WO2015151812A1 - 蛍光分析器 - Google Patents

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WO2015151812A1
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fluorescence
image
fluorescence analyzer
capillary
detector
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PCT/JP2015/058022
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基博 山崎
雄一郎 大田
高橋　智
佳孝 児玉
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence analyzer used for analysis of nucleic acids and proteins.
  • capillary electrophoresis apparatus is mainly used for determining the base sequence and base length of DNA.
  • capillary electrophoresis a thin tube called a capillary is filled with an electrophoresis medium such as a gel, and a sample DNA fragment is migrated in the capillary. Then, the length of the DNA fragment is examined by measuring the time required for the sample to migrate by a fixed distance (usually from the end of the capillary to the end).
  • Each sample, that is, each DNA fragment is labeled with a fluorescent dye, and the fluorescent signal of the migrated sample is detected by an optical detector placed at the end of the capillary.
  • One of the methods for irradiating a plurality of capillaries with laser light is a multi-focus method described in Patent Document 1.
  • laser light is irradiated to capillaries positioned at one or both ends of a capillary array composed of a plurality of capillaries arranged on a flat substrate.
  • the irradiated laser light propagates one after another through adjacent capillaries and traverses the capillary array.
  • Light emission generated in the capillary array is detected by a photodetector.
  • a sample containing DNA labeled with a fluorescent dye is introduced into a capillary and irradiated with laser light so as to propagate through a plurality of capillaries arranged in a row.
  • the fluorescence-labeled DNA emits fluorescence by the laser beam irradiated to the capillary.
  • DNA analysis of the sample introduced into each capillary can be performed. The same applies to the analysis of proteins and the like.
  • the fluorescence of each fluorescent dye obtained by irradiating the capillary end portion with laser light of a specific wavelength is separated into wavelength components by a diffraction grating, and images in the spatial direction and the wavelength direction are converted into two components such as a CCD.
  • Detect with dimension detector An image captured by the detector is stored as spectral data in a specific capillary and used for data analysis.
  • a fluorescence spectrometer as described in Patent Document 2 performs analysis by continuously dispersing the acquired fluorescence using a diffraction grating and measuring a spectrum (actually, discrete for each pixel).
  • the capillary electrophoresis apparatus described above is one of them.
  • the main fluorescence detector conventionally used detects fluorescence with one detector.
  • the dynamic range and detection range depend on the excitation efficiency of the fluorescent sample, the NA of the camera lens, and the performance of the two-dimensional detector itself.
  • a method is used in which a beam splitter or a filter is provided in the middle of the optical path to divide the detection image, and a plurality of images having different fluorescence intensities are acquired by a plurality of detectors.
  • a plurality of expensive detectors are required, there are disadvantages such as an increase in apparatus cost and an increase in the size of the detection unit.
  • the fluorescence intensity depends on the irradiation detection time and the irradiation intensity. For this reason, data with different intensities can be acquired by controlling the parameters on the irradiation side. Therefore, a method has also been proposed in which data having different fluorescence intensities is acquired by changing the irradiation time or the detection time during analysis using a single detector.
  • the number of measurement points per unit time decreases, and the number of sampling points necessary for data acquisition may be insufficient.
  • the sample concentration is limited within the dynamic range of the apparatus.
  • analysis is performed after taking a long time for purification of the sample and adjusting the sample concentration to be almost uniform. For example, after checking the concentration with RNA, it is set in an electrophoresis apparatus.
  • one object image is divided into a plurality of images having different fluorescence intensities by an image dividing element, and the obtained plurality of images are different in the same detection plane.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic configuration of an irradiation unit of an electrophoresis apparatus used in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a fluorescence analyzer of an electrophoresis apparatus used in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 1.
  • FIG. which shows the ray tracing by the conventional imaging system.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic configuration of an irradiation unit of an electrophoresis apparatus used in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a fluorescence analyzer of an electrophoresis apparatus used in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a detailed configuration of a flu
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a schematic diagram of an image dividing prism used in the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a specific example of an image dividing prism used in the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an image division effect according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 3.
  • FIG. 6 is a diagram showing a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing a detailed configuration of a fluorescence analyzer used in Example 4.
  • each of the fluorescence analyzers according to the respective embodiments, one object image is divided into a plurality of images having different fluorescence intensities by an image dividing element, and the obtained plurality of images are simultaneously detected in different regions within the same detection plane.
  • the fluorescence analyzer uses a combination of the above-described image dividing element and spectroscopic element.
  • Both fluorescence analyzers simultaneously measure a plurality of signals having different fluorescence intensities for the same sample, so that the dynamic range can be apparently increased. For example, it is possible to acquire two types of images having different signal strengths by 10 times, and samples having different concentrations by 10 times can be analyzed. For example, in the case of a sample having a high concentration, the fluorescence intensity is strong, and the image on the detector may be saturated and an accurate analysis may not be performed. In that case, the analysis is performed using the image on the side where the fluorescence intensity is weak. For samples with a low concentration, analyze using images with strong fluorescence intensity. Even if the concentration is different by 10 times, the analysis can be performed by using the two strong and weak data on the detector.
  • the fluorescence detector is an optical filter for separating excitation light and fluorescence, a condensing lens for acquiring an image, a spectroscopic element (diffraction grating, prism, optical filter) for separating fluorescence, and for dividing an image.
  • Optical elements priss, beam splitters
  • an imaging lens and a two-dimensional detector (CCD, CMOS, etc.) for acquiring a dispersed image as data.
  • the optical filter is disposed between the object plane and the condenser lens and after the condenser lens. Further, the spectroscopic element for splitting the fluorescence and the optical element for dividing the image are arranged on the collimated optical path after the condenser lens.
  • the imaging lens is disposed in front of the optical path after the spectral and image division and the two-dimensional detector.
  • an image dividing element for example, a prism
  • the structure of an image dividing element is composed of a plane perpendicular to the optical axis (optical path) of collimated fluorescence and the same number of planes as the number of dividing the optical path. .
  • These image dividing planes are inclined by several to tens of degrees from a plane parallel to a plane perpendicular to the optical axis of the collimated fluorescence. For example, it is inclined in the range of 1 ° to less than 20 °. Therefore, the optical axis changes on the image division plane of the prism.
  • An image is divided by generating a plurality of fluorescent light paths by the number of image dividing planes.
  • the fluorescence intensity of the divided image can be controlled.
  • the fluorescence intensity of each image can be controlled by changing the ratio of the areas of the divided surfaces.
  • an image dividing element (for example, a beam splitter) having another structure is a flat plate, and divides the optical path by transmission and reflection. The ratio of transmission and reflection can be controlled.
  • the image dividing element is arranged at an angle of 45 ° with the optical axis of the collimated fluorescence. Since the transmitted optical axis and the reflected optical axis have a large angle of 90 °, a total reflection mirror is disposed on the transmitted optical path or the reflected optical path, and the divided optical paths are made substantially parallel.
  • the capillary or the like is irradiated with laser light to excite the fluorescent dye in the sample.
  • the excited fluorescence is transmitted through the fluorescence necessary for analysis while preventing the excitation light component with an optical filter or the like, condensed with a lens, and collimated.
  • Unnecessary components are again removed from the collimated fluorescence with an optical filter, and spectrally separated with a diffraction grating.
  • the light separated by the diffraction grating is divided into zero-order light, first-order light, and second-order light components.
  • the image dividing element is arranged on the optical path of the primary light having the highest signal intensity after the spectroscopy.
  • the light after the diffraction grating is also kept in a collimated state.
  • the optical axis changes through a prism surface perpendicular to the optical axis, not parallel to the surface, but inclined several degrees from the parallel surface.
  • Light is refracted by Snell's law on the prism-air interface.
  • new optical paths are generated as many as the number of the surfaces, and one image incident on the prism is divided to form a plurality of images.
  • the image can be divided into images having different signal intensities.
  • the spectrum and a plurality of images that is, fluorescence divided into a plurality of optical paths are imaged on a two-dimensional detector using a camera lens or the like.
  • a plurality of divided objects and a dispersed image are formed on the two-dimensional detector.
  • the signal intensity of image formation is determined depending on the amount of light on the dividing surface.
  • the detector is not limited to a two-dimensional detector, and a one-dimensional detector is used depending on the combination of an image dividing element and a spectroscopic element to be used.
  • FIG. 1 shows a configuration example of a gene analyzer using a capillary electrophoresis apparatus for fluorescence detection. This apparatus configuration is common to the embodiments described later.
  • the gene analyzer is an example of a fluorescence analyzer.
  • the gene analysis apparatus 100 includes a data analysis apparatus 128 and an electrophoresis apparatus 101.
  • the electrophoresis apparatus 101 includes a detection unit 116 for optically detecting a sample, a thermostatic chamber 118 for keeping the capillary at a constant temperature, a transporter 125 for transporting various containers to the capillary cathode end, and a high voltage across the capillary.
  • a high voltage power source 104 for applying current, a first ammeter 105 for detecting current generated from the high voltage power source, a second ammeter 112 for detecting current flowing through the anode side electrode, and one or a plurality of capillaries 102
  • the configured capillary array 117 includes a pump mechanism 103 for injecting a polymer into the capillaries.
  • the capillary array 117 is an exchange member including a plurality of capillaries (for example, four), and includes a load header 129, a detection unit 116, and a capillary head.
  • the capillary array 117 is replaced and the length of the capillary 102 is adjusted.
  • the capillary is damaged or quality is deteriorated, it is replaced with a new capillary array.
  • the capillary 102 is composed of a glass tube having an inner diameter of several tens to several hundreds of microns and an outer diameter of several hundreds of microns, and the surface is coated with polyimide to improve the strength.
  • the light irradiation portion irradiated with the laser light has a structure in which the polyimide coating is removed so that internal light emission is likely to leak to the outside.
  • the inside of the capillary 102 is filled with a separation medium for giving a migration speed difference during electrophoresis.
  • the separation medium has both fluidity and non-fluidity, a fluid polymer is used in this embodiment.
  • the detection unit 116 is a member that acquires information depending on the sample, and is irradiated with excitation light and emits light having a wavelength depending on the sample.
  • the vicinity of the light irradiation part of the four capillaries is arrayed and fixed on the optical flat plane with an accuracy of several microns in height.
  • two substantially coaxial laser beams are irradiated from both sides and are continuously transmitted through all the light irradiation units. By this laser light, information light (fluorescence having a wavelength depending on the sample) is generated from the sample and emitted from the light irradiation unit to the outside. This information light is detected by the optical detector 115 to analyze the sample.
  • the capillary cathode end 127 is fixed through a metal hollow electrode 126, and the capillary tip protrudes from the hollow electrode 126 by about 0.5 mm. Further, all the hollow electrodes provided for each capillary are integrally attached to the load header 129. Further, all the hollow electrodes 126 are electrically connected to the high-voltage power supply 104 mounted on the apparatus main body, and operate as cathode electrodes when it is necessary to apply a voltage such as electrophoresis or sample introduction.
  • the capillary end (the other end) opposite to the capillary cathode end 127 is bundled into one by a capillary head, and is attached to and detached from the block 107 through the capillary head while keeping the bundle in a pressure-proof manner.
  • a syringe 106 is connected to one of the flow paths in the block 107, and the syringe 106 fills the capillary with a new polymer from the other end side. Refilling of the polymer in the capillary is performed for each measurement in order to improve the measurement performance.
  • the pump mechanism 103 includes a syringe 106 and a mechanism system for pressurizing the syringe 106.
  • the block 107 is a connection part for communicating the syringe 106, the capillary array 117, the anode buffer container 110, and the polymer container 109.
  • the optical detection unit includes a light source 114 for irradiating the detection unit 116 and an optical detector 115 for detecting light emission in the detection unit 116. When the sample in the capillary separated by electrophoresis is detected, the light source 114 irradiates the light irradiation part of the capillary, and the optical detector 115 detects light emission from the light irradiation part.
  • the thermostat 118 is covered with a heat insulating material in order to keep the thermostat at a constant temperature, and the temperature is controlled by the heating / cooling mechanism 120. Further, the fan 119 circulates and stirs the air in the thermostatic chamber, and keeps the temperature of the capillary array 117 uniform and constant in position.
  • the conveyor 125 includes three electric motors and a linear actuator, and is movable in three axes in the vertical direction, the horizontal direction, and the depth direction.
