CN112444508A - 荧光图像分析装置 - Google Patents
荧光图像分析装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112444508A CN112444508A CN202010902890.0A CN202010902890A CN112444508A CN 112444508 A CN112444508 A CN 112444508A CN 202010902890 A CN202010902890 A CN 202010902890A CN 112444508 A CN112444508 A CN 112444508A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescence
- image
- fluorescent sample
- polarization
- sample image
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims abstract description 201
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 79
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 claims abstract description 69
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 120
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 98
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 65
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 284
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 63
- 210000002858 crystal cell Anatomy 0.000 description 61
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 12
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 5
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 4
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
- G01N2201/06—Illumination; Optics
- G01N2201/068—Optics, miscellaneous
- G01N2201/0683—Brewster plate; polarisation controlling elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明涉及荧光图像分析装置。该荧光图像分析装置存储基准荧光样品图像和对象荧光样品图像。基准荧光样品图像是通过用线性偏振光照射面内荧光强度的关系已知的基准荧光样品并捕获来自基准荧光样品的荧光的第一预定偏振分量而获得的图像。对象荧光样品图像是通过用线性偏振光照射对象荧光样品并捕获来自对象荧光样品的荧光的第二预定偏振分量而获得的图像。该荧光图像分析装置被配置为基于基准荧光样品图像来确定用于校正在捕获的图像的像素之间测量的光强度中的不均匀性的校正系数，并且基于校正系数来校正对象荧光样品图像的像素的光强度。
Description
技术领域
本发明涉及荧光图像分析装置。
背景技术
荧光图像分析被广泛用于评估各种分子的各种状态。通过用偏振光作为激发光照射荧光标记的样品并从荧光中提取特定的偏振分量来获得荧光图像。例如，荧光去偏振方法根据与激发光的偏振方向平行和垂直的荧光的偏振分量来计算荧光偏振值，从而对样品进行分析。荧光偏振值(荧光各向异性)教导了关于分子的信息，例如，大小、形状、浓度和粘度。
发明内容
用于获取偏振荧光的图像的荧光偏振测量装置可以具有偏振依赖性。换言之，荧光偏振测量装置可以对不同方向上的偏振表现出不同的敏感性。为了校正该依赖性，计算G因子以在荧光偏振值的计算中用作校正系数。G因子被表示为荧光的与线性偏振入射光的偏振方向垂直的偏振分量相对于荧光的与线性偏振入射光的偏振方向平行的偏振分量之比。
但是，荧光偏振测量装置具有改变荧光图像的多种因素；仅使用G因子难以准确地测量荧光偏振。
本发明的一方面是一种荧光图像分析装置，其包括一个或多个处理器和一个或多个存储装置。所述一个或多个存储装置存储基准荧光样品图像和对象荧光样品图像。基准荧光样品图像是通过用线性偏振光照射面内荧光强度的关系已知的基准荧光样品并捕获来自基准荧光样品的荧光的第一预定偏振分量而获得的图像。对象荧光样品图像是通过用线性偏振光照射对象荧光样品并捕获来自对象荧光样品的荧光的第二预定偏振分量而获得的图像。所述一个或多个处理器被配置为基于基准荧光样品图像来确定用于校正在捕获图像的像素之间测量的光强度中的不均匀性的校正系数，并基于校正系数校正对象荧光样品图像的像素的光强度。
本发明的一个方面实现了荧光偏振的更准确的测量。
应当理解的是，前面的概述和下面的详细描述都是示例性和说明性的，并不限制本发明。
附图说明
图1示意性地示出了实施方式1和实施方式2中的荧光偏振测量系统中包括的荧光偏振测量装置的结构示例；
图2示意性地示出了荧光偏振测量系统的逻辑结构的示例；
图3示意性地示出了荧光偏振测量控制器的结构示例；
图4是荧光偏振测量控制器的操作的示例的流程图；
图5是存储基准荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图6示意性地示出了根据装置控制程序的用于液晶单元的驱动电压与透射通过液晶单元的光的强度之间的关系；
图7是存储对象荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图8是分析对象荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图9示出了ROI的位置；
图10是(当液晶单元接通时)从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表；
图11是(当液晶单元接通时)从基准荧光样品测得的光强度的图表；
图12是基于从基准荧光样品测得的光强度校正了从对象荧光样品测得的光强度之后的结果的图表；
图13是(当液晶单元关断时)从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表；
图14是(当液晶单元关断时)从基准荧光样品测得的光强度的图表；
图15是基于从基准荧光样品测得的光强度校正了从对象荧光样品测得的光强度之后的结果的图表；
图16示出了在实施方式2中施加于液晶单元的电压的时间变化的示例；
图17示意性地示出了当图16中示出的电压被施加于液晶单元时透射通过液晶单元的荧光的光强度的变化；
图18是实施方式2中的存储基准荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图19是实施方式2中的存储对象荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图20是实施方式2中的分析对象荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图21是在时间段D1中从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表；
图22是在时间段D1中从基准荧光样品测得的光强度的图表；
图23是基于从基准荧光样品测得的光强度校正了从对象荧光样品测得的光强度之后的结果的图表；
图24A示意地示出了用于容纳液体样品的单元的结构示例；
图24B示出了沿着图24A中的线B-B截取的单元的剖面结构；
图25示出了ROI的位置；
图26是示出按照参照图4至图8描述的方法校正之前和校正之后的偏振值的图表；
图27是示出按照参照图16至图20描述的方法校正之前和校正之后的偏振值的图表；
图28示意性地示出了荧光偏振测量装置的另一结构示例；
图29示意地示出了实施方式3中的荧光偏振测量系统的逻辑结构的示例；
图30是实施方式3中的存储基准荧光样品图像的步骤的细节的流程图；
图31是实施方式3中的存储对象荧光样品图像的步骤的细节的流程图；
图32提供了实施方式3中由偏振相机从填充在微通道单元的5个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的平均值和校正后的光强度的平均值；
图33提供了实施方式3中由偏振相机从填充在微通道单元的5个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的标准偏差(σ)和校正后的光强度的标准偏差(σ)；
图34提供了实施方式3中由偏振相机从填充在微通道单元的5个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的离差(σ/平均值)和校正后的光强度的离差(σ/平均值)；
图35示意性地示出了荧光偏振测量装置的又一结构示例；
图36示意地示出了实施方式4中的荧光偏振测量系统的逻辑结构的示例；
图37是实施方式4中的存储基准荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图38是实施方式4中的存储对象荧光样品图像的步骤的细节的示例的流程图；
