CN101336293A - 用于鉴定细胞信号转导调节物的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种鉴定潜在的细胞信号转导途径调节物的方法，包括以下步骤：(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中可通过使所述第一种细胞类型序贯暴露于两种或更多种反应条件将所述第一种细胞类型经祖细胞分化为第二种细胞类型；(b)以暴露于一种或多种含所述潜在调节物的不同反应条件加入或置换祖细胞已暴露的所述两种或更多种反应条件中的至少一种；和(c)监测第一种细胞类型的分化，以确定第二种细胞类型的形成。

Description

用于鉴定细胞信号转导调节物的方法
发明领域
本发明涉及用于鉴定细胞信号转导途径调节物的方法。具体地说，涉及用于鉴定在细胞中触发分化的细胞信号转导途径调节物的方法。可通过使祖细胞接触候选调节物来鉴定调节物。一方面，祖细胞是多能干细胞或单能干细胞，其在分化的不同阶段被分离，并进一步与分化过程的潜在调节物一起培养，所述调节物用于促进或抑制细胞信号转导途径对分化的作用。
发明背景
再生医学领域对患有诸如心血管疾病、神经退化性疾病、肌肉骨骼疾病、肝病或糖尿病的病症的患者在体内再生受损组织和器官持有现实希望。用再生受损组织的技术包括使用再生药物在体内修复既有的患病组织，或者使用先在体外使用(或不使用)再生药物制备的细胞置换所述组织，然后移植体内。
在任何一种情况下，只有在能鉴定出控制细胞信号转导途径和它们调节的下游细胞过程的特定基因、因子或调节物时，才能实现再生医学的目标。一般认为，受控的体外干细胞分化例如可提供用于移植的置换细胞来源。干细胞的多能性和可塑性允许它们在用某些培养条件处理之后被定型为特定细胞类型。然而，此方法依赖于控制谱系分化的细胞和分子事件的因子或调节物的事前鉴定。对离体干细胞使用这些因子或调节物可以降低移植时干细胞自发分化为分支谱系的可能性，以及就胚胎干细胞而言降低了畸胎瘤形成的风险。
这些因素或调节物还可以构成治疗基础，所述治疗的目的在于体内移动内源干细胞，或者触发它们分化为可扩增、修复、恢复、置换或有益于损伤组织的细胞类型。影响细胞分化并用于治疗的因素的实例为促红细胞生成素(EPO)。EPO为促进造血前体分化为红细胞的天然蛋白因子。重组EPO用于治疗贫血，并具有约100亿美元的全球市场。
除了天然分子或因子以外，还有可能使用信号转导途径的合成调节物、尤其是控制分化的途径的调节物来影响细胞分化。SB-497115是一种由GSK开发的小分子药物，其模拟血小板生成素(TPO)的活性，血小板生成素为促进血小板生长和生产的蛋白因子。该药物可用于治疗血小板减少症：没有生产血小板的能力，血小板为出血时凝血过程必需的关键成分。估计商机约为40-50亿美元。
尽管再生药物如EPO或SB-497115作用于干细胞，但还没有提出使用干细胞、尤其是胚胎或胎儿干细胞发现再生药物的一般性方法。
在药物发现中使用干细胞的最初尝试包括这样的试验：其中在天然产物或合成化合物的基于细胞的表型和途径特异性筛选中使用多潜能胚胎干细胞、自我更新成年干细胞或细胞系，以发现能够影响这些细胞分化的物质(参见Ding和Shultz(2004)Nature Biotechnology 22：833-840的综述)。使用这些细胞的其中一个理由是它们可易于扩增，以产生筛选所需的量。然而，由于以下论述的众多理由，其中使用自我更新的未分化干细胞或细胞系的现有技术方法被发现不能作为药物发现方法。
首先，现有技术中使用的细胞类型(尤其是ES细胞和细胞系)可能不是适于体内药物干涉的生理相关靶标。例如，尽管能够使ES细胞分化为例如心肌细胞的因子(Wu等，J Am Chem Soc.2004：126(6)：1590-1)可能对允许由ES细胞体外产生心肌细胞有用，但ES细胞在成体中不存在，对ES细胞具有特异性活性的任何物质都应当没有可能用作体内再生药物。
