz dispersa se dispersa en una amplia gama de ángulos y, por lo tanto, llena una apertura numérica mayor que la luz iluminadora reflejada.

La lente 13 de tubo enfoca la luz de salida de la lente 11 objetivo sobre el detector 5.

El sistema 6 óptico también incluye un divisor 14 de haces que está dispuesto para dividir las trayectorias ópticas para la luz de iluminación de la fuente 4 de luz y la luz de salida dirigida al detector 5. Excepto por la provisión de un filtro espacial como se describe a continuación, el divisor 14 de haces puede tener una construcción convencional que proporcione una reflexión parcial y una transmisión parcial de la luz incidente sobre el mismo. Por ejemplo, el divisor 14 de haces puede ser una placa, normalmente provista de una película, que puede ser metálica o dieléctrica, dispuesta a 45° con respecto a las trayectorias ópticas. Alternativamente, el divisor 14 de haces puede ser un divisor de haces de cubo formado por un par de prismas emparejados que tienen una película parcialmente reflectante en la interfaz entre los prismas. Alternativamente, el divisor 14 de haces puede ser un divisor de haces polarizador, usado en combinación con una placa de cuarto de onda entre el divisor 14 de haces y la muestra 3.

En el ejemplo que se muestra en la Figura 1, la fuente 4 de luz está desplazada de la trayectoria óptica de la lente 11 objetivo de modo que la luz de iluminación de la fuente 4 de luz es reflejada por el divisor 14 de haces en la lente 11 objetivo, y a la invenrsa el detector 5 está alineado con la trayectoria óptica de la lente 11 objetivo de modo que la luz de salida desde la ubicación de la muestra se transmite a través del divisor 14 de haces hacia el detector 5.

Además de los componentes descritos anteriormente que pueden ser de una construcción convencional, el microscopio 1 incluye un filtro 20 espacial. En el ejemplo mostrado en la Figura 1, el filtro 20 espacial se forma en el divisor 14 de haces y por lo tanto se coloca detrás de la apertura posterior de la lente 11 objetivo, y así directamente detrás del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo. Por tanto, el filtro 20 espacial puede implementarse sin entrar en la lente objetivo como en la microscopía de contraste de fase. Colocar el filtro espacial directamente detrás de la apertura de entrada del objetivo en lugar de en un plano conjugado (por ejemplo, como se describe a continuación) tiene la clara ventaja de suprimir fuertemente los reflejos posteriores que se originan en las numerosas lentes dentro de los objetivos de microscopio de alta apertura numérica. Esto, a su vez, reduce el ruido de la imagen, disminuye el fondo no interferométrico y reduce la complejidad experimental, el número de ópticas y la longitud de la trayectoria óptica, lo que conduce a aumentar la estabilidad de la configuración óptica y, por lo tanto, la calidad de la imagen.

Sin embargo, esta ubicación no es esencial y se puede proporcionar un filtro espacial que tenga una función equivalente en otro lugar como se describe a continuación.

El filtro 20 espacial se posiciona de este modo para filtrar la luz de salida que pasa al detector 5. En el ejemplo mostrado en la Figura 1 en donde el detector 5 está alineado con la trayectoria óptica de la lente 11 objetivo, el filtro 20 espacial es por lo tanto transmisivo.

El filtro 20 espacial es parcialmente transmisor y por lo tanto deja pasar la luz de salida, que incluye la luz de iluminación reflejada, pero con una reducción de intensidad. El filtro 20 espacial también está alineado con el eje óptico y tiene una apertura predeterminada de modo que proporciona una reducción en la intensidad dentro de una apertura numérica predeterminada. En este documento, la apertura numérica se define en su forma normal como una cantidad adimensional que caracteriza una gama de ángulos con respecto a la ubicación de la muestra desde la que se origina la luz de salida. Específicamente, la apertura numérica NA puede definirse mediante la ecuación NA=msen(9), donde 0 es el medio ángulo de recolección y n es el índice de refracción del material a través del cual pasa la luz de salida (por ejemplo, el material de los componentes del sistema 6 óptico).

El filtro 20 espacial no proporciona reducción de intensidad fuera de la apertura numérica predeterminada. En principio, el filtro 20 espacial podría proporcionar alternativamente una reducción en la intensidad fuera de su apertura predeterminada, pero una reducción en la intensidad que sea menor que la reducción en la intensidad dentro de la apertura numérica predeterminada, aunque esto es menos deseable.