图39提供了实施方式4中从填充在微通道单元的9个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的平均值和校正后的光强度的平均值；
图40提供了实施方式4中从填充在微通道单元的9个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的标准偏差(σ)和校正后的光强度的标准偏差(σ)；以及
图41提供了实施方式4中从填充在微通道单元的九个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的离差(σ/平均值)和校正后的光强度的离差(σ/平均值)。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施方式。应当注意，这些实施方式仅仅是实现本发明的示例，而不旨在限制本发明的技术范围。
本文公开的荧光图像分析装置对荧光图像中的面内光强度分布进行校正。荧光图像由荧光偏振测量装置拍摄。荧光偏振测量装置可以包括改变荧光图像的若干因素。
例如，当荧光偏振测量装置包括二向色镜时，二向色镜可以使荧光图像中的面内光强度偏置。也就是说，具有均匀的面内光强度的样品的荧光图像可能表现出面内偏置的光强度。因素的另一个示例是激发光的光强度分布。当激发光的光强度分布不均匀时，荧光图像的面内光强度可能会改变。也就是说，具有均匀的面内光强度的样品的荧光图像可能在面内表现出不均匀的光强度。
本文公开的荧光图像分析装置基于基准荧光样品图像来确定对捕获图像的像素的非均匀的测量光强度的校正值，并校正对象荧光样品图像中的像素的光强度值。其结果是，可以适当地校正由于仪器原因而改变的对象荧光样品图像的光强度的值。
实施方式1
装置结构
图1示意性地示出了荧光偏振测量系统中包括的荧光偏振测量装置的结构示例。如稍后将描述的，荧光偏振测量系统包括荧光偏振测量装置和荧光偏振测量控制器，荧光偏振测量控制器用于控制荧光偏振测量装置并分析由荧光偏振测量装置拍摄的荧光图像。
在图1所示的结构示例中，荧光偏振测量装置10包括光源101、聚光透镜103、光圈105、准直仪107、偏振调节器109、激发滤光器111和二向色镜113。荧光偏振测量装置10还包括物镜115、工作台117、发射滤光器119、偏振调节器121、成像透镜123和成像装置125。
样品151放置在工作台117上。光源101可以是LED；光源101输出激发样品151中的荧光的波长的激发光(例如，中心波长为470nm的蓝光)。来自光源101的激发光被聚光透镜103收集并通过光圈105。光圈105减少外部光。
已通过光圈105的激发光被准直仪107转换成平行光并进入偏振调节器109。偏振调节器109可以是偏振板、偏振分束器或液晶单元。在以下描述的示例中，偏振调节器109是偏振板。偏振调节器109使特定方向上的线性偏振的光透射。来自偏振调节器109的线性偏振的激发光通过激发滤光器111，并被二向色镜113朝向物镜115反射。激发滤光器111用于选择包括激发光的波长的波长范围，并减少与来自偏振调节器109的激发光不同的光。
物镜115将由二向色镜113反射的线性偏振的激发光聚焦在工作台117上的样品151上。样品151响应于来自物镜115的线性偏振的激发光而发出具有特定波长的荧光(例如，绿光)。荧光通过物镜115转换为平行光，并通过二向色镜113和发射滤光器119。二向色镜113选择性地使包括来自样品151的荧光的预定波长范围内的光透射，并反射其他光。发射滤光器119用于选择包括来自样品151的荧光的波长的波长范围，并减少除荧光之外的光。
已通过发射滤光器119的荧光进入偏振调节器121。偏振调节器121可以是偏振板、偏振分束器或液晶单元。偏振调节器也可以是偏振相机中的偏振滤光器。偏振相机是在传感器上包括偏振滤光器以获取对象的偏振信息的成像装置。以下描述的示例中的偏振调节器121是将由施加的电压控制的液晶单元。偏振调节器121仅使荧光的特定线性偏振分量透射。具体地，偏振调节器121使在与激发光的偏振方向平行或垂直的方向上线性偏振的光透射。
已通过偏振调节器121的线性偏振的荧光被成像透镜123成像在成像装置125的成像平面上。成像装置125的示例包括CMOS图像传感器。成像装置125具有多个像素，以根据荧光的光强度生成图像数据，并将所生成的数据发送至荧光偏振测量控制器(图1中未示出)。
荧光偏振测量装置10可以具有与图1所示的结构不同的结构。例如，荧光偏振测量装置10通过用激发光倾斜地照射样品而可以去除二向色镜113。光圈105、激发滤光器111和发射滤光器119是可选的。作为图1的透镜的附加或代替，荧光偏振测量装置10可以包括一个或多个透镜。
图2示意性地示出了荧光偏振测量系统的逻辑结构的示例。荧光偏振测量系统1包括荧光偏振测量装置10、荧光偏振测量控制器20和D/A转换器(DAC)30。荧光偏振测量装置10参照图1所述被配置。荧光偏振测量控制器20控制荧光偏振测量装置10并分析由荧光偏振测量装置10拍摄的荧光图像。具体地，荧光偏振测量控制器20控制荧光偏振测量装置10的光源101、液晶单元(偏振调节器)121和成像装置125。
例如，荧光偏振测量控制器20保持光源101接通，以在测量期间用激发光照射样品。荧光偏振测量控制器20使用D/A转换器30控制要施加于液晶单元121的电压。通过控制施加于液晶单元121的电压，可以控制要透射通过液晶单元121的荧光的偏振分量。
液晶单元121包括彼此相对的两个透明基板、设置在基板的相对面上的透明电极、封装在基板之间的液晶材料以及设置在成像装置侧(发射侧或下游侧)的外表面上的偏振板。可以如所需要地配置液晶单元121，只要液晶单元121能够调节荧光的可透射偏振分量即可。
除了要施加于液晶单元121的电压之外，荧光偏振测量控制器20还控制成像装置125的曝光时间(成像时间)或成像的开始时间和成像的持续时间，以获取荧光的所需的偏振分量的图像数据。荧光偏振测量控制器20还分析所获取的图像数据。如稍后将描述的，荧光偏振测量控制器20基于基准样品的图像校正从要分析的样品(对象样品)测得的值。该操作校正被荧光偏振测量装置10的装置结构改变的图像，以实现更准确的测量。
图3示意性地示出了荧光偏振测量控制器20的结构示例。荧光偏振测量控制器20可以被配置成具有计算机。图3的示例中的荧光偏振测量控制器20包括处理器201、存储器(主存储装置)202、辅助存储装置203、输出装置204、输入装置205和通信接口(I/F)207。这些部件通过总线相互连接。存储器202、辅助存储装置203或它们的组合是存储装置，并且存储将被处理器201使用的程序和数据。
存储器202可以是半导体存储器，并且主要用于存储正在执行的程序和数据。处理器201按照存储在存储器202中的程序来执行各种处理。除了未示出的操作系统之外，图3中的结构示例中的存储器202还保存装置控制程序221和荧光图像分析程序222。
处理器201按照程序进行操作以实现各种功能单元。例如，处理器201按照装置控制程序221进行操作以用作装置控制单元，以及按照荧光图像分析程序222进行操作以用作荧光图像分析单元。
辅助存储装置203可以是大容量存储装置，例如硬盘驱动器或固态驱动器；它用于长期保存程序和数据。图3的结构示例中的辅助存储装置203包括基准荧光样品图像数据库(DB)231和对象荧光样品图像数据库232。对象荧光样品图像数据库232存储从对象荧光样品获取的图像。基准荧光样品图像数据库231存储用于校正对象荧光样品图像的基于光强度的值的基准荧光样品图像。
处理器201可以是一个或多个处理单元，并且包括一个或多个计算单元或多个处理内核。处理器201可以被实现为一个或多个中央处理单元、微处理器、微型计算机、微控制器、数字信号处理器、状态机、逻辑电路、图形处理单元、片上系统和/或按照控制指令对信号进行操作的任何装置。
存储在辅助存储装置203中的程序和数据在启动时或需要时被加载到存储器202，并且程序由处理器201执行以执行荧光偏振测量控制器20的各种处理。因此，由以下描述的程序执行的处理是由处理器201或荧光偏振测量控制器20执行的处理。
输入装置205是用于用户向荧光偏振测量控制器20输入指令和信息的硬件装置。输出装置204是用于呈现用于输入和输出的图像的硬件装置，例如，是显示装置或打印装置。通信I/F 207是用于连接到网络的接口。输入装置205和输出装置204是可选的，并且荧光偏振测量控制器20可以由终端经由网络访问。
荧光偏振测量控制器20的功能可以在计算机系统中实现，该计算机系统包括一个或多个计算机，该计算机包括一个或多个处理器以及一个或多个存储装置，该存储装置包括非暂时性存储介质。多个计算机通过网络相互通信。例如，荧光偏振测量控制器20的功能的一部分可以在一个计算机中实现，另一部分可以在另一计算机中实现。
操作
在下文中，描述了荧光偏振测量控制器20的操作。如参照图2所述的，装置控制程序221控制荧光偏振测量装置10的光源101、液晶单元(偏振调节器)121和成像装置125。在以下描述的示例中，液晶单元121在接通和关断之间切换。在关断状态下，液晶单元121仅使与入射到样品上的线性偏振光平行的线性偏振分量透射。在接通状态下，液晶单元121仅使与入射在样品上的线性偏振光垂直的线性偏振分量透射。处于接通状态的液晶单元121使线性偏振光旋转90°。与该示例相比，处于接通/关断状态的液晶单元121的情况可以相反。
图4是荧光偏振测量控制器20的操作的示例的流程图。装置控制程序221从荧光偏振测量装置10获取基准荧光样品图像，并将它们存储到基准荧光样品图像数据库231(S101)。在以下描述的示例中，装置控制程序221获取通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量而获得的基准荧光样品图像、以及通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的线性偏振分量而获得的另一基准荧光样品图像。
