JP7365350B2 - 誘導放出抑制顕微鏡法のための方法およびシステム - Google Patents

誘導放出抑制顕微鏡法のための方法およびシステム Download PDF

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Description

政府支援の声明
本発明は、全米科学財団によって授与された認可番号１５０９９２８、１３５３７５７、１３３７５７３に基づく政府支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６３７３７５号、および米国仮特許出願番号２０１８年３月７日に出願された米国仮特許出願第６２／６３９４３８号の優先権の利益を主張する。
本開示は、一般に、顕微鏡法のためのシステムおよび方法に関し、特に、誘導放出抑制顕微鏡法のための方法およびシステムに関する。
誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法は、回折限界を解消し、～４０ｎｍ程度の構造を解決することができる重要な技術である。これは、フルオロフォアを使用する生物学的環境において特に有用な強力な方法であり、ｉｎ ｓｉｔｕで細胞内活動を監視するために使用されることができる。典型的なＳＴＥＤセットアップは、異なる波長の２つのレーザービームに依存している：「ドーナツ」抑制ビームと重複したガウス励起ビーム。抑制ビーム（ＳＴＥＤビームとも呼ばれる）は、ビームの中心にあるヌルを除く全ての場所で蛍光を抑制する誘導放出のプロセスを駆動する。その結果は、回折限界よりも小さい蛍光発光の領域になる。光学軌道角運動量（ＯＡＭ）を有するラゲール－ガウス（ＬＧ）ビームは、好都合なドーナツモードを提供するため、ＳＴＥＤビームとして頻繁に使用される。
ＳＴＥＤの適用性は、自由空間から光ファイバに移動することによって強化されることができ、内視鏡および生体内サブ回折限界撮像の可能性を広げる。ファイバベースのＳＴＥＤの主な障害は、標準的な市販のステップインデックスファイバが固有モードとしてＯＡＭモードをサポートしないということである。最近、特殊なボルテックスファイバを使用したファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡システムが大幅に進歩しており、１０３ｎｍの蛍光スポットサイズをもたらしている。例えば、非特許文献１を参照されたい。
しかしながら、本発明者らは、ＯＡＭを有するビームが、直交エルミート－ガウス状直線偏光モードに結合することによって偏光保持ファイバを使用して生成されているが、ファイバ出力におけるモードの相対位相への依存が、システムをファイバの摂動および曲げに対して非常に感受性があるものにすることに留意している。
Ｌｕ Ｙａｎら、「Ａｌｌ－ｆｉｂｅｒ ＳＴＥＤ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｌｉｇｈｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」、ＣＬＥＯ ２０１６、ＳＭ４Ｐ．３（２０１６） Ｒ．Ｄ．Ｎｉｅｄｅｒｒｉｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｓｉｅｍｅｎｓ，およびＪ．Ｔ．Ｇｏｐｉｎａｔｈ、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｒｂｉｔａｌ ａｎｇｕｌａｒ ｍｏｍｅｎｔｕｍ ａｎｄ ｂｅａｍ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｔｗｏ－ｍｏｄｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｅｒ」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．、４１（２４）、５７３６－５７３９（２０１６） Ｒ．Ｄ．Ｎｉｅｄｅｒｒｉｔｅｒら、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｔｕｎａｂｌｅ ｏｒｂｉｔａｌ ａｎｇｕｌａｒ ｍｏｍｅｎｔｕｍ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｅｒ」、Ｏｐｔ Ｌｅｔｔ、４１（１４）、３２１３－１６（２０１６） Ｂ．Ｍ．Ｈｅｆｆｅｒｎａｎら、「Ｔｕｎａｂｌｅ ｈｉｇｈｅｒ－ｏｒｄｅｒ ｏｒｂｉｔａｌ ａｎｇｕｌａｒ ｍｏｍｅｎｔｕｍ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｅｒ」、Ｏｐｔ Ｌｅｔｔ、４２（１４）、２６８３－８６、（２０１７） Ｒ．Ｄ．Ｎｉｅｄｅｒｒｉｔｅｒら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｎａｂｌｅ ｏｒｂｉｔａｌ ａｎｇｕｌａｒ ｍｏｍｅｎｔｕｍ ｉｎ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｅｒ」、Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｐｔｉｃｓ（ＦｉＯ）、ＦＴｈ５Ｂ．２（２０１６） Ｂ．Ｍ．Ｈｅｆｆｅｒｎａｎら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ－ｏｒｄｅｒ ｏｒｂｉｔａｌ ａｎｇｕｌａｒ ｍｏｍｅｎｔｕｍ ｉｎ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｂｅｒ」、Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｌａｓｅｒｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏ－Ｏｐｔｉｃｓ（ＣＬＥＯ）、ＳＴｕ４Ｋ．３（２０１７） Ｄｒｏｂｉｚｈｅｖ，Ｍ．ら、「Ｔｗｏ－Ｐｈｏｔｏｎ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（５）、３９３－９９（２０１１） Ｂｅｔｈｇｅ，Ｐ．ら、「Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ＳＴＥＤ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｔｗｏ ｃｏｌｏｒｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｂｒａｉｎ ｓｌｉｃｅｓ」、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．、１０４（４）、７７８－８５（２０１４）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１２．１２．０５４ Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｋ．Ｔ．ら、「Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｐｕｌｓｅｄ ＳＴＥＤ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．、１０４（４）、７７０－７７（２０１４） Ｍｏｎｅｒｏｎ，Ｇ．ら、「Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ＳＴＥＤ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．、１７（１７）、１４５６７－７３（２００９） Ｗ．Ｚｏｎｇら、「Ｆａｓｔ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｆｒｅｅｌｙ ｂｅｈａｖｉｎｇ ｍｉｃｅ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（７）、７１３－１９（２０１７） Ｒ．Ｐ．ＢａｒｒｅｔｔｏおよびＭ．Ｊ．Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｌｙｉｎｇ ｄｅｅｐ ｗｉｔｈｉｎ ｌｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ、２０１２（１０）、１０２９－３４、（２０１２）
したがって、必要とされるものは、ＳＴＥＤ顕微鏡法のための改善された方法およびシステムである。
本開示の一態様は、撮像対象物中の蛍光種であって、蛍光励起波長、蛍光抑制波長および蛍光発光波長を有する蛍光種の誘導放出抑制顕微鏡法のための方法であって、偏光保持光ファイバを提供することと、ファイバの中心モードにおける蛍光励起波長の励起放射を伝播することと、ファイバの１つ以上の周辺モードにおける蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することであって、１つ以上の周辺モードのそれぞれが、ファイバの中心モードと実質的に重複する最小の強度を有し、抑制放射がファイバ内で実質的に時間的にインコヒーレントに伝播することと、励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することであって、励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射が、励起放射の周りに環状リングを形成し且つスポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、励起放射が、スポットの中心に配置された最大強度において対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射が、環状抑制放射の領域における蛍光発光波長の放射の発光を防止することと、発光放射の強度を判定することと、を備える、方法である。
本開示の別の態様は、本明細書に記載される方法を実行するように構成された光学系である。例えば、特定の実施形態では、そのような光学系は、中心モードと、それぞれが偏光保持光ファイバの中心モードと実質的に重複する最小強度を有する１つ以上の周辺モードとを有する偏光保持光ファイバと、偏光保持光ファイバの中心モードにおいて蛍光励起波長の励起放射の伝播を引き起こすように結合された励起放射源と、ファイバの１つ以上の周辺モードにおいて実質的に時間的にインコヒーレントに抑制放射の伝播を引き起こすように結合された抑制放射源と、励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に（例えば、必要に応じて追加の光学系を介して）送達するように構成された偏光保持光ファイバであって、励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射が、励起放射の周りに環状リングを形成し且つスポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、励起放射が、スポットの中心に配置された最大強度において対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射が、環状抑制放射の領域における蛍光発光波長の放射の発光を防止する、偏光保持光ファイバと、を含む。
本開示のさらなる態様は、本明細書の開示から明らかとなろう。
添付の図面は、本開示の方法および装置のさらなる理解を提供するために含められ、本明細書に組み込まれてその一部を構成する。図面は、必ずしも縮尺どおりに描かれているわけではなく、様々な要素のサイズは、明確さのために歪められることがある。図面は、本開示の１つ以上の実施形態を示しており、詳細な説明とともに本開示の原理および動作を説明するのに役立つ。