  • at least one or more containers can be placed on the moving stage 130 of the transporter 125. Further, the moving stage 130 is provided with an electric grip 131 so that each container can be grasped and released.
  • the transporting device 125 can transport the cathode buffer container 121, the cleaning container 122, the waste liquid container 123, and the sample container 124 to the cathode end, if necessary, using the grip 131. Unnecessary containers are stored in a predetermined container in the apparatus.
  • the electrophoresis apparatus 101 is used in a state where it is connected to the data analysis apparatus 128 with a communication cable.
  • the operator can control the functions of the apparatus by the data analysis apparatus 128 and can exchange data detected by the detector in the apparatus.
  • FIG. 2 schematically shows a configuration in the vicinity of the optical system laser irradiation unit of the gene analyzer 100 and the detection unit of the capillary array 117, and a laser beam introduction path.
  • Laser shutters, filters, and the like are well-known matters in this field, and are not a direct object of the present invention.
  • a figure is a schematic side view of a laser irradiation part
  • a figure is a schematic front view. However, the arrangement relationship in the diagrams (a) and (b) does not represent the arrangement relationship in the drawing.
  • a capillary array has four capillaries 102 arranged and fixed on a reference base 209.
  • a plane formed by the central axes of the four capillaries 102 on the reference base 209 and a virtual plane obtained by extending the plane to the entire space are referred to as a capillary array plane.
  • An imaginary straight line that lies in the capillary array plane and is perpendicular to the four capillary axes and passes through the center of the detector is hereinafter referred to as an irradiation optical axis basic axis 210.
  • the laser beam 202 introduced from both ends of the capillary array is parallel to the capillary array plane and coaxial with the irradiation optical axis basic axis 210.
  • the capillary 102 is a quartz glass tube covered with a polymer thin film (polyimide). However, in the detection part, the polymer film is removed and the quartz is exposed.
  • the inner diameter / outer diameter of the quartz tube is 50/320 ⁇ m, and the outer diameter of the capillary including the polymer thin film is 363 ⁇ m.
  • DNA is detected by irradiating the fluorescence detection part (part where quartz is exposed) of the capillary array with laser light 202 from one side surface of the array and observing the fluorescence emitted from the detection part.
  • the capillary 102 located at the end of the capillary array and into which the laser is introduced is hereinafter referred to as a first capillary.
  • the distance between the laser condensing lens 206 and the first capillary is 62 mm, and the laser light introduced into the first capillary propagates one after another to adjacent capillaries and crosses the four capillaries.
  • Wavelength plates ( ⁇ / 4) 207 are arranged at both end positions of the capillary array in order to change the linearly polarized light of the laser light 202 into circularly polarized light before the laser light 202 reaches the capillary 102.
  • the laser beam 202 that has been circularly polarized by the one wavelength plate 207 is again made linearly polarized by the other wavelength plate 207.
  • the linear deflection direction of the linear deflection that has passed through the wave plate 207 twice is rotated by 90 degrees with respect to the linear polarization direction before being introduced into the first wave plate 207.
  • a polarizer 204 is disposed immediately after the solid-state laser 201 as a countermeasure against return light.
  • the polarizer 204 is an optical element that transmits only polarized light in one direction, such as a polarizing plate or a polarized cube. Since the laser beam that has passed through the wave plate 207 twice is blocked by the polarizer 204, it does not reach the light source.
  • a plurality of capillaries 102 are arranged and fixed on a ceramic reference base 209 that is a flat surface to form a capillary array.
  • a ceramic reference base 209 that is a flat surface to form a capillary array.
  • four capillaries 102 are arranged on a capillary holding surface, held down by a silicon flat mask 301, and fixed with an adhesive or the like to form a capillary array.
  • a plane formed by the central axes of the four capillaries on the reference base 209 and a virtual plane obtained by extending the plane to the entire space are called capillary array planes.
  • a straight line perpendicular to the irradiation optical axis basic axis 210 and also perpendicular to the capillary array plane is referred to as a detection optical axis basic axis 310.
  • Laser light 202 introduced from both ends of the capillary array is parallel to the capillary array plane and coaxial with the irradiation optical axis basic axis 210.
  • Each capillary 102 is a quartz glass tube covered with a polymer thin film, but the laser irradiation section 302 (detection site) has a polymer film removed and quartz is exposed. .
  • FIG. 3B is a schematic diagram of a cross section obtained by cutting a part of the detection unit along a plane orthogonal to the capillary.
  • the laser beam 202 first irradiates the endmost capillary 102, and after passing through it, irradiates the next capillary 102.
  • the laser beam 202 passes through the plurality of capillaries one after another and exits from the capillary 102 at the opposite end. Since the capillary 102 has a cylindrical shape and is filled with a polymer, the capillary 102 provides a light collecting function similar to that of a convex lens. Thereby, the divergence of the laser beam 202 is suppressed.
  • the fluorescence detector 303 is arranged on the detection optical axis basic axis 310 and can efficiently collect the fluorescence of four samples simultaneously. That is, all samples can be detected simultaneously while maintaining high sensitivity.
  • FIG. 4 shows a detailed configuration of the fluorescence detector 303.
  • 4A shows a view on the surface formed by the axis of the capillary 102 and the detection optical axis basic axis 310
  • FIG. 4B shows a side view thereof, that is, the irradiation optical axis basic axis 210.
  • FIG. 5 is a diagram on a plane formed by the detection optical axis basic axis 310.
  • FIG. 5B the arrangement of the optical system after the diffraction grating 405 is modified for easy explanation.
  • the fluorescence detector 303 includes a first optical filter 402 and a second optical filter 404 for separating excitation light and fluorescence, a condensing lens 403 for acquiring an image, a diffraction grating 405 for separating fluorescence.
  • a thin prism 409 for dividing the image, an imaging lens 406 for forming the image, and a two-dimensional detector 407 (CCD, CMOS, etc.) for acquiring the dispersed image as data are configured.
  • the capillary 102 is irradiated with a laser beam 202 to excite the fluorescent dye in the sample.
  • the first optical filter 402, the condensing lens 403, the second optical filter 404, and the diffraction grating 405 are disposed on the detection optical axis basic axis 310.
  • the light emitted from the capillary 102 is separated into excitation light and a necessary fluorescent component by the first optical filter 402, and condensed and collimated by the condenser lens 403.
  • the collimated fluorescence is again incident on the second optical filter 404, and unnecessary components are removed.
  • the fluorescence from which unnecessary components have been removed is separated by the diffraction grating 405.
  • the light separated by the diffraction grating 405 is divided into zero-order light, first-order light, and second-order light components.
  • the optical path of the primary light having the highest signal intensity after the spectroscopy is the detection optical axis 410 after the spectroscopy, and the thin prism 409 that is an image dividing element, the imaging lens 406 that forms an image,
  • a two-dimensional detector 407 (CCD, CMOS, etc.) for acquiring a spectral image as data is arranged.
  • the structure of the thin prism 409 is composed of a plane perpendicular to the collimated fluorescence optical axis (optical path) -detecting optical axis basic axis 310 and the same number of planes as the number of optical paths divided. These image dividing surfaces are inclined by several to tens of degrees from a surface parallel to a plane perpendicular to the optical axis of the collimated fluorescence (described later in FIG. 6). Therefore, the optical axis changes on the image dividing surface of the thin prism 409. In this embodiment, the image is divided by having two image dividing planes having the same area and generating two fluorescent light paths 411 and 412.
  • the optical axis changes through a plane that passes through a prism surface perpendicular to the optical axis, is not parallel to the surface, but is inclined by several degrees from the parallel surface.
  • the light is refracted by Snell's law on the prism / air interface.
  • the same number of new optical paths are generated, and one image incident on the prism is divided to form a plurality of images.
  • a dielectric film or a vapor deposition film is formed on each divided surface, and the fluorescence intensity of the divided image can be controlled by changing the transmittance.
  • a thin prism 409 having an image dividing surface with a transmittance of 90% and an image dividing surface with a transmittance of 10% is disposed.
  • the spectrum and the fluorescence divided into a plurality of images are imaged on the two-dimensional detector 407 using the imaging lens 406.
  • a plurality of regions constituting the same detection surface of the two-dimensional detector 407 a plurality of object images obtained by dividing a specific spectrum (primary light) are formed.
  • the signal intensity of the object image to be formed is determined depending on the light quantity of the dividing surface.
  • Fluorescence passing through the fluorescent light path 411 is transmitted through the image division plane having a transmittance of 90%, and forms a first image (strong) having a strong signal intensity on the two-dimensional detector 407. Since the fluorescence passing through the fluorescent light path 412 is transmitted through the image division plane having a transmittance of 10%, a second image (weak) having a low signal intensity is formed on the two-dimensional detector 407.
  • the signal intensity ratio between the first image and the second image is approximately 9: 1 which is the same as the transmittance ratio. That is, two types of data of the first image (strong) and the second image (weak) are simultaneously acquired on the two-dimensional detector 407.
  • wavelength calibration is performed every time the capillary is replaced (500).
  • a known DNA sample calibrated from a dye group to be analyzed for example, four color fluorescent dyes, is migrated to obtain spectral data serving as a reference.
  • the basic procedure of electrophoretic analysis can be roughly divided into analysis by preliminary preparation, loading of the electrophoresis medium (503), preliminary electrophoresis (506), sample introduction (509), and electrophoresis (512).
  • preparation before starting electrophoresis will be described.
  • the operator sets the following in the device before starting the measurement. That is, a cathode buffer container 121 containing a buffer solution, a washing container 122 containing pure water for capillary washing, a waste liquid container 123 for discharging the polymer in the capillary, a polymer container 109 containing a polymer as a separation medium, A sample container 124 containing a sample to be measured is set.
  • the anode buffer container 110 is filled with a buffer enough to immerse both the electrode (GND) 111 and the communication pipe.
  • As the buffer solution an electrolyte solution commercially available for electrophoresis from each company is used.
  • a sample to be analyzed is dispensed into the well of the sample container 124.
  • the sample is, for example, a DNA PCR product.
  • a cleaning solution for cleaning the capillary cathode end 127 is dispensed into the cleaning container 122.
  • the cleaning solution is pure water, for example.
  • a separation medium for electrophoresis of the sample is injected into the syringe 106.
  • the electrophoresis medium is, for example, a polyacrylamide separation gel (hereinafter referred to as a polymer) commercially available for electrophoresis from various companies.
  • samples set in the sample container 124 include positive samples, negative controls, and allelic ladders in addition to the actual DNA samples to be analyzed, which are electrophoresed in different capillaries.
  • the positive control is, for example, a PCR product containing known DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that DNA is correctly amplified by PCR.
  • the negative control is a PCR product that does not contain DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that the PCR amplification product does not contain contamination such as operator DNA or dust.
  • the cathode buffer container 121 fills the buffer so that the hollow electrode 126 and the capillary cathode end 127 are sufficiently immersed. If the measurement is started with the buffer liquid amount insufficient or the cathode buffer container 121 is empty, there is a risk that a discharge will occur between the negative electrode with a high potential and another with a low potential when a high voltage is applied. It is. Furthermore, it is desirable that both buffer levels are equal. This is to prevent the polymer in the capillary from moving due to the pressure due to the height difference. In addition, all of the flow paths used for electrophoresis or the flow paths used to transport the polymer to the flow paths need to be filled with the polymer before starting the measurement.
  • the flow path is filled with a polymer.
  • the operator operates the pump mechanism of the device or manually operates the syringe, etc. Is replaced with a polymer. Thereafter, the operator visually confirms that there are no remaining bubbles or foreign matter in the flow path. Then, after the preliminary preparation is completed, the operator operates the apparatus and starts analysis.
  • the analysis is an analysis in which a high voltage is applied to the electrophoresis path.
  • the apparatus starts analysis in response to a command from the data analysis apparatus 128 (501).
  • the loading of the electrophoresis medium is a procedure for filling the capillary 102 with a new electrophoresis medium and forming a migration path.
  • the waste container 123 is carried directly below the load header 129 by the transport device 125 so that the used migration medium discharged from the capillary cathode end 527 can be received. Then, the syringe 106 is driven to fill the capillary 102 with a new electrophoresis medium, and the used electrophoresis medium is discarded. Finally, the capillary cathode end 127 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 122, and the capillary cathode end 127 soiled with the electrophoresis medium is cleaned.