接下来，装置控制程序221从荧光偏振测量装置10获取对象荧光样品图像，并将它们存储到对象荧光样品图像数据库232(S102)。在以下描述的示例中，装置控制程序221获取通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量而获得的对象荧光样品图像、以及通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的线性偏振分量而获得的另一对象荧光样品图像。
接下来，荧光图像分析程序222基于基准荧光样品图像来分析对象荧光样品图像(S103)。在以下描述的示例中，荧光图像分析程序222在计算对象荧光样品的荧光偏振值之前，基于基准荧光样品图像校正对象荧光样品图像。
图5是存储基准荧光样品图像的步骤S101的细节的示例的流程图。基准荧光样品由操作者放置在工作台117上。装置控制程序221向液晶单元121提供驱动电压以使液晶单元121接通(S201)。
装置控制程序221使成像装置125接收光达预定的曝光时间段，以拍摄第一基准荧光样品图像(S202)。第一基准荧光样品图像是荧光的与激发光的偏振方向垂直的线性偏振分量的图像。装置控制程序221从成像装置125获取第一基准荧光样品图像，并将其存储到基准荧光样品图像数据库231(S203)。
接下来，装置控制程序221向液晶单元121提供驱动电压以使液晶单元121关断(S204)。装置控制程序221使成像装置125接收光达预定的曝光时间段，以拍摄第二基准荧光样品图像(S205)。第二基准荧光样品图像是荧光的与激发光的偏振方向平行的线性偏振分量的图像。装置控制程序221从成像装置125获取第二基准荧光样品图像，并将其存储到基准荧光样品图像数据库231(S206)。
图6示意性地示出了根据装置控制程序221的用于液晶单元121的驱动电压与透射通过液晶单元121的光的强度之间的关系。装置控制程序221提供在预定的正电压与负电压之间周期性振荡的矩形波401，以保持液晶单元121接通。液晶单元121在正电压或负电压下接通。在液晶单元121为接通的时间段(接通时间段)411中限定测量时间段421。
装置控制程序221使成像装置125在测量时间段421期间接收荧光以拍摄荧光的图像。当液晶单元121为接通时，成像装置125接收来自样品的荧光中的与激发光的偏振方向垂直的偏振分量。接收光的强度I⊥由在测量时间段421期间接收的光的总量或时间平均值来表示。
装置控制程序221提供零电压402以使液晶单元121关断。在液晶单元121关断的时间段(关断时间段)412中限定测量时间段422。装置控制程序221使成像装置125在测量时间段422期间接收荧光以拍摄荧光的图像。当液晶单元121为关断时，成像装置125接收来自样品的荧光中的与激发光的偏振方向平行的偏振分量。接收光的强度I//由在测量时间段422期间接收到的光的总量或时间平均值来表示。
图7是存储对象荧光样品图像的步骤S102的细节的示例的流程图。对象荧光样品由操作者放置在工作台117上。装置控制程序221向液晶单元121提供驱动电压以使液晶单元121接通(S301)。
装置控制程序221使成像装置125接收光达预定的曝光时间段，以拍摄第一对象荧光样品图像(S302)。第一对象荧光样品图像是荧光的与激发光的偏振方向垂直的线性偏振分量的图像。装置控制程序221从成像装置125获取第一对象荧光样品图像，并将其存储到对象荧光样品图像数据库232(S303)。
接下来，装置控制程序221向液晶单元121提供驱动电压以使液晶单元121关断(S304)。装置控制程序221使成像装置125接收光达预定的曝光时间段，以拍摄第二对象荧光样品图像(S305)。第二对象荧光样品图像是荧光的与激发光的偏振方向平行的线性偏振分量的图像。装置控制程序221从成像装置125获取第二对象荧光样品图像并将其存储到对象荧光样品图像数据库232(S306)。
图8是分析对象荧光样品图像的步骤S103的细节的示例的流程图。荧光图像分析程序222从基准荧光样品图像数据库231获取第一基准荧光样品图像(S401)。第一基准荧光样品图像是通过捕获与激发光的偏振方向垂直的线性偏振分量而获得的基准荧光样品图像。荧光图像分析程序222计算用于第一对象荧光样品图像的校正系数(第一校正系数)(S402)。稍后将描述计算第一校正系数的细节。
荧光图像分析程序222从基准荧光样品图像数据库231获取第二基准荧光样品图像(S403)。第二基准荧光样品图像是通过捕获与激发光的偏振方向平行的线性偏振分量而获得的基准荧光样品图像。荧光图像分析程序222计算用于第二对象荧光样品图像的校正系数(第二校正系数)(S404)。稍后将描述计算第二校正系数的细节。
接下来，荧光图像分析程序222从对象荧光样品图像数据库232获取第一对象荧光样品图像和第二对象荧光样品图像(S405)。荧光图像分析程序222基于第一校正系数和第二校正系数以及第一对象荧光样品图像和第二对象荧光样品图像来计算对象荧光样品的偏振值(S406)。荧光图像分析程序222将计算出的偏振值存储到辅助存储装置203，并将其输出到输出装置204。荧光图像分析程序222还可以将第一对象荧光样品图像和第二对象荧光样品图像输出到输出装置204。
校正方法
在下文中，描述了基于基准荧光样品图像计算校正系数的方法。荧光图像分析程序222从第一基准荧光样品图像计算第一校正系数。在该示例中，在视野内，基准荧光样品所占据的区域包括对象荧光样品的所有的感兴趣区域(ROI)。从基准荧光样品发出的面内荧光强度是均匀的。如果面内荧光强度的关系是已知的，则该强度不必是均匀的。
第一校正系数是用于通过捕获与线性偏振激发光的偏振方向垂直的线性偏振分量而获得的对象荧光样品图像(第一对象荧光样品图像)的校正系数。针对各个像素分别确定校正系数。校正系数a⊥(i,j)可以通过下式计算：
a⊥(i,j)＝(1/Ir⊥(i,j))*│Ir⊥(i,j)│，
其中，Ir⊥(i,j)表示第一基准荧光样品图像中的像素(i,j)处的光强度(接收光的强度)，│Ir⊥(i,j)│表示构成第一基准荧光样品图像中的包括像素(i,j)的预定区域的多个像素的光强度的平均值。
预定区域可以是整个捕获图像(视野)、由从基准荧光样品接收的荧光的强度高于阈值的所有像素构成的区域、或者是包括对象荧光样品的多个ROI的图像的部分区域。当预定区域包括接收来自基准荧光样品的荧光的所有像素时，能够校准更多数量的像素以实现更精确的校正。
荧光图像分析程序222从第二基准荧光样品图像计算第二校正系数。第二校正系数是用于通过捕获与线性偏振激发光的偏振方向平行的线性偏振分量而获得的对象荧光样品图像(第二对象荧光样品图像)的校正系数。校正系数a//(i,j)可以通过下式计算：
a//(i,j)＝(1/Ir//(i,j))*│Ir//(i,j)│，
其中，Ir//(i,j)表示第二基准荧光样品图像中的像素(i,j)处的光强度(接收光的强度)，│Ir//(i,j)│表示构成第二基准荧光样品图像中的包括像素(i，j)的预定区域的多个像素的光强度的平均值。该预定区域是与第一基准荧光样品图像的预定区域相对应的区域。
荧光图像分析程序222还可使用用于背景校正的校正系数。例如，在将样品容纳在容器(诸如单元内的微通道)中的情况下，来自该单元的光的波长可能被包含在待测量的波长范围内。消除该背景噪声实现更准确的测量。预先确定用于第一基准荧光样品图像的背景校正系数(偏移值)b⊥(i,j)以及用于第二基准荧光样品图像的背景校正系数(偏移值)b//(i,j)。
基于从基准荧光样品图像计算的校正系数a⊥(i,j)和a//(i,j)以及背景校正系数b⊥(i,j)和b//(i,j)，校正对象荧光样品图像的各个像素的光强度。具体地，第一对象荧光样品图像中的像素的校正后的光强度可以表示为下式：
Ic⊥(i,j)＝a⊥(i,j)*It⊥(i,j)+b⊥(i,j)，
其中，It⊥(i,j)表示由成像装置125拍摄的第一对象荧光样品图像中的像素(i,j)的未校正的光强度，Ic⊥(i,j)表示同一像素(i,j)的校正后的光强度。
类似地，第二对象荧光样品图像中的像素的校正后的光强度可以表示为下式：
Ic//(i,j)＝a//(i,j)*It//(i,j)+b//(i,j)，
其中，It//(i,j)表示由成像装置125拍摄的第二对象荧光样品图像中的像素(i,j)的未校正的光强度，Ic//(i,j)表示同一像素(i,j)的校正后的光强度。
ROI中的偏振值P表示为下式：
P＝(Ic//–Ic⊥)/(Ic//+Ic⊥)，
其中，Ic//表示ROI中的多个像素的校正后的光强度Ic//(i,j)之和或平均值，Ic⊥表示ROI中的多个像素的校正后的光强度Ic⊥(i,j)之和或平均值。
荧光图像分析程序222可以根据另一函数来校正对象荧光样品图像中的像素的光强度。例如，荧光图像分析程序222可以首先对对象荧光样品图像中的像素的光强度执行背景校正，然后利用从基准荧光样品图像计算出的校正系数来校正获得的值。
具体地，荧光图像分析程序222计算背景区域(不包括样品的区域)中的光强度(背景光强度)的平均值。以具有微通道的单元为例，荧光图像分析程序222计算除微通道以外的区域中的光强度的平均值b。用于计算平均值的区域可以具有等于样品的ROI的大小。
荧光图像分析程序222按照下式校正通过捕获与激发光平行或垂直的线性偏振分量而获得的对象荧光样品图像中的每个像素的光强度It(i，j)：
Ic(i，j)＝a(i，j)*(It(i，j)–b)，
其中，Ic(i，j)表示像素(i，j)的校正后的光强度，a(i，j)表示从基准荧光样品图像计算的校正系数，It(i，j)表示像素(i，j)的未校正的光强度，b表示背景校正系数。