El filtro 20 espacial puede formarse de cualquier manera adecuada, comprendiendo típicamente una capa de material depositado. El material puede ser, por ejemplo, un metal como la plata. La deposición se puede realizar utilizando cualquier técnica adecuada.

Como los objetos de tamaño de subdifracción cerca de una interfaz dispersan la luz preferentemente en una apertura numérica mayor que la luz iluminadora reflejada, la reducción en la intensidad proporcionada por el filtro 20 espacial reduce preferentemente la intensidad en la detección de la luz iluminadora reflejada sobre la luz dispersa. Por consiguiente, la reducción de intensidad por el filtro 20 espacial a aperturas numéricas bajas afecta predominantemente a la luz iluminadora reflejada y tiene un efecto mínimo sobre la luz dispersa, maximizando así el contraste en la imagen de captura. El contraste de imagen mejorado permite la detección de alto contraste de objetos que son dispersores débiles.

La mejora del contraste puede entenderse como sigue. A medida que el filtro 20 espacial deja pasar parte de la luz de salida a la apertura numérica predeterminada (es decir, es parcialmente transmisiva en este ejemplo), fracciones de luz de iluminación y campos de luz dispersa llegan al detector e interfieren para una fuente de iluminación suficientemente coherente. La intensidad de la luz que llega al detector Idet viene dada por Idet = |Enc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cos0}, donde Enc es el campo de luz incidente, r2 es la reflectividad de la interfaz y t2 es la transmisividad del filtro 20 espacial, s es la amplitud de dispersión del objeto, y O es la diferencia de fase entre la luz de iluminación transmitida y la luz dispersa. Por tanto, se mejora el contraste de dispersión, aunque a expensas del número total de fotones detectados.

Por tanto, el contraste se proporciona de manera similar al iSCAT convencional, pero controlado adicionalmente por la transmisividad del filtro espacial. Esto proporciona la capacidad de sintonizar la amplitud del campo de referencia directamente mediante la selección de la transmisividad t2 del filtro 20 espacial en lugar de ser fijado por la reflectividad de una interfaz vidrio-agua como en iSCAT estándar. En el caso de que el filtro 20 espacial sea una capa de material depositado, la transmisividad t2 puede seleccionarse mediante la elección del material y/o el espesor de la capa. Tal ajuste se puede realizar de acuerdo, por ejemplo, con el objeto de dispersión de interés, la capacidad total del recinto de la cámara y el aumento.

Para maximizar estos efectos beneficiosos para iSCAT, la apertura numérica predeterminada puede ser la apertura numérica de la luz de iluminación reflejada dentro de la luz de salida, pero eso no es esencial. Por ejemplo, podrían lograrse beneficios de naturaleza similar si la apertura numérica predeterminada fuera ligeramente menor o mayor que la apertura numérica de la luz de iluminación reflejada.

El uso del filtro 20 espacial no altera fundamentalmente los límites de sensibilidad o SNR (relación señal/ruido) que se pueden lograr para la dispersión por un objeto dado, la intensidad de la luz incidente y el tiempo de exposición. Sin embargo, al mejorar el contraste y reducir el flujo de fotones detectado en general, se simplifica drásticamente la implementación de iSCAT para lograr una sensibilidad o SNR determinada. Los microscopios iSCAT existentes tienen componentes complejos y costosos, por ejemplo, que requieren una mesa óptica y componentes electrónicos y ópticos costosos y complejos, además de que requieren una operación experta. Estos requisitos se relajan en gran medida con el uso del filtro 20 espacial. Se puede lograr un rendimiento equivalente al de los microscopios iSCAT existentes, por ejemplo, simplemente agregando el filtro 20 espacial a un microscopio comercial existente que no tenga los componentes complejos y costosos mencionados anteriormente. El filtro 20 espacial en sí mismo es, por supuesto, un componente simple y económico. Además, el filtro 20 espacial permite el uso de cámaras CMOS o CCD estándar con baja capacidad de recinto completo sin pérdida de sensibilidad de imagen.