開示にかかるファイバベースＳＴＥＤシステムの概略図である。ＳＬＭ－空間光変調器。ＰＢＳ－偏光キューブビームスプリッタ。ＰＭＦ－偏光保持ファイバ。ＡＰＤ－アバランシェフォトダイオード。ファイバベースＳＴＥＤシステムの図。抑制レーザーは、高次ファイバ固有モードに効率的に結合するために、ＳＬＭによってエルミート－ガウス状モードに成形される。次に、２つのアームに分割され、一方のダブプリズムがビームプロファイルを回転させる（挿入図において、それぞれ、２つのローブの暗い部分が最大強度を表し、ラブの外側の暗い部分が最小強度を表す）。励起レーザーは、ハイパスダイクロイックミラーを通過し、励起ビームおよびＳＴＥＤビームの双方が偏光保持ファイバに結合される。次に、ファイバからの光が送られ、ＡＰＤを使用して集光および検出された蛍光を含むサンプルを撮像する。 重複する励起放射および抑制放射の図である。 金ナノ粒子を使用した、ＳＴＥＤ（上）および励起（下）ビームの測定されたタイトな集束を実証する図である。 ドーナツのピークと比較して１５ｄＢよりも良好な強度抑制を示すＳＴＥＤビームの断面図である。 挿入図の拡大した関心領域を有する（挿入図のスケールバーは７００ｎｍ）共焦点蛍光顕微鏡法（左）とＳＴＥＤ顕微鏡法（右）とを比較した図であり、２２０＋／－１８ｎｍの計算された共焦点解像度および１０１＋／－８ｎｍの計算されたＳＴＥＤ解像度でスポットサイズが明確に減少していることを示す。 右側に２つのビーズ（黄色の枠）のラインカットを示す図である。 本開示のＳＴＥＤ顕微鏡法を実証する一連のセクションを提供する図であり、セクション（ａ）は、覚醒行動マウスの深部脳構造を高解像度で撮像するためのファイバ結合ＳＴＥＤ顕微鏡の図で基本的な概念を示している。４８８ｎｍおよび５８５ｎｍのレーザーは、それぞれ、ガウスモードと２つの直交高次エルミートガウスモードに成形される。セクション（ｂ）において、双方のレーザーは、柔軟な偏光保持光ファイバに入射され、ファイバの曲がりの影響を受けない。セクション（ｃ）において、自由に動く動物の脳に埋め込まれたマイクロ内視鏡を介して、２つの波長（１つのガウスビームおよび明確な中心ヌルを有する１つのドーナツビーム）が集束される。マイクロ内視鏡は、小型化された高開口数のＧＲＩＮ対物レンズ、リレー光学系、および約８０ｎｍの解像度で画像を構築するための横方向走査用のコンパクトな技術を含むことができる。セクション（ｄ）は、海馬ニューロンの樹状突起のベンチトップＳＴＥＤ顕微鏡で撮像した画像を提供する。 「ドーナツ」抑制ビームの成形を実証する図であり、モード（０）間の位相が９０°の場合、偏光保持ファイバにおいてサポートされる２つのモードが追加され、軌道角運動量（ＯＡＭ＝＋１ｈ）を有するビームを生成する。 「ドーナツ」抑制ビームの成形を実証する図であり、時間的コヒーレンスの度合いγ、および２πを法とするＰＭファイバモード間の相対位相に対応する測定されたビームプロファイルを示している。γ≒１の場合、強度パターンは、相対位相に応じてドーナツ型と２ローブ型との間で変化する。モード間の時間的コヒーレンスが減少すると、ビームプロファイルは、相対位相にあまり依存しなくなる。γ＜＜１の場合、ビームプロファイルは、相対位相の影響を受けない。全体を通して、トロイドの中心の暗い部分は、最小強度を表すが、トロイドの弧状部分の中央と、対になっているローブの中心の暗い部分とは、最大強度である。 ファイバ結合ＳＴＥＤを実証するデータの図である。 ＳＴＥＤマイクロ内視鏡の設計の例を示す図である。 ファイバＳＴＥＤ顕微鏡の図であり、フルオロフォアは、４８５ｎｍで励起され、５８５ｎｍで抑制される。レーザーは、２０ＭＨｚの繰り返し周波数を有する。ＳＴＥＤレーザー（５８５ｎｍ）は、空間光変調器（ＳＬＭ）を使用してＰ Ｍ０１モードに一致するように成形される。偏光キューブビームスプリッタ（ＰＢＳ）は、ビームをマッハツェンダー干渉計に分割する。一方のアームでは、ダブプリズムは、レーザーの空間プロファイルを回転させ、７４ｐｓの遅延を導入する。２つのＳＴＥＤビームの横モードが描かれており、偏光は黒矢印によって示されている。これらのビームは、別のＰＢＳを使用して結合され、ＰＭファイバ（長さ２メートル）に結合される。励起光は、その偏光を制御するために４分の１波長板および半波長板を通過し、次にハイパスダイクロイックミラーがＳＴＥＤ光と合成する。ファイバから出ると、ＳＴＥＤおよび励起ビームは、コリメートされ、１．４ＮＡの油浸対物レンズを使用して蛍光サンプルに集束される。この対物レンズは、次にＰＭファイバに戻されて結合される蛍光を集光およびコリメートする。ダイクロイックミラーは、共通のビーム経路からの蛍光を分割する。光は、２つのクロマティックフィルターを通過した後、単一光子計数モジュール（ＳＰＣＭ）に結合されたマルチモード（ＭＭ）ファイバに集束される。 （ａ）共焦点および（ｂ）ＳＴＥＤモダリティを使用して得られた４５ｎｍ蛍光ビーズの画像である。対物レンズ前のＳＴＥＤレーザーには約４５ｍＷのパワーがあった。画素サイズは１９．５ｎｍである。これらの画像は、平滑化のために小ガウス（８画素のウエスト）で畳み込まれており、明瞭さを高めるために背景が差し引かれている。拡大された関心領域が示される。 （ａ）倍率内で図１０の枠で囲まれた領域の断面図、および（ｂ）ビーズ画像のガウスフィッティングＦＷＨＭ値のヒストグラムである。共焦点分布は、２６０ｎｍの中央値を有するが、ＳＴＥＤ分布は、１１６ｎｍの中央値を有する。これは、共焦点からの解像度の２倍以上の改善を示している。図１１のグラフは、生データから得られた。 Ａｌｅｘａ ４８８を使用してチューブリンに対して免疫染色されたヒーラ細胞の画像である。画像は、平滑化のために０．８画素（３９ｎｍ）のウエストを有するガウシアンで畳み込まれており、背景が差し引かれた。上の行は、共焦点画像であり、下の行は、ＳＴＥＤである。 （ａ）に示される生データの正規化されたラインカットを示す図であり、（ｂ）は少なくとも２倍の改善解像度を示している。画素サイズは、４８．８ｎｍであり、対物レンズ前で測定された約２０ｍＷのＳＴＥＤおよび６μＷの励起パワーが使用された。 １００ｎｍ蛍光ビーズのビーズ画像の測定されたＦＷＨＭの箱ひげ図を提供する。各箱の中心線は、データセットの中央値を与える。ＦＷＨＭの変化の分布は、ファイバ状態の変化ではなく、ステージのｚ軸における時間ドリフトによって引き起こされることに留意されたい。下は、最小曲げ半径がマーキングされた、曲げた状態のファイバの画像である。
本発明者らは、光ファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡法における多くの改善を究明した。例えば、本発明者らは、２つの直交直線偏光モード（例えば、直交エルミート－ガウス状直線偏光モード）が時間的にインコヒーレントである場合、相対位相に実質的な依存性のない環状（または「ドーナツ状」）ビームが実現されることができるため、光ファイバの物理的摂動などのファイバ状態の影響を実質的に受けないことを究明した。本発明者らは、そのような時間的にインコヒーレントな直線偏光モードの使用が、本明細書に記載されるように、ファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡法のための方法および光学系において有意な改善を提供することができることを究明した。
ＳＴＥＤ撮像は、異なる波長の２つのレーザービームを使用する：通常はより長い波長の「ドーナツ」状の抑制ビームと重複する励起ビーム（例えば、ガウシアン）。抑制ビーム（ＳＴＥＤビーム）は、抑制ビームの中心にあるヌルを除く全ての場所で蛍光を抑制する誘導放出のプロセスを駆動する。その結果は、回折限界よりも小さい蛍光発光の領域であり、ＳＴＥＤビームは、励起ビームの周辺において蛍光を抑制し、効果的により小さい画像の画素サイズを提供する。光学軌道角運動量（ＯＡＭ）を有するラゲール－ガウス（ＬＧ）ビームは、好都合なドーナツモードを提供するため、ＳＴＥＤ抑制ビームとして頻繁に使用される。ＯＡＭビームの利点は、らせん状の位相構造と固有の位相の特異性が、ビームの中心に非常に暗いヌルをもたらすということである（残りのビームに対して＞１３ｄＢのコントラスト）。この暗いヌルは、それがないと解像度が低下する可能性があるため、ＳＴＥＤビームにとって非常に望ましいものである。しかしながら、ＳＴＥＤビームが実質的なＯＡＭを有する必要はないことに留意することが重要である：より一般的には、ビームの暗い中心と強い外側部分との間に良好なコントラスト（例えば、少なくとも１０ｄＢ、さらには少なくとも１３ｄＢ）を有する任意のドーナツ状ビームは、ＳＴＥＤにおいて望ましい抑制ビームになる。また、本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、実質的なＯＡＭを有しない。
したがって、本開示の一態様は、撮像対象物における蛍光種のＳＴＥＤ顕微鏡法用の光学系である。そのような光学系の一例が図１の概略図に示されている。図１の光学系１００は、中心モードと、それぞれが偏光保持光ファイバの中心モードと実質的に重複する最小強度を有する１つ以上（例えば、少なくとも２つ）の周辺モードとを有する偏光保持光ファイバ１１０を含む。光学系１００はまた、蛍光励起波長の励起放射源１２０と、蛍光抑制波長の抑制放射源１３０とを含む。励起放射源１２０は、例えば、その第１の端部１１１から第２の端部１１２まで、偏光保持光ファイバ１１０の中心モードにおける励起放射の伝播を引き起こすように結合される。抑制放射源は、例えば、その第１の端部１１１から第２の端部１１２まで、偏光保持光ファイバ１１０の１つ以上（例えば、少なくとも２つ、または２つ）の周辺モードにおいて抑制放射の伝播を引き起こすように結合される。特に、システムは、抑制放射が偏光保持光ファイバの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、または２つ）の周辺モードにおいて実質的に時間的にインコヒーレントに伝播されるように構成される。偏光保持光ファイバは、光ファイバから撮像対象物１４０に励起放射を送達するように構成され、励起放射は、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射は、励起放射の周りに環状リングを形成し且つ励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複する。これは、図２の概略図に示されており、励起放射スポット２５０は、中心に配置された最大強度２５１を有し、抑制放射２５５は、励起放射の周りに環状リングを形成し且つスポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複する。使用中、励起放射は、スポットの中心に配置された最大強度で対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射は、環状抑制放射の領域での蛍光発光波長の放射の発光を実質的に防止する。当業者が理解するように、例えば、偏光保持光ファイバに励起放射を提供し、偏光保持光ファイバに抑制放射を成形して提供し、励起および抑制放射を撮像対象物に伝送するために、システム全体にわたって追加の光学系を使用することができる。
特定の望ましい実施形態では、本明細書に別途記載される光学系はまた、撮像対象物からの発光放射の強度を判定するように構成された強度検出器も含む。図１のシステムでは、検出器１６０は、（ここでは、ダイクロイックミラー１６２により一次ビーム経路から反射されることにより）撮像対象物からの放射の強度を判定するように構成される。
本開示の別の態様は、撮像対象物中の蛍光種の誘導放出抑制顕微鏡法のための方法であって、蛍光種が、蛍光励起波長、蛍光抑制波長および蛍光発光波長を有する、方法である。本方法は、例えば、本明細書に記載されるようなシステムを使用して実行されることができる。しかしながら、当業者は、本明細書に記載の方法を実行するために他のシステムを適合させることができることを理解するであろう。そのような方法は、偏光保持光ファイバ（例えば、図１の１１０）を提供することと、（例えば、図１の第１の端部１１１から第２の端部１１２まで）偏光保持光ファイバの中心モードにおける蛍光励起波長の励起放射を伝播することと、（例えば、図１の第１の端部１１１から第２の端部１１２まで）偏光保持光ファイバの１つ以上の周辺モードにおける蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することであって、１つ以上の周辺モードのそれぞれが、（例えば、図２に関して上述したように）偏光保持光ファイバの中心モードと実質的に重複する最小強度を有し、抑制放射が、偏光保持光ファイバ内で実質的に時間的にインコヒーレントに伝播することと、を含む。本方法は、さらに、偏光保持光ファイバから撮像対象物（図１の１４０）に励起放射および抑制放射を送達することであって、励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射が、励起放射の周りに環状リングを形成し且つ励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複することとを含む。励起放射は、励起放射スポットの中心に配置された最大強度で対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射は、環状抑制放射の領域での蛍光発光波長の放射の発光を防止する。本方法は、さらに、（例えば、図１の実施形態では、ダイクロイックミラー１６２および検出器１６０を使用して）発光放射の強度を判定することを含む。