二向色镜113和光源101对在像素处接收的光的强度的影响可能根据偏振方向分量而不同。因此，通过使用用于与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量的校正系数以及用于与激发光的线性偏振方向垂直的线性偏振分量的校正系数，可以更准确地测量对象样品的荧光偏振。根据系统设计，荧光图像分析程序222可以仅使用通过捕获任一线性偏振分量而获得的一个基准荧光样品图像。
测量结果的示例
在下文中，描述了从荧光样品获得的测量结果的示例。图9示出了ROI的位置。在捕获的图像(视野)内的样品的区域中定义了9个ROI。样品区域501中的数字表示ROI的编号。对象荧光样品是容纳在容器中的液体材料(荧光标记的溶液)。基准荧光样品是YAG陶瓷片。
图10是(当液晶单元接通时)从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。ROI中的光强度是ROI中包括的像素(成像装置125的像素)处的光强度之和。由于液晶单元121接通，因此测得的荧光强度是与激发光的线性偏振方向垂直的线性偏振分量的光强度。
图11是(当液晶单元接通时)从基准荧光样品测得的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。由于液晶单元121接通，因此测得的荧光强度是与激发光的线性偏振方向垂直的线性偏振分量的光强度。
图12是在基于从基准荧光样品测得的光强度对从对象荧光样品测得的光强度进行校正之后的结果的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。与图10的图表相比，图12的图表示出了多个ROI之间的所测得的光强度的较小差异(变动)。从对象荧光样品测得的光强度在平面内应该是均匀的。图12教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。
图13是(当液晶单元关断时)从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。由于液晶单元121关断，因此测得的荧光强度是与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量的光强度。
图14是(当液晶单元关断时)从基准荧光样品测得的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。由于液晶单元121关断，因此测得的荧光强度是与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量的光强度。
图15是在基于从基准荧光样品测得的光强度对从对象荧光样品测得的光强度进行校正之后的结果的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。与图13的图表相比，图15的图表示出了多个ROI之间的所测得的光强度的较小差异(变动)。从对象荧光样品测得的光强度在平面内应该是均匀的。图15教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。
上述结构示例控制液晶单元121以从荧光提取不同的偏振分量。另一结构示例可以采用偏振板取代液晶单元121。操作者或荧光偏振测量控制器20改变偏振板的方向以从荧光中提取所需的偏振分量。
上述示例在确定校正系数时使用基准荧光样品图像中的测量值。另一个结构示例可以使用基于插值或回归分析的二维曲线拟合来校正基准荧光样品图像的像素的光强度。该操作减少了基准荧光样品图像中的噪声，以实现更适当的校准。可以使用任何的拟合函数；例如，可以通过预定阶次(例如六阶次)的函数来定义使成像平面(像素阵列)的X方向和Y方向与测量值拟合的曲线。
上述示例在不去除由图像传感器产生的随机的固定模式噪声的情况下，计算包括噪声的光强度的ROI中的光强度的平均值。另一结构示例基于预定阈值(图像传感器噪声阈值)从具有固定模式噪声的像素中确定固定模式噪声像素(所谓的热像素)，并将它们排除。
为了确定像素的光强度的阈值，例如，荧光图像分析程序222计算相邻的24个像素(5(沿垂直线)×5(沿水平线)–1(感兴趣的像素)＝24个像素)的光强度的平均值。如果像素的光强度高于所计算的平均值的105％，则荧光图像分析程序222确定该像素是固定模式噪声像素。荧光图像分析程序22对图像中的所有的像素执行这种计算，以生成固定模式噪声像素的x-y坐标图。在计算对象荧光样品和基准荧光样品的光强度时，荧光图像分析程序222在x-y坐标图中排除固定模式噪声像素，并利用剩余的像素计算光强度。
实施方式2
测量方法
描述了通过另一种方法对从对象荧光样品测得的光强度的校正。主要描述与实施方式1的不同。装置控制程序221将以周期变化的电压施加于液晶单元121，该周期比反转周期长。图16示出了施加于液晶单元121的电压的时间变化的示例。横轴表示时间，纵轴表示施加的电压。如图16所示，施加的电压在高频下在正值与负值之间反转。正包络线和负包络线关于横轴是线对称的。包络线以比反转周期长的周期变化。
图17示意性地示出了当图16所示的电压被施加于液晶单元121时透射通过液晶单元121的荧光的光强度的变化。荧光的强度近似正弦地变化。强度随着施加的电压的绝对值的增大而减小，并且随着施加的电压的绝对值的减小而增大。施加于液晶单元121的电压的波形不限于特定的波形，只要光强度近似正弦地变化即可。
荧光图像分析程序222计算在时间段D1至D4中的每个时间段中的荧光样品的图像中的ROI中的光强度。每个时间段中的光强度是每个时间段中的ROI中的光强度随时间的积分值，或是每个时间段(曝光时间段)中的在ROI中的像素处接收的光的总量。荧光图像分析程序222基于时间段D1至D4中的光强度来评估样品的荧光偏振。成像装置125在时间段D1至D4中的每个时间段中接收荧光的特定偏振分量。每个时间段中的偏振分量具有一定的偏振方向宽度。
测量的总体过程与图4的流程图所示的方法相同。图4中的每个步骤的细节在下面描述。图18是存储基准荧光样品图像的步骤S101的细节的示例的流程图。装置控制程序221向液晶单元121提供如图16所示的周期性变化的驱动电压(S501)。
装置控制程序221控制成像装置125在四个时间段D1至D4的每个时间段中拍摄基准荧光样品图像(S502)。在每个时间段中获取的图像表示在该时间段中在成像装置125的每个像素处接收的荧光量。装置控制程序221将四个时间段D1至D4中的基准荧光样品图像存储到基准荧光样品图像数据库231(S503)。
图19是存储对象荧光样品图像的步骤S102的细节的示例的流程图。装置控制程序221向液晶单元121提供如图16所示的周期性变化的驱动电压(S601)。
装置控制程序221控制成像装置125在四个时间段D1至D4中的每个时间段中拍摄对象荧光样品图像(S602)。装置控制程序221将四个时间段D1至D4中的对象荧光样品图像存储到对象荧光样品图像数据库232(S603)。
图20是分析对象荧光样品图像的步骤S103的细节的示例的流程图。荧光图像分析程序222对每个时间段的数据执行步骤S701至S703。荧光图像分析程序222从基准荧光样品图像数据库231获取相应时间段中的基准荧光样品图像(S701)。荧光图像分析程序222从获取的基准荧光样品图像计算用于该时间段中的对象荧光样品图像的校正系数(S702)。在该示例中，荧光图像分析程序222从具有与对象荧光样品图像的偏振分量相同的偏振分量的基准荧光样品图像来计算校正系数。这些偏振分量不必是相同的偏振分量。
计算校正系数的方法与参考图8描述的计算第一系数或第二系数的方法相同。荧光图像分析程序222按照下式确定用于每个像素的光强度的校正系数a(i，j)：
a(i，j)＝(1/Ir(i，j))*│Ir(i，j)│，
其中，Ir(i，j)表示成像装置125的在基准荧光样品图像中的像素(i，j)处的光强度，│Ir(i，j)│表示在构成预定区域的多个像素处的光强度的平均值。
荧光图像分析程序222基于校正系数a(i，j)校正对象荧光样品图像中的各个像素(i，j)的光强度(S703)。如实施方式1中所述，背景校正系数可以一起使用。
在对所有时间段的数据执行了步骤S701至S703之后，荧光图像分析程序222基于四个时间段中的对象荧光样品图像的校正后的光强度来计算偏振值(S704)。例如，荧光图像分析程序222使用下式计算偏振值P：
P＝(π/4√2)*(B/A)
A＝(LD1+LD2+LD3+LD4)
B＝√{(LD1–LD3)2+(LD2–LD4)2}，
其中，LD1至LD4是四个时间段中的对象荧光样品图像中的ROI中的校正后的光强度(接收光的量)。
测量结果的示例
在下文中，描述了按照参照图16至图20描述的方法从荧光样品获得的测量结果的示例。下面描述了四个时间段中的时间段D1中的示例。对象荧光样品是容纳在容器中的液体材料(荧光标记的溶液)。基准荧光样品是YAG陶瓷片。
图21是在时间段D1中从对象荧光样品测得的未校正的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。图22是在时间段D1中从基准荧光样品测得的光强度的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。图23是在基于从基准荧光样品测得的光强度校正了从对象荧光样品测得的光强度之后的结果的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示ROI中的光强度。
将图23的图表与图21的图表进行比较，多个ROI之间的光强度的差异(变动)减小。从对象荧光样品测得的光强度在平面中应该是均匀的。图23教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。该校正在其他时间段D2至D4表现出相同的效果。