其次，现有技术中使用的细胞类型(尤其是ES细胞和自我更新成年干细胞)位于发育途径中靶细胞谱系上游过远的位置，以至于不能响应于单一物质的单一应用而定向分化为该谱系。例如，已知需要连续地定时应用已知众多因子的混合物，以将ES细胞分化为特定谱系，尤其是由于相对复杂的组织特化过程而在发育的相对晚期特化的那些谱系。
第三，在现有技术中使用的细胞类型(尤其是原初成年干细胞)可能难以获得实施大规模的高通量药物筛选的足够量。
最后，用于现有技术的细胞类型(尤其是原初成年干细胞)可能响应于药物表现出高度可变的作用，这取决于来源或分离和制备的方法。
WO2004/031369描述了允许细胞如干细胞分化的方法和细胞信号转导途径。在WO2004/031369所述的技术中，细胞在多个培养步骤下于多种条件下培养，以调节细胞途径，该方法提供了确定多个不同培养步骤方案对细胞过程如分化的作用的手段。
发现再生药物的现有方案是次优的，需要发现这类药物的改良方法。本发明提供这些问题的解决方案，并提供用于发现药物如再生药物的改良方法。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现：有可能将干细胞停滞在分化途径中，由此分离适于筛选的另一类细胞。在一个实施方案中，这可以如下实现：获得第一类细胞，并确定导致经祖细胞显现出给定的目标靶表型的分化方案，任选地进一步修改该方案，通常通过改变细胞培养基，使得分化过程停止在其中存在另一类细胞(优选祖细胞)的阶段。第二类细胞(例如祖细胞)的身份不需要是已知的，但它们在制备物中的存在可由以下事实推定：如果跟踪初始分化方案至完成，则将出现目标表型。因此，在一个实施方案中，本文所述方法可用于生产其祖代在体内仍是未知的细胞类型的发育祖代。
一种生产这类细胞的方法是使用WO2004/031369的方法，以便发现一系列培养步骤，这些步骤导致分化，随后修改或缩短(trucating)祖细胞分离的过程。本发明认识到，通过序贯接触选定物质，可分离与体内祖代群基本相同的部分分化状态的细胞，然后筛选诱导进一步分化的因子。
本发明还认识到，如果在天然产物或合成化合物的基于细胞筛选的测定中使用生理学相关的祖细胞，则再生药物发现筛选测定更有可能鉴定有效的药物候选物。生理学相关的祖细胞与自我更新的胚胎或成年干细胞相比发育潜力低，并在发育途径中位于这些多能细胞的下游。例如，在贫血的临床治疗中EPO的靶细胞类型不是胚胎干细胞，也不是自我更新成年造血干细胞，而是更定型于红细胞祖细胞，其位于沿着发育途径的更远处，其发育潜力更加有限(Fisher，Exp Biol Med，2003年1月；228(1)：1-14)。如果该祖代群可用于药物发现筛选测定，则EPO对再生红细胞的作用应是相当明显的。另一方面，如果在筛选中使用未分化的ES细胞，即便这些细胞可使用适宜方案分化为红细胞，则EPO的此再生作用也不会如此显而易见。因此，在药物筛选中应使用生理学相关的祖细胞去鉴定再生药物，而不是使用多能的自我更新干细胞。
然而，使用祖代群的重要问题在于它们极难获得，它们的扩增能力有限，在某些情况下它们完全没有被表征。例如，某些神经祖代是众所周知的，但定居在活体脑中，因此难以获得用于药物筛选测定。此外，肝脏是能够在体外快速再生的器官，相比于脑活检品，肝脏活检品相对较容易获得，但负责肝脏再生的祖细胞群还没有被最后鉴定，因此不能被分离、培养和用于药物筛选测定。
本发明还认识到，适于再生药物发现筛选测定的生理学相关祖细胞可来源于自我更新的胚胎或成年干细胞，条件是可使这些细胞一直分化到但没有超过相关祖代阶段。因此，在本领域需要分离部分分化细胞的改良技术，以便随后筛选可用于调节它们的分化的因子。
本发明包括分离部分分化的细胞类型的方法，所述细胞类型包括生理学相关的祖细胞。在一个实施方案中，这可以如下实现：获得干细胞，并对它们实施在WO2004/031369中描述的技术，以发现分化方案，并进一步修改该方案，使得分化过程停止在或发展没有超过其中存在靶祖细胞的阶段。在另一个实施方案中，其包括由发育胎儿或动物的不同发育阶段的成年干细胞群分离它们，任选地修饰它们，使得它们可在体外被扩增。另外，这些祖细胞可用于这样的测定：其中筛选细胞信号转导的天然产物和候选小分子调节物，以鉴定在祖细胞中影响细胞信号转导的物质，这些物质引起例如移动、扩增或分化，然后可将这些物质开发成再生药物。