本明細書に記載される方法およびシステムの１つの特定の実施形態が図１に示されている。この実施形態では、５８５ｎｍの光を使用して抑制される、撮像対象物内の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を励起するために、２０ＭＨｚ、パルス化された４８８ｎｍの光が使用される。したがって、この実施形態では、励起波長は４８８ｎｍであり、抑制波長は５８５ｎｍである。抑制光は、抑制源１３０によって供給され、（半波長板１３１を通過した後）ビームをエルミート－ガウス（ＨＧ）モード（例えば、ＴＥＭ１０またはＴＥＭ０１モード）に成形する空間光変調器１３２に最初に入射する。それは半波長板１３３を通過し、第１の偏光キューブビームスプリッタ１３４は、ビームをマッハツェンダー干渉計の２つのアームに分離する。第１の干渉計アームでは、ダブプリズム１３５を使用して、空間プロファイルを９０°回転させ、パルスを遅延させる。励起光は、励起源１２０によって提供される。ダイクロイックミラー１２２は、第１のアームの抑制放射を反射し、第１の干渉計アームのビーム経路に励起放射を一緒に通過させる。ダイクロイックミラー１２２は、第１の偏光ビームスプリッタ１３４と第２の偏光ビームスプリッタとの間に延在する第２の干渉計アームが反射するために使用され、２つの干渉計アームにおいて放射を再合成する。２つの干渉計アームのモードが図１に示されており、それらは類似しているが、互いに９０度回転されていることに留意されたい。合成された励起および抑制放射は、（例えば、光学系１１３を使用して）５８５ｎｍにおいて６モード（偏光を含む）および４８８ｎｍにおいて１２モードをサポートする偏光保持光ファイバ１１０に結合される。ファイバは、約５０ｍｍの曲げ半径でテーブル上に緩く巻かれている。励起光（４８８ｎｍ）を２ｍのファイバ長で問題なく伝播するガウス状モードに結合するように注意が払われる。～１０ｃｍの中程度の曲げ半径では、モード間結合は観察されない。図１の実施形態では、ファイバの出力をコリメートするために、超アクロマートの長い作動距離の対物レンズ１１４が使用される。ビームはノッチダイクロイック１６２を通過し、油浸、１００Ｘ、１．４ＮＡ顕微鏡対物レンズに到達する。サンプルスライド（すなわち、対象物１４０を支持する）は、高精度の３軸ピエゾ並進ステージに配置される。上述したように、励起放射は、撮像対象物からの蛍光発光を引き起こす。蛍光は、対物レンズを介して集光され、ノッチダイクロイック１６２を使用してビーム経路から分割され、共焦点ピンホールとして機能するコア直径６２．５μｍのマルチモードファイバに集束される。ファイバの端部にあるアバランシェフォトダイオードは、高感度な検出を提供する（すなわち、検出器１６０として機能する）。ミラー１３６、１２１および１１６は、図１のシステムにおいて放射を好都合にルーティングするために使用されるが、当業者は、他の実装では、ミラーは異なるように構成されることができ、さらには完全に省略されることができることを理解するであろう。
もちろん、当業者が理解するように、光路は、しかしながら他の実施形態では異なることができる。例えば、特定の実施形態では、システムサイズを最小化するために、ＧＲＩＮレンズベースの光学系を使用することができる。また、特定の実施形態では、蛍光発光は、励起および抑制放射を送達する同じ偏光保持ファイバによって集光されることができる。当業者は、従来の技術を使用して、ポータブル機器で使用するためにシステムサイズを最小化することができる。
この技術をＳＴＥＤ顕微鏡システムに実装するために、偏光効果を考慮することが重要であり得る。近軸近似は、ＳＴＥＤ顕微鏡法の高開口数集束条件ではもはや成立せず、電界ベクトルの偏光を互いに「傾斜」させる。Ｄｅｂｙｅ－Ｗｏｌｆ積分を使用したタイトフォーカスのシミュレーションは、ＨＧモードが、焦点下で暗い中心（例えば、少なくとも約－１３ｄＢのコントラスト）を保持するために、ビームの暗い節線に平行な偏光を有することが望ましいことを示している。この効果は、ＯＡＭビームが正しく円偏光されていない場合に、従来のＳＴＥＤ実装において「渦崩壊」を引き起こす同じ物理現象に起因する。暗い中心は、ＳＴＥＤシステムによって達成可能な解像度にとって非常に重要である。本発明者らは、ドーナツのピーク強度のものと比較して－１３ｄＢの強度抑制を達成することが可能であることを検証し、これは、実行可能なＳＴＥＤビームにとって望ましい。これは、Ｗｉｌｌｉｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．、３、７２１－２３（２００６）に記載されたように、カバースリップ上に固定された８０ｎｍ金粒子からの反射を使用して集束されたドーナツを撮像することによって試験された。ペリクルビームスプリッタを使用してビームラインからの反射を分割し、検出には光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用した。その結果が図３のセクション（ａ）の画像および図３のセクション（ｂ）のグラフに示されている。ドーナツのピーク強度のものと比較して－１７ｄＢの強度抑制を達成することができることが検証され、これは、実行可能なＳＴＥＤビームにとって望ましい－１３ｄＢの閾値を超えている（図７のセクション（ａ）も参照）。
図１のファイバ結合ＳＴＥＤ顕微鏡の解像度を測定するために、直径１００ｎｍの蛍光ビーズが撮像され、得られたスポットサイズは、ガウシアンにフィットした。スポットサイズの平均半値全幅（ＦＷＨＭ）を記録し、ビーズの有限サイズを考慮して解像度を計算した。１０１＋／－８ｎｍのサブ回折限界解像度は、対物レンズ前で測定されたように、３０ｍＷの平均ＳＴＥＤレーザーパワーおよび１μＷの平均励起パワーによって達成された。これは、ガウシアンによって適切にフィットし且つ明らかに複数のビーズから構成されていない１３のスポットを使用して計算された。共焦点蛍光顕微鏡法およびＳＴＥＤの結果の比較が図４に示されている。要約すると、我々は、単一の偏光保持ファイバを介して運ばれるＳＴＥＤおよび励起光を使用してサブ回折限界撮像を実証した。１０１ｎｍの解像度が達成された。
生物学的サンプルの感度を試験するために、ＥＧＦＰによって標識されたオリゴデンドロサイトを用いた固定マウス皮質の撮像を行った。ファイバ結合ＳＴＥＤは、共焦点に比べて向上した解像度を示し、追加のサブ回折限界構造を明確に解像することができる。図７は、ファイバ結合ＳＴＥＤを実証するデータを提供する。セクションａ）は、油浸ＮＡ＝１．４、１００倍対物レンズを使用して、直径８０ｎｍの固定された金ナノ粒子のカバースライド上へのファイバから生成されたドーナツビームの集束を示している。これらのナノ粒子からの散乱を対物レンズによって集光し、光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出して、軸方向（ＸＺおよびＹＺ）ならびに横方向（ＸＹ）のＳＴＥＤビームの点像分布関数（ＰＳＦ）を撮像した。セクションｂ）は、ファイバ結合ＳＴＥＤを使用した固定皮質スライス（ＰＬＰ－ｅＧＦＰマウス）の画像を提供し、セクションｃ）は、共焦点撮像対ファイバＳＴＥＤの拡大比較を提供する。関心のある２つのラインアウトにラベルが付けられ、ファイバＳＴＥＤを使用すると、共焦点顕微鏡法を使用して解像できない組織の特徴が解像可能になることを示すセクションｄ）においてプロットされている。
これらの研究結果は、生体内の生物学的撮像またはナノスケールパターニングのためにサブ回折限界解像度を提供することができるコンパクトなフットプリントを有するファイバ結合誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡の提供を可能にする。超解像顕微鏡法およびリソグラフィーは、生物学的システムの理解と、ムーアの法則によって予測された進歩を続けるためのより小型で高性能な電子および光子コンポーネントの追求の双方の観点から非常に重要である。一態様では、本開示は、＜８０ｎｍの解像度を有し、可視領域における古典的な回折限界を３～４倍下回る、コンパクトで柔軟なファイバＳＴＥＤシステムを提供し、これにより、現在の境界を大きな潜在的利益によって押し上げる能力を提供する。本明細書の開示の様々な態様のファイバ結合ＳＴＥＤ顕微鏡システムは、分子間相互作用、細胞構造および機能、学習におけるシナプス形成の基本的な超解像研究から材料科学用途までの幅広い範囲で有用であり得る。
図５は、例示的な実装を示す一組の図面を提供する。セクション（ａ）は、偏光保持光ファイバへの励起（例えば、４８８ｎｍ）ビームおよび抑制（例えば、５８５ｎｍ）ビームの結合を示している。励起ビームはガウシアンであるが、抑制ビームは、ファイバからの出力モードが曲げの影響を受けないように、光ファイバにおいて２つのモードをインコヒーレントに加算することによって生成されるドーナツビームである。セクション（ｂ）は、コイル状ファイバと、励起ビームおよび抑制ビームの重複モードの断面図を示している。その全体を参照することにより本明細書に組み込まれ、ドーナツ状抑制ビームを提供する方法の例を開示する、非特許文献２を参照されたい。図５のセクション（ｃ）に示されるように、コンパクトな光学スキャナおよび小型対物レンズは、光をサンプル上に集束する。得られた蛍光は、対物レンズを介して集光され、ファイバを介して結合される。図５のセクション（ｄ）は、海馬ニューロン樹状突起のベンチトップ非ファイバＳＴＥＤ顕微鏡によって撮像された画像を示している。本明細書に記載される小型対物レンズを備えた柔軟なファイバ結合ＳＴＥＤは、覚醒行動動物における超解像生体内撮像と、ｉｎ ｓｉｔｕ分光法およびリソグラフィー（例えば、低温保持装置）とを可能にする。
したがって、特定の態様では、本開示は、超解像顕微鏡法に新たな能力を提供する：生体内生物学的撮像、ナノスケールパターニングおよび革新的な分光法のためのサブ回折限界解像度を提供することができるコンパクトなフットプリントを有するファイバ結合誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡。ここで説明するコンパクトで柔軟なＳＴＥＤシステムは、可視領域における古典的な回折限界を３～４倍下回る解像度であり、現在の境界を大きな潜在的利益によって押し上げる能力を提供する。既存の超解像撮像システムは、生きた動物の撮像や内視鏡検査のためのスターターではないかさばる固定顕微鏡を必要とし、ＳＴＥＤの空間的および時間的解像度の双方を提供することはできない。他の撮像技術や機器とは対照的に、本明細書に記載されるファイバ結合ＳＴＥＤ顕微鏡は、他の超解像技術の能力を飛躍的に向上させたコンパクトで柔軟なフォーマットで１００ｎｍ以下の解像度の撮像を可能にする。本技術は、生体内動物研究、内視鏡検査、ならびに光学的パターニングおよびナノスケール分光法のための潜在的な用途を有する。
ＳＴＥＤ顕微鏡の最も強力な用途の１つは、生細胞撮像である。ＳＴＥＤ顕微鏡法は、サブ回折解像度を達成するための複数の画像からの計算を必要としない点で、他の超解像技術（例えば、構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）、光活性化ローカリゼーション顕微鏡法（ＰＡＬＭ）および確率的光学再構成顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ））よりも回折限界を破る利点を有する。現在、ＳＴＥＤ顕微鏡法は、３０フレーム／秒という高いフレームレートで、遺伝的にコード化されたフルオロフォアを用いた生細胞撮像のために日常的に使用されている。この用途では、本質的により遅い画像取得レート（０．０４フレーム／秒）のカメラ取得時間によって制限されるＰＡＬＭおよびｆＰＡＬＭの性能を大幅に上回る。生細胞ＳＩＭは、広いフィールドにおいて～１０Ｈｚの撮像速度を達成したが、横方向寸法の空間解像度は、ＳＴＥＤ顕微鏡法が達成することができる解像度よりも３倍大きく、ここで説明する多くの用途には不十分である。生細胞ＳＴＯＲＭ撮像の欠点のいくつかは、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を使用することができないことと、細胞に有毒であり得る特別な緩衝液の必要性である。ＳＴＥＤ顕微鏡法は、組織の散乱における生体内撮像に効果的であることが示されている唯一の超解像技術である。
自由空間（かさばる顕微鏡ヘッドに固定）から光ファイバ結合ＳＴＥＤシステムに移行することは、この技術に刺激的な新たな柔軟性を提供し、内視鏡および生体内サブ回折限界撮像の可能性を広げる。ファイバベースのＳＴＥＤの主な障害は、標準的な市販のステップインデックスファイバが固有モードとして必要とされるＯＡＭモードをサポートしないということである。最近、特殊なボルテックスファイバを使用したファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡システムが進歩しており、校正されたサンプルから１０３ｎｍの蛍光スポットサイズをもたらしている。しかしながら、これは、高価で入手が困難なカスタムボルテックスファイバを必要とし、大幅な設計作業を必要とする。
光ファイバにおいてドーナツ状の放射を伝送する魅力的な代替方式では、図６のセクション（ａ）に示すように、直交エルミート－ガウス（ＨＧ）状直線偏光モードに結合することにより、偏光保持ファイバによってＯＡＭのビームが生成される。例えば、本発明者らおよびその共同研究者は、偏光保持ファイバに２つの直線偏光モードを追加することにより、合計モード間の位相を制御することによって±２および±１ｈの範囲にわたって調整可能なＯＡＭを生成することができることを実証した。それぞれがその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６に記載されている。この明確な位相制御は、いくつかの用途において有用であり得るが、モードの相対位相へのＳＴＥＤ顕微鏡法の出力ドーナツの依存性は、システムを摂動に対して非常に感受性があるものとする。したがって、本方法だけでは、ファイバの動きによって導入される位相変化をリアルタイムで調整する必要があることから、ファイバＳＴＥＤにはあまり利点がない。
しかしながら、本発明者らは、ドーナツを構成する２つのファイバモードが低い時間的コヒーレンスを有する場合、相対位相に実質的に依存しないドーナツビームが生成されることを究明した。これは、コヒーレンスが低いほど、ビームプロファイルが位相差に対してより鈍感である、図６のセクション（ｂ）に実証されている。この「インコヒーレントドーナツ」は、ファイバ状態の影響を受けず、動的なファイバ曲げ下であっても、堅牢で高品質で安定したＳＴＥＤビームを提供することができる。本方法は、本明細書に記載されたファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡において有利に使用されることができる。本発明者らは、これらの２つのモードが時間的にコヒーレントでない場合、相対位相に依存しないドーナツ状ビームが実現されることができ、したがって、ファイバ状態に実質的に鈍感であることを究明した。本発明者らは、本技術が、ファイバベースＳＴＥＤ顕微鏡法の方法およびシステムの提供において特に有用であることを究明した。