图24A和图24B示意性地示出了用于容纳液体样品的单元的结构示例。图24B示出了沿着图24A中的线B-B截取的单元的剖面结构。如图24A所示，单元600具有多个微通道601以及用于将液体注入到微通道601的入口602。在图24A中，作为示例，通道之一被提供附图标记601，并且入口之一被提供附图标记602。通道601的宽度可以是大约100μm。
如图24B所示，单元600包括：有色(例如，黑色)的硅基板612，硅基板612具有与通道601相对应的凹槽；以及透明的玻璃板611，玻璃板611覆盖在硅基板612上以封闭凹槽。单元600被放置在工作台117上，使得玻璃板611面对成像装置125。激发光穿过玻璃板611并入射到样品上；来自样品的荧光穿过玻璃板611并朝向物镜115行进。
在下文中，描述了从在具有微通道的单元中包含的样品获得的测量结果的示例。图25示出了ROI的位置。在包含样品的每个通道601中限定了五个ROI。矩形内的表示ROI的数字表示ROI的编号。对象荧光样品是包含在单元中的液体材料(荧光标记的溶液)。基准荧光样品是Ce：YAG陶瓷片。
图26是示出按照参照图4至图8描述的方法校正之前和校正之后的偏振值的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示偏振值。图26示出了计算出的不同通道中的样品的在校正之前和校正之后的偏振值。线701表示在校正之前的关于第一通道的偏振值，线702表示在校正之后的关于第一通道的偏振值。线703表示在校正之前的关于第二通道的偏振值，线704表示在校正之后的关于第二通道的偏振值。线705表示在校正之前的关于第三通道的偏振值，线706表示在校正之后的关于第三通道的偏振值。
比较同一通道的偏振值，多个ROI之间的偏振值的差异(变动)在校正之后减小。无论ROI如何，从对象荧光样品测得的光强度应该是均匀的。图26教导了通过基于从基准荧光样品测量的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。
图27是示出按照参照图16至图20描述的方法校正之前和校正之后的偏振值的图表。横轴表示ROI编号，纵轴表示偏振值。图27示出了计算出的一个通道中包含的样品的在校正之前和校正之后的偏振值。线751表示计算出的校正之前的偏振值，线752表示计算出的校正之后的偏振值。校正之后，多个ROI之间的偏振值的差异(变动)减小。无论ROI如何，从对象荧光样品测得的光强度应该是均匀的。图27教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。
如实施方式1中所述，该实施方式2也可以被配置为排除固定模式噪声像素的x-y坐标，并利用剩余像素计算对象荧光样品和基准荧光样品的光强度。
实施方式3
装置结构
描述使用具有另一种装置结构的荧光偏振测量装置的测量方法。主要描述与实施方式1的不同。荧光偏振测量装置如图28所示被配置。与图1中的实施方式1的结构的不同之处有以下两点：(1)实施方式3中的装置在发射侧不包括偏振板或液晶单元作为偏振调节器；(2)实施方式3中的装置包括偏振相机127取代通常的成像装置。
偏振相机是一种成像装置，其包括位于传感器阵列(图像传感器)正上方的偏振滤光器，以获取关于对象的偏振信息。图像传感器具有多个像素，并且偏振滤光器包括多个偏振器，这些偏振器使荧光中的以不同方向线性偏振的光透射。透射通过偏振器的线性偏振光进入一个或多个像素。
偏振相机可以同时拍摄在不同方向上线性偏振并在指定的曝光时间内透射通过偏振滤光器的光的相同数量的图像。在以下描述的示例中，偏振相机127的偏振滤光器使与激发光的偏振方向平行(在0°处)和垂直(在90°处)的线性偏振的光透射。
操作
在下文中，描述了荧光偏振测量控制器20的操作。如图29所示，装置控制程序221控制荧光偏振测量装置10的光源101和偏振相机127。在以下描述的示例中的偏振相机127可以拍摄在两个方向(0°和90°)上偏振的光的图像。通过使与入射到样品上的线性偏振光平行的线性偏振分量透射来获取在0°方向上偏振的荧光图像。通过使与入射到样品上的线性偏振光垂直的线性偏振分量透射来获取在90°的方向上偏振的荧光图像。与该示例相比，在0°和90°方向上偏振的荧光的情况可以相反。其余的操作与实施方式1中描述的操作相同。主要描述与实施方式1的不同。
例如，荧光偏振测量控制器20保持光源101接通以在测量期间用激发光照射样品。荧光偏振测量控制器20还控制偏振相机127的曝光时间(成像时间)、或成像的开始时间和成像的持续时间，以获取所需的荧光的偏振分量的图像数据。荧光偏振测量控制器20分析所获取的图像数据。荧光偏振测量控制器20基于基准样品的图像校正从对象样品测得的值。该操作校正被荧光偏振测量装置10的装置结构改变的图像，以实现更准确的测量。
例如，荧光偏振测量控制器20控制偏振相机127的曝光时间(成像时间)、或成像的开始时间和成像的持续时间，以在捕获来自基准荧光样品的荧光中的多个偏振分量的相同长度的时间段捕获来自对象荧光样品的荧光中的多个偏振分量。这种结构消除了由时间变化引起的图像之间的差异，从而实现了准确的测量。
测量方法
与实施方式1相同，实施方式3被配置为通过分别捕获与激发光的线性偏振方向平行和垂直的线性偏振分量，来获取对象荧光样品图像和基准荧光样品图像。
测量的总体过程与图4的流程图所示的实施方式1中的方法相同。主要描述与实施方式1的不同。图30是存储基准荧光样品图像的步骤S101的细节的示例的流程图。装置控制程序221将偏振相机127设定为拍摄在两个方向(0°和90°)上偏振的荧光的图像的模式(S1501)，并且同时拍摄两个偏振方向(0°和90°)的基准荧光样品的图像(S1502)。偏振方向为0°的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的偏振分量而获得的基准荧光样品图像，偏振方向为90°的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的偏振分量而获得的基准荧光样品图像。装置控制程序221将获取的图像存储到基准荧光样品图像数据库231(S1503)。
图31是存储对象荧光样品图像的步骤S102的细节的示例的流程图。装置控制程序221将偏振相机127设定为拍摄在两个方向(0°和90°)上偏振的荧光的图像的模式(S1601)，并同时拍摄两个方向(0°和90°)的对象荧光样品图像(S1602)。偏振方向为0°的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的偏振分量而获得的对象荧光样品图像，偏振方向为90°的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的偏振分量而获得的对象荧光样品图像。装置控制程序221将获取的图像存储到对象荧光样品图像数据库232(S1603)。
与实施方式1相同，荧光图像分析程序222按照图8的流程图计算用于第一对象荧光样品图像和第二对象荧光样品图像的校正系数(第一校正系数和第二校正系数)。
荧光图像分析程序222使用获得的校正系数来校正每个对象荧光样品图像中的各个像素(i，j)的光强度。如实施方式1中所述，背景校正系数可以一起使用。
如实施方式1中所述，该实施方式3也可以被配置为排除固定模式噪声像素的x-y坐标，并利用剩余像素计算对象荧光样品和基准荧光样品的光强度。
测量结果的示例
以下，描述使用实施方式3中所述的偏振相机从荧光样品获得的测定结果的示例。以下描述的是关于在偏振相机127的偏振方向为0°时所获取的与激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量的图像的示例。对象荧光样品是容纳在容器中的液体材料(荧光标记的溶液)。基准荧光样品是YAG陶瓷片。
图32提供了由偏振相机127从填充在微通道单元的五个通道中的对象荧光样品中测量的未校正的光强度的平均值和校正后的光强度的平均值。填充在五个通道中的对象荧光样品处于相同的浓度水平，并且偏振相机127的偏振方向为0°，以拍摄在与激发光的线性偏振方向平行的方向上偏振的光的图像。基于从基准荧光样品测得的光强度校正了测得的光强度。纵轴表示五个通道之间的平均光强度。图33提供了由偏振相机127从填充在微通道单元的五个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的标准偏差(σ)和校正后的光强度的标准偏差(σ)。纵轴表示五个通道之间的标准偏差。
图34提供了由偏振相机127从填充在微通道单元的五个通道中的对象荧光样品中测得的未校正的光强度的离差(σ/平均值)和校正后的光强度的离差(σ/平均值)。纵轴表示五个通道之间的光强度的离差(σ/平均值)。比较图34中的校正前和校正后的离差，通道之间的校正后的光强度的差异(变动)较小。从对象荧光样品测得的光强度在平面中应该是均匀的。图32至图34教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。
实施方式4
装置结构
描述了使用具有又一结构的荧光偏振测量装置的测量方法。主要描述与实施方式1的不同。荧光偏振测量装置被配置为如图35所示。与图1的实施方式1的结构的不同之处为以下两点：(1)实施方式4中的发射侧的偏振调节器不是偏振板或液晶单元，而是偏振分束器110；(2)该装置包括两个成像装置125。
偏振分束器110使荧光的特定线性偏振分量(p)透射，并反射与前述偏振分量(偏振分束器110的方向：p)正交的分量(偏振分束器110的方向：s)。具体地，偏振分束器110使平行于激发光的偏振方向偏振的p线性偏振光透射并且反射垂直于激发光的偏振方向偏振的s线性偏振光。
操作
在下文中，描述了荧光偏振测量控制器20的操作。如图36所示，荧光偏振测量系统1包括荧光偏振测量装置10、荧光偏振测量控制器20以及D/A转换器(DAC)30。荧光偏振测量装置如参照图36所述被配置。荧光偏振测量控制器20控制荧光偏振测量装置10，并分析由荧光偏振测量装置10拍摄的荧光图像。