Por tanto, el microscopio 1 puede ser un microscopio comercial existente, que se adapta incorporando el filtro 20 espacial. Tal adaptación se puede realizar de forma muy económica y sencilla. La adaptación se puede realizar formando el filtro espacial en un adaptador dispuesto para ser recibido en una ranura accesoria de un microscopio comercial existente, por ejemplo de manera similar al adaptador descrito en el documento WO-2015/092778 que se usa para incorporar un espejo en un microscopio.

Alternativamente, el microscopio 1 puede diseñarse específicamente para su uso con el filtro 20 espacial.

En la Figura 2 se muestra una imagen adquirida usando un ejemplo del microscopio 1. En este ejemplo, se proporcionó una luz de iluminación de campo claro coherente y el filtro 20 espacial comprendido por una capa de plata de 180 nm de espesor depositada sobre sílice fundida con una capa de 3.5 mm. de diámetro para transmitir 1^ 10-2 de la intensidad de la luz reflejada. Esto da como resultado un contraste de dispersión del 1% para una única proteína de 395 kDa y una SNR de 10 (a una tasa de captura de imagen de 10 fotogramas s-1, y con una intensidad de luz de iluminación de 10 kW/cm2). La Figura 2 es una imagen capturada usando una cámara CMOS de bajo coste como el detector 5. Como puede verse, se logra una imagen de alto contraste. Además, la iluminación de campo claro asegura que los reflejos de fondo no deseados más fuertes, normalmente originados en el objetivo, se dirijan lejos del detector 5, minimizando el fondo de imagen y permitiendo grandes campos de visión sin un escaneo complejo del haz de luz iluminadora.

Las ventajas del contraste mejorado permiten obtener imágenes de objetos que dispersan la luz de manera tan débil que la imagen con otras técnicas es difícil. Por ejemplo, la presente invención puede aplicarse con ventaja a una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 5000 kDa o menos. Normalmente, la presente invención se puede aplicar a una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 10 kDa o más, por ejemplo objetos que tienen una masa dentro de un intervalo de 10 kDa a 5000 kDa.

Alternativamente o también, la presente invención se puede aplicar a una muestra que comprenda objetos que tengan una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-12 m2 o menos, o más preferiblemente de 10-17 m2 o menos. Normalmente, dichos objetos también pueden tener una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación. Típicamente, tales objetos también pueden tener una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-20 m2, o más preferiblemente de 10-26 m2 o más, por ejemplo dentro de un rango de 10-17 m2 desde 10-26 m2 La sección transversal de dispersión es una propiedad fundamental y medible relacionada con el tamaño efectivo de un objeto a la luz incidente de una longitud de onda particular, independientemente de la técnica utilizada para medirla. Las secciones transversales de dispersión se pueden medir, por ejemplo, mediante microscopía de campo oscuro.

Los ejemplos de objetos a los que se puede aplicar la presente invención incluyen proteínas o pequeños agregados de las mismas, o sus compañeros de unión.

Para obtener imágenes de objetos que son dispersores relativamente débiles, el filtro 20 espacial puede estar dispuesto para que pase la luz reflejada de iluminación con una reducción de intensidad dentro de la apertura numérica predeterminada a una intensidad en el rango de 10-2 a 10-4 de la intensidad incidente (en este contexto, la intensidad de la luz de salida que incide en el filtro 20 espacial).

De lo contrario, el microscopio 1 puede diseñarse y operarse sin referencia al filtro 20 espacial. Por ejemplo, el campo de visión es ajustable cambiando las condiciones de enfoque de la luz de iluminación. De manera similar, la formación de imágenes multicolor no requiere más que acoplar fuentes de láser adicionales en una fibra monomodo, si dicha fibra se utiliza para entregar la luz de iluminación. En términos generales, el microscopio 1 puede adaptarse para utilizar otros componentes y técnicas conocidas para iSCAT, por ejemplo, como se describe en Kukura et al., "Highspeed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus", Nature Methods 2009 6:923-935, y en Ortega-Arroyo et al. "Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy", Physical Chemistry Chemical Physics 2012 14:15625-15636.

Algunos ejemplos de modificaciones específicas que se pueden hacer al microscopio 1 se describirán ahora con referencia a las Figuras 3 a 5, aunque estos ejemplos son sin limitación. Aparte de las modificaciones descritas a continuación, el microscopio 1 tiene la misma construcción y funcionamiento que los descritos anteriormente. Por brevedad, a los componentes comunes se les dan los mismos números de referencia, y la descripción anterior de los mismos no se repite.