本開示のＳＴＥＤ顕微鏡システムは、実証されたＳＴＥＤ顕微鏡システムの後にモデル化されることができるが、いくつかの重要な相違点がある：（１）適切な空間プロファイルおよび低コヒーレンスの励起および抑制ビームの双方を提供する光ファイバの組み込み、および（２）同じ光ファイバを介した蛍光集光。図１および図５は、全体的な実験的セットアップの図を提供する。ＧＦＰ／ＹＦＰの励起には、４８８ｎｍのパルスレーザービームを使用することができる。抑制光は、同期パルス５８５ｎｍレーザーによって生成することができる。双方のビームは、ファイバの曲げに大きく依存することなく基本モードおよび高次モードにおいて直線偏光を保持する偏光保持ファイバに結合される。
本明細書に記載のシステムの特定の実施形態では、小型顕微鏡対物レンズは、従来の対物レンズに取って代わり、生体内撮像または内視鏡検査の機能を改善することができる。そのような特定の実施形態では、ファイバは、小型レンズ、走査デバイス、および対物レンズを含む小型マイクロ内視鏡に接続されることができる。マイクロ内視鏡は、重量が＜４グラムになるように設計されて、行動している動物の付属の脳撮像に使用されることができる。励起ビームは、回折限界スポットに集束するが、ＳＴＥＤビームは、０．８の開口数（ＮＡ）および～７０ミクロンの視野を有する特別に設計されたアクロマティックレンズアセンブリを介して中心にヌルがある「ドーナツ」モードに集束する。
特定の実施形態では、励起光は、ＳＴＥＤ抑制ビームと組み合わせた２光子励起蛍光のための短パルス赤外線レーザーとすることができる。ＧＦＰまたはＹＦＰの場合、２光子励起波長は、通常、２０ＭＨｚ～８０ＭＨｚで動作する持続時間において２００フェムト秒の短パルスを使用して９００ｎｍ～９５０ｎｍ（ＧＦＰ）および９００ｎｍ～１０５０ｎｍ（ＹＦＰ）である。２色ＳＴＥＤ撮像は、ＧＦＰおよびＹＦＰ標識ニューロンの同時撮像のために、９１０ｎｍ、２００ｆｓにおける短パルスレーザーおよび５９２ｎｍ、～１００ｐｓパルス持続時間における抑制（ＳＴＥＤ）レーザーによる２光子励起を使用して実証された。本明細書に記載されるファイバＳＴＥＤ顕微鏡は、ＩＲ波長のシングルモード伝播を可能にするコアサイズの偏光保持ファイバを利用しており、ファイバ分散の補償後、本技術を２光子ＳＴＥＤ顕微鏡法と互換可能にする。２光子励起を使用したＳＴＥＤ顕微鏡法は、より長い波長における光の散乱が少ないため、１光子可視励起よりも重要な利点を有する。さらに、２光子ＳＴＥＤは、１光子ＳＴＥＤよりも改善されたライブ撮像について実証された。２光子ＳＴＥＤは、さらに、例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０に記載されている。
ＳＴＥＤマイクロ内視鏡の設計の例が図８に示されている。ファイバからの励起光およびＳＴＥＤ光をコリメートするためにアクロマティックレンズが使用され、次に、走査レンズおよびリレーレンズがＭＥＭＳスキャナから対物レンズに光を送る。マイクロ内視鏡の設計。（Ａ）軸焦点の色補正のためのＺｅｍａｘ光学系設計。（Ｂ）色補正を使用することにより、焦点シフトは０．５ミクロン未満である。（Ｃ）ダブレット、屈折素子、およびＧＲＩＮレンズアセンブリを含む軸焦点の色補正について、＞０．８のストレール比を示すシステムの軸外性能。
撮像システムの初期Ｚｅｍａｘ設計（ダブレット、屈折素子、およびＧＲＩＮレンズアセンブリ（高ＮＡ ＧＲＩＮ対物レンズ（部品＃ＧＴ－ＭＯ－０８０－０４１５－４８８、ＧＲＩＮＴｅｃｈ Ｉｎｃ．））を含む）は、図８のセクション（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるコンパクトな設計におけるタイトフォーカスを提供するために示されている。セクション（ｂ）は、焦点シフトが０．５ミクロン未満であることを実証している。セクション（ｃ）は、広いフィールド距離にわたって少なくとも０．８のストレール比を示している。図８のセクション（ｄ）は、マイクロ内視鏡の概略図を示している。システムは、撮像が不要な場合には、埋め込まれたＧＲＩＮレンズを小型スキャナおよびレンズアセンブリから取り外すことができるように、２つの接続セクションから構築されることができる。例示的なシステムのさらなる詳細は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる、非特許文献１１において提供されるようなものとすることができる。様々な実施形態は、ＭＥＭＳスキャナを使用するが、圧電スキャナなどの他のスキャナを使用することができる。
励起および抑制レーザーの焦点は、軸方向および横方向の双方において、システムの予想される解像度内で位置合わせされることが非常に望ましい。典型的なＧＲＩＮレンズアセンブリは、単一の波長で動作するように設計されており、４８８および５８５ｎｍの異なる波長において大幅な位置合わせ不良を引き起こす可能性がある。Ｚｅｍａｘ光学設計ソフトウェアを使用した光学モデリングは、ＧＲＩＮレンズからの色の集束誤差がカスタムレンズアセンブリによって排除されることができることを示している。２つのストックアクロマティックダブレットレンズ（Ｅｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓ ＃４９－２７１および＃６５－５６８）ならびにカスタムガラス凹レンズ（色補正素子）を使用して、ＧＲＩＮレンズの色収差のバランスをとることができる（図８のセクション（ａ））。このモデルでは、＜０．５μｍの２色間の焦点シフトを有して２つの波長間において優れた位置合わせが達成された。ＳＴＥＤ超解像体制はまた、ＧＲＩＮレンズによって軸外で撮像するときに望ましくない可能性がある全視野（ＦＯＶ）にわたって最小の幾何学的収差を望む。この実施形態のシステムは、通常は～１２０μｍである全ＧＲＩＮレンズＦＯＶの最高性能体制のみを使用するように設計されている。初期の設計は、７０μｍの視野（ＦＯＶ）にわたって最小の軸外歪みを示している。励起ビームのストレール比は、７０ミクロンの範囲にわたってから１である。この視野では、５８５ｎｍの光のストレール比は～０．８であり、これは、回折限界に近く、必要に応じてより多くのカスタムレンズを使用することでさらに改善することができる。したがって、この設計は、慎重に設計された光学素子を使用することにより、色補正および高ＮＡ集束が満たされることができることを示している。
もちろん、他の設計を使用することもできる。例えば、頭蓋窓を介した撮像のために、より大きな開口光学系を使用して歪みを最小限に抑えることができる。
ＳＴＥＤ顕微鏡法からの解像度の向上は、ＳＴＥＤプロセスの既知の理論から計算されることができ、以下の方程式によって与えられる：
Figure 0007365350000001
ここで、λは、波長（５８５ｎｍ）であり、ＮＡは、開口数であり、ＩＳＴＥＤは、ＳＴＥＤドーナツビームの最大強度であり、ＩＳＡＴは、励起された分子の半分が誘導放出プロセスによって抑制される強度である。一般的なフルオロフォアのＩＳＡＴは、通常は、１０ＭＷ／ｃｍ２～２０ＭＷ／ｃｍ２の範囲である。本開示のシステムの一実施形態におけるＳＴＥＤ抑制ビームは、０．５ｎＪ～１ｎＪのパルスエネルギーを前提として、２０ＭＨｚの繰り返しレートで、１０ｍＷ～２０ｍＷのサンプルにおける平均パワーを有する。このパルスエネルギーの場合、最大ＳＴＥＤ強度Ｉｓｔｅｄは、パルス幅（～１ｎｓ）およびＳＴＥＤモードサイズ（０．８の小型対物レンズＮＡについて、３００ｎｍの回折限界スポットサイズより約４倍大きい面積）を前提として、約０．１ＧＷ／ｃｍ２と計算される。したがって、開示された小型マイクロ内視鏡設計について～８０ｎｍの解像度で、標準的な共焦点撮像よりも３から４倍の改善を達成することが可能である。
蛍光発光を集光し、光ファイバを介して検出のために伝送することができる。ファイバコア自体は、軸方向のセクショニングに必要な共焦点ピンホールを提供することができる。ダイクロイックミラーを使用して、励起およびＳＴＥＤから発光を分離し、高感度アバランシェ光検出器によって検出することができる。上述した光学アセンブリを使用する実施形態では、蛍光は、高ＮＡ ＧＲＩＮ対物レンズを透過した後、励起と同じ光学系を介して中継され、ＭＥＭｓスキャナによってデスキャンされ、同じファイバに戻されて集束されることができ、システムを大幅に簡素化する。もちろん、本開示の他のシステムでは、蛍光発光は、例えば、別個の光ファイバを介して、異なるように集光される。
コンパクトなマイクロ内視鏡はまた、調整可能なｘｙｚおよび回転ステージにマウントすることにより、柔軟なナノスケールリソグラフィを含む様々な用途向けに設計されることもできる。ユーザの実験的要件に応じて、追加の設計を作成することができる。例えば、側坐核や梨状皮質などのより深い脳領域における撮像は、変更された光学設計に含めることができるより長いＧＲＩＮレンズを必要とする。
本明細書に記載されるファイバＳＴＥＤ顕微鏡は、例えば、生体外脳スライスを使用して海馬樹状突起棘を撮像するために使用することができる。スライスは、Ｔｈｙ１－ＹＦＰマウスから生成され、組織は、撮像中に人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）溶液においてインキュベートされる。達成可能な撮像の深さ、信号対ノイズ比、撮像面積および解像度を比較するために、ＹＦＰのＳＴＥＤ撮像は、最初にベンチトップＳＴＥＤ顕微鏡によって実行されることができ、サンプルの同じ領域は、本開示のファイバ結合ＳＴＥＤ顕微鏡によって撮像されることができる。生体内での脳の撮像のために、ＧＲＩＮレンズは、小さな開頭術を行った後、歯科用セメントによって頭蓋骨に取り付けられる。脳の層１の撮像では、レンズを脳の表面に配置することができる。深部脳領域の撮像では、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる、非特許文献１２と同様の処置を使用して、小径のＧＲＩＮレンズを脳に挿入することができる。
別の実験的研究では、ＳＴＥＤ顕微鏡を使用して、蛍光ビーズのファイバ経由のＳＴＥＤ画像だけでなく、生物学的サンプルも取得した。これらの画像は、１１６ｎｍの標準的な解像度を示している。この結果は、サブ回折限界解像度による将来の覚醒行動脳撮像の準備を整える。
図９の概略図に示された、これらの実験において使用されたＳＴＥＤ顕微鏡は、ほとんど完全に既製の部品から構築され、典型的な共焦点蛍光顕微鏡に設計が類似している。（ＰｉｃｏＱｕａｎｔ ＬＤＨ－Ｐ－Ｃ－４８５Ｂからの）４８５ｎｍの波長を有する励起放射の５００ｐｓパルスを使用して蛍光が励起される。これらの励起放射のパルスは、（Ｍｏｂｉｕｓ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｒａｉｎｂｏｗ－７－２０ＭＨｚからの）５８５ｎｍの波長を有する抑制放射の１ｎｓパルスと時間的に重複する。双方のレーザーは、２０ＭＨｚの繰り返し周波数を有する。光を効率的にファイバに結合するために、抑制レーザーは、空間光変調器（Ｍｅａｄｏｗｌａｒｋ Ｏｐｔｉｃｓ、標準１９２０×１１５２Ｎｅｍａｔｉｃ ＳＬＭシステム）を使用してＰＭ０１ ＬＧモードに一致するように成形される。次に、抑制放射は、半波長板を通過し、偏光キューブビームスプリッタ（ＰＢＳ）は、マッハツェンダー干渉計の２つのアームにそれを分離する。一方のアームでは、ダブプリズムが空間プロファイルを９０度回転させ、パルスを約７４ｐｓ遅延させる。ＳＴＥＤレーザーのコヒーレンス時間は、レーザーの線幅から２ｐｓと推定される。第２のＰＢＳは、２つの抑制放射ビームを再合成する。半波長板が続く４分の１波長板は、励起ビームの偏光を制御し、ハイパスダイクロイックミラー（Ｃｈｒｏｍａ ＺＴ５６１ｓｐｒｄｃ）は、それを抑制放射ビーム経路と合成する。３本のビームは、全て、約５０ｍｍの曲げ半径によって緩いコイル状の光ファイバ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｐ１－９８０ＰＭ－ＦＣ－２）に結合される。ファイバは、５８５ｎｍにおいて６モードをサポートし、各横モードについて２つの可能な偏光を有する３つの異なる横プロファイルをサポートする。１２モードが４８５ｎｍにおいてサポートされる。励起光をガウス状モードに結合するように注意が払われ、これは、２ｍのファイバ長にわたってモード間結合なしで伝播する。アポクロマート対物レンズ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ １０倍プランアポクロマート）は、ファイバの出力をコリメートし、これは、その後、油浸、１００倍、１．４ＮＡ顕微鏡対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰＬＳＡＰＯ １００ＸＯ）に導かれる。ピエゾステージ（Ｍａｄ Ｃｉｔｙ Ｌａｂｓ Ｎａｎｏ－ＬＰ１００ ＸＹＺ）ラスタは、集束を介してサンプルを３次元で走査する。
高ＮＡ対物レンズは、その後に偏光保持光ファイバに結合される前にＳＴＥＤおよび励起ビームの経路をたどるサンプルからの蛍光を集光してコリメートする。反対方向に伝播する蛍光は、ファイバから出た後にコリメートされ、蛍光波長を反射するダイクロイックミラー（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ５２５／５０ｄｃｒｂ）を使用してビーム経路から分割される。次に、光は、蛍光光のみを検出するように２つのクロマティックフィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ ＳＰ０１－５６１ＲＵ－２５およびＦＦ０１－５２０／３５－２５）を通過する。ファイバ結合シングル光子計数モジュール（ＳＰＣＭ）（Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ ＳＰＣＭ－ＡＱＲ－１５）は、通常は５０マイクロ秒である可変露光／画素滞留時間の蛍光光子を検出して計数する。
共焦点モダリティと比較して解像度が２倍以上向上していることを実証する概念実証画像が、蛍光試験標的および生物学的サンプルの双方から得られた。４５±６ｎｍの蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ Ｆ８７９５）の画像は、対物レンズ前に測定された約４５ｍＷのＳＴＥＤ光および約７μＷの励起を使用して撮像された。結果が図１０に示されており、ここで、セクション（ａ）は、共焦点顕微鏡法を使用した画像を示し、セクション（ｂ）は、本明細書に記載されるようなＳＴＥＤ顕微鏡法を使用した画像を示している。画素サイズは１９．５ｎｍである。これらの画像は、平滑化のために小ガウス（０．８画素のウエスト）で畳み込まれており、明瞭さを高めるために背景が差し引かれている。拡大された関心領域が識別される。ＳＴＥＤを使用すると、間隔の狭いビーズが識別可能になり、共焦点撮像よりも明らかに向上した解像度をみることができる。図１１のセクション（ａ）は、図１０のセクション（ｂ）の識別された領域の断面カットのグラフを提供する。ＳＴＥＤシステムの解像度は、使用中のフルオロフォアの特性と、分子が曝される状態とに依存する。これは、ＳＴＥＤシステムに解像度を割り当てることを困難にする。しかしながら、推定値として、ガウシアンは、蛍光ビーズの画像にフィットし、フィットしたガウシアンの半値全幅（ＦＷＨＭ）として解像度を定義するために使用される。これは、ピーク検出コードを使用してアルゴリズム的に行われ、ビーズを中心とした関心領域を定義する。正確にフィットさせるため、近すぎるピークは省略される。これは、図１１のセクション（ｂ）のヒストグラムに示されるＦＷＨＭ値の分布を生み出す。この分布の中央値は、典型的な解像度と見なされる。この手順は、２６０±７ｎｍ共焦点および１１６±６ｎｍＳＴＥＤの推定解像度を与える。ビーズの有限サイズは考慮されないため、撮像されたビーズのＦＷＨＭから導出される解像度は、ＳＴＥＤ顕微鏡の真の解像度の上限推定値を表す。これらの分布の中央値の不確実性は、僅かに異なる結果を生成する可能性があるピーク検出コードの入力パラメータの変動に起因する。
蛍光ビーズの画像は、解像度推定に良好に適しているが、ＳＴＥＤシステムの真の試験は、生物学的サンプルを撮像する能力である。したがって、固定されたヒーラ細胞におけるＡｌｅｘａ ４８８によって免疫染色されたチューブリンの画像がシステムを使用して撮像された。これらの画像は、図１２に示されている。画像は、平滑化のために０．８画素（３９ｎｍ）のウエストを有するガウシアンで畳み込まれており、背景が差し引かれた。上の行は、共焦点画像であり、下の行は、ＳＴＥＤである。共焦点と比較して、解像度の明らかな改善が見られ、１２０ｎｍの小さな構造を含むＳＴＥＤケースでは、特徴およびそれらの形態がより明確になる。生データの正規化されたラインカットが、少なくとも２倍の改善解像度を実証している図１３のセクション（ａ）および（ｂ）（それぞれ共焦点およびＳＴＥＤ）に示されている。画素サイズは、４８．８ｎｍであり、対物レンズ前で測定された約２０ｍＷのＳＴＥＤおよび６μＷの励起パワーが使用された。
実験はまた、このファイバＳＴＥＤ顕微鏡法の方法が条件に依存しない解像度を生み出すことも実証した。この堅牢性は、自由に動いている動物の脳機能の研究など、生体内用途向けのファイバＳＴＥＤ顕微鏡法の実用的な展開に不可欠である。理論的には、ＳＴＥＤビームは、ＳＴＥＤドーナツを構成する２つのファイバモードが互いに完全にインコヒーレントであるという制限の中で、ファイバ状態に影響を受けないようにする必要がある。初期の試験として、２つのＳＴＥＤビームをＰＭファイバの基本モードに結合し、干渉計の可視性を測定した。ピエゾ遅延ステージを使用して２つのビーム間の相対位相を走査し、３％のフリンジの視認性をもたらした。これは、２つのＳＴＥＤモード間の相互コヒーレンスがごく僅かであること、およびファイバの出力が曲げや加熱によって実質的に変化しないことを示している。したがって、当業者は、本明細書において使用される場合、「時間的にインコヒーレント」という用語が理論的に完全な時間的インコヒーレンスを必要とせず、以下に記載されるようにある程度のインコヒーレンスを許容することができることを認識するであろう。
次に、より厳密な試験において、ファイバがフレーム間で異なる構成に曲げられたとき、１００ｎｍの蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ Ｆ８８０３）が連続して４回撮像された。各画像の取得には約７５秒かかり、測定にかかった合計時間は５分であった。最初のフレームは、光退色、ピエゾステージのｚ方向のドリフト、または取得中の時間経過中に発生する可能性のあるファイバへの位置合わせの任意のドリフトを制御するために最後のフレームと同様に、その通常の静止位置（曲げ半径５０ｍｍ）におけるファイバによって撮像された。結果として生じるＦＷＨＭ値の分布は、図１４に示されるように、曲げではなく、これらのドリフト効果のうちの１つに起因して測定の過程で変化することがわかった。この結論は、ファイバの静止曲げ半径が測定の最初および最後において同じ結果を生成しないという観察から推測される。試験は、現在説明されているファイバＳＴＥＤ顕微鏡法へのアプローチが、理論的な考慮事項と一致して、堅牢なプラットフォームを生成することを実証している。
フルオロフォアは、励起偏光およびＳＴＥＤ偏光の双方に感度を呈することができるため、ＳＴＥＤドーナツに直線偏光を使用する戦略は、我々の顕微鏡の動作に影響を与える。その双極子モーメントの特定の向きを有するフルオロフォアを考える。励起光の偏光が双極子モーメントに平行であるときに最適に励起され、相対角度がそれらの間に形成されるにつれて励起の確率が減少する。したがって、励起光は、光の各サイクル中のある時点で、偏光および双極子モーメントが確実に平行になるように有利に円偏光される。この議論は、誘導放出を介して脱励起を引き起こすＳＴＥＤ光にも同様にあてはめることができる。しかしながら、ファイバ（ＳＴＥＤ）モードは、暗い中心を保持するために直線偏光のままであることが望ましいため、その全空間範囲にわたる円偏光ＳＴＥＤビームほど効率的にフルオロフォアを抑制することはできない。これは、ＳＴＥＤビームが分子の双極子モーメントに対して垂直に偏光されている場所では蛍光が抑制されないため、単一分子の非対称画像をもたらす可能性がある。この現象は、標的内の分子の配向に関する情報を得るために他のＳＴＥＤ顕微鏡において活用されており、ＳＴＥＤを使用した分子配向顕微鏡法（ＭＯＭ－ＳＴＥＤ）をもたらす。この能力は、我々の顕微鏡の基本である。しかしながら、フルオロフォアが自由に回転することができる状況、ランダムに配向したフルオロフォアが多数存在する状況、またはより小さい開口数を有する対物レンズでは、ＳＴＥＤ偏光制約が大きな役割を果たすべきではないことを予想する。低ＮＡの状況では、集束が節点の特徴を潰すほどタイトではないため、ドーナツモードの偏光はそれほど重要ではなく、したがって、原則として、ＳＴＥＤ偏光を円形にすることができる。
本明細書における記載に基づいて、本開示のＳＴＥＤ顕微鏡法システムおよび方法は、いくつかを提供することができる。これらの中で最も重要なのは、信号対雑音比の改善である。蛍光のファイバ結合に起因して、いかなるファイバ結合顕微鏡においても信号に固有の損失がある。最近では、より効率的な信号収集を可能にする従来の蛍光顕微鏡にダブルクラッドファイバが装備されている。同様に重要なのは、ファイバに関連するノイズ源を減らすことである。ファイバファセットから反射され、結合レンズを使用してコリメートされたレーザーパルスによって引き起こされる可能性のある大きな背景ノイズが観察された。別の可能な背景ノイズ源は、ファイバ内の自己蛍光である。将来的には、これらのノイズ源は、時間相関光子計数技術または洗練された検出スキームによって軽減される可能性がある。解像度は、ＳＴＥＤビームのパワーを増やすことによって改善することができ、これは、現在約４５ｍＷの時間平均に制限されている。我々のファイバＳＴＥＤ顕微鏡は、長周期のブラッグ回折格子を使用して基本波から高次ファイバモードが励起される場合、全てのファイバ実装に容易に構成されることができ、より堅牢で耐位置合わせ動作を提供する。我々の顕微鏡はまた、覚醒して自由に行動する動物における深部組織の超解像を提供するファイバ２光子ＳＴＥＤシステムを作成するための基礎も提供する。
本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、偏光保持光ファイバの中心モードは、例えば実質的にガウスモードのように、その中心に最大値を有する。特定の実施形態では、中心モードは、基本モードである。
本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、偏光保持光ファイバの２つの直交モードで伝播される。これらの直交モードは、例えば、エルミート－ガウスモード（例えば、０、１；１、０；２、１；１、２などの少なくとも１つの奇数番号の識別子を有する）とすることができる。しかしながら、他のモード、特に中心ヌルの周囲に配置された２つのローブを有するモードを使用することができる。
本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、実質的な軌道角運動量で偏光保持光ファイバ内で伝播される。しかしながら、本明細書に別途記載される特定の代替実施形態では、抑制放射は、実質的な軌道角運動量なしで、偏光保持光ファイバ内で伝播される。
本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、トロイドの形状である。そのようなトロイドは、例えば、２つの直交するＨＧまたは同様の形状のモードの合計から形成されることができる。
上述したように、本開示の方法およびシステムの様々な態様において、抑制放射は、偏光保持光ファイバの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、または２つ）の周辺モードにおいて実質的に時間的にインコヒーレントに伝播する。上記のように、これは、完全な理論的インコヒーレンスを必要としない。むしろ、それが所望の程度の曲げ鈍感をもたらす限り、ある程度の時間的コヒーレンスは許容可能である。例えば、抑制放射が２つ以上のモードで伝播される、本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、モード間の時間的インコヒーレンス（γ）は、０．３以下、例えば、０．２以下、０．１５以下、または０．１以下である。
抑制放射は、望ましくは、励起放射の周辺での蛍光を強く阻害することができるが、励起放射の中心での蛍光を実質的に阻害しないように、高度の強度コントラストを有する。したがって、本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射（すなわち、ファイバ内を伝播する、および／または対象物において送達される）は、少なくとも１３ｄＢ、例えば、少なくとも１５ｄＢ、または少なくとも１７ｄＢのコントラストを有する（すなわち、中心における最大強度から最小強度まで）。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、幅が２５ｎｍ～３００ｎｍの範囲内、例えば、幅が２５ｎｍ～２００ｎｍ、または２５ｎｍ～１００ｎｍ、または５０ｎｍ～３００ｎｍ、または５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、または７５ｎｍ～３００ｎｍ、または７５ｎｍ～２００ｎｍ、または１００ｎｍ～３００ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍである対象物において－５ｄＢ幅を有する中心の暗い部分を有する（すなわち、最大強度と比較して）。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、抑制放射は、幅が１０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲内、例えば、幅が１０ｎｍ～１２５ｎｍ、または１０ｎｍ～１００ｎｍ、または１０ｎｍ～７５ｎｍ、または２０ｎｍ～１５０ｎｍ、または２０ｎｍ～１２５ｎｍ、または２０ｎｍ～１００ｎｍ、または２０ｎｍ～７５ｎｍ、または４０ｎｍ～１５０ｎｍ、または４０ｎｍ～１２５ｎｍ、または４０ｎｍ～１００ｎｍ、または４０ｎｍ～７５ｎｍである対象物において－１０ｄＢ幅を有する中心の暗い部分を有する。
上述したように、対象物における励起放射の最大強度は、対象物における抑制放射の中心の暗い部分内にあることが望ましい。
当業者は、本明細書の記載に基づいて、対象物において所望の狭い有効励起スポットを提供するように、抑制放射を励起放射の周辺と重複させる。例えば、本明細書に別途記載される特定の方法およびシステムでは、抑制放射と励起放射は、対象物において光学系の回折限界よりも実質的に小さい（例えば、７５％以下の半値全幅、例えば、回折限界のものの５０％以下、または３０％以下）有効励起スポット（すなわち、対象物の蛍光を引き起こす能力を有する）を提供するように重複する。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定のこのような実施形態では、有効励起スポットは、２００ｎｍ以下、例えば、１５０ｎｍ以下もしくは１２５ｎｍ以下の直径、または１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲、例えば、１０ｎｍ～１５０ｎｍ、または１０ｎｍ～１２５ｎｍ、または５０ｎｍ～２００ｎｍ、または５０ｎｍ～１５０ｎｍ、または５０ｎｍ～１２５ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍの直径を有する。
励起放射は、いくつかの方法において偏光保持光ファイバに提供されることができ、上述した実施形態は単なる例にすぎない。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、ファイバの中心モードにおける蛍光励起波長の励起放射を伝播することは、励起放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）から励起放射を提供することと、（例えば、励起放射を光ファイバの端面の中心部分に集束させることによって）励起放射をファイバの中心モードに結合することとを備える。
同様に、抑制放射は、いくつかの方法において偏光保持光ファイバに提供されることができ、上述した実施形態は単なる例にすぎない。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することは、抑制放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）から抑制放射を提供することと、（例えば、抑制放射を光ファイバの端面の周辺部分に集束させることによって）抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することとを備える。
様々な方法を使用して、所望のトロイダル形状（または中心最小強度を有するその他の形状）を提供することができる。本明細書に別途記載される特定の実施形態では、抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することは、例えば、空間光変調器を使用して、放射をその中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに成形することと、成形された放射を２つのビームに分離することと、一方のビームの強度プロファイルを他方に対して９０度回転させることと、ビームを再合成することと、再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することとを含む。また、特定の実施形態では、抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することは、例えば、空間光変調器を使用して、放射をその中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに成形することと、（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）成形された放射を、直交偏光を有する２つのビームに分離することと、（例えば、ダブプリズムによって）第１のビームの強度プロファイルを他のビームに対して約９０度回転させ、他のビームに対して第１のビームを遅延させることと、（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）ビームを再合成することと、再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することとを含む。特定の望ましいこのような実施形態では、成形された放射は、中心に最小強度を有する２つのローブを有する。
当業者が理解するように、蛍光励起波長は、撮像対象物、特に蛍光を受ける特定の種に応じて変化する。特定の実施形態では、励起波長は、４８８ｎｍ、または４００ｎｍ～６００ｎｍの範囲である。励起放射は、例えば、パルス化されることができる。特定の実施形態では、励起波長は、２光子顕微鏡法を可能にするように、対象物に２光子吸収を提供するように選択される（すなわち、「２光子放射」である）。特定のこのような実施形態では、励起波長は、９００ｎｍ～１０５０ｎｍである。当業者は、励起放射が、典型的には、蛍光励起波長またはその近くに相対最大を有する波長の広がりを有することを理解するであろう。
同様に、蛍光抑制波長は、撮像対象物、特に蛍光を受ける特定の種に応じて変化する。特定の実施形態では、蛍光抑制波長は、５００ｎｍ～７００ｎｍの範囲、例えば５８５ｎｍである。蛍光抑制波長は、通常、単一光子システムの場合の蛍光励起波長よりも長く、または２光子システムの場合の蛍光励起波長の半分以上である。蛍光抑制放射は、例えば、パルス化されることができる。当業者は、蛍光抑制放射が、典型的には、蛍光抑制波長またはその近くに相対最大を有する波長の広がりを有することを理解するであろう。
上述したように、本明細書に記載される方法およびシステムは、偏光保持光ファイバが曲げられている場合であっても首尾よく動作することができる。本明細書に別途記載される特定の実施形態では、偏光保持光ファイバは、１つ以上の曲率半径で配置され、最小曲率半径は、２０ｍｍから２５０ｍｍの範囲、例えば、２０ｍｍ～２００ｍｍ、２０ｍｍ～１５０ｍｍ、または２０ｍｍ～１００ｍｍ、または３５ｍｍ～２５０ｍｍ、または３５ｍｍ～２００ｍｍ、または３５ｍｍ～１５０ｍｍ、または３５ｍｍ～１００ｍｍ、または５０ｍｍ～２５０ｍｍ、または５０ｍｍ～２００ｍｍ、または５０ｍｍ～１５０ｍｍ、または５０ｍｍ～１００ｍｍである。
当業者は、本明細書の開示に基づいて、所望の顕微鏡法またはシステムにおける好都合な動作を提供する偏光保持光ファイバの長さを選択するであろう。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、偏光保持光ファイバは、２００ｃｍから１０ｍの範囲、例えば、５００ｃｍから１０ｍの範囲、または１ｍから１０ｍの範囲の長さを有する。
本開示の方法およびシステムの実施において、様々な種類の偏光保持光ファイバを使用することができる。例えば、１つ以上の応力ロッドが、例えば、いわゆるパンダ、ボウタイまたは楕円クラッドの配置で光ファイバ内に配置されるファイバを使用することができる。他の実施形態では、直交軸よりも実質的に広い１つの軸を有する成形コアを有するファイバを使用することができる。しかしながら、本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、偏光保持光ファイバは、低屈折率領域によって中心コアから分離された高屈折率リングコアを含まない。
励起放射および抑制放射は、偏光保持光ファイバから撮像対象物にいくつかの方法で提供されることができ、上述した実施形態は、単なる例にすぎない。本明細書に別途記載される特定の実施形態では、励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することは、ファイバの出力をコリメートすることと、ファイバのコリメートされた出力を撮像対象物に送達することとを含む。また、特定の実施形態では、励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することは、ファイバの出力をコリメートすることと、１つ以上のレンズを使用して、コリメートされた出力をＧＲＩＮレンズに集束することと、ＧＲＩＮレンズを使用して放射を対象物に伝達することとを備える。ＧＲＩＮレンズは、例えば、１つ以上のレンズから取り外し可能とすることができる。１つ以上のレンズは、例えば、一対のアクロマティックダブレットレンズと、ＧＲＩＮレンズの色度のバランスをとるように構成されたガラス凹レンズとを含むことができる。
発光放射の強度は、いくつかの方法で判定されることができ、上述した実施形態は、単なる例にすぎない。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、発光放射の強度を判定することは、励起放射および抑制放射の伝播と反対方向に光ファイバ内で発光放射を伝播することと、伝播された発光放射の強度を判定することとを含む。本明細書に別途記載される方法およびシステムの特定の実施形態では、発光放射の強度を判定することは、偏光保持光ファイバとは別の光ファイバ内で発光放射を伝播することを備える。
以下の番号付きの実施形態のリストは、本開示の追加の態様を形成する。それらは、論理的または技術的に矛盾しない任意の方法および任意の数で組み合わせられて並べ替えられることができる。
実施形態１：撮像対象物中の蛍光種であって、蛍光励起波長、蛍光抑制波長および蛍光発光波長を有する蛍光種の誘導放出抑制顕微鏡法のための方法であって、
偏光保持光ファイバを提供することと、
偏光保持光ファイバの中心モードにおける蛍光励起波長の励起放射を伝播することと、
偏光保持光ファイバの１つ以上の周辺モードにおける蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することであって、１つ以上の周辺モードのそれぞれが、偏光保持光ファイバの中心モードと実質的に重複する最小強度を有し、抑制放射が偏光保持光ファイバ内で実質的に時間的にインコヒーレントに伝播することと、
励起放射および抑制放射を偏光保持光ファイバから撮像対象物に送達することであって、励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射が、励起放射の周りに環状リングを形成し且つ励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、励起放射が、励起放射スポットの中心に配置された最大強度において対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射が、環状抑制放射の領域における蛍光発光波長の放射の発光を防止することと、
発光放射の強度を判定することと、を備える、方法である。
実施形態２：偏光保持光ファイバの中心モードが、例えば、偏光保持光ファイバの実質的にガウスモードであるように、その中心に最大値を有する、実施形態１の方法。
実施形態３：抑制放射が、偏光保持光ファイバの２つの直交モードで伝播される、実施形態１または実施形態２の方法。
実施形態４：抑制放射が、実質的な軌道角運動量で偏光保持光ファイバ内で伝播される、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
実施形態５：抑制放射がトロイドの形状である、実施形態１～４のいずれかの方法。
実施形態６：抑制放射が、複数（例えば、２つ）の周辺モードにおいて偏光保持光ファイバ内で伝播され、モード間の時間的インコヒーレンス（γ）が、０．３以下、例えば、０．２以下、０．１５以下、または０．１以下である、実施形態１～５のいずれかの方法。
実施形態７：抑制放射（すなわち、ファイバ内を伝播するおよび／または対象物に送達されるものとして）が、少なくとも１３ｄＢ、例えば、少なくとも１５ｄＢ、または少なくとも１７ｄＢのコントラスト（すなわち、中心における最大強度から最小強度まで）を有する、実施形態１～６のいずれかの方法。
実施形態８：対象物において（すなわち、対象物の蛍光を引き起こす能力を有する）光学系の回折限界よりも実質的に小さい（例えば、回折限界のものの７５％以下の半値全幅、例えば５０％以下、または３０％以下）有効励起スポットを対象物に提供するように、抑制放射および励起放射が重複する、実施形態１～７のいずれかの方法。
実施形態９：有効励起スポットが、２００ｎｍ以下、例えば、１５０ｎｍ以下もしくは１２５ｎｍ以下の直径、または１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲、例えば、１０ｎｍ～１５０ｎｍ、または１０ｎｍ～１２５ｎｍ、または５０ｎｍ～２００ｎｍ、または５０ｎｍ～１５０ｎｍ、または５０ｎｍ～１２５ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍの範囲の直径を有する、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０：ファイバの中心モードにおける蛍光励起波長の励起放射を伝播することが、励起放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）から励起放射を提供することと、（例えば、励起放射を光ファイバの端面の中心部分に集束させることによって）励起放射をファイバの中心モードに結合することとを備える、実施形態１～９のいずれかの方法。
実施形態１１：蛍光励起波長が、４００ｎｍ～６００ｎｍの範囲、例えば４８８ｎｍである、実施形態１～１０のいずれかの方法。