本发明的若干方面和实施方案
在第一方面，本发明提供一种鉴定细胞信号转导途径的潜在调节物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中通过使所述第一种细胞类型序贯暴露于一种或多种、优选两种或更多种反应条件，可将所述第一种细胞类型经祖细胞分化为第二种细胞类型；(b)以暴露于一种或多种含所述潜在调节物的不同反应条件加入或置换祖细胞已暴露的所述两种或更多种反应条件中的至少一种；和(c)监测第一种细胞类型的分化，以确定第二种细胞类型的形成。
又一方面，本发明提供一种鉴定细胞信号转导途径的潜在调节物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中通过使所述第一种细胞类型序贯暴露于两种或更多种反应条件可将所述第一种细胞类型经祖细胞分化为第二种细胞类型；(b)以暴露于一种或多种含所述潜在调节物的不同反应条件加入或置换祖细胞已暴露的所述两种或更多种反应条件中的至少一种；和(c)监测第一种细胞类型的分化，以确定第二种细胞类型的形成，其中细胞分化为第二种细胞类型表示所述潜在调节物调节细胞分化途径。
本发明还认识到，通过由早期发育状态的生物体获得，可分离部分分化状态的细胞，并任选地扩增，任选地进一步分化，然后筛选诱导分化为靶细胞谱系或表型的调节物。
因此，在一个实施方案中，第一种细胞类型得自或者可得自胚胎或胎儿，并任选地被修饰，以允许扩增。
在一个实施方案中，通过暴露于(例如序贯暴露于)一种或多种(例如两种或更多种)反应条件，在体外由第一种细胞类型获得祖细胞。
在另一个实施方案中，监测细胞的死亡而不是细胞分化。因此，筛选可为毒性筛选。
在一个实施方案中，反应条件包括筛选潜在调节物(例如筛选至少100个潜在调节物、至少1000个潜在调节物或至少10,000个潜在调节物)。
在另一个实施方案中，第一种细胞类型为自我更新的干细胞。
本发明使用细胞单元。这样的单元可为单细胞，但最好为两个或更多细胞的集落，细胞集落的排列形式使它们甚至在传代培养程序中也抗分离。例如，细胞可在固体基质如珠子上培养，如下文更详细的描述。在本发明中，细胞单元可在通过将多种物质序贯加入培养基中触发的分化过程的任何阶段分离。因此，本发明提供一种确定多种培养条件对如上所述的细胞的作用的方法，其中部分分化的细胞单元随后分离，并将其用于所述鉴定调节物对细胞信号转导途径的作用的方法。
通常使用的细胞单元为微载体，其小得能以液相转移入HTS筛选系统，而细胞单元没有显著分离。该系统极大地促进了筛选的分化细胞的产量，还有利于HTS测定的建立。具体地说，其还允许将细胞用于HTS，没有任何先前的细胞破裂，例如通过蛋白水解消化，以允许将细胞由一个容器转移至另一个容器，这是有利的，因为这些过程可以影响细胞的即时分化状态或下游分化能力。此外，其允许使用机器人系统自动化转移细胞。
因此，在筛选前使用细胞单元(例如在微载体上培养的细胞单元)制备细胞物质的重要优势在于，其保留了在制备过程中产生的细胞巢，该细胞巢对下游分化筛选可能很重要。如果以常规方式制备细胞物质，并破裂以分散入各孔中，则所述巢应破裂。另一方面，如果细胞物质被制备用于在单独的孔中筛选，则在制备中产生的孔间差异会使药物筛选难以解释。
有利的是，在某些应用中可标记细胞单元。标记允许细胞已暴露的以下培养条件；因此，任何给定细胞单元都可以具有其标记读数，以便确定其如何来源于起始细胞群或培养物。标记可采用多种形式，包括核酸标记、射频编码标记、微球体标记、条形码标记和在基质或表面的空间编码细胞单元。
标记可选自病毒、寡核苷酸、肽、荧光化合物、仲胺、卤代烃、稳定同位素的混合物、条形码、光学标记、珠子、量子点和射频编码标记。甚至可选择该类别两个或更多个标记，并组合用于标记细胞单元，例如含有荧光化合物和/或量子点的珠。标记和用于细胞单元的特异性标记进一步论述于我们的共同未决的申请GB01517382.8，该文献在此引入作为参考。
细胞可以细胞单元培养，每个细胞单元都含有一种或多种细胞。在另一个实施方案中，细胞单元为单个细胞。细胞单元可含有一种或多种粘附至固体基质或由固体基质结合的细胞。在又一个实施方案中，固体基质为微载体或珠子。在又一个实施方案中，固体基质为孔或可穿透介质的屏障物。培养条件可为细胞接触的介质。所述介质可含有一种或多种影响细胞过程的特异性物质。
在一个实施方案中，反应条件包括任何物理或化学介质，其中分离并操作细胞，但适宜地反应条件为细胞暴露的培养条件。培养条件包括生长介质、温度方案、底物、大气条件、物理细胞操作等。生长介质包括滋养和影响细胞的天然和合成物质，包括但不限于基础介质、生长因子、营养物、缓冲物质、化学品、药物等。反应条件甚至可包括细胞信号转导途径的潜在调节物的筛选。
本发明可用于监测在任何发育阶段的第一种细胞类型的分化，但发明人认识到，由于多潜能和有治疗潜能的干细胞相对易于培养，所以所述干细胞可能尤其适合作为第一种细胞类型。因此，在一个实施方案中，本发明提供如上所述的方法，其中第一种细胞类型为沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞的细胞。
在一个实施方案中，细胞类型为原初细胞、细胞系或肿瘤衍生细胞系。细胞类型的来源组织可选自：脑、心脏、肝脏、肺、毛发、眼、肠、血液、耳、肾脏、皮肤、牙齿、胰腺、肌肉、骨和血管系统。
在另一个实施方案中，提供部分分化的细胞类型或祖细胞类型的用途。所述细胞类型可使用确定培养条件对分化的作用的方法分离自生物体或产生自多潜能细胞；并进一步经受鉴定调节物对影响分化的细胞信号转导途径的作用的方法。鉴定调节物对影响分化的细胞信号转导途径的作用的方法可包括使用制药公司常用的药物发现技术筛选潜在调节物(Reinventing Drug Discovery，Executive Briefing，Accenture，1997；High Performance Drug Discovery，Executive Briefing，Accenture，2001)。
在另一个实施方案中，提供使祖细胞或部分分化的细胞接触潜在调节物并随后监测调节物对分化过程的作用的方法。在一个实施方案中，潜在调节物为细胞信号转导途径的抑制剂。在另一个实施方案中，潜在调节物为细胞信号转导途径的促进剂。调节物促进或抑制影响分化的细胞信号转导途径的作用可通过适宜的测定来评价，包括但不限于监测表型、报告基因表达、基因型、分子产生、存活力、代谢改变或细胞的增殖能力。
本发明提供由发育中的胚胎和胎儿或实际上成体的组织获得祖细胞或部分分化细胞的方法。因为组织经过胎儿和成体阶段发育，所以它们发展出在发育能力方面逐渐受限的干细胞，最终变成成年干细胞。因此，在生物体发育的任何时刻，都可以将祖细胞从组织切离，例如从动物胎畜或从选择性流产之后立即获得的人类胎儿切离祖细胞。例如，包含产多巴胺细胞的前体的细胞可分离自胎儿的发育中枢神经系统的特定区域。因为来源于胎儿物质的细胞是稀少的，所以可能必需扩增这些细胞。在此情况下，有可能通过例如使用癌基因如c-myc转化这些细胞进行扩增，而不影响它们的分化状态。适宜地，转化是可逆的并且不会导致祖细胞分化。本发明认识到，胎儿或成年干细胞材料可能需要进一步分化，以便产生祖细胞，这可以通过以下公开的其它干细胞如ES细胞的方法来实现。
通过确定分化方案和部分实施此方案，本发明还提供由多潜能细胞系(包括但不限于胚胎干细胞系)获得祖细胞或部分分化细胞的方法。在此情况下，获得的细胞群含有一种或多种祖细胞：不需要知道群体中祖细胞的细胞比例，也不能鉴定此比例，但是，它们的存在可由以下事实推断：如果结束所述分化方案(而不是被停滞)，则完全分化的细胞应由这些祖细胞产生。
分化方案通常包括对细胞实施一系列临时指定的适宜培养条件。可使用此系列细胞培养方法，诱导产生祖细胞的细胞沿着期望的发育途径分化。通过中断或改变适宜的培养条件系列，细胞可停滞在该分化过程的任何阶段，因此获得祖细胞。例如，如果将ES细胞分化为巨噬细胞需要含有系列的5个细胞培养步骤的10天分化方案，则完全实施该系列中的仅3个步骤将导致ES细胞沿着该谱系部分分化，并允许分离巨噬细胞祖细胞。