La Figura 3 ilustra el microscopio 1 con una modificación para colocar el filtro 20 espacial en un plano 21 focal conjugado del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo, en lugar de estar detrás de la apertura posterior de la lente 11 objetivo. El plano 21 focal conjugado del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo está formado entre un par de lentes 22 y 23 telescópicas colocadas detrás de la lente 13 de tubo. La primera lente 22 telescópica en la trayectoria óptica toma imágenes del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo para formar el plano 21 focal conjugado y la segunda lente 23 del telescopio forma imágenes del plano 21 focal conjugado sobre el detector 5.

El filtro 20 espacial se proporciona en el plano 21 focal conjugado y se forma en una placa 24 transparente. La configuración y el funcionamiento del filtro 20 espacial son los mismos que los descritos anteriormente con referencia a la Figura 1, por ejemplo, estando alineado con el eje óptico y que tiene una apertura predeterminada para que proporcione una reducción en la intensidad dentro de la misma apertura numérica predeterminada como se describió anteriormente (aunque el filtro 20 espacial es ahora casi perpendicular a la trayectoria óptica, en lugar de a 45° de la trayectoria óptica).

La Figura 4 ilustra el microscopio 1 con una modificación en la que el filtro 20 espacial es reflectante, en lugar de transmisivo. En esta modificación, las posiciones de la fuente 4 de luz y el detector 5 se invierten de modo que la luz de iluminación de la fuente 4 de luz se transmite a través del divisor 14 de haces al lente 11 objetivo y, a la inversa, la luz de salida de la ubicación de la muestra es reflejada por el divisor 14 de haces hacia el detector 5.

El filtro 20 espacial está formado en el divisor 14 de haces, pero en vista de la inversión de la fuente 4 de luz y el detector 5, el filtro 20 espacial es reflectante. A pesar de ser reflectante, el filtro 20 espacial está dispuesto para funcionar de la misma manera que se describe anteriormente. Es decir, el filtro 20 espacial filtra la luz de salida que pasa al detector 5 y deja pasar la luz de salida pero con reducción de intensidad. Aunque se consigue en este caso siendo parcialmente reflectante, la configuración y el funcionamiento del filtro 20 espacial son por lo demás los mismos, por ejemplo, están alineados con el eje óptico y tienen una apertura predeterminada para que proporcionen una reducción de la intensidad dentro de una apertura numérica predeterminada, como se describió anteriormente.

La Figura 5 ilustra el microscopio 1 con una modificación similar a la de la Figura 3 para colocar el filtro 20 espacial en un plano 25 focal conjugado del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo, en lugar de estar detrás de la abertura posterior de la lente 11 objetivo, y con una modificación adicional en la que el filtro 20 espacial es reflectante, en lugar de transmisivo. El plano 25 focal conjugado del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo está formado entre un par de lentes 22 y 23 telescópicas colocadas detrás de la lente 13 de tubo, de la misma manera que en la modificación de la Figura 3. Sin embargo, se proporciona una placa 26 reflectante entre las lentes 22 y 23 telescópicas en el plano 25 focal conjugado pero dispuesta a 45° para desviar la trayectoria óptica de modo que la reflexión en la placa 26 reflectante desvíe la trayectoria óptica 90°. El filtro 20 espacial se proporciona en el plano 25 focal conjugado al estar formado en la placa 26 reflectante y, por lo tanto, es reflectante en lugar de transmisivo. A pesar de ser reflectante, el filtro 20 espacial está dispuesto para funcionar de la misma manera que se describió anteriormente, es decir, de una manera similar a la modificación de la Figura 4.

La Figura 6 ilustra el microscopio 1 con una modificación para colocar el filtro 20 espacial en un plano 21 focal conjugado del plano focal posterior de la lente 11 objetivo, en lugar de estar detrás de la apertura posterior de la lente 11 objetivo. El plano 21 focal conjugado del plano 15 focal posterior de la lente 11 objetivo está formado entre un par de lentes 22 y 23 telescópicas colocadas detrás de la lente 13 de tubo, de la misma manera que en la modificación de la Figura 3. Sin embargo, en comparación con la modificación de la Figura 3, también se realizan las siguientes modificaciones adicionales, señalando que cada una de las modificaciones de la Figura 6 podrían aplicarse independientemente unas de otras.

Un deflector 32 acústico-óptico está dispuesto después de la fuente 4 de luz para proporcionar una exploración de la luz de iluminación. El deflector 32 acústico-óptico puede operarse para escanear una región de la muestra 3 para construir una imagen y/o proporcionar modulación espacial para eliminar patrones de motas que surgen de la naturaleza coherente de la iluminación y el ruido láser, como se mencionó anteriormente.

La lente 12 condensadora se reemplaza por un par de lentes 30 y 31 telecéntricas que realizan la función de captar imágenes de cualquier modificación de la trayectoria del haz en el deflector 32 acústico-óptico en el plano focal posterior del objetivo de formación de imágenes.

Las posiciones de la fuente 4 de luz y el detector 5 se invierten de manera similar a la modificación de la Figura 4, de modo que la luz de iluminación de la fuente 4 de luz se transmite a través del divisor 14 de haces al lente 11 objetivo, y viceversa la luz de salida de la ubicación de la muestra es reflejada por el divisor 14 de haces hacia el detector 5.

El divisor 14 de haces es un divisor de haces polarizador y una placa 33 de cuarto de onda está dispuesta entre el divisor 14 de haces y la muestra 3, de modo que el divisor 14 de haces divide la luz.

Un espejo 34 está dispuesto para desviar la luz de salida reflejada por el divisor 14 de haces. Esto es simplemente para proporcionar una disposición más compacta del microscopio 1.

El microscopio 1 se puede utilizar para realizar iSCAT para una amplia gama de aplicaciones, incluida la detección de una sola molécula. En general, la mejora del contraste es beneficiosa y se puede aplicar a todas las imágenes de subdifracción y objetos de dispersión débil. Una aplicación particular es la obtención de imágenes sin etiquetas de dispersores débiles, donde los objetos de interés tienen que detectarse invariablemente sobre un fondo grande, lo que reduce el contraste de la imagen. El microscopio 1 se puede utilizar para una amplia gama de estudios y mediciones, por ejemplo, para medir cualquier cambio en el índice de refracción, que incluye, por ejemplo: unión/ desunión de una sola molécula, transiciones de fase, agolpamiento, ensamblaje/desensamblaje, agregación, interacciones proteína/proteína, interacciones proteína/molécula pequeña, imágenes sin etiquetas de alta sensibilidad.

Por tanto, existen numerosas aplicaciones para el microscopio 1, que van desde la investigación fundamental hasta aplicaciones industriales, por ejemplo en la industria farmacéutica. En particular, abre iSCAT a campos excluidos por las complejas configuraciones experimentales que se necesitan actualmente para realizar iSCAT. Por ejemplo, la iSCAT es actualmente el biosensor de imágenes de una sola molécula sin etiquetas más sensible del mundo, lo que podría tener un impacto significativo, por ejemplo, en el mercado de sensores de resonancia de plasmones superficiales. Además, funciona como un espectrómetro de masas de molécula única en solución, exacto, preciso y de alta resolución, con muchas aplicaciones en la investigación y la industria.

Ejemplos

Se han cuantificado importantes parámetros de rendimiento de exactitud, resolución y precisión utilizando una serie de muestras de proteínas en un microscopio que tiene la configuración que se muestra en la Figura 6 , como sigue.

La cuantificación de la precisión instrumental en la determinación del peso molecular se realizó registrando los contrastes de dispersión de una serie de proteínas disueltas a una concentración de 10 nM en regulador PBS estándar (las proteínas son Estreptavidina - 53 kDa, Albúmina de Suero Bovino - 66 kDa, Alcohol Deshidrogenasa - ~ 146 kDa, p-Amilasa - 224 kDa, HSP 16.5 - 395 kDa, miosina IIb no muscular modificada con una etiqueta HALO - 598 kDa, Tiroglobulina - 669 kDa, GroEL - 802 kDa). Los resultados se muestran en la Figura 7, que es un gráfico del contraste de dispersión frente al peso molecular de la secuencia y las barras de error asociadas. Los resultados exhiben un comportamiento altamente lineal como se esperaba dada la dependencia lineal del contraste iSCAT del volumen del objeto y el hecho de que todas las proteínas están hechas del mismo grupo de aminoácidos, que a su vez tienen un índice de refracción común y, por lo tanto, una sección transversal de dispersión. La variación observada entre la masa molecular esperada y la medida es en promedio del orden del 3% de la masa que se va a determinar. Esto demuestra un alto grado de precisión en la determinación del peso molecular de moléculas de proteína individuales utilizando el microscopio 1.