実施形態１２：励起放射が２光子放射であり、蛍光励起波長が９００ｎｍ～１０５０ｎｍの範囲にある、実施形態１～１０のいずれかの方法。
実施形態１３：蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することが、抑制放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）から抑制放射を提供することと、（例えば、抑制放射を光ファイバの端面の周辺部分に集束させることによって）抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することとを備える、実施形態１～１２のいずれかの方法。
実施形態１４：抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することが、
例えば、空間光変調器を使用して、その中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに放射を成形することと、成形された放射を２つのビームに分離することと、
一方のビームの強度プロファイルを他方に対して９０度回転させることと、ビームを再合成することと、
再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することと、を備える、実施形態１３の方法。
実施形態１５：抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することが、
例えば、空間光変調器を使用して、その中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに放射を成形することと、
（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）成形された放射を、直交偏光を有する２つのビームに分離することと、
（例えば、ダブプリズムによって）第１のビームの強度プロファイルを他のビームに対して約９０度回転させ、他のビームに対して第１のビームを遅延させることと、
（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）ビームを再合成することと、
再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することと、を備える、実施形態１３の方法。
実施形態１６：成形された放射が、中心に最小強度を有する２つのローブを有する、実施形態１４～１５のいずれかの方法。
実施形態１７：偏光保持光ファイバの周辺モードが、エルミート－ガウスモードである（例えば、０、１；１、０；２、１；１、２などの少なくとも１つの奇数番号の識別子を有する）、実施形態１～１６のいずれかの方法。
実施形態１８：偏光保持光ファイバが、１つ以上の曲率半径で配置され、最小曲率半径は、２０ｍｍから２５０ｍｍの範囲、例えば、２０ｍｍ～２００ｍｍ、２０ｍｍ～１５０ｍｍ、または２０ｍｍ～１００ｍｍ、または３５ｍｍ～２５０ｍｍ、または３５ｍｍ～２００ｍｍ、または３５ｍｍ～１５０ｍｍ、または３５ｍｍ～１００ｍｍ、または５０ｍｍ～２５０ｍｍ、または５０ｍｍ～２００ｍｍ、または５０ｍｍ～１５０ｍｍ、または５０ｍｍ～１００ｍｍである、実施形態１～１６のいずれかの方法。
実施形態１９：偏光保持光ファイバが、２００ｃｍから１０ｍの範囲、例えば、５００ｃｍから１０ｍの範囲、または１ｍから１０ｍの範囲の長さを有する、実施形態１～１８のいずれかの方法。
実施形態２０：蛍光抑制波長が、５００ｎｍ～７００ｎｍの範囲、例えば５８５ｎｍである、実施形態１～１９のいずれかの方法。
実施形態２１：励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することは、ファイバの出力をコリメートすることと、ファイバのコリメートされた出力を撮像対象物に送達することとを備える、実施形態１～２０のいずれかの方法。
実施形態２２：励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することが、ファイバの出力をコリメートすることと、１つ以上のレンズを使用して、コリメートされた出力をＧＲＩＮレンズに集束することと、ＧＲＩＮレンズを使用して放射を対象物に伝達することとを備える、実施形態１～２０のいずれかの方法。
実施形態２３：ＧＲＩＮレンズが、１つ以上のレンズから取り外し可能である、実施形態２２の方法。
実施形態２４：１つ以上のレンズが、一対のアクロマティックダブレットレンズと、ＧＲＩＮレンズの色度のバランスをとるように構成されたガラス凹レンズとを備える、実施形態２２または実施形態２３の方法。
実施形態２５：抑制放射が、幅が２５ｎｍ～３００ｎｍの範囲内、例えば、幅が２５ｎｍ～２００ｎｍ、または２５ｎｍ～１００ｎｍ、または５０ｎｍ～３００ｎｍ、または５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、または７５ｎｍ～３００ｎｍ、または７５ｎｍ～２００ｎｍ、または１００ｎｍ～３００ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍである、対象物において－５ｄＢ幅を有する中心が暗い部分を有する（すなわち、最大強度と比較して）、実施形態１～２４のいずれかの方法。
実施形態２６：抑制放射が、幅が１０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲内、例えば、幅が１０ｎｍ～１２５ｎｍ、または１０ｎｍ～１００ｎｍ、または１０ｎｍ～７５ｎｍ、または２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～１２５ｎｍ、または２０ｎｍ～１００ｎｍ、または２０ｎｍ～７５ｎｍ、または４０ｎｍ～１５０ｎｍ、または４０ｎｍ～１２５ｎｍ、または４０ｎｍ～１００ｎｍ、または４０ｎｍ～７５ｎｍである、対象物において－１０ｄＢ幅を有する中心が暗い部分を有する、実施形態２５の方法。
実施形態２７：対象物における励起放射の最大強度が、対象物における抑制放射の中心の暗い部分内にある、実施形態１～２６のいずれかの方法。
実施形態２８：発光放射の強度を判定することが、励起放射および抑制放射の伝播と反対方向に光ファイバ内で発光放射を伝播することと、伝播された発光放射の強度を判定することとを備える、実施形態１～２７のいずれかの方法。
実施形態２９：発光放射の強度を判定することが、偏光保持光ファイバとは別の光ファイバ内で発光放射を伝播することを備える、実施形態１～２７のいずれかの方法。
実施形態３０：偏光保持光ファイバが、低屈折率領域によって中心コアから分離された高屈折率リングコアを含まない、実施形態１～２８のいずれかの方法。
実施形態３１：請求項１～３０のいずれかの方法を実行するように構成された光学系。
実施形態３２：請求項３１に記載の光学系であって、
中心モードと、それぞれが偏光保持光ファイバの中心モードと実質的に重複する最小強度を有する１つ以上の周辺モードとを有する偏光保持光ファイバと、
偏光保持光ファイバの中心モードにおいて蛍光励起波長の励起放射の伝播を引き起こすように結合された励起放射源と、
偏光保持光ファイバの１つ以上の周辺モードにおいて実質的に時間的にインコヒーレントに抑制放射の伝播を引き起こすように結合された抑制波長の抑制放射源と、
励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に（例えば、必要に応じて追加の光学系を介して）送達するように構成された偏光保持光ファイバであって、励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、抑制放射が、励起放射の周りに環状リングを形成し且つ励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、励起放射が、スポットの中心に配置された最大強度において対象物からの蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、抑制放射が、環状抑制放射の領域における蛍光発光波長の放射の発光を実質的に防止する、偏光保持光ファイバと、を備える、光学系。
実施形態３３：さらに、発光放射の強度を判定するように構成された強度検出器を備える、実施形態３２の光学系。
実施形態３４：偏光保持光ファイバの中心モードが、例えば、偏光保持光ファイバの実質的にガウスモードの場合のように、その中心に最大値を有する、実施形態３２または実施形態３３の光学系。
実施形態３５：偏光保持光ファイバの２つの直交モードで抑制放射を伝播するように構成された、実施形態３２～３４のいずれかの光学系。
実施形態３６：偏光保持光ファイバの２つの直交モードで抑制放射を伝播するように構成された、実施形態３２～３５のいずれかの光学系。
実施形態３７：実質的な軌道角運動量で偏光保持光ファイバ内で抑制放射を伝播するように構成された、実施形態３２～３６のいずれかの光学系。
実施形態３８：抑制放射をトロイドの形状で伝播するように構成された、実施形態３２～３７のいずれかの光学系。
実施形態３９：複数の（例えば、２つの）周辺モードにおいて偏光保持光ファイバ内で抑制放射を伝播するように構成され、モード間の時間的インコヒーレンス（γ）が、０．３以下、例えば、０．２以下、０．１５以下、または０．１以下である、実施形態３２～３８のいずれかの光学系。
実施形態４０：抑制放射（すなわち、ファイバ内を伝播するおよび／または対象物に送達されるものとして）が、少なくとも１３ｄＢ、例えば、少なくとも１５ｄＢ、または少なくとも１７ｄＢのコントラスト（すなわち、中心における最大強度から最小強度まで）を有するように構成された、実施形態３２～３９のいずれかの光学系。
実施形態４１：対象物において（すなわち、対象物の蛍光を引き起こす能力を有する）光学系の回折限界よりも実質的に小さい（例えば、回折限界のものの７５％以下、５０％以下、または３０％以下の半値全幅）有効励起スポットを対象物に提供するように、抑制放射および励起放射が重複する、実施形態３２～４０のいずれかの光学系。
実施形態４２：有効励起スポットが、２００ｎｍ以下、例えば、１５０ｎｍ以下もしくは１２５ｎｍ以下の直径を有する、実施形態４１に記載の光学系。
実施形態４３：励起放射が励起放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）によって提供され、（例えば、励起放射を光ファイバの端面の中心部分に集束させることによって）ファイバの中心モードに結合されるように構成された、実施形態３２～４２のいずれかの光学系。
実施形態４４：蛍光励起波長が４８８ｎｍである、実施形態３２～４３のいずれかの光学系。当業者は、励起放射が、典型的には、蛍光励起波長またはその近くに相対最大を有する波長の広がりを有することを理解するであろう。望ましい蛍光励起波長は、蛍光を受ける特定の種に依存する。励起放射は、パルス化されることができる。
実施形態４５：励起放射が２光子放射であり、蛍光励起波長が９００ｎｍ～１０５０ｎｍの範囲にある、実施形態３２～４３のいずれかの光学系。
実施形態４６：蛍光抑制波長の抑制放射が、抑制放射源（例えば、レーザー、またはフィルタリングされた広帯域源、または増幅された自然発光源、またはレーザーダイオード）によって提供され、（例えば、抑制放射を光ファイバの端面の周辺部分に集束させることによって）ファイバの１つ以上の周辺モードに結合されるように構成された、実施形態３２～４５のいずれかの光学系。
実施形態４７：抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することが、
例えば、空間光変調器を使用して、その中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに放射を成形することと、
成形された放射を２つのビームに分離することと、
一方のビームの強度プロファイルを他方に対して９０度回転させることと、ビームを再合成することと、
再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することと、を備える、実施形態１３の方法。
実施形態４８：抑制放射をファイバの１つ以上の周辺モードに結合することが、
例えば、空間光変調器を使用して、その中心部分において（例えば、１、０または０、１などの適切なエルミート－ガウスモードにおいて）最小強度を有するプロファイルに放射を成形することと、
（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）成形された放射を、直交偏光を有する２つのビームに分離することと、
（例えば、ダブプリズムによって）第１のビームの強度プロファイルを他のビームに対して約９０度回転させ、他のビームに対して第１のビームを遅延させることと、
（例えば、偏光ビームスプリッタを使用して）ビームを再合成することと、再合成されたビームをファイバの１つ以上の周辺モードに結合することと、を備えるように構成された、実施形態４７の光学系。
実施形態４９：成形された放射が、中心に最小強度を有する２つのローブを有するように構成された、実施形態４７または実施形態４８の光学系。
実施形態５０：偏光保持光ファイバの周辺モードが、エルミート－ガウスモードである（例えば、０、１；１、０；２、１；１、２などの少なくとも１つの奇数番号の識別子を有する）、実施形態３２～４９のいずれかの光学系。