用于鉴定多个培养条件的所述方法允许在多重高通量测定中测试数千或数百万细胞培养条件和试剂，以确定实现细胞分化所必需的条件。
在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定如前所述的细胞信号转导调节物的方法，其中通过调节细胞信号转导和/或在细胞中表达一种或多种基因使第一种细胞分化为第二种细胞类型。
细胞信号转导和/或细胞中的基因表达可如下调节：例如加入生物分子，例如各种因子、生长因子、成形素、激素、受体激动剂和拮抗剂、脂质、抗体、药物等；或者加入合成药物、化学品、小分子等。适宜地，组合加入以上调节物，例如得自细胞提取物的调节物、得自共培养物的调节物、在动物血清中的调节物或在体外制备的混合物。
细胞信号转导和/或基因表达还可以如下调节：将基因转染或转移入细胞中，使得其以瞬时的、配体诱导的或永久的方式表达或过表达。或者，可改变内源基因表达，例如通过靶向的增强物插入或给予引起基因表达增加或降低的外源物质。而且，基因产物自身可以给予细胞，或者由细胞消除其活性，以实现相同结果。能够降低基因表达的调节物包括干扰RNA或反义化合物，而能够降低蛋白活性的调节物包括药物、抗体、适体等。
一方面，通过观测细胞表型或者检测细胞中一种或多种基因的表达的调节监测细胞分化，由此确定所述细胞的分化状态。表型确定可通过多种技术实施，例如在显微镜下目检细胞单元，或者使用高内容物筛选和分析设备(参见Cellomics Inc；www.cellomics.com)。或者，通过观测分化细胞的标记产物特征可检测分化。此标记可以为内源标记，例如特定DNA或RNA序列，或者可通过配体、酶底物转化检测的细胞蛋白，或者识别特定表型标记的抗体。分化标记也可以是外源的，即通过例如转染或病毒转导已被导入到细胞群中的标记。外源标记的实例为荧光蛋白(例如GFP)，或一般在特定细胞谱系中不表达或为表位修饰的或来自不同种属的细胞表面抗原。与转录控制元件结合的转基因或外源标记基因可以这样的方式表达：反映指示表型或分化状态的内源基因的代表模式。这可以通过使基因与细胞类型特异性启动子结合或通过将转基因整合入特定基因座(例如参见欧洲专利号EP0695351)而实现。指示分化的标记可通过众多手动和自动化技术检测，包括在显微镜下观察、亲和纯化(‘淘选’)或通过荧光活化的细胞分拣(FACS)。因此，本发明提供监测分化的方法，其中观察一种或多种报告基因的表达调节，其中所述报告基因对应于所述细胞的一种或多种分化状态。
在又一个实施方案中，在基因芯片上监测涉及的基因表达。基因表达可使用由供应商(诸如Affymetrix)广泛获得的基因芯片或阵列技术便利地分析。
更有利的是，用于此分析的基因编码胞外标记，其可通过例如免疫测定来检测。
在本发明的另一个实施方案中，细胞分化通过增殖能力的丧失来监测。
而且，本发明提供培养干细胞、分化来源于体外的干细胞的细胞、粘附至微载体(如珠)的方法。微载体培养物具有明显的优势，包括培养的放大，还根据需要允许干细胞单元暴露于选定的培养条件，以便获得需要的生长和/或分化条件。
潜在调节物可包括有机或无机小分子、天然或衍生化的糖、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、RNA、寡核苷酸或蛋白质-核酸(PNA)。在另一个实施方案中，潜在调节物得自具有药物样特性的小分子文库。
又一方面，提供本文所述方法获得或可获得的细胞信号转导途径的调节物。
另一方面，提供药物组合物，其含有所述调节物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
又一方面，提供部分分化的细胞，其由干细胞在体外分化，并沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞。部分分化的细胞可为神经细胞或造血细胞。部分分化的细胞可为双能细胞。部分分化的细胞可为单能细胞。
