JP5164085B2 - 細胞内発光イメージングのために最適化されたルシフェラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
1. pH非感受性ルシフェラーゼをコードする遺伝子構築体であって、ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子構築体と比較して細胞内の発現活性が高い遺伝子構築体。
2. 前記細胞が哺乳類細胞である、項1に記載の遺伝子構築体。
3. 前記遺伝子構築体が、哺乳類細胞中での翻訳を効率化されたルシフェラーゼ遺伝子からなる項2に記載の遺伝子構築体。
4. 前記遺伝子構築体がヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼをコードする項1〜3のいずれかに記載の遺伝子構築体。
5. ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼがPyrophorus属、Pyrearinus属由来ルシフェラーゼまたはその変異体からなる群より選択される、項4に記載の遺伝子構築体。
6. ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼをコードする遺伝子が配列番号:2の塩基配列を有する、項4または5に記載の遺伝子構築体。
7. pH非感受性ルシフェラーゼが不安定化されたルシフェラーゼである、項1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築体。
8. 遺伝子構築体がpH非感受性ルシフェラーゼまたはその部分配列と少なくとも1つの異種タンパク質またはタグ配列からなる融合タンパク質をコードすることを特徴とする項1〜7のいずれかに記載の遺伝子構築体。
9. 異種タンパク質またはタグ配列がタンパク質不安定化シグナルである、項8に記載の遺伝子構築体。
10. タンパク質不安定化シグナルがPEST配列を有する、項9に記載の遺伝子構築体。
11. PEST配列がマウスオルニチンデカルボキシラーゼの3’末端またはその変異体である、項10に記載の遺伝子構築体。
12. 異種タンパク質またはタグ配列が細胞内局在化シグナルである項8に記載の遺伝子構築体。
13. pH非感受性の前記ルシフェラーゼのN末端部分と少なくとも1つの第一異種タンパク質からなる融合タンパク質をコードする項8に記載の遺伝子構築体。
14. pH非感受性の前記ルシフェラーゼのC末端部分と少なくとも1つの第二異種タンパク質からなる融合タンパク質をコードする項8に記載の遺伝子構築体。
15. 項13の遺伝子構築体と項14の遺伝子構築体との組合せ。
16. 項13および14の融合タンパク質をコードする遺伝子構築体を同一の細胞に導入し、前記融合タンパク質を発現させ、第一異種タンパク質と第二異種タンパク質の相互作用を評価する方法。
17. 項13および14に記載の遺伝子構築体からの発現産物を混合し、第一異種タンパク質と第二異種タンパク質の相互作用を評価する方法。
18. 項1〜14の遺伝子構築体または項15に記載の遺伝子構築体の組合せを用いて形質転換された形質転換細胞。
19. 前記細胞が哺乳類細胞である項18に記載の形質転換細胞。
20. 前記細胞がヒト細胞である、項18または19に記載の形質転換細胞。
21. 配列番号2に記載のヒカリコメツキルシフェラーゼ遺伝子改変体。
22. 細胞内のオルガネラのイメージングのための項18〜20のいずれかに記載の形質転換細胞の使用。
23. 試験対象となる転写制御配列制御下でpH非感受性ルシフェラーゼを発現する試験細胞を所望の条件下で培養し、該発現ルシフェラーゼによる発光を生細胞において測定することを含み、ホタル由来ルシフェラーゼと比較してpH非感受性ルシフェラーゼの細胞内の発現活性が高いことを特徴とする転写活性測定方法。
24. pH非感受性ルシフェラーゼがヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼである、項23に記載の方法。
25. pH非感受性ルシフェラーゼがPyrophorus属、Pyrearinus属のヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼまたはその変異体からなる群より選択される、項23または24に記載の方法。
26. 転写制御配列制御下のpH非感受性ルシフェラーゼ遺伝子が、配列番号:2に示される塩基配列を有する、項23〜25のいずれかに記載の方法。
27. pH非感受性ルシフェラーゼが不安定化されている、項23〜26のいずれかに記載の方法。
28. 細胞が哺乳類細胞、酵母、大腸菌および植物細胞からなる群より選択される、項23〜27のいずれかに記載の方法。
29. 被験転写制御配列が転写活性が低い配列である、項23〜28のいずれかに記載の方法。
30. 細胞が遺伝子導入効率の低い細胞である、項23〜29のいずれかに記載の方法。