実施形態５１：光ファイバが、１つ以上の曲率半径で配置され、最小曲率半径は、２０ｍｍから２５０ｍｍの範囲、例えば、２０ｍｍ～２００ｍｍ、２０ｍｍ～１５０ｍｍ、または２０ｍｍ～１００ｍｍ、または３５ｍｍ～２５０ｍｍ、または３５ｍｍ～２００ｍｍ、または３５ｍｍ～１５０ｍｍ、または３５ｍｍ～１００ｍｍ、または５０ｍｍ～２５０ｍｍ、または５０ｍｍ～２００ｍｍ、または５０ｍｍ～１５０ｍｍ、または５０ｍｍ～１００ｍｍである、実施形態３２～５０のいずれかの光学系。
実施形態５２：偏光保持光ファイバが、２００ｃｍから１０ｍの範囲、例えば、５００ｃｍから１０ｍの範囲、または１ｍから１０ｍの範囲の長さを有する、実施形態３２～５１のいずれかの光学系。
実施形態５３：蛍光抑制波長が５８５ｎｍである、実施形態３２～５２のいずれかの光学系。当業者は、抑制放射が、典型的には、蛍光抑制波長またはその近くに相対最大を有する波長の広がりを有することを理解するであろう。望ましい蛍光抑制波長は、蛍光を受ける特定の種に依存する。抑制放射は、パルス化されることができる。
実施形態５４：励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することは、ファイバの出力をコリメートすることと、ファイバのコリメートされた出力を撮像対象物に送達することとを備えるように構成された、実施形態３２～５３のいずれかの光学系。
実施形態５５：励起放射および抑制放射を光ファイバから撮像対象物に送達することが、ファイバの出力をコリメートすることと、１つ以上のレンズを使用して、コリメートされた出力をＧＲＩＮレンズに集束することと、ＧＲＩＮレンズを使用して放射を対象物に伝達することとを備えるように構成された、実施形態３２～５３のいずれかの光学系。
実施形態５６：ＧＲＩＮレンズが、１つ以上のレンズから取り外し可能である、実施形態５５の光学系。
実施形態５７：１つ以上のレンズが、一対のアクロマティックダブレットレンズと、ＧＲＩＮレンズの色度のバランスをとるように構成されたガラス凹レンズとを備える、実施形態５５の光学系。
実施形態５８：抑制放射が、幅が２５ｎｍ～３００ｎｍの範囲内、例えば、幅が２５ｎｍ～２００ｎｍ、または２５ｎｍ～１００ｎｍ、または５０ｎｍ～３００ｎｍ、または５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、または７５ｎｍ～３００ｎｍ、または７５ｎｍ～２００ｎｍ、または１００ｎｍ～３００ｎｍ、または１００ｎｍ～２００ｎｍである、対象物において－５ｄＢ幅を有する中心の暗い部分を有する（すなわち、最大強度と比較して）ように構成された、実施形態１～５７のいずれかの光学系。
実施形態５９：抑制放射が、幅が１０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲内、例えば、幅が１０ｎｍ～１２５ｎｍ、または１０ｎｍ～１００ｎｍ、または１０ｎｍ～７５ｎｍ、または２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～１２５ｎｍ、または２０ｎｍ～１００ｎｍ、または２０ｎｍ～７５ｎｍ、または４０ｎｍ～１５０ｎｍ、または４０ｎｍ～１２５ｎｍ、または４０ｎｍ～１００ｎｍ、または４０ｎｍ～７５ｎｍである、対象物において－１０ｄＢ幅を有する中心の暗い部分を有するように構成された、実施形態５８のいずれかの光学系。
実施形態６０：対象物における励起放射の最大強度が、対象物における抑制放射の中心の暗い部分内にあるように構成された、実施形態３２～５９のいずれかの光学系。
実施形態６１：発光放射の強度を判定することが、励起放射および抑制放射の伝播と反対方向に光ファイバ内で発光放射を伝播することと、伝播された発光放射の強度を判定することとを備えるように構成された、実施形態３２～５９のいずれかの光学系。
実施形態６２：発光放射の強度を判定することが、偏光保持光ファイバとは別の光ファイバ内で発光放射を伝播することを備えるように構成された、実施形態３２～５９のいずれかの光学系。
実施形態６３：偏光保持光ファイバが、低屈折率領域によって中心コアから分離された高屈折率リングコアを含まない、実施形態３２～６２のいずれかの光学系。
本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されているプロセスおよび装置に対して様々な変更および変形を行うことができることが当業者には理解されるであろう。したがって、本開示は、本発明のそのような変更および変形が添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある限り、本発明のそのような変更および変形を網羅することを意図している。
１００ 光学系
１１０ 偏光保持光ファイバ
１１１ 第１の端部
１１２ 第２の端部
１１３ 光学系
１１４ 対物レンズ
１１６ ミラー
１２０ 励起源、励起放射源
１２１ ミラー
１２２ ダイクロイックミラー
１３０ 抑制源、抑制放射源
１３１ 半波長板
１３２ 空間光変調器
１３３ 半波長板
１３４ 第１の偏光ビームスプリッタ
１３５ ダブプリズム
１３６ ミラー
１４０ 撮像対象物
１６０ 検出器
１６２ ノッチダイクロイック、ダイクロイックミラー

Claims (15)

  1. 撮像対象物中の蛍光種であって、蛍光励起波長、蛍光抑制波長および蛍光発光波長を有する前記蛍光種の誘導放出抑制顕微鏡法のための方法であって、
    偏光保持光ファイバを提供することと、
    前記偏光保持光ファイバの中心モードにおける前記蛍光励起波長の励起放射を伝播することと、
    前記偏光保持光ファイバの１つ以上の周辺モードにおける前記蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することであって、前記１つ以上の周辺モードのそれぞれが、前記偏光保持光ファイバの前記中心モードと実質的に重複する最小強度を有し、前記抑制放射が前記偏光保持光ファイバ内で実質的に時間的にインコヒーレントに伝播することと、
    前記励起放射および前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバから前記撮像対象物に送達することであって、前記励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有する励起放射スポットを形成し、前記抑制放射が、前記励起放射の周りに環状リングを形成し且つ前記励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく前記励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、前記励起放射が、前記励起放射スポットの中心に配置された最大強度において前記撮像対象物からの前記蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、前記抑制放射が、環状の前記抑制放射の領域における前記蛍光発光波長の放射の発光を防止することと、
    前記発光放射の強度を判定することと、
    を備える、方法。
  2. 前記抑制放射が、前記偏光保持光ファイバの２つの直交モードで伝播される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抑制放射がトロイドの形状である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記抑制放射が、複数の周辺モードにおいて前記偏光保持光ファイバ内で伝播され、モード間の時間的インコヒーレンス（γ）が、０．２以下である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記偏光保持光ファイバ内を伝播する、かつ／または、前記撮像対象物に送達される前記抑制放射が、前記中心における最大強度から最小強度まで少なくとも１３ｄＢのコントラストを有する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 回折限界のものの５０％以下の半値全幅を有する前記撮像対象物の蛍光を引き起こす能力を有する前記撮像対象物において、有効励起スポットを前記撮像対象物に提供するように、前記抑制放射および前記励起放射が重複する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記有効励起スポットが、２００ｎｍ以下の直径を有する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記蛍光励起波長が、４００ｎｍ～６００ｎｍの範囲内または９００ｎｍ～１０５０ｎｍの範囲内であり、前記蛍光抑制波長が、５００ｎｍ～７００ｎｍの範囲内である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記蛍光抑制波長の抑制放射を伝播することが、抑制放射源から抑制放射を提供することと、前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバの前記１つ以上の周辺モードに結合することとを備え、前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバの前記１つ以上の周辺モードに結合することが、
    プロファイルに前記放射を成形することであって、前記プロファイルが前記プロファイルの中心部分において最小強度を有する、前記放射を成形することと、
    前記成形された放射を、直交偏光を有する２つのビームに分離することと、
    第１のビームの強度プロファイルを他のビームに対して約９０度回転させ、前記他のビームに対して前記第１のビームを遅延させることと、
    前記ビームを再合成することと、前記再合成されたビームを前記偏光保持光ファイバの前記１つ以上の周辺モードに結合することと、
    を備える、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記偏光保持光ファイバの前記周辺モードが、少なくとも１つの奇数番号の識別子を有するエルミート－ガウスモードである、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記励起放射および前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバから前記撮像対象物に送達することが、前記偏光保持光ファイバの出力をコリメートすることと、前記偏光保持光ファイバの前記コリメートされた出力を前記撮像対象物に送達することとを備える、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記励起放射および前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバから前記撮像対象物に送達することが、前記偏光保持光ファイバの出力をコリメートすることと、１つ以上のレンズを使用して、前記コリメートされた出力をＧＲＩＮレンズに集束することと、前記ＧＲＩＮレンズを使用して前記放射を前記撮像対象物に伝達することとを備える、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  13. 前記抑制放射が、幅が１０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲内である、前記撮像対象物において－１０ｄＢ幅を有する中心が暗い部分を有する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記撮像対象物における前記励起放射の最大強度が、前記撮像対象物における前記抑制放射の中心の暗い部分内にある、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 請求項１～１４のいずれかに記載の方法を実行するように構成された光学系であって、
    中心モードと、それぞれが偏光保持光ファイバの前記中心モードと実質的に重複する最小強度を有する１つ以上の周辺モードとを有する前記偏光保持光ファイバと、
    前記偏光保持光ファイバの前記中心モードにおいて前記蛍光励起波長の励起放射の伝播を引き起こすように結合された励起放射源と、
    前記偏光保持光ファイバの１つ以上の前記周辺モードにおいて実質的に時間的にインコヒーレントに抑制放射の伝播を引き起こすように結合された前記蛍光抑制波長の抑制放射源と、
    前記励起放射および前記抑制放射を前記偏光保持光ファイバから前記撮像対象物に必要に応じて追加の光学系を介して送達するように構成された前記偏光保持光ファイバであって、前記励起放射が、実質的に中心に配置された最大強度を有するスポットを形成し、前記抑制放射が、前記励起放射の周りに環状リングを形成し且つ前記励起放射スポットの中心に配置された最大強度と実質的に重複することなく前記励起放射スポットの周辺と実質的に重複し、前記励起放射が、前記スポットの中心に配置された最大強度において前記撮像対象物からの前記蛍光発光波長の発光放射を引き起こし、前記抑制放射が、環状の前記抑制放射の領域における前記蛍光発光波長の放射の発光を実質的に防止する、偏光保持光ファイバと、
    を備える、光学系。
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