具体地，荧光偏振测量控制器20控制荧光偏振测量装置10的光源101和两个成像装置125。在以下描述的示例中，发射侧的偏振调节器是偏振分束器110，以使得成像装置125能够捕获在方向p和方向s上偏振的光的图像。在方向p上偏振的光的图像是与入射到样品上的线性偏振光平行的线性偏振分量的荧光偏振图像。在方向s上偏振的光的图像是与入射到样品上的线性偏振光垂直的线性偏振分量的荧光偏振图像。与该示例相比，方向p和方向s上的偏振情况可以相反。其余的操作与实施方式1中描述的操作相同。主要描述与实施方式1的不同。
例如，荧光偏振测量控制器20保持光源101接通以在测量期间用激发光照射样品。荧光偏振测量控制器20还通过D/A转换器30控制两个成像装置125的曝光时间(成像时间)、或成像的开始时间和成像的持续时间，以获取荧光的所需的偏振分量的图像数据。荧光偏振测量控制器20分析所获取的图像数据。荧光偏振测量控制器20基于基准样品的图像校正从对象样品测得的值。该操作校正被荧光偏振测量装置10的装置结构改变的图像，以实现更准确的测量。
例如，荧光偏振测量控制器20利用处理器控制成像装置125的曝光时间(成像时间)、或成像的开始时间和成像的持续时间，以在相同的测量(曝光)时间段测量来自对象荧光样品的荧光中的两个方向的偏振分量。进一步，荧光偏振测量控制器20控制成像装置125以与对象荧光样品的测量时间段相同的测量(曝光)时间段测量来自基准荧光样品的荧光中的两个方向的偏振分量。这种结构消除了由时间变化引起的图像之间的差异，从而实现了准确的测量。
测量方法
与实施方式1相同，实施方式4被配置为通过分别捕获与激发光的线性偏振方向平行和垂直的线性偏振分量，来获取对象荧光样品图像和基准荧光样品图像。
测量的总体过程与图4的流程图所示的实施方式1中的方法相同。主要描述与实施方式1的不同。图37是存储基准荧光样品图像的步骤S101的细节的示例的流程图。装置控制程序221相同地配置两个成像装置125的曝光条件(S1701)。装置控制程序221同步驱动两个成像装置125，以同时拍摄来自偏振分束器的两个偏振方向p和s上的荧光信号的基准荧光样品图像(S1702)。偏振方向p的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的偏振分量而获得的基准荧光样品图像，偏振方向s的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的偏振分量而获得的第二基准荧光样品图像。装置控制程序221将获取的图像存储到基准荧光样品图像数据库231(S1703)。
图38是存储对象荧光样品图像的步骤S102的细节的示例的流程图。装置控制程序221相同地配置两个成像装置125的曝光条件(S1801)。装置控制程序221同步驱动两个成像装置125，以同时拍摄来自偏振分束器的两个偏振方向p和s上的荧光信号的对象荧光样品图像(S1802)。偏振方向p的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向平行的偏振分量而获得的对象荧光样品图像，偏振方向s的图像是通过捕获与激发光的线性偏振方向垂直的偏振分量而获得的对象荧光样品图像。装置控制程序221将所获取的图像存储到对象荧光样品图像数据库232(S1803)。
与实施方式1相同，荧光图像分析程序222按照图8的流程图计算用于第一对象荧光样品图像和第二对象荧光样品图像的校正系数(第一校正系数和第二校正系数)。
荧光图像分析程序222使用获得的校正系数来校正每个对象荧光样品图像中的各个像素(i，j)的光强度。如实施方式1中所述，背景校正系数可以一起使用。
如实施方式1中所述，该实施方式4也可以被配置为排除固定模式噪声像素的x-y坐标，并利用剩余像素计算对象荧光样品和基准荧光样品的光强度。
测量结果的示例
在下文中，描述了利用实施方式4中描述的成像装置从荧光样品获得的测量结果的示例。以下描述的是关于与在偏振分束器110的偏振方向为p时获取的激发光的线性偏振方向平行的线性偏振分量的图像。对象荧光样品是容纳在容器中的液体材料(荧光标记的溶液)。基准荧光样品是YAG陶瓷片。
图39提供了从填充在微通道单元的九个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的平均值和校正后的光强度的平均值。填充在九个通道中的对象荧光样品处于相同的浓度水平，并且偏振分束器的偏振方向为p，以拍摄在与激发光的线性偏振方向平行的方向上偏振的光的图像。基于从基准荧光样品测得的光强度校正测得的光强度。纵轴表示九个通道之间的平均光强度。图40提供了从填充在微通道单元的九个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的标准偏差(σ)和校正后的光强度的标准偏差(σ)。纵轴表示九个通道之间的标准偏差。
图41提供了从填充在微通道单元的九个通道中的对象荧光样品测得的未校正的光强度的离差(σ/平均值)和校正后的光强度的离差(σ/平均值)。纵轴表示九个通道之间的光强度的离差(σ/平均值)。比较图41中校正前和校正后的离差，通道之间的校正后的光强度的差异(变动)较小。从对象荧光样品测得的光强度在平面中应该是均匀的。图39至图41教导了通过基于从基准荧光样品测得的光强度进行的校正，实现了对对象荧光样品的更准确的测量。关于偏振分束器的另一偏振方向s，校正表现出相同的效果。
如上所述，已经描述了本发明的多个实施方式，然而，本发明不限于前述实施方式。在本发明的范围内，本领域技术人员可以容易地修改、添加或转换前述实施方式中的每个要素。一个实施方式的结构的一部分可以被另一实施方式的结构取代，或者一个实施方式的结构可以被并入另一实施方式的结构中。
Claims (11)
1.一种荧光图像分析装置，包括：
一个或多个处理器；以及
一个或多个存储装置，
其中，所述一个或多个存储装置存储基准荧光样品图像和对象荧光样品图像，
其中，所述基准荧光样品图像是通过用线性偏振光照射面内荧光强度的关系已知的基准荧光样品并捕获来自所述基准荧光样品的荧光的第一预定偏振分量而获得的图像，
其中，所述对象荧光样品图像是通过用线性偏振光照射对象荧光样品并捕获来自所述对象荧光样品的荧光的第二预定偏振分量而获得的图像，以及
其中，所述一个或多个处理器被配置为：
基于所述基准荧光样品图像来确定用于校正在捕获的图像的像素之间测量的光强度中的不均匀性的校正系数；以及
基于所述校正系数校正所述对象荧光样品图像的像素的光强度。
2.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，来自所述基准荧光样品的荧光的面内强度是均匀的。
3.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，所述第一预定偏振分量和所述第二预定偏振分量是相同的偏振分量。
4.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，
其中，所述一个或多个存储装置存储通过捕获包括所述第一预定偏振分量的多个偏振分量而获得的基准荧光样品图像以及通过捕获所述多个偏振分量而获得的对象荧光样品图像，以及
其中，所述一个或多个处理器被配置为基于通过捕获所述多个偏振分量而获得的基准荧光样品图像，使用所述校正系数来对通过捕获对应的相同的偏振分量而获得的所述对象荧光样品图像中的每一个对象荧光样品图像进行校正。
5.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，所述一个或多个处理器被配置为基于预定的偏移值来校正所述对象荧光样品图像的像素的光强度。
6.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，所述一个或多个处理器被配置为：
确定所述对象荧光样品图像中的除所述对象荧光样品的区域以外的区域中的背景光强度；以及
基于所述背景光强度校正所述对象荧光样品图像的像素的光强度。
7.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，所述一个或多个处理器被配置为基于预定的拟合函数来确定所述基准荧光样品图像中的像素的光强度。
8.根据权利要求1所述的荧光图像分析装置，其中，所述一个或多个处理器被配置为：
基于图像传感器噪声的预定阈值，从所述基准荧光样品图像的像素和所述对象荧光样品图像的像素中检测图像传感器的固定模式噪声；
在确定所述校正系数时，从所述基准荧光样品图像中排除具有噪声的像素；以及
在确定所述对象荧光样品图像的像素的光强度时，从所述对象荧光样品图像中排除具有噪声的像素。
9.一种荧光偏振测量系统，包括：
根据权利要求4所述的荧光图像分析装置；以及
偏振相机，所述偏振相机包括图像传感器和偏振滤光器，所述图像传感器和所述偏振滤光器中的每一者被配置为使所述多个偏振分量中的一个偏振分量透射，
其中，所述荧光图像分析装置被配置为控制所述偏振相机通过捕获所述多个偏振分量来获取基准荧光样品图像，并通过捕获所述多个偏振分量来获取对象荧光样品图像，以及
其中，通过捕获所述多个偏振分量来获取所述基准荧光样品图像和所述对象荧光样品图像的测量时间段具有相同的长度。
10.一种荧光偏振测量系统，包括：
根据权利要求4所述的荧光图像分析装置；
偏振分束器，所述偏振分束器被配置为将光分成所述多个偏振分量；以及
多个成像装置，所述多个成像装置中的每一个成像装置设置成接收所述多个偏振分量中的一个偏振分量，
其中，所述荧光图像分析装置被配置为控制所述多个成像装置通过捕获所述多个偏振分量来获取基准荧光样品图像，并通过捕获所述多个偏振分量来获取对象荧光样品图像，以及
其中，通过捕获所述多个偏振分量来获取所述基准荧光样品图像和所述对象荧光样品图像的测量时间段具有相同的长度。
11.一种荧光图像分析方法，包括：