  • the transporter 125 transports the cleaning container 122 to the capillary cathode end 127 and performs cleaning by immersing the capillary cathode end 127 in pure water in the cleaning container (504). .
  • the transporting device 125 transports the cathode buffer container 121 to the capillary cathode end 127 (505).
  • preliminary electrophoresis (506) is performed. This step may be performed automatically or sequentially by transmitting a control signal from the data analysis device 128.
  • a predetermined voltage is applied to start preliminary electrophoresis (506).
  • Preliminary electrophoresis is intended to bring the state of the polymer in the capillary into a state suitable for analysis prior to the original analysis step of performing electrophoresis from sample introduction.
  • a voltage of several to several tens of kilovolts is usually applied for several to several tens of minutes.
  • the capillary cathode end 127 is again washed with the washing container (507), and then the sample container 124 is transported to the capillary cathode end (508).
  • a voltage of about several kilovolts is applied to the capillary cathode end 127 in the sample liquid stored in the sample container 124, an electric field is generated between the sample liquid and the anode side electrode. This electric field introduces the sample in the sample liquid into the capillary (509).
  • the capillary cathode end 127 is washed with a washing container (510), and then the cathode buffer container 121 is conveyed again to the capillary cathode end 127 (511). Then, electrophoresis is started by applying a predetermined voltage (512).
  • electrophoresis (512) is performed. This step may be performed automatically or sequentially by transmitting a control signal from the data analysis device 128. Electrophoresis (512) is to impart mobility to the sample in the capillary by the action of the electric field generated between the cathode and anode buffer, and to separate the sample by the difference in mobility depending on the nature of the sample.
  • electrophoresis (512) in the present embodiment first, the capillary cathode end 127 is immersed in the buffer solution in the cathode buffer container 121 by the carrier 125 to form a current path.
  • a high voltage of about 15 kV is applied to the energization path by the high-voltage power source 104 to generate an electric field in the migration path. Due to the generated electric field, each sample component in the migration path moves to the detection unit 116 at a speed depending on the property of each sample component. That is, the sample components are separated by the difference in moving speed. And it detects in order from the sample component which reached
  • the detection unit 116 is reached in order from the DNA having the shorter base length.
  • a fluorescent dye depending on the terminal base sequence is attached to each DNA.
  • the luminance of only a partial area in the image data may be transmitted instead of the image data.
  • the luminance values only at the wavelength positions at regular intervals may be transmitted for each capillary.
  • FIGS. 6A to 6C show the principle of splitting the strong and weak images and the image splitting prism structure.
  • FIGS. 6A to 6B the effect of spectroscopy by the diffraction grating 405 is omitted, and only an imaging system is shown.
  • FIG. 6A shows an imaging system using a fluorescence spectrometer according to the prior art. Capillary 102 is arrayed, and fluorescence ray trace 601 collimated by second condenser lens 404 A forms one image 602 on two-dimensional detector 407 by imaging lens 406. In the case of a one-to-one imaging system, the same image as the object image is formed.
  • FIG. 6B shows ray tracing in this example.
  • an image division prism 409 is arranged in addition to the configuration of the conventional fluorescence spectrometer.
  • the fluorescence after passing through the image dividing prism 409 is refracted at the interface between the image dividing surface of the image dividing prism 409 and air. Since there are two split planes, the light beam from one point is refracted in two directions, resulting in two ray traces 603 and 604.
  • Two images 605 and 606 are formed by the imaging lens 406, respectively.
  • f1 focal length of condensing lens
  • f2 focal length of imaging lens
  • Y Image height (object plane) (half of array width)
  • Y ' Image height (imaging plane)
  • Y ′ the image height (imaging plane) Y ′ is calculated.
  • Y ' is given by the following equation.
  • Y ' tan ⁇ 2 ⁇ f2 / f1 ⁇ f2
  • ⁇ 1 tan -1 (Y / f1)
  • n ⁇ sin ⁇ '2 sin ⁇ 1
  • the inclination angle ⁇ of the image dividing prism 409 can be obtained from the original object image Y so as to satisfy these expressions (1) and (2).
  • FIG. 7 shows an outline of the image dividing prism 409.
  • the fluorescence collimated by the condenser lens 403 enters from the incident surface shown in the figure.
  • the image dividing prism 409 is configured with two planes inclined by an angle ⁇ from a plane parallel to the incident plane as a reference plane.
  • the apex angle ⁇ of the image dividing prism 409 has a characteristic of ⁇ 2 ⁇ .
  • the material of the image division prism 409 is, for example, BK7 (refractive index 1.517).
  • FIG. 8 shows a specific example of the image dividing prism 409.
  • the pitch of the capillaries 102 is equal to the outer diameter of the capillary and is 363 ⁇ m
  • the image height from the center is The (object surface) is half of 1.5 mm.
  • the focal lengths of the condenser lens 403 and the imaging lens 406 are 50 mm
  • the incident angle ⁇ 1 1.72 °
  • the emission angle ⁇ 2 6.47 °. Since the image height on the object side is 6.7 mm, which is sufficiently larger than the capillary width of 2.96 mm, each divided image can be acquired on the detector.
  • the first image and the second image are shifted by the distance between the capillaries, and the first image is moved between the capillaries. It is also possible to form and image a capillary image of two images.
  • FIG. 9A shows a ray tracing diagram in the case where the inclination angle ⁇ of the image dividing prism 409 is 15 ° and a state of image formation on the two-dimensional detector.
  • the ray tracing all capillaries 901
  • three rays are each expressed by a subtle difference in angle.
  • the first image is divided into ray tracing (first capillary) 902 to (second capillary) 904.
  • FIG. 9B shows a ray tracing diagram and an image formation state on the two-dimensional detector when the inclination angle ⁇ of the image dividing prism 409 is 5 °.
  • the inclination angle ⁇ is an accurate value for the three capillaries 102, and the first image and the second image are obtained almost adjacent to each other on the two-dimensional detector. For this reason, in the case of this example, when the inclination angle ⁇ of the image dividing prism 409 is set to 5 °, there is an effect that the detector region can be used without waste.
  • FIG. 10A shows an example of a first image (strong) and a second image (weak) formed on the two-dimensional detector.
  • the vertical axis indicates the spatial direction of the capillary, that is, the capillary number, and the horizontal axis chromatic dispersion direction.
  • point A for example, the second capillary, wavelength 600 nm
  • FIG. 10B shows time-series data of each point A in the first image and the second image.
  • the horizontal axis represents time
  • the vertical axis represents signal intensity.
  • the signal intensity may exceed the saturation limit value (“12” in the figure), and an accurate value may not be detected. This is the case indicated by the “saturated state of signal value” in the first image. Therefore, focusing on the second image, since the data is acquired with the signal intensity reduced in the first place, the saturation limit value is not exceeded and the data of the same DNA fragment can be taken. There is no need to perform the analysis again, and the analysis can be performed efficiently without waste of samples and analysis costs. By properly using the first image and the second image, it is possible to analyze samples having different densities on one side.
  • the signal intensity ratio between the first image and the second image follows the transmittance of each divided surface of the image dividing prism. By setting the transmittance to 1:10 or the like, it is possible to deal with samples having a concentration 10 times different. Which of the first image and the second image is used as the normal mode can be determined for each apparatus system, and in this embodiment, either data can be acquired. It is also possible for the user to select when performing analysis by providing a function for the user to check in advance, such as displaying the first image and the second image in time series on the operation screen (not shown). It is.
  • one detector apparently performs two types of analysis.
  • the analysis is performed a plurality of times while changing the irradiation detection time and the irradiation intensity.
  • the fluorescence analyzer according to the present embodiment has a function as if it had two detectors having the same components and the same performance. That is, the dynamic range of the apparatus is apparently expanded while maintaining the S / N ratio and sensitivity that can be analyzed.
  • the fluorescence detector according to the present embodiment can simultaneously acquire a plurality of detected images with a single detector, it is possible to provide a small and low-priced device having a very wide detection range.
  • the dynamic range can be expanded 10 times or more compared to the conventional method.
  • the number of measurement points can be maintained and high-precision analysis can be performed.
  • Example 2 Subsequently, a second embodiment of a fluorescence analyzer suitable for use in a capillary electrophoresis apparatus will be described.
  • the thin prism 409 was used as an image dividing element.
  • the image division plane of the prism in Example 1 has an equal area (see FIG. 4), and the fluorescence intensity of the divided image was controlled by changing the transmittance.
  • vapor-depositing a dielectric multilayer film having different characteristics on the image division plane has the following disadvantages. 1) It is expensive because it undergoes a plurality of vapor deposition steps in production. 2) Lowering the transmittance wastes the original condensed light quantity.
  • Example 2 a prism that controls the fluorescence intensity by the area ratio of the image dividing plane is used.
  • FIG. 11 shows a detailed configuration of the fluorescence detector 303 used in this embodiment.
  • the main configuration is the same as that of the first embodiment, but an image dividing prism 1109 having image dividing surfaces with different area ratios is used as an optical element for image division.
  • the fluorescence dispersed by the diffraction grating 405 is passed through an image division prism 1109 having a plurality of image division planes having different areas, and is divided into a plurality of images having different signal intensities according to the difference in the area of passage.
  • the optical axis is refracted at the boundary surface between the image dividing surface and the air, so that the direction of the fluorescent light changes.
  • the amount of light proportional to the area of the image dividing plane is the fluorescence intensity at the time of image formation. That is, the signal intensity detected by the two-dimensional detector 407 is determined according to the area ratio of the image division plane.
  • Example 3 a third embodiment of a fluorescence analyzer suitable for use in a capillary electrophoresis apparatus will be described.
  • a thin prism is used as an image dividing element.
  • the prism is one of the wavelength dispersion elements, and has a function of dispersing the condensed fluorescent component for each wavelength, like the diffraction grating. For this reason, the influence of wavelength dispersion by the prism is somewhat generated in the image division direction. Depending on the application and the type of detection image, minute chromatic dispersion may affect the analysis.
  • the image dividing element is composed of a beam splitter (half mirror) and a total reflection mirror. Since image division is performed without using a prism, there is no influence of wavelength dispersion caused by the image division prism as in the first and second embodiments.
  • Example 3 The configuration of the gene analyzing apparatus according to Example 3 is the same as the configuration shown in FIG.
  • a combined structure of an image division optical element for example, a half mirror or a beam splitter
  • a beam splitter 1209 is used as the image dividing optical element.
  • the beam splitter 1209 and the total reflection mirror 1210 are disposed between the condenser lens 403 and the second optical filter 404. As shown in FIG. 12, the beam splitter 1209 is approximately 45 ° with respect to the detection optical axis basic axis 310, and the total reflection mirror 1210 is 45 ° or less (for example, 43 to 44 °) with respect to the detection optical axis basic axis 310. To place.
  • the beam splitter 1209 is a flat optical element and divides the optical path into two by transmission and reflection. That is, the transmittance (or reflectance) is controlled, and incident light is divided into two lights at a predetermined division ratio. At the time of division, the transmission and reflection characteristics are not different depending on the wavelength as in a dichroic mirror, but the transmission and reflectance are uniquely determined in a certain wavelength region.
  • types of polarization there are a non-polarization type, a non-polarization type, and a polarization type. In this embodiment, the non-polarization type including the polarization state of incident light is used.
  • Fluorescence at the light emitting point 401 is collimated by the condenser lens 403 and enters the beam splitter 1209 at an incident angle of 45 °.
  • the transmittance: reflectance of the beam splitter 1209 is 90%: 10%
  • 90% of the collected light amount is transmitted and 10% is reflected.
  • Ninety percent of the light is parallel to the detection optical axis basic axis 310, as shown by a fluorescent light path (strong) 411, dispersed by the diffraction grating 405, and imaged on the two-dimensional detector 407.
  • 10% of the reflected light is returned almost parallel to the detection optical axis basic axis 310 by the total reflection mirror 1210 as indicated by a fluorescent light path (weak) 412.
  • the total reflection mirror 1210 is disposed at 45 ° or less (eg, 43 to 44 °) with respect to the detection optical axis basic axis 310, and the fluorescent light path (weak) 412 is relative to the detection optical axis basic axis 310.
  • the incident light is not completely parallel but has an angle of 1 to 2 °.