Se prevé que el microscopio 1 es capaz de cuantificar la masa de objetos tan pequeños como proteínas individuales con una precisión superior al 5% de su masa, independientemente de su composición en términos de aminoácidos, lípidos o carbohidratos.

Se prevé que el microscopio 1 es capaz de cuantificar cambios en la masa de objetos más pequeños que las técnicas existentes, por ejemplo, que tienen masas por debajo de 5000 kDa y por debajo de 10 kDa. La cuantificación de la precisión instrumental se realizó de la siguiente manera. La precisión en la determinación de la masa de un objeto usando el enfoque aquí descrito está estadísticamente limitada por la capacidad de determinar el centro de distribución de los contrastes de dispersión. Dado que la distribución registrada exhibe perfiles gaussianos como se esperaba para un proceso de ruido de disparo limitado, la precisión es bien conocida para escalar como sN'1/2, donde s es la desviación estándar de la distribución de interés y N el número de muestras tomadas. Como resultado, la precisión de la medición de masa no está limitada por la resolución o precisión, sino que, en principio, puede aumentarse arbitrariamente aumentando el número de mediciones. Para ilustrar esto, se registraron histogramas de masas de avidina en ausencia (6839 eventos) y presencia (6609 eventos) de biotina saturada en solución y los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9, respectivamente. Se midió un aumento de masa en presencia de biotina de 950±330 Da en comparación con los 970 Da esperados para cuatro moléculas de biotina unidas.

La cuantificación de la resolución instrumental y, en particular, los límites de resolución, se realizó registrando un histograma de masas utilizando la calibración obtenida de los resultados ilustrados en la Figura 6 de albúmina de suero bovino. El histograma resultante se muestra en la Figura 10 y exhibe picos discernibles individuales para monómeros, dímeros y trímeros en solución con una fwhm del pico de monómero de 28 kDa que conduce a una resolución de 34 kDa. Este valor es una función del número total de fotones detectados y, por lo tanto, puede mejorarse utilizando intensidades de luz más altas. Esto demuestra un alto grado de resolución de masa para el microscopio 1. Tomados en conjunto, estos resultados ilustran que el microscopio 1 es capaz de cuantificar diferencias de masa tan pequeñas como las inducidas por la unión de moléculas pequeñas y una caracterización exacta y precisa de la masa de un objeto a través de la polarización. Actualmente, esto permite la detección de proteínas individuales de hasta 40 kDa y la determinación precisa de su masa molecular dentro del 5% de su masa de secuencia (Figura 7). La alta SNR permite además la caracterización de cambios en la masa, por ejemplo a través de eventos de unión con una precisión que solo está limitada por el número de moléculas detectadas, que actualmente alcanza 250 Da (Figuras 8 y 9). Además, la alta SNR alcanzable permite la detección clara de diferentes estados oligoméricos de proteínas en solución, lo que permite una caracterización detallada de la agregación de proteínas (Figura 10).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común que comprende:

un portamuestras (2 ) para contener una muestra en una ubicación de muestra;

una fuente (4) de iluminación dispuesta para proporcionar luz de iluminación;

un detector (5); y

un sistema (10) óptico que está dispuesto para dirigir la luz de iluminación sobre la ubicación de la muestra y está dispuesto para recoger la luz de salida en reflexión, la luz de salida comprende tanto la luz dispersada desde la ubicación de la muestra como la luz de iluminación reflejada desde la ubicación de la muestra, y para dirigir la luz de salida al detector; y

caracterizado por un filtro (14) espacial posicionado para filtrar la luz de salida, estando dispuesto el filtro espacial para dejar pasar la luz de salida pero con una reducción en la intensidad que es mayor dentro de una apertura numérica predeterminada que en aperturas numéricas más grandes.

2. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la apertura numérica predeterminada es la apertura numérica de la luz iluminadora reflejada desde la ubicación de la muestra que está comprendida en la luz de salida.

3. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la apertura numérica predeterminada es menor que 1.

4. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la apertura numérica predeterminada es menor que 0.5.

5. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el filtro (14) espacial está dispuesto para dejar pasar la luz de salida con una reducción de intensidad dentro de dicha apertura numérica predeterminada a 10-2 de la intensidad incidente o menos.

6. Un microscopio de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el filtro (14) espacial está dispuesto para dejar pasar la luz de salida con una reducción de intensidad dentro de dicha apertura numérica predeterminada a 10-4 de la intensidad incidente o más.

7. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la luz de iluminación es espacial y temporalmente coherente.

8. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema óptico comprende un divisor de haces dispuesto para dividir las trayectorias ópticas para la luz de iluminación y la luz de salida, siendo el filtro espacial parte del divisor de haces.

9. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el filtro (14) espacial es transmisivo o en donde el filtro espacial es reflectante.

10. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema óptico (10) incluye una lente (11) objetivo y el filtro espacial está colocado directamente detrás de la abertura posterior de la lente objetivo o en donde el sistema óptico incluye una lente objetivo y el filtro (14) espacial se coloca en un plano focal conjugado del plano focal posterior de la lente objetivo.

11. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el portamuestras contiene una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 5000 kDa o menos.

12. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el portamuestras contiene una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 10 kDa o más.

13. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el portamuestras (2 ) sostiene una muestra que comprende objetos que tienen una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-17 m2 o menos.

14. Un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el portamuestras (2 ) sostiene una muestra que comprende objetos que tienen una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-26 m2 o más.

15. Un método de adaptación de un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común, caracterizado el método por comprender un filtro (14) espacial que realiza un filtrado espacial de la luz de salida en reflexión, cuya luz de salida comprende tanto la luz dispersada de una muestra (3 ) en una ubicación de muestra y luz de iluminación reflejada desde la ubicación de muestra, antes de la detección de la luz de salida, dejando pasar el filtrado espacial la luz de salida pero con una reducción de intensidad que es mayor dentro de una apertura numérica predeterminada que en aperturas numéricas más grandes.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la apertura numérica predeterminada es la apertura numérica de la luz iluminadora reflejada desde la ubicación de la muestra que está comprendida en la luz de salida.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde el filtro espacial está dispuesto para dejar pasar la luz de salida con una reducción de intensidad dentro de dicha apertura numérica predeterminada a 10-2 de la intensidad incidente o menos, o en donde el filtro espacial está dispuesto para pasar la luz de salida con reducción de intensidad dentro de dicha apertura numérica predeterminada a 10-4 de la intensidad incidente o más.

18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la apertura numérica predeterminada es menor que 1, preferiblemente menor que 0.5.

19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde la luz de iluminación es espacial y temporalmente coherente.

20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el portamuestras (2) contiene una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 5000 kDa o menos, o en donde el portamuestras contiene una muestra que comprende objetos que tienen una masa de 10 kDa o más.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde la muestra (3) comprende objetos que tienen una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-12 m2 o menos, o en donde la muestra comprende objetos que tienen una sección transversal de dispersión con respecto a la luz de iluminación de 10-20 m2 o más.

22. Un método para cuantificar la masa de un objeto, en donde la masa de dicho objeto se cuantifica mediante dispersión de luz interferométrica de trayectoria común usando un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 1, y en donde dicha masa se cuantifica con hasta un 5% de error de masa.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicho objeto es:

(a) un dispersor débil de luz;

(b) es una única proteína; o

(c) está en solución.

24. Un método para medir o cuantificar un cambio en la masa de un objeto, en donde el cambio en la masa de dicho objeto se mide o cuantifica por dispersión de luz interferométrica de trayectoria común usando un microscopio (1) de dispersión interferométrica de trayectoria común de acuerdo con la reivindicación 1.

25. Un método de la reivindicación 19, en donde la masa del objeto cambia debido a uno o más eventos seleccionados del grupo que consiste en unión/desunión de una sola molécula, transición de fase, agrupamiento, ensamblaje/desensamblaje, agregación, ensamblaje oligomérico, uno o más interacciones proteína/proteína y/o una o más interacciones proteína/molécula pequeña.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde la masa de dicho objeto es de 10 kDa a 5000 KDa.