获取基准荧光样品图像和对象荧光样品图像；
基于所述基准荧光样品图像，确定用于校正在捕获的图像的像素之间测量的光强度中的不均匀性的校正系数；以及
基于所述校正系数，校正所述对象荧光样品图像的像素的光强度，
其中，所述基准荧光样品图像是通过用线性偏振光照射面内荧光强度的关系已知的基准荧光样品并捕获来自所述基准荧光样品的荧光的第一预定偏振分量而获得的图像，以及
其中，所述对象荧光样品图像是通过用线性偏振光照射对象荧光样品并捕获来自所述对象荧光样品的荧光的第二预定偏振分量而获得的图像。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019-160627 | 2019-09-03 | ||
| JP2019160627 | 2019-09-03 | ||
| JP2020055140A JP7497186B2 (ja) | 2019-09-03 | 2020-03-25 | 蛍光偏光測定システム |
| JP2020-055140 | 2020-03-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112444508A true CN112444508A (zh) | 2021-03-05 |
Family
ID=74681465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010902890.0A Pending CN112444508A (zh) | 2019-09-03 | 2020-09-01 | 荧光图像分析装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11525782B2 (zh) |
| CN (1) | CN112444508A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114414535A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-29 | 中钞印制技术研究院有限公司 | 检测方法和检测装置 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102116232B1 (ko) * | 2019-11-12 | 2020-05-28 | (주)로고스바이오시스템스 | 시료 검출 장치 및 이를 이용한 시료 검출 방법 |
| US20220206279A1 (en) * | 2020-12-28 | 2022-06-30 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Microscopy illumination apparatus, methods, and applications |
| CN113720825B (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-08 | 四川丹诺迪科技有限公司 | 光学即时检测器及检测方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10281876A (ja) * | 1997-04-09 | 1998-10-23 | Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk | 偏光性イメージング装置 |
| CN1637408A (zh) * | 2003-12-24 | 2005-07-13 | 横河电机株式会社 | 光量分布的校正方法以及生物芯片阅读器 |
| JP2010266380A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-11-25 | National Agriculture & Food Research Organization | 成分分布分析方法および成分分布分析装置 |
| WO2016009604A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Image processing apparatus, image processing method, and program |
| CN109565546A (zh) * | 2016-08-24 | 2019-04-02 | 索尼公司 | 图像处理设备、信息生成设备以及信息生成方法 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5515864A (en) * | 1994-04-21 | 1996-05-14 | Zuckerman; Ralph | Method and apparatus for the in vivo measurement of oxygen concentration levels by the indirect determination of fluoescence lifetime |
| US6052187A (en) * | 1998-08-31 | 2000-04-18 | Containerless Research, Inc. | Hyperspectral polarization profiler for remote sensing |
| US7217573B1 (en) * | 1999-10-05 | 2007-05-15 | Hitachi, Ltd. | Method of inspecting a DNA chip |
| WO2001049874A1 (en) * | 2000-01-06 | 2001-07-12 | Caliper Technologies Corp. | Methods and systems for monitoring intracellular binding reactions |
| US7420675B2 (en) * | 2003-06-25 | 2008-09-02 | The University Of Akron | Multi-wavelength imaging system |
| US7072039B2 (en) * | 2003-08-20 | 2006-07-04 | Itt Manufacturing Enterprises, Inc. | Active multiple-color imaging polarimetry |
| WO2006058187A2 (en) * | 2004-11-23 | 2006-06-01 | Robert Eric Betzig | Optical lattice microscopy |
| US7522278B2 (en) * | 2006-03-10 | 2009-04-21 | University Of Washington | Real-time linear-birefringence-detecting polarization microscope |
| US20120321759A1 (en) * | 2007-01-05 | 2012-12-20 | Myskin, Inc. | Characterization of food materials by optomagnetic fingerprinting |
| JP5208825B2 (ja) * | 2008-09-12 | 2013-06-12 | オリンパス株式会社 | 光学顕微鏡 |
| JP5449816B2 (ja) * | 2009-03-26 | 2014-03-19 | オリンパス株式会社 | 画像処理装置、画像処理プログラムおよび画像処理装置の作動方法 |
| US8570650B2 (en) * | 2009-12-09 | 2013-10-29 | Applied Precision, Inc. | Method and system for fast three-dimensional structured-illumination-microscopy imaging |
| WO2011091253A2 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-28 | Physical Sciences, Inc. | Multi-functional adaptive optics retinal imaging |
| EP2831559A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-02-04 | Clarient Diagnostic Services, Inc. | Methods for generating an image of a biological sample |
| US8947656B2 (en) * | 2013-01-04 | 2015-02-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Smartphone biosensor |
| US9307159B2 (en) * | 2014-03-04 | 2016-04-05 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | Polarization image processing apparatus |
| US9500846B2 (en) * | 2014-03-17 | 2016-11-22 | Howard Hughes Medical Institute | Rapid adaptive optical microscopy over large multicellular volumes |