31. 0.01〜10mM D-luciferinを細胞培養液に添加する、項23〜30のいずれかに記載の方法。
32. 96、384または1536ウェルプレートフォーマットで実施する、項23〜31のいずれかに記載の方法。
33. ルシフェラーゼの発現差により化合物の細胞への影響を評価する、項23〜32のいずれかに記載の方法。
第2遺伝子構築体:(第2異種タンパク) −(ルシフェラーゼのC末端部分)
これらの遺伝子構築体を1つの細胞内で共発現させると、2つの異種タンパクの相互作用によりN末端・C末端が近接位にあることを発光シグナルにより確認することが可能になる。
野生型(配列番号1)および改良型(配列番号2)ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNAと、マウスオルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列(配列番号7)を連結した短寿命型ルシフェラーゼを作製した。これらを時計遺伝子マウスBmal1プロモーター(GenBank Accession No. AB064982)下流に挿入したベクターを作製した。続いて各ベクター1μgを、35mm培養ディッシュに播種した培養繊維芽細胞NIH3T3にリポフェクション法(リポフェクトアミンプラス、インビトロジェン社)により導入し、24時間37℃で培養後、100 nMのデキサメタゾンを含むDMEM培地で2時間処理した。更に200μMのD-ルシフェリンと10%(w/v)の牛血清を含むDMEM培地に交換後、遺伝子発現連続測定装置(アトー(株)社AB2500)にて、1分間の発光を15分間隔で5日間発光量をリアルタイムに測定した(図1(a))。野生型および改良型ルシフェラーゼともに、Bmal1プロモーターに依存した約24時間周期の変動をモニター可能であるが、改良型ルシフェラーゼの発光強度は野生型のそれよりも約100倍高いことが明らかとなった。
米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼcDNA(Luc(+)、プロメガ社製)および改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNA(配列番号2)に、マウスオルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列(配列番号7)を連結した短寿命型ルシフェラーゼを作製した。これらを時計遺伝子マウスBmal1プロモーター(GenBank Accession No. AB064982)下流に挿入したベクターを作製した。続いて各ベクター1μgを、35mm培養ディッシュに播種した培養繊維芽細胞rat1にリポフェクション法(リポフェクトアミンプラス)により導入し、24時間37℃で培養後、100 nMのデキサメタゾンを含むDMEM培地で2時間処理した。更に200μMのD-ルシフェリンと10%(w/v)の牛血清を含むDMEM培地に交換後、遺伝子発現連続測定装置(アトー(株)社AB2500)にて、1分間の発光を15分間隔で5日間測定した(図2)。米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼ(図2(a))と改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼ(図2(b))を比較すると、発光の変動パターンは同じであり、改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼがリアルタイム解析に用いられてきたアメリカ産ルシフェラーゼと同等の能力を持つ、一方、24時間以内の発光量を積算した結果(図2(c))、発光量が15倍以上高いことが明らかになった。
前述の短寿命型ホタルルシフェラーゼcDNAおよび短寿命・改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNAを、SV40プロモーターの下流に挿入した発現ベクターを作製した。200 ngの発現ベクターを、24ウェルプレートに播種した培養繊維芽細胞NIH3T3にリポフェクション法により導入し、37℃で48時間培養した。続いて100μMの蛋白質合成阻害剤シクロヘキシミドを含む培養液に置換し、30分間培養後、1時間毎に細胞内の発光活性を測定した。発光活性の測定は、実施例1と同様の方法で行った(図3)。短寿命化米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼでは、半減期が1時間であったが、短寿命型改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼでは半減期が4時間と4倍長寿命化された。
米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼcDNA(Luc(+)、プロメガ社製)および改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNA(配列番号2)のN末端にFLAGタグ配列(MDYDDDDK;配列番号15)を連結、これらをCMVプロモーターの下流に挿入した発現ベクター2μgを培養繊維芽細胞NIH3T3にリポフェクション法により導入し、37℃で24時間培養した。その後、200μMのD-ルシフェリンと10%(w/v)の牛血清を含むDMEM培地に交換し、−60℃に冷却したCCDカメラ(アトー(株)社セルグラフ)で3分間発光を測定した。米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼ(図4(a))およびヒカリコメツキルシフェラーゼ(図4(b))を比較すると、ヒカリコメツキルシフェラーゼを生産する哺乳類細胞が明らか強いシグナルを発することがわかる。細胞を拡大すると核では発光は見られず、PEST配列によって細胞内の細胞質内にルシフェラーゼが局在し発光することがわかる。
CMVプロモーター下流に挿入された改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNA(配列番号2)は哺乳類細胞のペルオキシゾームに局在することを確認した。このC末端のアミノ酸配列SKLを除去したものを細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼとし、次に細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼのC末端に核局在化シグナルDPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV(配列番号3)を配したものを核局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼとした。また、細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼのN末端MGWSCIILFLVATATGAHS(小胞体局在化シグナル、Vh chain targeting signal;配列番号4)をC末端にSEKDEL(小胞体保留シグナル;配列番号6)を配したものを小胞体局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼとした。さらに細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼのN末端にMLCCMRRTKQVEKNDEDQKI(膜局在化シグナル, Neuromodulin N-terminus;配列番号5)を配したものを膜局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼとした。
実施例5で作製したペルオキシソーム局在化、核局在化および細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNAのN末端にFLAGタグ配列(MDYDDDDK;配列番号15)を融合し、各々をCMVプロモーターの下流に挿入した発現ベクターpCMV-FLAG-PtGRm-POX(ペルオキシソーム局在化)、pCMV-FLAG-PtGRm-Nuc(核局在化)およびpCMV-FLAG-PtGRm-Cyto(細胞質局在化)を作製した。一方、EGFP(Clontech社)cDNAのC末端にSKL配列を融合し、これをCMVプロモーターの下流に挿入した発現ベクターpCMV-EGFP-POX(ペルオキシソーム局在化EGFP)を作製した。続いて35mm培養ディッシュに播種した培養繊維芽細胞NIH3T3に、pCMV-FLAG-PtGRm-POX 2μgとpCMV-EGFP-POX 0.2μg、pCMV-FLAG-PtGRm-Nuc 2μgとpAcGFP-Nuc(核局在化GFP、Clontech社)0.2μg、pCMV-FLAG-PtGRm-Cyto 2μgの組合わせで各発現ベクターをリポフェクション法(リポフェクトアミンプラス、Invitrogen社)により導入し、37℃で24時間培養した。発光イメージングは、200μMのD-ルシフェリンと10%牛血清を含むDMEM培地に交換後、冷却CCDカメラを搭載した発光イメージング装置(アトー(株)社 セルグラフ)を用い、40倍の対物レンズにて3分間発光を撮影した。改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼの細胞内局在は、抗FLAG抗体(Sigma社)を用いた免疫染色により、またコトランスフェクションしたGFPの細胞内局在はGFP蛍光を共焦点顕微鏡(BioRad社)により観察した(図6)。抗FLAG抗体を用いた免疫染色あるいは局在化GFPによる蛍光イメージングにより、ペルオキシソーム局在化、核局在化および細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼがそれぞれのオルガネラに局在化することが確認された。一方、高倍率の対物レンズを用いた発光イメージングにより、3分間の露光で各オルガネラから発する顕著な発光シグナルが得られ、細胞内の各所での局在のイメージングが可能であることが明らかとなった。