  • the image is formed on the two-dimensional detector 407 by the imaging lens 406 while having an angle with the detection optical axis basic axis 310.
  • the image is formed at a position different from the image by the fluorescent light path (strong) 411, two images are formed on the two-dimensional detector 407.
  • the signal intensity of the image by the fluorescent light path (strong) 411 on which 90% of the collected light amount forms an image is high, and the signal intensity by the fluorescent light path (weak) 412 is low.
  • Each signal intensity ratio is 9: 1 according to the transmittance: reflectance of the beam splitter 1209 of 90%: 10%. Similar to the first embodiment, two types of data can be acquired.
  • the beam splitter 1209 may be a cube type beam splitter. Since there is no refraction of transmitted light and the incident angle condition is vertical incidence, there is no need to make incidence at 45 ° unlike a plate type, and there is an advantage that alignment work becomes easy.
  • the fluorescence condensed by the condenser lens 403 by the beam splitter 1209 is divided into two, and one of the fluorescence is directly collected by the two-dimensional detector 407. Then, the other fluorescence is reflected by the total reflection mirror 1210 and then condensed on the two-dimensional detector 407. Since the condensing image is divided into two by the beam splitter 1209, wavelength dispersion does not occur.
  • the arrangement position of the optical system composed of the beam splitter 1209 and the total reflection mirror 1210 is not limited to the arrangement position shown in FIG.
  • an optical system including a beam splitter 1209 and a total reflection mirror 1210 may be disposed on the post-spectral detection optical axis 410 between the diffraction grating 405 and the imaging lens 406.
  • the beam splitter 1209 is arranged at approximately 45 ° with respect to the post-spectral detection optical axis 410.
  • Total reflection mirror 1210 is arranged at 45 ° or less (for example, 43 ° to 44 °) with respect to post-spectral detection optical axis 410.
  • Example 4 a fourth embodiment of a fluorescence analyzer suitable for use in a capillary electrophoresis apparatus will be described.
  • the diffraction grating 405 is used as the wavelength dispersion element (spectral element).
  • the diffraction grating 405 is not used.
  • a filter that transmits only the most sensitive wavelength band for each fluorescent dye is switched at high speed, or an image sensor and a filter corresponding to each fluorescent dye are provided at the same time as the number of fluorescent dyes.
  • a technique for imaging each fluorescent element is employed. The method of the present embodiment corresponds to sampling a spectrum at a sample position corresponding to each fluorescent dye.
  • FIG. 14 shows a detailed configuration of the fluorescence detector 303 used in this embodiment.
  • the fluorescence detector 303 in this embodiment includes a filter wheel 1301 that rotates at a high speed.
  • the filter wheel 1301 includes a plurality of fluorescent filters 1302 that transmit only the wavelength band with the highest sensitivity corresponding to each fluorescent dye.
  • the fluorescent filter 1302 is disposed perpendicular to the detection optical axis basic axis 310.
  • image division is performed by the beam splitter 1209 and the total reflection mirror 1210.
  • the divided fluorescence enters the fluorescence filter 1302, is dispersed according to the transmission characteristics of the fluorescence filter 1302 located on the optical path, and forms an image on the two-dimensional detector 407.
  • a one-dimensional line detector can be employed instead of the two-dimensional detector. Further, since the detection area is narrow and no diffraction grating is used, it is not affected by image distortion or the like.
  • the arrangement position of the optical system including the beam splitter 1209 and the total reflection mirror 1210 is not limited to the arrangement position shown in FIG.
  • an optical system including a beam splitter 1209 and a total reflection mirror 1210 may be disposed on the post-spectral detection optical axis 410 between the filter wheel 1301 and the imaging lens 406.
  • SYMBOLS 100 Gene analysis apparatus 101 ... Electrophoresis apparatus 102 ... Capillary 103 ... Pump mechanism 104 ... High voltage power supply 105 ... First ammeter 106 ... Syringe 107 ... Block 109 ... Polymer container 110 ... Anode buffer container 111 ... Electrode (GND) DESCRIPTION OF SYMBOLS 112 ... 2nd ammeter 113 ... Electric valve 114 ... Light source 115 ... Optical detector 116 ... Detection part 117 ... Capillary array 118 ... Constant temperature bath 119 ... Fan 120 ... Heating / cooling mechanism 121 ... Cathode buffer container 122 ... Cleaning container 123 ...
  • Waste liquid Container 124 ... Sample container 125 ... Conveyer 126 ... Hollow electrode 127 ... Capillary cathode end 128 ... Data analysis device 129 ... Load header 130 ... Moving stage 131 ... Grip 201 ... Solid laser 202 ... Laser beam 203 ... Reflection mirror 204 ... Polarizer 205 ... Beam splitter 206 ... Laser condensing lens 207 ... Wave plate ( ⁇ / 4) 209 ... reference base 210 ... irradiation optical axis basic axis 301 ... flat plate mask 302 ... laser irradiation unit 303 ... fluorescence detector 310 ... detection optical axis basic axis 401 ... light emission point 402 ...
  • first optical filter 403 condensing lens 404 ... Second optical filter 404A ... second condenser lens 405 ... diffraction grating 406 ... imaging lens 407 ... two-dimensional detector 409 ... thin prism (image division prism) 410: post-spectral detection optical axis 411: fluorescent light path (strong) 412 ... Fluorescent light path (weak) 601 ... Ray tracing according to the prior art 602 ... Imaging according to the prior art 603 ... First ray tracing 604 ... Second ray tracing 605 ... First imaging 606 ... Second imaging 901 ... Ray tracing (all capillaries) 902 ... Ray tracing (first capillary) 903 ...

Abstract

　未知濃度の試料を分析する際、ダイナミックレンジ不足し、再分析を行う事態が頻発することがある。そこで、蛍光分析器として、１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出するものを提案する。

Description

蛍光分析器
　本発明は、核酸やタンパク質などの分析に使用される蛍光分析器に関する。
　蛍光分析器の一つにキャピラリ電気泳動装置がある。キャピラリ電気泳動装置は、主にＤＮＡの塩基配列や塩基長の決定に使用される。キャピラリ電気泳動では、キャピラリと呼ばれる細い管にゲル等の泳動媒体を充填し、このキャピラリ内でサンプルのＤＮＡ断片を泳動させる。そして、サンプルが一定距離（通常はキャピラリの端から端まで）だけ泳動し終えるまでに要した時間を計測することで、ＤＮＡ断片長を調べる。各サンプル、すなわち各ＤＮＡ断片は蛍光色素で標識されており、キャピラリ終端部に置かれた光学検出器により、泳動されたサンプルの蛍光シグナルを検出する。