| US10591870B2 (en) * | 2014-05-01 | 2020-03-17 | Celloptic, Inc. | Birefringent lens interferometer for use in microscopy and other applications |
| WO2015174332A1 (ja) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | 国立大学法人東京工業大学 | 偏光分析装置 |
| WO2015193885A2 (en) * | 2014-06-15 | 2015-12-23 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center). | Method for huanglongbing (hlb) detection |
| US10761028B2 (en) * | 2015-06-19 | 2020-09-01 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Determining extracellular analyte concentration with nanoplasmonic sensors |
| JP6764880B2 (ja) * | 2015-12-11 | 2020-10-07 | 株式会社ニコン | 偏光特性画像計測装置、偏光特性画像計測方法 |
| WO2019103994A1 (en) * | 2017-11-27 | 2019-05-31 | The Government of the United State of America, as represented by the Secretary of the Navy | Substrates with independently tunable topographies and chemistries for quantifying surface-induced cell behavior |
| JP7365350B2 (ja) * | 2018-03-01 | 2023-10-19 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト | 誘導放出抑制顕微鏡法のための方法およびシステム |
| WO2019200248A1 (en) * | 2018-04-13 | 2019-10-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Sub-diffraction imaging, coding and decoding of non-bleaching scatterers |
| EP4081846A1 (en) * | 2019-12-27 | 2022-11-02 | Sony Group Corporation | Polarization imaging system and polarization imaging method |
-
2020
- 2020-09-01 CN CN202010902890.0A patent/CN112444508A/zh active Pending
- 2020-09-01 US US17/008,910 patent/US11525782B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10281876A (ja) * | 1997-04-09 | 1998-10-23 | Bunshi Bio Photonics Kenkyusho:Kk | 偏光性イメージング装置 |
| CN1637408A (zh) * | 2003-12-24 | 2005-07-13 | 横河电机株式会社 | 光量分布的校正方法以及生物芯片阅读器 |
| JP2010266380A (ja) * | 2009-05-15 | 2010-11-25 | National Agriculture & Food Research Organization | 成分分布分析方法および成分分布分析装置 |
| WO2016009604A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Image processing apparatus, image processing method, and program |
| CN109565546A (zh) * | 2016-08-24 | 2019-04-02 | 索尼公司 | 图像处理设备、信息生成设备以及信息生成方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114414535A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-29 | 中钞印制技术研究院有限公司 | 检测方法和检测装置 |
| CN114414535B (zh) * | 2022-01-05 | 2024-05-07 | 中钞印制技术研究院有限公司 | 检测方法和检测装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11525782B2 (en) | 2022-12-13 |
| US20210063310A1 (en) | 2021-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112444508A (zh) | 荧光图像分析装置 | |
| US10048481B2 (en) | Scanning microscope and method for determining the point spread function (PSF) of a scanning microscope | |
| US20210048344A1 (en) | Digital pathology color calibration and validation | |
| CN109813435B (zh) | 静态光反射显微热成像方法、装置及终端设备 | |
| EP1767910A2 (en) | Light amount measuring apparatus and light amount measuring method | |
| US9291750B2 (en) | Calibration method and apparatus for optical imaging lens system with double optical paths | |
| WO2015151812A1 (ja) | 蛍光分析器 | |
| JP2019101416A (ja) | 異なる厚さの液晶セルを使用した液晶可変リターダ | |
| US11619882B2 (en) | Method and apparatus for characterizing a microlithographic mask | |
| CN111736376B (zh) | 检测装置、检测方法及计算机可读存储介质 | |
| CN111712705A (zh) | 采用时间相关的单光子计数的荧光寿命-显微-方法 | |
| JP7497186B2 (ja) | 蛍光偏光測定システム | |
| US7388647B2 (en) | Method and system for real time uniformity feedback | |
| US10768401B1 (en) | Microscope apparatus and method for calibrating position of light source | |
| US20080111992A1 (en) | Defective Particle Measuring Apparatus and Defective Particle Measuring Method | |
| US10983338B2 (en) | Exit-pupil expander used distribute light over a liquid-crystal variable retarder | |
| JP2010078418A (ja) | 分光測定装置、校正装置、分光測定方法、および校正方法 | |
| CN112697401B (zh) | 一种相位型空间光调制器的标定方法及装置 | |
| JP2005291900A (ja) | レンズメータ | |
| US20160269660A1 (en) | Imaging device and method | |
| JP2017227625A (ja) | 直線偏光による計測誤差が補正された輝度色度計 | |
| JP2005265649A (ja) | 旋光度測定装置および濃度測定装置 | |
| KR20160023242A (ko) | 렌즈에 의한 불균일 영상 보정 장치 및 그 방법 | |
| KR102160969B1 (ko) | 액정 엑스선 검출기의 엑스선 영상 결정 방법 | |
| US10508991B2 (en) | Polarization analysis apparatus and control method of polarization analysis apparatus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |