CN110857908B - 基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统，包括：红光激光光源、二向色镜、白光光源、CCD和红外光谱仪，在红光激光光源射出的红光光路上固装一中灰镜和第一分光棱镜，二向色镜固装在水平光束的光路上，在第一光路上先后依次固装有一样品池、第一物镜和第二分光棱镜，在垂直光束的光路上安装一反射镜，在第二光路上固装一第二物镜；红外光的光路与第一光路重叠并先后依次经过样品池、第一物镜和第二分光棱镜并被该第二分光棱镜反射后进入光纤耦合器再通过光纤传入红外光谱仪。本发明的生物样品分析测试系统可以采集样品的全息图，再基于计算机进行快速相位解包裹，获得样品的形态信息，实现实时观测的目的。
Description
技术领域
本发明属于光学测试技术领域，具体来说涉及一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统。
背景技术
随着科技的发展，测量的地位变得越来越重要，尤其是在微观尺度下的微纳领域测量。在检测生物样品时数字全息显微术不仅具有实时的特点，获得定量的相位分布也是它的一大优势。数字全息术既可以利用物体的反射光进行测量，也可以利用物体的透射光进行测量。活体生物细胞一般为透明结构,因此其相位图像能提供更多独特的信息。相较于相衬方法的标记等可能对生物样品有损害的测量方式，满足无损测量也是测量生物样品时的原则。
近红外光谱分析方法被认为是一种比较有应用前景的无创检测技术,常被用于物质的成分组成及含量，测量方法多采用透射或扩散反射方式。已有的研究如利用近红外光谱透射法测量废水化学需氧量、无损检测赣南脐橙糖度、快速测定大豆油中的含磷量、检测三组分食用调和油含量等等。另外，越来越多的研究者正在开展应用近红外光谱进行人体内成分的无创实时检测，如采用透射方式进行血氧含量检测，以及采用扩散反射方式进行血糖含量及其他人体成分的检测。
对于生物样品的在体(活体)检测和追踪，需要同时观测其行为和生命基本信息。在非接触式光学测量中，光谱学分析一般可以用于获得生命体征信息，比如心率、血氧饱和度等。同时光谱学分析在药物浓度监测方面有很大的发展空间，通过对不同药物浓度的样本进行光谱采集，得到样本的吸光度曲线。再通过化学计量学方法建立分析模型，就可以对待测药物浓度作基本的分析。进行数字全息可以三维立体观测生物体的结构和追踪生物体的运动情况。所以综合运用这两种技术可以同时获得生物体的生物信息和运动规律信息，对生物活体检测来说，具有很重要的意义。但是，由于目前的技术限制，不能够在测量生物样品形貌形态的同时获得其生存环境的浓度或生物样品的生物特征信息。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统，该生物样品分析测试系统结构简单，测试方法可靠，能够实现同时获得生物样品特别是细胞细菌的红外光谱以及物光和干涉光干涉后的光谱，再通过计算机处理、分析采集的图像和光谱数据能够获得样品的形态信息和样品所在溶液的物质种类和浓度信息。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统，包括：红光激光光源、二向色镜、白光光源、CCD和红外光谱仪，其中，
在所述红光激光光源射出的红光光路上先后依次固装一中灰镜和第一分光棱镜，以使从所述红光激光光源发射的红光在通过中灰镜后被所述第一分光棱镜分成相干的水平光束和垂直光束，所述二向色镜固装在所述水平光束的光路上，用于将所述水平光束反射90°并形成第一光路，在所述第一光路上先后依次固装有一样品池、第一物镜和第二分光棱镜，以使穿过样品池的所述第一光路被所述第一物镜放大后射入所述第二分光棱镜并被第二分光棱镜分光后透射出与所述第一光路平行的光路为物光；
在所述垂直光束的光路上安装一反射镜，用于将所述垂直光束的光路反射90°并形成第二光路，在所述第二光路上固装一第二物镜，用于对所述第二光路进行放大；所述第二物镜透射出的光路射入所述第二分光棱镜并被分光反射的光路为参考光；
所述物光与所述参考光之间的夹角为θ，θ＝0～10°，所述CCD用于接收所述物光和参考光干涉后的光强；
在所述白光光源上安装一光纤准直器，用于将该白光光源发射的白光转变成平行白光(近似平行)，所述白光光源固装在所述二向色镜的一侧，以使所述二向色镜对所述平行白光滤波后从该二向色镜透过平行白光中的红外光(可见光被二向色镜反射)，所述红外光的光路与所述第一光路重叠并先后依次经过所述样品池、所述第一物镜和所述第二分光棱镜并被该第二分光棱镜反射后进入光纤耦合器，被所述光纤耦合器耦合后的光通过光纤传入所述红外光谱仪。
在上述技术方案中，所述中灰镜的光密度为0.04～1.0。
在上述技术方案中，所述第二分光棱镜与所述第一分光棱镜相同，所述第一分光棱镜的适用波长范围为400～700nm。
在上述技术方案中，所述第一物镜和第二物镜均为可见光的无穷远校正物镜。
在上述技术方案中，所述第一物镜的放大倍率为10～50倍。
在上述技术方案中，所述第二物镜的放大倍率与第一物镜的放大倍率相同。
在上述技术方案中，所述CCD为可见光CCD。
在上述技术方案中，所述第一物镜与CCD之间的距离大于该第一物镜的一倍焦距。
在上述技术方案中，所述第二物镜到所述第二分光棱镜的距离与所述第一物镜到所述第二分光棱镜的距离相同。
在上述技术方案中，所述水平光束与垂直光束位于同一平面且夹角为90°。
本发明的生物样品分析测试系统的有益效果如下：
(1)基于离轴数字全息显微术，本发明的生物样品分析测试系统可以采集样品的全息图，再基于计算机进行快速相位解包裹，获得样品的形态信息，实现实时观测的目的。
(2)基于红外光谱分析术，本发明的生物样品分析测试系统可以采集到样品的红外光谱，再结合计算机通过软件实现快速分析光谱数据，可以定性测量样品物质种类、定量测量样品物质浓度，同样也可以实现实时观测的目的。
(3)本发明的生物样品分析测试系统不仅在硬件上实现了数字全息显微术与红外光谱分析术的结合，而且能够实现对于生物样品形态信息和物质浓度信息的实时测量的同时性。
由于数字全息显微术和红外光谱分析术都能够实现实时测量，所以将两种技术联用以后，基于计算机的处理，可以同时获得样品的形态信息和样品物质浓度信息。本发明通过应用二向色镜，使得两种技术能够共用光路，实现实时在线测量，而在样品池之外的其他部分又能够保持各自的光学信息互相不会干扰，不会因为光路共用而产生干扰噪声。
附图说明
图1为本发明的生物样品分析测试系统的结构示意图；
图2为本发明的生物样品分析测试系统采集样品后的全息图；
图3为系统误差全息图；
图4为被测样品的形貌厚度示意图的灰度图；
图5为被测样品的形貌厚度的三维图；
图6为某一浓度下的光谱数据示例(纵坐标为光强)；
图7为不同糖浓度的归一化之后的光谱示意图，其中，1为水，曲线2为50mmol/L葡萄糖的水溶液，曲线3为100mmol/L葡萄糖的水溶液；(横坐标为波长/nm，纵坐标为归一化后的光强)
图8为用Unscrambler软件的建模结果示意曲线。
其中，1：红光激光光源，2：中灰镜，3：第一分光棱镜，4：白光光源，5：光纤准直器，6：二向色镜，7：样品池，8：第一物镜，9：第二物镜，10：第二分光棱镜，11：光纤耦合器，12：红外光谱仪，13：CCD，14：反射镜。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统，包括：红光激光光源1、二向色镜6、白光光源4、CCD13和红外光谱仪12，其中，
在红光激光光源1射出的红光光路上先后依次固装一中灰镜2和第一分光棱镜3，以使从红光激光光源1发射的红光在通过中灰镜2后被第一分光棱镜3分成相干的水平光束和垂直光束，二向色镜6固装在水平光束的光路上，用于将水平光束反射90°并形成第一光路，在第一光路上先后依次固装有一样品池7、第一物镜8和第二分光棱镜10，以使穿过样品池7的第一光路被第一物镜8放大后射入第二分光棱镜10并被第二分光棱镜10分光后透射出与第一光路平行的光路为物光；
在垂直光束的光路上安装一反射镜14，用于将垂直光束的光路反射90°并形成第二光路，在第二光路上固装一第二物镜9，用于对第二光路进行放大；第二物镜9透射出的光路射入第二分光棱镜10并被分光反射的光路为参考光；反射镜14能够旋转，通过调整反射镜14使物光与参考光之间的夹角为θ，θ＝0～10°，CCD13用于接收物光和参考光干涉后的光强；
在白光光源4上安装一光纤准直器5，用于将该白光光源4发射的白光转变成平行白光(近似平行)，白光光源4固装在二向色镜6的一侧，以使二向色镜6对平行白光滤波后从该二向色镜6透过平行白光中的红外光(可见光被二向色镜6反射)，红外光的光路与第一光路重叠并先后依次经过样品池7、第一物镜8和第二分光棱镜10并被该第二分光棱镜10反射后进入光纤耦合器11，被光纤耦合器11耦合后的光通过光纤传入红外光谱仪12。
实施例2
在实施例1的基础上，水平光束与垂直光束位于同一平面且夹角为90°，中灰镜2的光密度为0.04～1.0，第二分光棱镜10与第一分光棱镜3相同，第一分光棱镜3的适用波长范围为400～700nm，第一物镜8和第二物镜9均为可见光的无穷远校正物镜。第一物镜8的放大倍率为10～50倍，第二物镜9的放大倍率与第一物镜8的放大倍率相同。
实施例3
在实施例2的基础上，CCD13为可见光CCD，第一物镜8与CCD13之间的距离大于该第一物镜8的一倍焦距，第二物镜9到第二分光棱镜10的距离与第一物镜8到第二分光棱镜10的距离相同。
下面以鼠成纤维细胞的活细胞形态(非贴壁)的测试为例进行说明，下述测试中所采用各个部件的具体型号和规格如下：
红光激光光源(Thorlabs635nm红光激光二极管)
中灰镜(可见光范围可调节，光密度0.4-1.0)
第一分光棱镜和第二分光棱镜(400-700nm，50：50分束立方)
白光光源(Thorlabs宽谱光源360nm-2600nm)
光纤准直器(白光光纤准直器)
二向色镜(长波通二向色镜，截止波长900nm)
第一物镜和第二物镜(Mitutoyo,NA＝0.42,放大倍率50×)
光纤耦合器(海洋光学COL-UV-30)
红外光谱仪(海洋光学OceanOptics NIR Quest512)
CCD(PointGrey单色相机GS2-GE)，第一物镜8与CCD13之间的距离为该第一物镜8的一倍焦距。
反射镜(可见光范围700-1100nm)
测试结果：
一、对CCD13采集到的物光和参考光干涉后的光强进行数字全息相位解包裹，再结合样品的折射率，获得生物样品的形态信息，具体操作步骤如下：
首先，将空样品池当作无样品采集全息图，空样品池的全息图的强度图分布为：iplane(x,y)，提取iplane(x,y)中的干涉项cplane(x,y)作为系统误差(包括参考光以及光学系统的畸变相位)以便之后的相位校正。图3即为系统误差图。
将样品池通入流动样品或者静止的样品，在本实次测试中，待测样品为鼠成纤维细胞的活细胞形态(非贴壁)，采集得到被测样品的全息图(如图2所示)，该样品所采集到的全息图的强度图分布为i(x,y)＝a(x,y)+c(x,y)+c*(x,y)，其中
a(x,y)＝O(x,y)·O*(x,y)+R(x,y)·R*(x,y)＝|O(x,y)|2+|R(x,y)|2
c(x,y)＝O(x,y)R*(x,y)
c*(x,y)＝O*(x,y)R(x,y)
O(x,y)为物光的复振幅，R(x,y)为参考光的复振幅，O*(x,y)为物光复振幅的复共轭，R*(x,y)为参考光复振幅的复共轭。
将记录的系统误差干涉项的共轭项与滤出的被测样本干涉项相乘，可以达到消除系统误差的目的，即：
c(x,y)×c* plane(x,y)
＝[O(x,y)×R*(x,y)]×[Oplane(x,y)×Rplane *(x,y)]*
＝A×exp(φsample(x,y))
式中，A为通过软件得到的常数项，φsample(x,y)为样品相位。
最终样品的形貌厚度为
其中，λ为红光激光光源发射的光的波长(635nm)，ns为样品的折射率，ne为样品所处环境的折射率(本次测试为1)，图4和图5分别为被测样品的形貌厚度示意图的灰度图(图4)和三维图(图5)。本步骤具体可见：参考文献：曾雅楠.基于数字全息显微的微纳米几何量测量方法研究[D].天津大学,2016.曾雅楠,雷海,常新宇,胡晓东,胡小唐.基于离轴显微干涉术的单幅干涉图相位求解(英文)[J].中国激光,2015,42(09):284-291.