　複数のキャピラリにレーザ光を照射する方式の一つに、特許文献１に記載されたマルチフォーカス方式がある。この方式では、平面基板上に並んだ複数のキャピラリで構成されたキャピラリアレイの一方又は両側の端に位置するキャピラリにレーザ光を照射する。そして、照射されたレーザ光は、隣接するキャピラリを次々に伝搬し、キャピラリアレイを横断する。キャピラリアレイにおいて発生する発光は、光検出器によって検出する。蛍光色素によって標識されたＤＮＡを含む試料をキャピラリ内に導入し、１列に並べられた複数のキャピラリを伝播するようにレーザ光を照射している。キャピラリに照射されたレーザ光によって、蛍光標識されたＤＮＡは蛍光を発する。キャピラリの各々からの蛍光を測定することにより、各キャピラリに導入された試料のＤＮＡ解析を行うことができる。タンパク質等の解析を行う場合も同様である。
　上記装置における蛍光検出は、キャピラリ終端部に特定の波長のレーザ光を照射して得られる各蛍光色素の蛍光を回折格子によって波長成分に分離し、空間方向と波長方向の画像をＣＣＤ等の２次元検出器にて検出する。検出器によって撮像された画像は、特定のキャピラリにおけるスペクトルデータとして保存され、データ解析に用いる。特許文献２に記載されているような蛍光分光器は、取得した蛍光を、回折格子を用いて連続的に分散させ、スペクトル（実際は画素毎に離散的）を計測することで分析を行う。
　現在、蛍光検出器を用いた分析機器は、研究市場から応用市場に拡大しており、濃度の異なる（検出強度がばらつく）サンプルに対応する必要がある。上述したキャピラリ電気泳動装置も、その１つである。従来使用されている主な蛍光検出器は、１つの検出器により蛍光を検出する。そのダイナミックレンジや検出レンジは、蛍光サンプルの励起効率やカメラレンズのＮＡ、２次元検出器の性能そのものに依存する。
　広いダイナミックレンジや検出レンジが必要な機器では、光路の途中にビームスプリッタやフィルタを設けて検出像を分割し、蛍光強度の異なる複数の像を、複数の検出器で取得する方法が用いられる。しかし、高価な検出器を複数必要とするため、装置コストの増加、検出ユニットの巨大化というデメリットがある。
　なお、蛍光強度は、照射検出時間や照射強度に依存する。このため、照射側のパラメータを制御することで、強度の異なるデータを取得することができる。そこで、単一の検出器を用いた分析中に、照射時間又は検出時間を長短変化させ、蛍光強度の異なるデータを取得する方法も提案されている。しかし、時系列にデータを取得する装置では、単位時間当たりの測定点数が減少し、データ取得に必要なサンプリング点数が不足する場合がある。
米国特許第５５８２７０５号 米国特許第６６９０４６７号
　以下では、発明者の鋭意検討の結果判明した従来技術の課題を記載する。通常、キャピラリ電気泳動装置では、ＤＮＡ量を調整したサンプルについて分析を行っている。しかし今後は、キャピラリ電気泳動装置の用途を、臨床診断、ＤＮＡ鑑定等の応用市場へ拡大することが予想される。その場合、キャピラリ電気泳動装置には、未知の濃度のサンプルへの対応能力が求められると考えられる。しかし、ダイナミックレンジが不十分な場合、濃い濃度のサンプルの分析では検出信号値の飽和が生じ、薄い濃度のサンプルの分析では検出信号を検出できない事態が頻発すると考えられる。この場合、分析者は、濃度再調整した後、分析をやり直す必要がある。
　例えば特許文献１に記されている方法では、複数のサンプルを同時に測定するため、サンプル濃度は、装置のダイナミックレンジの範囲内に限定される。通常、電気泳動を用いた遺伝子配列解析では、電気泳動の前処理工程で、試料の精製に時間をかけ、ほぼ均一の試料濃度を整えた上で、分析を行っている。例えばＲＮＡによる濃度チェックを行った後、電気泳動装置に仕掛けられる。
　しかし、現在の電気泳動装置が臨床用の遺伝子機能解析の分野に適用されると、十分な前処理工程を経ないサンプルも測定対象となる。例えば濃度チェックを行うにはサンプル量が少なく、濃度を確認しないまま直接電気泳動装置に仕掛けられるもの、発現解析のため予め高濃度にしたものなども測定対象となる。その場合、分析中の測定信号値が、検出限界範囲を超えてしまう場合が生じる。そこで、分析者は、サンプル注入時の電圧や時間を調整すると共にサンプル注入量を制御し、分析をやり直すことになる。
　この他、実際の分析手法には、励起光の照射時間を２通り設定し、信号強度が飽和しない方を解析に用いるという方法がある。しかし、サンプリング時間中に、照射時間を２通り設けることは、データ処理・転送時間などを十分に確保できない場合がある。例えばサンプリング時間が１５０ミリ秒の場合、１つのデータ処理に４０ミリ秒を設けると、２通りの照射時間として合計７０ミリ秒しか確保できない。本来の感度を保つために、励起光の照射時間として１００ミリ秒を必要とする場合、本方法は適切でないことが分かる。また、２台の検出器を設けて、励起光の照射時間を２通り測定する方法もあるが、装置が高価になる。
　上記課題を解決するために、本発明に係る蛍光分光器では、１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出する手法を提案する。
　本発明によれば、同一サンプルに関して、蛍光強度の異なる信号を同時に計測するので、見掛け上、ダイナミックレンジを増やすことができる。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
各実施例で使用する遺伝子解析装置の概略構成を示す図。 実施例１で使用する電気泳動装置の照射部の概略構成を示す図。 実施例１で使用する電気泳動装置の蛍光分析器の概略構成を示す図。 実施例１で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。 実施例１で使用する遺伝子解析装置の処理フローを示す図。 従来の結像系による光線追跡を示す図。 実施例に係る結像系による光線追跡を示す図。 像分割プリズムの諸元を説明する図。 実施例１で使用する像分割プリズムの概略図を示す図。 実施例１で使用する像分割プリズムの具体例を示す図。 θ１５°のプリズムによる像分割の特徴を示す図。 θ５°のプリズムによる像分割の特徴を示す図。 実施例１による像分割効果を示す図。 実施例２で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。 実施例３で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。 実施例３で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。 実施例４で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。 実施例４で使用する蛍光分析器の詳細構成を示す図。
　まず、後述する各実施例で説明する蛍光分析器の概略構成を説明する。各実施例に係る蛍光分析器は、いずれも１つの物体像を像分割素子によって蛍光強度の異なる複数の像に分割し、得られた複数の像を同一検出面内の異なる領域で同時に検出する点で共通する。なお、蛍光分析器は、前述の像分割素子と分光素子とを組み合わせて使用する。
　いずれの蛍光分析装置も、同一サンプルについて、蛍光強度の異なる複数の信号を同時に計測するので、見掛け上、ダイナミックレンジを増やすことができる。例えば、信号強度が１０倍異なる強弱２種類の像を取得することが可能となり、濃度が１０倍異なるサンプルを分析することができる。例えば濃い濃度のサンプルの場合、蛍光強度が強く、検出器上の像は飽和して正確な分析が行えないことがある。その場合は、蛍光強度が弱い側の像を使用して分析を行う。薄い濃度のサンプルの場合は、蛍光強度の強い像を使って分析する。濃度が１０倍異なっても、検出器上の強弱２つのデータを使い分けることで、分析が行えるようになる。
　蛍光検出器は、励起光と蛍光を分離するための光学フィルタ、像を取得するための集光レンズ、蛍光を分光するための分光素子（回折格子やプリズム、光学フィルタ）、像を分割するための光学素子（プリズム、ビームスプリッタ）、結像レンズ、分光した像をデータとして取得するための２次元検出器（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）から構成される。
　光学フィルタは、物体面と集光レンズの間及び集光レンズの後に配置される。また、蛍光を分光するための分光素子と像を分割するための光学素子は、集光レンズ後のコリメートされた光路上に配置される。結像レンズは、分光及び像分割後の光路、２次元検出器の手前に配置される。
　像を分割するために使用される像分割素子（例えばプリズム）の構造は、コリメートされた蛍光の光軸（光路）に垂直な平面と、光路を分割する数と同じ数の平面から構成される。それら像分割する面は、コリメートされた蛍光の光軸に垂直な平面と平行な面より数~十数°傾いている。例えば１°～２０°未満の範囲で傾いている。そのため、プリズムの像分割面で光軸が変化する。像分割面の数だけ複数の蛍光光路が生成されることで、像が分割される。それぞれの分割面に誘電膜又は蒸着膜を形成し、透過率を可変させれば、分割された像の蛍光強度を制御することができる。または、各分割面の面積の比率を変えることで、各像の蛍光強度を制御することもできる。
　また、別な構造を持つ像分割素子（例えばビームスプリッタ）は、平板状であり、透過と反射により光路を分割する。透過と反射の割合は、制御することができる。像分割素子は、コリメートされた蛍光の光軸と４５°傾斜させて配置される。透過光軸と反射光軸は、９０°と大きな角度を持つため、透過光路又は反射光路上に全反射型ミラーを配置し、分割された光路をほぼ平行にする。
　以下、蛍光分析器内における像分割及び複数像の結像の仕組みについて説明する。各実施例に係る蛍光分析器の場合も、従来技術と同様、キャピラリ等にレーザ光を照射し、サンプル中の蛍光色素を励起する。励起された蛍光を光学フィルタ等で励起光成分を防ぎながら分析に必要な蛍光を透過させ、レンズで集光し、コリメートする。コリメートされた蛍光から、再度光学フィルタで不要な成分を取り除き、回折格子で分光する。回折格子により分光された光は、０次光、１次光、２次光成分へ分けられる。実施例に係る蛍光分析器では、分光後に最も信号強度の高い１次光の光路上に像分割素子を配置する。回折格子後の光も、コリメートされた状態が保持される。
　像分割プリズムでは、光軸に垂直なプリズム面を通り、その面とは平行ではなく、平行面より数°傾斜した面で光軸が変化する。プリズムと空気との界面上でのスネルの法則により光が屈折する。傾斜した面が複数有ると、その面の数だけ新たな光路が発生し、プリズムに入射した１つの像が、複数の像を形成すべく分割される。その際、像分割に用いられる各面に誘電体膜を蒸着し、透過率を制御すれば、信号強度が異なる像に分割することができる。
　最後に、分光及び複数の像、つまり複数の光路に分割された蛍光を、カメラレンズ等を用いて２次元検出器に結像させる。２次元検出器上には分割された複数の物体及び分光された像が結像される。複数の光路に分割する際、分割面の光量に依存して、結像の信号強度が決定される。なお、後述するように、検出器は２次元検出器に限られるものではなく、使用する像分割素子と分光素子の組み合わせによっては１次元検出器を使用する。
　以下、添付図面を参照して実施例について説明する。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
［実施例１］
　図１は、キャピラリ電気泳動装置を蛍光検出に使用する遺伝子解析装置の構成例を示す。なお、この装置構成は、後述する各実施例についても共通である。遺伝子解析装置は、蛍光分析器の一例である。
　遺伝子解析装置１００は、データ解析装置１２８と電気泳動装置１０１から構成される。電気泳動装置１０１は、サンプルを光学的に検出するための検出部１１６、キャピラリを恒温に保つための恒温槽１１８、キャピラリ陰極端に様々な容器を搬送するための搬送機１２５、キャピラリに高電圧を加えるための高圧電源１０４、高圧電源から発せられる電流を検出するための第１電流計１０５、陽極側電極に流れる電流を検出するための第２電流計１１２、単数又は複数本のキャピラリ１０２により構成されるキャピラリアレイ１１７、キャピラリにポリマーを注入するためのポンプ機構１０３により構成される。
　キャピラリアレイ１１７は、複数本（例えば４本）のキャピラリを含む交換部材であり、ロードヘッダ１２９、検出部１１６、キャピラリヘッドを含む。測定手法を変更する場合、キャピラリアレイ１１７を置き換え、キャピラリ１０２の長さを調節する。また、キャピラリに破損や品質の劣化が見られたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。
　キャピラリ１０２は、内径が数十～数百ミクロン、外径が数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ１０２の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。
　検出部１１６は、試料に依存した情報を取得する部材であり、励起光が照射され、試料に依存した波長の光を放出する。４本のキャピラリの光照射部近傍を、光学フラット平面に高さ数ミクロンの精度で配列固定している。電気泳動時、略同軸の２本のレーザ光が両側から照射され、全ての光照射部を連続して透過する。このレーザ光により、試料から情報光（試料に依存した波長を有する蛍光）が生じ、光照射部から外部に放出される。この情報光を光学検出器１１５により検出して、試料を分析する。
　キャピラリ陰極端１２７は、それぞれ金属製の中空電極１２６を通して固定されており、キャピラリ先端が中空電極１２６から０.５ｍｍ程度突き出た状態になっている。また、キャピラリ毎に装備された中空電極はすべてが一体となってロードヘッダ１２９に装着される。さらに、すべての中空電極１２６は装置本体に搭載されている高圧電源１０４と導通しており、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。
　キャピラリ陰極端１２７と反対側のキャピラリ端部（他端部）は、キャピラリヘッドにより１つに束ねられており、キャピラリヘッドを通じ、束のまま耐圧機密でブロック１０７に着脱される。ブロック１０７内の流路の１つにはシリンジ１０６が接続されており、このシリンジ１０６により、前記他端部側からキャピラリ内に新規ポリマーが充填される。キャピラリ中のポリマーの詰め替えは、測定の性能を向上するために測定ごとに実施される。