細胞質局在化改良型ヒカリコメツキルシフェラーゼcDNAのN末端にマウスimportin a1 cDNA(GenBank No.D55720)を融合し、これをCMVプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを作製した。続いてベクター2μgを、35mm培養ディッシュに播種した培養繊維芽細胞NIH3T3にリポフェクション法(リポフェクトアミンプラス)により導入し、37℃で3時間培養後、200μMのD-ルシフェリンと10%(w/v)の牛血清を含むDMEM培地に交換した。発光イメージングは発光イメージング装置(アトー(株)社 セルグラフ)を用い、40倍の対物レンズにて3分間露光、4分間隔で撮影した(図7)。発光イメージングにより、importin a1が約30分間隔で核内と細胞質の輸送を繰り返すことが確認され、タンパク質の細胞内局在の変化を連続してイメージング可能なことがわかる。
pSLG-HSVtk control(東洋紡績)を鋳型として、オリゴヌクレオチド1、2(シグマ アルドリッチ ジャパン社)(配列番号9、10)、PCR酵素KOD -plus-(東洋紡績)を用いて、Herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) 由来のプロモーター配列を増幅した。オリゴヌクレオチドの5’末端には、制限酵素Spe I、EcoR Vの認識配列が付加されている。 このPCR産物、pELuc-test(東洋紡績、配列番号2のPtGRm遺伝子搭載ベクター)をそれぞれ制限酵素Spe I、EcoR V(東洋紡績)で分解し、Ligation high(東洋紡績)を用いてライゲーション反応を行い、HSVtkプロモーターをpELuc-testのPtGRm遺伝子上流に挿入した(pPtGRm-HSVtk)。続いて、オリゴヌクレオチド3(シグマ アルドリッチ ジャパン社)(配列番号11)とそれに相補的なオリゴヌクレオチド4(シグマ アルドリッチ ジャパン社)(配列番号12)、オリゴヌクレオチド5(シグマ アルドリッチ ジャパン社)(配列番号13)とそれに相補的なオリゴヌクレオチド6(シグマ アルドリッチ ジャパン社)(配列番号14)をそれぞれアニーリングし、NFκB応答配列カセット、AP1応答配列カセットを作成した。
HeLa S3細胞を96ウェル白色不透明プレートに1ウェル当たり3×104cells (100μl)ずつ播種し、10% FCSを含むダルベッコ変法イーグル培地DMEM(日水製薬)中で培養した。翌日、プラスミドpEluc-AP1、pGL3-AP1をそれぞれ1ウェル当たり0.2μg(DMEM(FCS無添加)25μlで希釈)をLipofectamine 2000 transfection reagent(インビトロジェン社)0.5μl(DMEM 25μlで希釈)と混合し、DMEM+0.1% FCS 100μlで置換された細胞に添加し、24時間インキュベートすることによって遺伝子導入を行った。翌日、未添加、0.01μM TPA(Sigma)、0.1μM TPA、1μM TPAまたは10 ng/ml EGFを含むDMEM+0.1% FCS(さらに0.2mM D-luciferinを含む)に置換し、5時間インキュベートした。その後、プレートリーダー1420 ARVOMX(パーキンエルマー)を用いて、発光を測定した。結果を図9に示す。測定値グラフは読取り値を、誘導比グラフは読取り値をもとに、各コンストラクトについて無添加条件を1として各種濃度の薬剤添加条件の発現誘導比をプロットしている。本発明のルシフェラーゼにおいても各刺激に対し従来のルシフェラーゼと同様の変動が認められる一方で、およそ15倍の発光強度が認められた。
Jurkat細胞を1×106cells (4 ml)になるように、0.1% FCSを含むRPMI1640培地(日水製薬)に懸濁し、1 mlずつに24ウェルプレートの4ウェルに分注した。プラスミドpEluc-NFκB、pGL3-NFκB、pEluc-AP1、pGL3-AP1をそれぞれ2μg(RPMI1640(FCS無添加)200μlで希釈)をLA2000(RPMI 1640(FCS無添加)200μlで希釈)と混合し、Jurkat細胞と混合し、24時間インキュベートすることによって遺伝子導入を行った。翌日、遺伝子導入されたJurkat細胞を50μlずつ白色透明プレートに分注した。つづいて、pEluc-NFκBまたはpGL3-NFκB、pEluc-AP1またはpGL3-AP1を導入されたJurkat細胞には、添加物なし、または種々濃度のTNFα(PEPROTECH)を含むRPMI+0.1% FCS(さらに0.4mM D-luciferinを含む)50μlを添加し、5時間インキュベートした。TNFαは最終濃度で0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlとなるように添加している。その後、プレートリーダー1420 ARVOMX(パーキンエルマー)を用いて、発光を測定した。
ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ酵素標品は、ベクターpELuc-test(東洋紡)のルシフェラーゼ遺伝子PtGRmを大腸菌発現用ベクターに挿入し大腸菌で発現させ、組換え体として取得した。ホタルルシフェラーゼ酵素標品は、QuantiLum Recombinat Luciferase(Promega社、図中はfLucと記載)を用いた。それぞれの酵素標品について、15mM MgSO4、6mM EDTA、4mM CoenzymeA、1.2mM D-luciferin,6mM DTT、0.2% Nonidet P40、2mM ATP及び2μg/ml酵素標品の発光試薬を調製した。0.02mM, 0.2mM, 1mM ATP溶液100μlと100mM Hepes-NaOH pH6.6〜8.8 100μlを混合し発光を計測した。
Claims (11)
- pH非感受性ヒカリコメツキムシ・ルシフェラーゼをコードする遺伝子構築体であって、前記ルシフェラーゼは米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼと比較して哺乳類細胞内の発光量が15倍以上高く、前記ルシフェラーゼは配列番号2の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有し、pH非感受性ヒカリコメツキムシ・ルシフェラーゼをコードする遺伝子構築体が、哺乳類細胞における翻訳を効率化するために遺伝子配列を改変したものであり、前記遺伝子配列の改変が、下記のa)〜b):
a) 余分な転写因子が結合しないように、cDNAの配列を変えること、
b)cDNA配列における昆虫のコドンユーセージを哺乳類細胞用に変えること、
を含み、pH非感受性ヒカリコメツキムシ・ルシフェラーゼの改変した遺伝子配列は配列番号2の塩基配列と80%以上の同一性を有する、遺伝子構築体。 - 前記遺伝子配列の改変が、下記のc):
c)cDNAの制限酵素部位をなくすように変えること
をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子構築体。 - 野生型のpH非感受性ヒカリコメツキムシ・ルシフェラーゼの遺伝子構築体と比較して哺乳類細胞における発光量が100倍以上高い、請求項1又は2に記載の遺伝子構築体。
- pH非感受性ルシフェラーゼまたはそのN末端ドメイン配列もしくはC末端ドメイン配列と少なくとも1つの異種タンパク質またはタグ配列からなる融合タンパク質をコードする遺伝子構築体であって、前記ルシフェラーゼは配列番号2の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有し、前記遺伝子構築体が、哺乳類細胞における翻訳を効率化するために遺伝子配列を改変したものであり、前記遺伝子配列の改変が、下記のa)〜b):
a) 余分な転写因子が結合しないように、cDNAの配列を変えること、
b)cDNA配列における昆虫のコドンユーセージを哺乳類細胞用に変えること、
を含み、pH非感受性ヒカリコメツキムシ・ルシフェラーゼの改変した遺伝子配列は配列番号2の塩基配列と80%以上の同一性を有し、改変された遺伝子配列によりコードされるpH非感受性ルシフェラーゼは米国産Photinus pyralisホタルルシフェラーゼと比較して哺乳類細胞内の発光量が15倍以上高いことを特徴とする、遺伝子構築体。 - 前記遺伝子配列の改変が、下記のc):
c)cDNAの制限酵素部位をなくすように変えること
をさらに含む、請求項4に記載の遺伝子構築体。 - 異種タンパク質またはタグ配列が細胞内局在化シグナルである請求項4又は5に記載の遺伝子構築体。
- pH非感受性の前記ルシフェラーゼのN末端ドメイン部分と少なくとも1つの第一異種タンパク質からなる融合タンパク質をコードする請求項4又は5に記載の遺伝子構築体。
- pH非感受性の前記ルシフェラーゼのC末端ドメイン部分と少なくとも1つの第二異種タンパク質からなる融合タンパク質をコードする請求項4又は5に記載の遺伝子構築体。
- 請求項7の遺伝子構築体と請求項8の遺伝子構築体との組合せ。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の遺伝子構築体または請求項9に記載の遺伝子構築体の組合せを用いて形質転換された形質転換哺乳類細胞。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項10に記載の形質転換哺乳類細胞。
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