又一方面，提供鉴定细胞信号转导途径的调节物(例如再生药物)的方法，该方法包括使用祖细胞。
又一方面，提供鉴定细胞信号转导途径的调节物(例如再生药物)的方法，该方法包括使用部分分化的细胞，所述部分分化的细胞由干细胞在体外分化，并沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞。
又一方面，提供祖细胞在药物筛选测定中用于鉴定细胞信号转导途径调节物(例如再生药物)的用途。
又一方面，提供部分分化的细胞在药物筛选测定中用于鉴定细胞信号转导途径调节物(例如再生药物)的用途，所述部分分化的细胞由干细胞在体外分化，并沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞。
又一方面，提供将胚胎干细胞分化为骨髓谱系祖代的方法，该方法包括使用明胶微载体(例如CultiSpher微载体)。
又一方面，提供明胶微载体(例如CultiSpher微载体)用于将胚胎干细胞分化为造血祖代的用途。
又一方面，提供一种在体外由干细胞生产造血细胞的方法，该方法包括使所述干细胞接触一种或多种、优选两种或更多种反应条件，其中所述反应条件包括使所述干细胞与以下物质温育：(a)视黄酸、二甲基亚砜(DMSO)和/或干细胞因子(SCF)；和(b)胰岛素、干细胞因子(SCF)、TGFβ1、BMP2、BMP4和/或TPO；和(c)IL-3、IL-6、TPO、EPO和/或M-CSF。
在一个实施方案中，干细胞接种在微载体上，例如明胶微载体。
在一个实施方案中，干细胞包含在IMDM基础培养基或Streamline造血扩增培养基中。
在一个实施方案中，在步骤(b)中使用单独的胰岛素。
在一个实施方案中，在步骤(b)中使用SCF、TGFβ1、BMP2和TPO。
在一个实施方案中，在步骤(c)中使用1L-3和IL-6。在另一个实施方案中，还使用TPO、EPO和/或M-CSF。
在一个实施方案中，步骤(a)在第1天进行。
在一个实施方案中，步骤(b)在第4天进行。
在一个实施方案中，步骤(c)在第6天进行。
发明详述
定义
培养条件  本文使用的术语“培养条件”是指为了促进所述细胞的生长或分化而放置细胞或细胞暴露的环境。因此，该术语是指可能影响细胞的生长和/或分化的培养基、温度、大气条件、基质、搅拌条件等。更特别地，该术语是指可掺入培养基中并可以影响细胞的生长和/或分化的特定物质。
细胞  在此所指的细胞被定义为能够独立发挥功能的生物体的最小结构单位，或单细胞的生物体，所述细胞由被半透性的细胞膜或细胞壁包围的一个或多个细胞核、细胞质和多种细胞器组成。细胞可以是原核的、真核的或古细菌的。例如，细胞可以是真核细胞。哺乳动物细胞是适宜的，特别是人细胞。细胞可以是天然的，或者改进的例如通过遗传操作或在培养物中传代而获得所需要的特性。下文更详细地定义干细胞，其是能够产生一个以上的分化细胞类型的全能、多潜能或多能细胞。干细胞可以在体外分化，以产生分化细胞，干细胞本身可以是多能的，或者可以是终末分化的。体外分化的细胞为干细胞已经暴露于一种或多种促进细胞分化的物质而人工产生的细胞。
第一种细胞类型  在一个实施方案中，第一种细胞类型为通过细胞分裂保留了自我更新能力并可以分化为广泛的特化细胞类型的细胞。在另一个实施方案中，第一种细胞类型为相比于祖细胞几乎不分化的细胞。在另一个实施方案中，第一种细胞类型为如下文所述的干细胞。干细胞可以为例如胚胎干细胞或成年干细胞。第一类细胞可分化为第二种细胞类型的某些谱系，然后筛选第二种细胞类型的细胞。因此，在一个实施方案中，使第一种细胞类型暴露(例如序贯暴露)于两种或更多种(例如3种以上、4种以上或5种以上)反应条件，将第一种细胞类型分化为第二种细胞类型。
第二种细胞类型  在一个实施方案中，第二种细胞类型为仅可以分化但再也不能自我更新的细胞。第二种细胞类型在其可变成的细胞种类方面可能比第一种细胞类型更有限。第二种细胞可以比第一种细胞类型更多分化。第二种细胞可以比祖细胞分化程度更高。在一个实施方案中，第二种细胞类型为部分分化的细胞，其由第一种细胞类型在体外分化，并沿着第一类细胞(例如干细胞)和分化细胞类型之间的分化途径停滞。在另一个实施方案中，第二种细胞类型为具有靶细胞表型的细胞。