　ポンプ機構１０３は、シリンジ１０６とそのシリンジを加圧するための機構系で構成される。また、ブロック１０７は、シリンジ１０６、キャピラリアレイ１１７、陽極バッファ容器１１０、ポリマー容器１０９をそれぞれ連通させるための接続部である。光学検出部は、検出部１１６を照射するための光源１１４と、検出部１１６内の発光を検出するための光学検出器１１５で構成される。電気泳動により分離されたキャピラリ中のサンプルを検出するときは、光源１１４でキャピラリの光照射部を照射し、光照射部からの発光を光学検出器１１５で検出する。
　恒温槽１１８は、恒温槽内を一定の温度に保つために、断熱材で覆われ、加熱冷却機構１２０により温度が制御される。また、ファン１１９が恒温槽内の空気を循環及び攪拌させ、キャピラリアレイ１１７の温度を位置的に均一かつ一定に保つ。搬送機１２５は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下、左右、および奥行き方向の３軸に移動可能である。また、搬送機１２５の移動ステージ１３０には、少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。さらに移動ステージ１３０には、電動のグリップ１３１が備えられており、各容器を掴んだり放したりできる。このため、搬送機１２５は、グリップ１３１を使用して、陰極バッファ容器１２１、洗浄容器１２２、廃液容器１２３及びサンプル容器１２４を、必要に応じて、陰極端まで搬送することができる。なお、不必要な容器は、装置内の所定収容所に保管されている。
　電気泳動装置１０１は、データ解析装置１２８と通信ケーブルで接続された状態で使用される。オペレータは、データ解析装置１２８により、装置の保有する機能の制御し、装置内の検出器で検出されるデータを授受できる。
　図２に、遺伝子解析装置１００の光学系レーザ照射部とキャピラリアレイ１１７の検出部付近の構成と、レーザ光の導入経路を模式的に示す。レーザ用のシャッタ，フィルタ等はこの分野で周知事項であり、本発明の直接の対象ではないので、簡略化のため、表示していない。（ａ）図はレーザ照射部の概略側面図であり、（ｂ）図は概略正面図である。ただし、（ａ）図と（ｂ）図における配置関係は、製図上の配置関係を表すものではない。
　光源である固体レーザ２０１から射出されたレーザ光２０２は、反射ミラー２０３やビームスプリッタ２０５を通じ、キャピラリアレイへ照射される。４本のキャピラリ１０２を基準ベース２０９上に並べて固定したものがキャピラリアレイである。基準ベース２０９上の４本のキャピラリ１０２の中心軸が形成する平面及びその平面を全空間に延長した仮想の平面をキャピラリ配列平面と呼ぶ。また、キャピラリ配列平面にあって、４本のキャピラリ軸に垂直であり、検出部の中央を貫く仮想の直線を、以下、照射光軸基本軸２１０と呼ぶ。
　キャピラリアレイの両端から導入されるレーザ光２０２は、キャピラリ配列平面に対して平行であり、照射光軸基本軸２１０と同軸である。キャピラリ１０２は、石英のガラス管がポリマー薄膜（ポリイミド）で覆われたものであるが、検出部においては、ポリマー被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。石英管の内径／外径は５０／３２０μｍ、ポリマー薄膜を含めたキャピラリ外径は３６３μｍである。キャピラリ１０２のピッチは、キャピラリ外径に等しく３６３μｍ、キャピラリアレイの幅は８．７ｍｍ（＝３６３μｍ×４）である。
　キャピラリアレイの蛍光検出部（石英がむき出しの部分）に、アレイの片側側面からレーザ光２０２を照射し、検出部から発せられる蛍光を観測することにより、ＤＮＡを検出する。レーザ光２０２は、レーザ集光レンズ２０６（ｆ＝６０ｍｍ）によって集光される。キャピラリアレイの端に位置し、レーザが導入されるキャピラリ１０２を、以下、第１キャピラリとする。レーザ集光レンズ２０６と第１キャピラリの距離は６２ｍｍであり、第１キャピラリに導入されたレーザ光は、隣接するキャピラリに次々と伝搬し、４本のキャピラリを横断する。
　レーザ光２０２がキャピラリ１０２へ到達する前に、レーザ光２０２の直線偏光を円偏光に変えるために、キャピラリアレイの両端位置には、波長板（λ/４）２０７が配置される。片側の波長板２０７で円偏光にされたレーザ光２０２は、もう片方の波長板２０７で、再び直線偏光にされる。この際、波長板２０７を２回通過した直線偏向の直線偏向方向は、最初の波長板２０７に導入される前の直線偏光方向に対して偏光方向が９０度回転している。また、戻り光対策として、固体レーザ２０１の直後には、偏光子２０４が配置される。偏光子２０４は、偏光板やポラライズキューブといった一方向の偏光のみを透過させる光学素子である。偏光子２０４によって、波長板２０７を２回通過したレーザ光は遮られるため、光源まで届くことはない。
　図３を用い、照射部と検出部の配置について説明する。前述の通り、複数本のキャピラリ１０２（例えば４本）を、平坦な表面であるセラミック製の基準ベース２０９上に並べて固定し、キャピラリアレイを形成している。図示の例では、４本のキャピラリ１０２をキャピラリ保持面上に並べ、シリコン製の平板マスク３０１で抑え、接着剤等で固定し、キャピラリアレイを形成している。
　基準ベース２０９上の４本のキャピラリの中心軸が形成する平面及びその平面を全空間に延長した仮想の平面を、キャピラリ配列平面と呼ぶ。また、照射光軸基本軸２１０に垂直かつキャピラリ配列平面とも垂直な直線を検出光軸基本軸３１０と呼ぶ。キャピラリアレイの両端から導入されるレーザ光２０２は、キャピラリ配列平面に対して平行であり、照射光軸基本軸２１０と同軸である。一本一本のキャピラリ１０２は、石英のガラス管がポリマー薄膜で覆われたものであるが、レーザ照射部３０２（検出部位）は、ポリマー被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。
　図３の（ｂ）図に、検出部の一部をキャピラリに直交する面に沿って切断した断面の模式図を示す。キャピラリ１０２は４本であり、レーザ光２０２は、先ず、一番端のキャピラリ１０２を照射し、それを通過すると、次のキャピラリ１０２を照射する。こうしてレーザ光２０２は、複数のキャピラリを次々に通過し、反対側の端のキャピラリ１０２より出る。キャピラリ１０２は円筒形状を有し、その中にポリマーが充填されているから、凸レンズと同様な集光機能を提供する。これにより、レーザ光２０２の発散を抑制する。レーザ光２０２をキャピラリアレイの左右両方向から照射することにより、略全てのキャピラリ１０２に、均一強度のレーザ光２０２を照射させることができる。そのため、レーザ強度を保ちながら４サンプルを同時に照射することができる。蛍光検出器３０３は、検出光軸基本軸３１０上に配置され、４サンプルの蛍光を効率良く同時に集光することができる。つまり、全サンプルにおいて高感度を保ちながら同時に検出することができる。
　図４に、蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。図４の（ａ）図は、キャピラリ１０２の軸と検出光軸基本軸３１０により作られる面上の図を示し、図４の（ｂ）図はその側面図、つまり、照射光軸基本軸２１０と検出光軸基本軸３１０により作られる平面上の図である。ただし、（ｂ）図では、説明を容易にするため、回折格子４０５以降の光学系の配置に修正を加えている。本来的には、（ａ）図の配置に合わせて、（ｂ）図中の薄型プリズム（「像分割プリズム」ともいう）４０９や結像レンズ４０６等が傾斜しているように表す必要がある。
　蛍光検出器３０３は、励起光と蛍光を分離するための第１の光学フィルタ４０２と第２の光学フィルタ４０４、像を取得するための集光レンズ４０３、蛍光を分光するための回折格子４０５、像を分割するための薄型プリズム４０９、像を結像させる結像レンズ４０６、分光した像をデータとして取得するための、２次元検出器４０７（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）から構成される。
　以下、光学素子の詳細配置と、検出器内の像分割及び複数像の結像される仕組みを説明する。キャピラリ１０２にレーザ光２０２を照射し、サンプル中の蛍光色素を励起する。第１の光学フィルタ４０２、集光レンズ４０３、第２光学フィルタ４０４、回折格子４０５は、検出光軸基本軸３１０上に配置する。従来技術と同様に、キャピラリ１０２からの発光を、第１の光学フィルタ４０２で励起光と必要な蛍光成分に分離し、集光レンズ４０３にて集光及びコリメートする。コリメートされた蛍光は、再度、第２の光学フィルタ４０４に入射され、不要な成分が取り除かれる。不要な成分が取り除かれた蛍光は、回折格子４０５において分光される。回折格子４０５により分光された光は、０次光、１次光、２次光成分へ分けられる。本実施例では、分光後に最も信号強度の高い１次光の光路を、分光後検出光軸４１０とし、それ上に、像分割素子である薄型プリズム４０９、像を結像させる結像レンズ４０６、分光した像をデータとして取得するための２次元検出器４０７（ＣＣＤやＣＭＯＳなど）を配置する。
　薄型プリズム４０９の構造は、コリメートされた蛍光の光軸（光路）－検出光軸基本軸３１０に垂直な平面と、光路を分割する数と同じ数の平面から構成される。それら像分割する面は、コリメートされた蛍光の光軸に垂直な平面と平行な面より数～十数°傾いている（図６にて後述する）。そのため、薄型プリズム４０９の像分割面において光軸が変化する。本実施例では、面積の等しい２つの像分割面を持ち、２つの蛍光光路４１１、４１２が生成されることで、像が分割される。像分割プリズムでは、光軸に垂直なプリズム面を通り、その面とは平行ではなく、平行面より数°傾斜した面で光軸が変化する。プリズムと空気との界面上でのスネルの法則により、光が屈折する。傾斜した面が複数面有ると、その数だけ新たな光路が発生し、プリズムに入射した１つの像が、複数の像を形成すべく分割される。それぞれの分割面には、誘電膜又は蒸着膜が形成され、透過率を可変させることで、分割された像の蛍光強度を制御することができる。本実施例では、透過率９０％の像分割面と透過率１０％の像分割面を持つ薄型プリズム４０９を配置する。
　最後に、分光及び複数の像つまり光路に分割された蛍光を、結像レンズ４０６を用いて２次元検出器４０７に結像させる。２次元検出器４０７の同一検出面を構成する複数の領域には、特定の分光（１次光）を分割した複数の物体像が結像される。複数の光路に分割する際、分割面の光量に依存して、結像する物体像の信号強度が決定される。
　蛍光光路４１１を通る蛍光は、透過率９０％の像分割面を透過するため、２次元検出器４０７上に信号強度の強い第１の像（強）を結像する。蛍光光路４１２を通る蛍光は、透過率１０％の像分割面を透過するため、２次元検出器４０７上に信号強度の弱い第２の像（弱）を結像する。第１の像と第２の像の信号強度比は、透過率の比と同じおよそ９：１になる。つまり、２次元検出器４０７上に、第１の像（強）と第２の像（弱）の２種類のデータを同時に取得する
　以下、主に図５を参照して、電気泳動分析の基本的手順について説明する。電気泳動を行い、任意のサンプルの分析を行う前に、キャピラリを交換毎に波長校正を行う（５００）。波長校正は、分析する色素群、例えば4色の蛍光色素から校正された既知のDNAサンプルを泳動し、基準となるスペクトルデータを取得する。キャピラリ１０２の劣化による分析性能の低下、分析によってキャピラリ１０２の長さを変更する場合、キャピラリアレイを交換した後は、必ず行う作業である。
　電気泳動分析の基本的手順は、事前準備、泳動媒体充填（５０３）、予備泳動（５０６）、試料導入（５０９）及び電気泳動（５１２）による分析に大別できる。まず、電気泳動を開始前の準備について説明する。オペレータは、測定を開始する前に次のものを装置にセットする。すなわち、バッファ液の入った陰極バッファ容器１２１、キャピラリ洗浄用の純水が入った洗浄容器１２２、キャピラリ中のポリマーを排出するための廃液容器１２３、分離媒体となるポリマーが入ったポリマー容器１０９、これから測定するサンプルを入れたサンプル容器１２４がセットされる。
　陽極バッファ容器１１０には、電極（ＧＮＤ）１１１及び連通管の双方を十分に漬す程度のバッファが満たされる。緩衝液は、各社から電気泳動用として市販されている電解質液を使用する。また、サンプル容器１２４のウェルには、分析対象である試料が分注される。試料は、例えばＤＮＡのＰＣＲ産物である。また、洗浄容器１２２には、キャピラリ陰極端１２７を洗浄するための洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば純水である。また、シリンジ１０６内に、試料を電気泳動する為の分離媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲル（以下、ポリマー）である。
　このときに、サンプル容器１２４にセットされるサンプルには、解析の対象であるDNAの実サンプルの他、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、アレリックラダーがあり、それぞれ異なるキャピラリにおいて電気泳動される。ポジティブコントロールは、例えば既知のＤＮＡを含むＰＣＲ産物であり、ＰＣＲによってＤＮＡが正しく増幅されていることを確認するための対照実験用のサンプルである。ネガティブコントロールとは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ産物であり、ＰＣＲの増幅物にオペレータのＤＮＡや塵などのコンタミネーションが生じていないことを確認するための対照実験用のサンプルである。
　また、陰極バッファ容器１２１は、中空電極１２６とキャピラリ陰極端１２７が十分に浸る程度のバッファを満たす。バッファの液量が足りない、又は、陰極バッファ容器１２１が空の状態で測定を開始すると、高電圧印加時に高電位の陰電極と、電位の低い他のものの間で放電が起こる危険があるためである。さらに双方のバッファレベルは同等であることが望ましい。それは、高低差による圧力でキャピラリ内のポリマーが動かないようにするためである。また、電気泳動に利用される流路、あるいはその流路にポリマーを搬送するために使用される流路はすべて測定開始前にポリマーで満たされておく必要がある。通常、連続して装置を使用する場合は前記の流路はポリマーで満たされている。また、キャピラリアレイの交換、流路内の洗浄等の後で流路をポリマーで再置換するときは、オペレータが、装置のポンプ機構を操作するか手動でシリンジを操作するなどして流路内をポリマーで再置換する。その後、流路内に気泡の残留や異物の混入がないようにオペレータは目視にて確認する。そして、事前準備が完了した後、オペレータは本装置を操作して、分析を開始する。その分析とは、ここでは電気泳動路に高電圧を加えるような分析である。
　本装置は、データ解析装置１２８からの命令により分析を開始する（５０１）。装置は、はじめに、キャピラリへのポリマー注入に備え、搬送機１２５により、廃液容器をキャピラリ陰極端に運ぶ（５０２）。その後、ポンプ機構１０３によってキャピラリにポリマーを注入する。すなわち泳動媒体充填（５０３）が開始される。このステップは、分析開始後に自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動媒体充填とは、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。
　本実施例における泳動媒体充填（５０３）では、まず、搬送機１２５により廃液容器１２３をロードヘッダ１２９の直下に運び、キャピラリ陰極端５２７から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ１０６を駆動して、キャピラリ１０２に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器１２２内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端１２７を浸し、泳動媒体により汚れたキャピラリ陰極端１２７を洗浄する。
　所定の量の泳動媒体の充填が終了すると、搬送機１２５は、洗浄容器１２２をキャピラリ陰極端１２７まで搬送し、キャピラリ陰極端１２７を洗浄容器内の純水に浸すことにより洗浄を行う（５０４）。次に、搬送機１２５は、キャピラリ陰極端１２７に陰極バッファ容器１２１を搬送する（５０５）。
　次に、予備泳動（５０６）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。所定の電圧を印加し、予備泳動を開始する（５０６）。予備泳動とはサンプル導入から電気泳動を行う本来の分析工程に先立って、キャピラリ内のポリマーの状態を分析に適した状態にするためのものである。予備泳動では通常数～数十キロボルト程度の電圧が数～数十分間加えられる。
　予備泳動が終了すると、再び洗浄容器でキャピラリ陰極端１２７を洗浄した後（５０７）、キャピラリ陰極端にサンプル容器１２４を搬送する（５０８）。そして、サンプル容器１２４に収納されたサンプル液中でキャピラリ陰極端１２７に数キロボルト程度の電圧を加えると、前記サンプル液から陽極側電極の間で電界が発生する。この電界によりサンプル液中のサンプルがキャピラリ内に導入される（５０９）。サンプルの導入を終えると、キャピラリ陰極端１２７を洗浄容器で洗浄した後（５１０）、再びキャピラリ陰極端１２７に陰極バッファ容器１２１を搬送する（５１１）。その後、所定の電圧を加えることで電気泳動を開始する（５１２）。
　次に電気泳動（５１２）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、データ解析装置１２８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。電気泳動（５１２）とは、陰極及び陽極バッファ間で発生した電界の作用によりキャピラリ中のサンプルに移動度を与え、サンプルの性質に依存する移動度の差によりサンプルを分離することである。本実施例における電気泳動（５１２）では、まず、搬送機１２５により、陰極バッファ容器１２１内の緩衝液にキャピラリ陰極端１２７を浸し、通電路を形成する。次に、高圧電源１０４により、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各サンプル成分は、各サンプル成分の性質に依存した速度で検出部１１６へ移動する。つまり、サンプル成分は、その移動速度の差により分離される。そして、検出部１１６に到達したサンプル成分から順番に検出される。
　例えば、サンプルが、塩基長の異なるDNAを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いDNAから順に検出部１１６に到達する。各DNAには、その末端塩基配列に依存した蛍光色素が取り付けられている。検出部１１６に光源１１４から励起光が照射されると、サンプルから情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）が生じ、外部に放出される。この情報光を光学検出器１１５により検出する。泳動分析中は、光学検出器１１５では、一定の時間間隔でこの情報光を検出し、画像データをデータ解析装置１２８へ送信する。もしくは送信する情報量を減らすため、画像データではなく、画像データ中の一部の領域のみの輝度を送信してもよい。例えば、キャピラリ毎に、一定間隔の波長位置のみの輝度値を送信してもよい。最後に、電圧印加開始から所定の時間が経過し、予定していたデータを取り終えたら電圧印加を停止し、電気泳動を終了する（５１３）。以上が一連の測定シーケンスである。
　図６Ａ～図６Ｃを用い、強弱２像が分割される原理及び像分割プリズム構造について説明する。図６Ａ～図６Ｂでは、回折格子４０５による分光の効果を省き、単に結像系を示す。図６Ａに、従来技術による蛍光分光器による結像系を示す。キャピラリ１０２が配列されており、第２の集光レンズ４０４Ａによりコリメートされた蛍光の光線追跡６０１は、結像レンズ４０６により１つの像６０２が２次元検出器４０７上に結像される。１対１の結像系の場合、物体像と同じ像が、結像される。
　図６Ｂに、本実施例の光線追跡を示す。本実施例の場合、従来の蛍光分光器の構成に加え、像分割ブリズム４０９が配置される。この像分割プリズム４０９透過後の蛍光は、像分割プリズム４０９の像分割面と空気との界面で屈折する。分割面が２つあるため、１点からの光線は２方向に屈折し、２つの光線追跡６０３と６０４になる。それぞれ、結像レンズ４０６により２つの像６０５、６０６が結像される。
　以下、像分割プリズム４０９から出射される光線の角度や、２つの像が重ならないためのプリズム設計について述べる。各添え字は、以下の値を示す。
ｆ1：集光レンズの焦点距離
ｆ2：結像レンズの焦点距離
Y　：像高（物体面）（アレイ幅の半分）
Y’：像高（結像面）
　次に、集光レンズ等への角度を以下と定義する。
θ1　：集光レンズへの入射角
θ'1 ：プリズムへの入射角
θ2　：プリズムからの出射角
θ　 ：プリズムの傾斜角（頂角＝２π－２θ）
　まず、像高（結像面）Y'を計算する。Y'は次式で与えられる。
Y'＝tanθ2×f2／f1×f2
　２つに分割された像が重ならないためには、次式の条件を満たす必要がある。
Tanθ2×f2＝Y'＞2Y　　　…（１）式
（ただし、f1＝f2の１:１結像系の場合）
　また、Y/f1＝tanθ1であるので、θ1は次式で与えられる。
θ1＝tan-1(Y／f1)
　ここで、プリズム材質の屈折率n、プリズム内の光路の角度をθ3～θ4（図６Ｃ参照）とすると、θ1とθ2の関係は、スネルの法則より、次式となる。
ｎ×sinθ'2＝sinθ1
　さらに、図６Ｃより、次式となる。
θ'3＝θ'2＋θ
　　＝sin-1（sinθ1/n）＋θ
　また、像分割面では、再度、スネルの法則より、次式が成立する。
n×sinθ'3＝sinθ'4
　図６Ｃより、θ'4を求めると、次式となる。
θ'4＝sin-1(n×sinθ'3)
　　＝sin-1(n×sin(sin-1（sinθ1/n）＋θ))
　さらに、像分割プリズム４０９からの出射角θ２は、
θ2＝θ'4－θ
　 ＝sin-1(n×sin(sin-1（sinθ1/n）＋θ))－θ　　　…（２）式
となる。
　これらの（１）式と（２）式を満たすように、元の物体像Yから像分割プリズム４０９の傾斜角θを求めることができる。
　図７に、像分割プリズム４０９の概略を示す。集光レンズ４０３によってコリメートされた蛍光は、図示する入射面から入射する。像分割プリズム４０９は、入射面を基準として、それと平行な面から角度θだけ傾いた２面を分割面として構成される。像分割プリズム４０９の頂角αは、π－２θとなる特徴を持つ。像分割プリズム４０９の材質は、例えばＢＫ７（屈折率1.517）である。
　図８に、像分割プリズム４０９の具体例を示す。例えば８本のキャピラリ１０２でキャピラリアレイが構成される場合、キャピラリ１０２のピッチはキャピラリ外径に等しく３６３μｍであり、アレイの幅は２．９６ｍｍ（＝３６３μｍ×８）であり、中心からの像高（物体面）は半分の１．５ｍｍである。集光レンズ４０３、結像レンズ４０６の焦点距離を５０ｍｍとすると、入射角θ１＝１．７２°、出射角θ２＝６．４７°となる。物体側の像高は６．７ｍｍとなり、キャピラリ幅２．９６ｍｍより十分大きいため、分割されたそれぞれの像を検出器上で取得できる。
　図示はしないが、各キャピラリ間隔が十分に大きい場合（例えば、キャピラリ外径以上の場合）、第１の像と第２の像をキャピラリ間隔分だけずらし、第１の像のキャピラリ間に、第２の像のキャピラリ像を結像させ、撮像することも可能である。
　図９Ａに、像分割プリズム４０９の傾斜角θが１５°の場合の光線追跡図及び２次元検出器上の結像の様子を示す。例えば３本のキャピラリ１０２を用いる場合、光線追跡（全キャピラリ）９０１には、それぞれ３本分の光線が微妙な角度の違いで表現される。像分割プリズム４０９の後は、第１の像の光線追跡（第１キャピラリ）９０２～（第２キャピラリ）９０４に分割される。同様に、第２の像の光線追跡も３本分が存在する。第１の像の光線追跡（第１キャピラリ）９０２～（第２キャピラリ）９０４、第２の像の光線追跡は、２次元検出器上に到達し、それぞれ、キャピラリ像を表す。傾斜角が大きいため、第１の像と第２の像は、２次元検出器上で離れて得られる。
　一方で、図９Ｂに、像分割プリズム４０９の傾斜角θが５°の場合の光線追跡図及び２次元検出器上の結像の様子を示す。傾斜角θは、３本のキャピラリ１０２に対して的確な値であり、２次元検出器上で、第１の像と第２の像は、ほぼ隣り合って得られる。このため、本例の場合、像分割プリズム４０９の傾斜角θを５°に設定すると、検出器領域を無駄なく使用できるという効果がある。
　以下では、図１０を用い、図４において強弱２種類の信号強度の像を取得することの効果を説明する。図１０の（ａ）図に、２次元検出器上に結像される第１の像（強）と第２の像（弱）の例を示す。それぞれ、縦軸がキャピラリの空間方向つまりキャピラリ番号、横軸波長分散方向を示す。ここで、２次元検出器上のＡ点（例えば、第２のキャピラリ、波長６００ｎｍ）に着目する。
　図１０の（ｂ）図に、第１の像と第２の像おける各Ａ点の時系列データを示す。横軸が時間、縦軸が信号強度を示す。ＤＮＡ断片が流れてくると、レーザにより励起されて発せられた蛍光の強度を表す信号が検出され、時系列的にピークとして観測される。通常、ＤＮＡの断片長さに応じてピークが生じる時間が異なるため、複数のピークが観測できる。サンプル濃度が的確な値に調整されている場合、通常全てのＤＮＡ断片を観測することができる。
　一方で、未知のサンプルに対応する場合、濃度の濃いＤＮＡ断片を分析する必要がある。その際、信号強度が飽和限界値（図中では“１２”）を上回ってしまい、正確な値が検出できないことがある。第１の像の「信号値の飽和状態」に示す箇所がその場合である。そこで、第２の像に着目すると、そもそも信号強度を小さくして、データを取得しているため、飽和限界値を超えておらず、同じＤＮＡ断片のデータを取ることができる。再度、分析をする必要もなく、サンプルの無駄や分析コストを挙げることなく、効率良く分析が行える。第１の像、第２の像を使い分けることで、一辺に、濃度の異なるサンプルを分析することも可能となる。
　第１の像、第２の像の信号強度比は、像分割プリズムの各分割面の透過率に従う。透過率を１：１０などとすることで、１０倍異なる濃度のサンプルに対応出来ることになる。第１の像、第２の像のどちらを通常モードとして利用するかは、装置システムごとに決めることができ、本実施例では、どちらのデータも取得するができる。操作画面上に、第１の像、第２の像を時系列に表示するなど（図示無）、ユーザが事前にチェックする機能を設けることで、解析を行う際、ユーザが選択することも可能である。
　本実施例では、１台の検出器で、見掛け上２種類の分析をすることになる。従来技術で例えれば、照射検出時間や照射強度を変えて、複数回分析するところ、長短２種類の照射検出時間を１回の分析で行うことと同義である。このように、本実施例に係る蛍光分析器は、当該装置を構成する各部品や性能が同じ２つの検出器をあたかも備えたかのような機能を有する。つまり、分析可能なＳＮ比・感度を保ちつつ、見かけ上、装置のダイナミックレンジが拡大したことになる。
　このように、見かけ上、ダイナミックレンジが拡大することで、本実施例に係る蛍光分析器では、分析最中に測定信号値が検出レンジに対して飽和することに起因する再測定を極力低減させることができる。特に、複数のサンプルを同時測定する際、各サンプル濃度のばらつきが大きくても、同時に測定することができる。また、濃度が未知のサンプルを測定するのにも効果的である。
　また、本実施例に係る蛍光検出器は、１つの検出器によって、強弱複数の検出像を同時取得できるので、小型かつ低価格、非常に広域の検出レンジを持つ装置を提供することができる。例えば、キャピラリ型遺伝子検査装置で、ダイナミックレンジを、従来比１０倍以上に拡大できる。また、強弱複数の検出像を同時取得することで、測定点数を維持し、高精度な分析を行うことができる。
［実施例２］
　続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第２の実施例を説明する。実施例１における蛍光分析器では、薄型プリズム４０９を像分割素子として用いた。この実施例１におけるプリズムの像分割面は等面積（図４参照）であり、透過率を変化させることで、分割された像の蛍光強度を制御した。しかし、像分割面に、異なる特性を持つ誘電多層膜を蒸着するのは、以下のようなデメリットがある。
１）製造上複数の蒸着工程を経るため高コストである。
２）透過率を下げることは、元々の集光した光量を無駄にする。
　そこで、実施例２においては、像分割面の面積比で蛍光強度を制御するプリズムを使用する。図１１に、本実施例で使用する蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。主な構成は、実施例１と同様であるが、像分割する光学素子に、異なる面積比の像分割面を持つ像分割プリズム１１０９を使用する。
　本実施例では、回折格子４０５で分光された蛍光を、面積が異なる複数の像分割面を持つ像分割プリズム１１０９を通過させ、通過する面積の違いによって信号強度の異なる複数の像に分割する。実施例１において、図６Ｂを用いて説明したように、像分割面と空気との境界面で光軸が屈折するため、蛍光の光線方向が変化する。像分割面の面積に比例した光線量が、結像する際の蛍光強度になる。つまり、像分割面の面積比に応じて、２次元検出器４０７で検出される信号強度が決まる。
　図１１の場合、像分割プリズム１１０９の２つの像分割面の面積比が９：１であるので、実施例１と同様、９：１の信号強度を持つ２つの像を取得することができる。本実施例に係る蛍光分析器の場合、像分割面に異なる誘電多層膜を蒸着する必要もなく、透過率の高いARコーティングを全面に施すだけで良い。また、もともとの光量をロスすることなく、２つの像の信号強度を９：１に分割することができ、SN比や感度を高く保つことができる。
［実施例３］
　続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第３の実施例を説明する。実施例１による蛍光分析器では、薄型のプリズムを像分割素子として用いている。しかし、プリズムは、波長分散素子の一つであり、回折格子と同様に、集光した蛍光成分を波長ごとに分散させる機能を持つ。このため、像分割方向について、プリズムによる波長分散の影響が多少発生する。アプリケーションや検出像の種類によっては、微小の波長分散が分析に影響を及ぼす場合がある。
　そこで、本実施例では、像分割素子をビームスプリッタ（ハーフミラー）と全反射ミラーで構成する。プリズムを使用しない像分割であるので、実施例１や実施例２のように像分割プリズムによる波長分散の影響は無い。
　以下、図１２を参照して実施例３に係る蛍光分析器の詳細構成を説明する。実施例３による遺伝子解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。前述したように、本実施例では、像分割素子として、入射光を透過光と反射光に分割する像分割光学素子（例えばハーフミラーやビームスプリッタ）と全反射ミラーの組み合わせ構造を使用する。以下では、像分割光学素子として、ビームスプリッタ１２０９を使用するものとする。
　本実施例の場合、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０を、集光レンズ４０３と第２の光学フィルタ４０４の間に配置する。図１２に示すように、ビームスプリッタ１２０９は、検出光軸基本軸３１０に対してほぼ４５°、全反射ミラー１２１０は、検出光軸基本軸３１０に対して４５°以下（例えば４３～４４°）に配置する。
　ビームスプリッタ１２０９は、平板状の光学素子であり、透過と反射により光路を２つに分割する。すなわち、透過率（又は反射率）を制御し、入射光を所定の分割比で２つの光に分割する。分割の際、ダイクロイックミラーのように波長に依存して、透過・反射特性が違うのではなく、ある波長領域において、一意に透過及び反射率が決まっている。偏光の種類としては、非偏光タイプ、無偏光タイプ、偏光タイプとあるが、本実施例では、入射光の偏光状態も含めて非偏光タイプを用いる。
　発光点４０１の蛍光は、集光レンズ４０３によってコリメートされ、入射角４５°でビームスプリッタ１２０９へ入射する。例えばビームスプリッタ１２０９の透過率：反射率を９０％：１０％とすると、集光された光量の９割が透過し、１割が反射する。９割の光は、蛍光光路（強）４１１に示すように、検出光軸基本軸３１０と平行であり、回折格子４０５により分光され、２次元検出器４０７上に結像される。一方、反射した1割の光は、蛍光光路（弱）４１２に示すように、全反射ミラー１２１０により、検出光軸基本軸３１０とほぼ平行に戻される。この際、全反射ミラー１２１０は、検出光軸基本軸３１０に対して４５°以下（例えば４３～４４°）に配置されており、蛍光光路（弱）４１２は、検出光軸基本軸３１０に対して完全に並行ではなく、１～２°角度を持って入射する。
　回折格子４０５により分光された後も、検出光軸基本軸３１０と角度を持ちながら、結像レンズ４０６によって、２次元検出器４０７上に結像される。その際、蛍光光路（強）４１１による像と異なる位置に像が結ばれるため、２次元検出器４０７上には２つの像が形成される。集光された光量９割分が結像する蛍光光路（強）４１１による像の信号強度は高く、蛍光光路（弱）４１２による信号強度は低い。それぞれの信号強度比は、ビームスプリッタ１２０９の透過率：反射率を９０％：１０％に従い、９：１になる。実施例１と同様に、強弱２種類のデータを取得することができる。
　ここで、ビームスプリッタ１２０９は、キューブ型ビームスプリッタを用いることもできる。透過光の屈折が一切ないこと、また入射角条件が垂直入射のため、プレート型のように４５°で入射にする必要がなく、アライメント作業が容易になることのメリットがある。
　以上に述べたように、本実施例による蛍光分析器では、ビームスプリッタ１２０９によって集光レンズ４０３で集光された蛍光を２つに分割し、一方の蛍光はそのまま２次元検出器４０７に集光し、もう一方の蛍光は全反射ミラー１２１０で反射させた後、２次元検出器４０７に集光する。ビームスプリッタ１２０９による集光像の２分割であるので、波長分散は生じずに済む。
　なお、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系の配置位置は、図１２に示す配置位置に限らない。例えば図１３に示すように、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系を、回折格子４０５と結像レンズ４０６の間の分光後検出光軸４１０上に配置しても良い。この場合、ビームスプリッタ１２０９は、分光後検出光軸４１０に対してほぼ４５°に配置する。全反射ミラー１２１０は、分光後検出光軸４１０に対して４５°以下(例えば４３°～４４°)に配置する。
［実施例４］
　続いて、キャピラリ電気泳動装置で使用して好適な蛍光分析器の第４の実施例を説明する。実施例１～３による蛍光分析器では、波長分散素子（分光素子）として回折格子４０５を用いていた。本実施例では、回折格子４０５を用いない実施例を説明する。具体的には、各蛍光色素に対して最も感度の高い波長帯域のみを透過するフィルタを高速に切り変える、又は、蛍光色素の数だけ撮像素子とその各蛍光色素に対応するフィルタを備え、同時に各蛍光素子を撮像する手法を採用する。本実施例の手法は、各蛍光色素に対応するサンプル位置においてスペクトルをサンプリングしたことに相当する。
　図１４に、本実施例で使用する蛍光検出器３０３の詳細な構成を示す。図１４に示すように、本実施例における蛍光検出器３０３は、高速回転をするフィルタホイール１３０１を備えている。フィルタホイール１３０１は、各蛍光色素に対応する最も感度の高い波長帯域のみを透過する蛍光フィルタ１３０２を複数備えている。蛍光フィルタ１３０２は、検出光軸基本軸３１０に垂直に配置されている。本実施例では、実施例３と同様、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０により像分割が実施される。分割された蛍光は、蛍光フィルタ１３０２に入射し、光路上に位置する蛍光フィルタ１３０２の透過特性に合わせて分光され、２次元検出器４０７上に結像される。
　本実施例の場合、蛍光フィルタ１３０２による切り替えで分光が行われるため、検出器を２次元検出器ではなく１次元のライン検出器を採用することができる。また、検出領域が狭く、回折格子を使用しないため、像歪等の影響を受けずに済む。
　なお、本実施例の場合も、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系の配置位置は、図１４に示す配置位置に限らない。例えば図１５に示すように、ビームスプリッタ１２０９と全反射ミラー１２１０で構成される光学系を、フィルタホイール１３０１と結像レンズ４０６の間の分光後検出光軸４１０上に配置しても良い。
［他の実施例］
　以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。
１００…遺伝子解析装置
１０１…電気泳動装置
１０２…キャピラリ
１０３…ポンプ機構
１０４…高圧電源
１０５…第１電流計
１０６…シリンジ
１０７…ブロック
１０９…ポリマー容器
１１０…陽極バッファ容器
１１１…電極（ＧＮＤ）
１１２…第２電流計
１１３…電動バルブ
１１４…光源
１１５…光学検出器
１１６…検出部
１１７…キャピラリアレイ
１１８…恒温槽
１１９…ファン
１２０…加熱冷却機構
１２１…陰極バッファ容器
１２２…洗浄容器
１２３…廃液容器
１２４…サンプル容器
１２５…搬送機
１２６…中空電極
１２７…キャピラリ陰極端
１２８…データ解析装置
１２９…ロードヘッダ
１３０…移動ステージ
１３１…グリップ
２０１…固体レーザ
２０２…レーザ光
２０３…反射ミラー
２０４…偏光子
２０５…ビームスプリッタ
２０６…レーザ集光レンズ
２０７…波長板（λ/４）
２０９…基準ベース
２１０…照射光軸基本軸
３０１…平板マスク
３０２…レーザ照射部
３０３…蛍光検出器
３１０…検出光軸基本軸
４０１…発光点
４０２…第１の光学フィルタ
４０３…集光レンズ
４０４…第２の光学フィルタ
４０４Ａ…第２の集光レンズ
４０５…回折格子
４０６…結像レンズ
４０７…２次元検出器
４０９…薄型プリズム（像分割プリズム）
４１０…分光後検出光軸
４１１…蛍光光路（強）
４１２…蛍光光路（弱）
６０１…従来技術による光線追跡
６０２…従来技術による結像
６０３…第１の光線追跡
６０４…第２の光線追跡
６０５…第１の結像
６０６…第２の結像
９０１…光線追跡（全キャピラリ）
９０２…光線追跡（第１キャピラリ）
９０３…光線追跡（第２キャピラリ）
９０４…光線追跡（第３キャピラリ）
９０５…結像（第１キャピラリ）
９０６…結像（第２キャピラリ）
９０７…結像（第３キャピラリ）
１１０９…像分割プリズム（面積比）
１２０９…ビームスプリッタ
１２１０…全反射ミラー
１３０１…フィルタホイール
１３０２…蛍光フィルタ
１３０３…フィルタ回転軸

Claims (16)

  1. 　試料に励起光を照射する光源と、
    　前記試料から発生される蛍光を集光するレンズと、
    　集光後の蛍光を入射して分光する分光素子と、
    　集光後の蛍光を強度が異なる複数の像に分割する像分割素子と、
    　特定の分光について前記複数の像を同一検出面内の異なる領域に結像する結像素子と、
    　前記同一検出面内の異なる領域で、異なる蛍光強度に対応する複数の像を同時に検出する検出器と
    　を有する蛍光分析器。
  2. 　請求項１に記載の蛍光分析器において、
    　前記像分割素子は、前記分光素子を通過した蛍光を入力する入射面と、第１の蛍光成分を透過する第１の射出面と、第２の蛍光成分を透過する第２の射出面とを有するプリズムである
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  3. 　請求項２に記載の蛍光分析器において、
    　前記第１及び第２の射出面は、それぞれに透過率の異なる蒸着膜が形成されている
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  4. 　請求項２に記載の蛍光分析器において、
    　前記第１及び第２の射出面の少なくとも一方は、前記入射面に対して数°から十数°の範囲で傾いている
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  5. 　請求項２に記載の蛍光分析器において、
    　前記検出器は、２次元検出器である
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  6. 　請求項２に記載の蛍光分析器において
    　前記第１及び第２の射出面の透過率が異なる
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  7. 　請求項２に記載の蛍光分析器において
    　前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線が泳動方向と平行に配置される
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  8. 　請求項２に記載の蛍光分析器において
    　前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線がレーザ射出方向と垂直に配置される
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  9. 　請求項２に記載の蛍光分析器において
    　前記第１及び第２の射出面の境界線として与えられる稜線が分光方向と垂直に配置される
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  10. 　請求項２に記載の蛍光分析器において
    　前記第１及び第２の射出面は互いに異なる傾斜角を有し、前記傾斜角の違いは数°から十数°である
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  11. 　請求項２に記載の蛍光分析器において、
    　前記第１及び第２の射出面は異なる面積を有する
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  12. 　請求項１に記載の蛍光分析器において、
    　前記像分割素子は、前記レンズから入力した蛍光を第１の透過率で透過して前記分光素子に出力するビームスプリッタと、前記分光素子から入力した前記蛍光のうち前記ビームスプリッタで反射された蛍光成分を反射して前記分光素子に出力する反射ミラーとを有する
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  13. 　請求項１に記載の蛍光分析器において、
    　前記像分割素子は、前記分光素子から入力した分光を第１の透過率で透過して前記検出器に出力するビームスプリッタと、前記分光素子から入力した前記分光のうち前記ビームスプリッタで反射された分光を反射して前記検出器に出力する反射ミラーとを有する
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  14. 　請求項１２又は１３に記載の蛍光分析器において、
    　前記ビームスプリッタは、透過率と反射率の値が異なる
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の蛍光分析器において、
    　前記検出器は、２次元検出器である
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
  16. 　請求項１３又は１４に記載の蛍光分析器において、
    　前記分光素子は、複数の透過特性を切り替え可能なフィルタ機構であり、
    　前記検出器はライン検出器である
    　ことを特徴とする蛍光分析器。
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