二、红外光谱仪12采集的光谱数据用化学计量学方法对进行处理，从而获得样品的物质种类和浓度信息。
其原理如下：基于化学计量学方法的红外光谱分析术，主要是应用朗伯-比尔定律，当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度和液层厚度的乘积成正比，即：
其中，k为吸光系数，它与吸光物质、入射光波长、溶液温度等因素有关；C为吸光物质的浓度；L为透光液层厚度；透光强度It与入射光强度Io之比称为透光度或透光率。
具体步骤如下：根据朗伯-比尔定律，
进行光谱分析时，需要在样品测试之前应用偏最小二乘法建立标准模型。偏最小二乘方法能够在自变量存在严重多重相关性的条件下进行回归建模，并且更易于辨识系统信息与噪声。该方法(也就是建立标准模型的步骤)首先需要用生物样品分析测试系统采集多组数据，例如本实施例采集了水、50mmol/L葡萄糖的水溶液、100mmol/L葡萄糖的水溶液等三种溶液的每种溶液10组数据，每次采集得到的数据与图6类似(图6为空样品池的一组光谱数据示例)。
将所采集的多组光谱数据归一化后(图7所示为本次实验将三种不同浓度溶液归一化后的结果)组成矩阵X，将对应于每组光谱数据的溶液浓度数值组成矩阵Y。然后应用Camo公司的化学计量学软件Unscrambler进行偏最小二乘建模。将之前所得的光谱矩阵X和溶液浓度矩阵Y输入该软件后，其运算得到该溶液浓度的光谱数据模型，图8为模型的示意图，具体如下：
图8a为建模分数图，横纵坐标均为主成分1，8b为回归相关系数图，横坐标为X变量，纵坐标为回归相关系数，8c图为残差图，横坐标为主成分，纵坐标为Y变量，8d为预测精度图，横坐标为测量精度，纵坐标为预测精度。
在测试待测溶液浓度信息的样品时，需要先用光谱仪测得其光谱矩阵X未知，然后将该光谱矩阵输入Unscrambler软件所建立的模型，即可得到该物质在此时的溶液浓度Y未知，即为所求数据。具体方法可以参见参考文献：邹达.近红外无创血糖测量[D].天津大学,2012.徐可欣,高峰,赵会娟.生物医学光子学[M].科学出版社,2007.
应用本发明的实验系统，在预先建立好的模型的前提下，通过计算机的实时计算，可以实时显示样品池中的溶液的浓度信息，结合数字全息显微术，还可以同时得到样品的形貌、形态信息。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于离轴数字全息显微术和光谱分析方法的生物样品分析测试系统，其特征在于，包括：红光激光光源(1)、二向色镜(6)、白光光源(4)、CCD(13)和红外光谱仪(12)，其中，
在所述红光激光光源(1)射出的红光光路上先后依次固装一中灰镜(2)和第一分光棱镜(3)，以使从所述红光激光光源(1)发射的红光在通过中灰镜(2)后被所述第一分光棱镜(3)分成相干的水平光束和垂直光束，所述二向色镜(6)固装在所述水平光束的光路上，用于将所述水平光束反射90°并形成第一光路，在所述第一光路上先后依次固装有一样品池(7)、第一物镜(8)和第二分光棱镜(10)，以使穿过样品池(7)的所述第一光路被所述第一物镜(8)放大后射入所述第二分光棱镜(10)并被第二分光棱镜(10)分光后透射出与所述第一光路平行的光路为物光；
在所述垂直光束的光路上安装一反射镜(14)，用于将所述垂直光束的光路反射90°并形成第二光路，在所述第二光路上固装一第二物镜(9)，用于对所述第二光路进行放大；所述第二物镜(9)透射出的光路射入所述第二分光棱镜(10)并被分光反射的光路为参考光；
所述物光与所述参考光之间的夹角为θ，θ＝0～10°，所述CCD(13)用于接收所述物光和参考光干涉后的光强；
在所述白光光源(4)上安装一光纤准直器(5)，用于将该白光光源(4)发射的白光转变成平行白光，所述白光光源(4)固装在所述二向色镜(6)的一侧，以使所述二向色镜(6)对所述平行白光滤波后从该二向色镜(6)透过平行白光中的红外光，所述红外光的光路与所述第一光路重叠并先后依次经过所述样品池(7)、所述第一物镜(8)和所述第二分光棱镜(10)并被该第二分光棱镜(10)反射后进入光纤耦合器(11)，被所述光纤耦合器(11)耦合后的光通过光纤传入所述红外光谱仪(12)。
2.根据权利要求1所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述中灰镜(2)的光密度为0.04～1.0。
3.根据权利要求2所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第二分光棱镜(10)与所述第一分光棱镜(3)相同，所述第一分光棱镜(3)的适用波长范围为400～700nm。
4.根据权利要求3所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第一物镜(8)和第二物镜(9)均为可见光的无穷远校正物镜。
5.根据权利要求4所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第一物镜(8)的放大倍率为10～50倍。
6.根据权利要求5所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第二物镜(9)的放大倍率与第一物镜(8)的放大倍率相同。
7.根据权利要求6所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述CCD(13)为可见光CCD。
8.根据权利要求7所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第一物镜(8)与CCD(13)之间的距离大于该第一物镜(8)的一倍焦距。
9.根据权利要求8所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述第二物镜(9)到所述第二分光棱镜(10)的距离与所述第一物镜(8)到所述第二分光棱镜(10)的距离相同。
10.根据权利要求9所述的生物样品分析测试系统，其特征在于，所述水平光束与垂直光束位于同一平面且夹角为90°。
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