再生医学或再生药物  术语‘再生药物’指天然或合成的物质，其作用于干细胞或祖细胞，因此能够再生或修复机体的组织或器官。‘再生医学’是指再生药物，或作为医学治疗再生组织或器官的学科。再生医学包括细胞置换疗法，和/或将再生药物给予患者。
祖代‘祖代’或‘祖细胞’是位于更多分化的细胞上游但位于真正的干细胞下游的细胞类型。祖代通常和真正的干细胞一样不能长期自我更新，它们的发育潜力比干细胞的发育潜力更有限。例如，CFU-E和BFU-E是红细胞定型的祖细胞群，而LT-HSC是自我更新和多能造血干细胞，ES细胞是自我更新和多潜能干细胞。分化的红细胞可来源于CFU-E，CFU-E又可来源于LT-HSC，LT-HSC又可来源于ES细胞。
细胞信号转导  术语“细胞信号转导”指分子机制，细胞借助此机制检测和响应于外部刺激，并传送信息至其它细胞。因此，细胞信号转导包括转录和翻译控制和机制以及信号转导机制。
调节物  术语“调节物”指可改变细胞状态的任何因子，其将细胞由一种状态改变为另一种状态。在本发明范围内，其指细胞信号转导过程的调节。调节物可抑制或促进特定细胞信号转导途径。它们可采取天然产物或化学合成分子的形式：例如有机或无机小分子、天然或衍生化糖、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、RNA、寡核苷酸或蛋白质-核酸(PNA)。调节物还包括激动剂或拮抗剂。为抑制物的调节物包括但不限于：非特异性的、不可逆的、可逆的-竞争性的和非竞争性的抑制剂。促进细胞信号转导的调节物刺激或增强特定分子途径对细胞的作用，包括但不限于：激动剂、激动剂模拟物、辅因子、启动子等。
扩增 “扩增”指细胞体积或细胞数、细胞组分或细胞过程的程度和数量增加的过程。具体地说，扩增指增加细胞培养系统中的细胞数量的过程，这可以通过增加系统中细胞的增殖率或存活率发生。
化合物  本文使用的术语“化合物”指的是本领域的通常意义的化合物。术语化合物以其最广义使用，即以固定比例包含两种或更多种元素的物质，包括分子和超分子复合物。该定义包括组成大部分药物的小分子(通常＜500道尔顿)。然而，该定义还包括较大分子，包括聚合物，例如多肽、核酸和糖，以及其超分子复合物。
高通量筛选  术语“高通量筛选”是指以基于靶或基于细胞的平行测定对化合物进行的大规模的反复试验评价。
化合物文库“化合物文库”是一组各异的化合物，其可用于在药物发现过程中鉴定新的领先候选物。化合物文库可通过本领域已知的任何方法产生，包括组合化学、化合物进化，或者购自商业来源，例如Sigma Aldrich、Discovery Partners International、Maybridge和Tripos。库有利地包含至少102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011种或以上的不同化合物，它们在结构或功能上可能是相关的或不相关的。
调节  术语调节用于表示待调节的参数的增加和/或降低。因此，基因表达的调节包括增加基因表达或降低基因表达这二者。
细胞过程  细胞过程是任何胞内或胞外发生或观察到的或者可归于细胞的特性、功能、过程、事件、起因或效应。细胞过程的实例包括但不限于：存活力、衰老、死亡、多潜能性、形态学、信号转导、结合、识别、分子产生或破坏(降解)、突变、蛋白折叠、转录、翻译、催化作用、突触传递、囊泡转运、细胞器功能、细胞周期、代谢、增殖、分裂、分化、表型、基因型、基因表达或这些过程的控制。
细胞单元  一群细胞，其可以是一种细胞的群体。可以分拣、重分和处理细胞单元的汇合，而基本上不解离细胞单元本身，使得细胞单元表现为细胞集落，并且在该细胞单元中的各个细胞均暴露于相同的培养条件。例如，细胞单元可包括附着细胞群体的珠子。
全能性   全能细胞是存在于生物体中的、具有分化成为任何类型的体细胞或生殖细胞的潜力的细胞.因此，可以通过某些方法从全能细胞得到任何所需要的细胞。
多潜能性或多能性  多潜能或多能的细胞是可分化成一种以上但可能不是所有的细胞类型的细胞。
标记  如在此所使用的标记或标记物是鉴定细胞单元和/或确定细胞单元暴露的培养条件或培养条件顺序的方式。因此，标记可以是各自在特定培养步骤加入的一组标记；或在试验开始时或实验中加入的标记，其根据细胞单元暴露的培养步骤修改或在培养步骤当中追踪；或只是定位参考，其容许推导所使用的培养步骤。标记或标记物也可以是在任一时刻报告或记录细胞单元的位置或身份或者将独特的标识物指派给细胞单元的装置。标记或标记物的实例是独特序列、结构或质量的分子；或荧光分子或诸如珠子的物体；或射频和其它转发器；或具有独特标记或颜色或形状的物体。
暴露于培养条件  当细胞处于与培养基接触的情况或在影响一种或多种细胞过程(例如细胞的生长、分化或代谢状态)的条件下生长时，该细胞暴露于培养条件。因此，如果培养条件包括在培养基中培养细胞，则将细胞置于培养基中足够的时段以使它具有某种作用。同样，如果该条件是温度条件，则在所需要的温度培养细胞。
汇合  一个或多个细胞单元群的汇合包括混合群体，以产生单个的群体或汇合，其包括一种以上背景的细胞单元，即所述细胞单元已经暴露于一组以上的不同培养条件。可以随机或非随机地将汇合进一步地再分为群体；这些群体自身不是用于本文目的的“汇合”，而是可以通过组合例如在暴露于不同组别的培养条件后自身汇合。
增殖  细胞生长和细胞增殖在本文可互换使用，表示细胞数目倍增而不是分化成不同的细胞类型或谱系。换言之，该术语表示活细胞数目的增加。在一个实施方案中，增殖不伴有表型或基因型的明显变化。
分化  细胞分化是从某种细胞类型发育为不同细胞类型。例如，双能、多潜能或全能细胞可以分化成为神经细胞。分化可以伴随有增殖，或者在其中可以是独立的。术语‘分化’一般指从较少发育性限定的细胞类型获得成熟细胞类型的表型，例如神经元或淋巴细胞，但是不排除转分化，由此一种成熟细胞类型可能转化成另一种成熟细胞类型，例如神经元转化为淋巴细胞。在本申请中，采用‘分化’来表示‘去分化’，反之亦然。通常，‘去分化’是指从较多发育性限定的细胞类型获得不太成熟的细胞类型的表型，例如肌细胞变为肌原性前体。去分化可继之以进一步分化，以回复原始细胞类型或者其它细胞类型[Ding和Shultz(2004)Nature Biotechnology 22：833-840以及其中的参考文献]。
分化状态  细胞的分化状态是细胞已沿着特定途径或谱系分化的水平。
细胞过程的状态  细胞过程的状态是指发生还是不发生细胞过程，而在复杂的细胞过程中，可表示该细胞过程中的特定步骤或阶段。例如，细胞中的细胞分化途径可以是非活化的，或者可以是已被诱导的，并可以包括许多不连续的步骤或组成部分，例如以存在一组特征性的酶或中间体为特征的信号转导事件。
基因  基因是编码为多肽或RNA基因产物的基因产物的核酸。本文使用的基因至少包括编码基因产物的编码序列；它可以任选地包括一个或多个为编码序列的转录和/或翻译所必需的调节区域。
基因产物  基因产物通常是由基因以常规的方式编码的蛋白质。但是，该术语也包括由基因编码的非多肽基因产物，例如核糖核酸。
核酸合成  可以根据任何可利用的技术合成核酸。在一个实施方案中，核酸合成是自动化的。此外，可以通过生物复制产生核酸，例如通过在细菌或真核细胞中根据本领域已知的方法克隆和复制。
差异表达  可通过例如基因陈列的基因表达分析，通过本领域已知的方法，鉴定响应于细胞培养条件而在不同水平表达的基因。相对于总的基因表达水平，差异表达的基因在测试条件下于细胞中表现出的mRNA或基因产物的量多于或少于替代条件下的量。
转染  可以通过任何适当的方式将基因转染到细胞中。该术语在本文用于表示常规的转染，例如使用磷酸钙进行的转染，而且包括将核酸转移到细胞中的其它技术，包括转化、病毒转导、电穿孔等。
基于细胞的测定
基于细胞的测定是现代生物医学科学的重要组成部分，包括涉及其中使用细胞的步骤的任何测定。基于细胞的测定可跨越药物发现和开发过程的几乎所有阶段使用，并对提供有关化合物可能怎样在生物系统中相互作用的信息有价值，而不仅仅是有关其如何与分离的潜在药物靶相互作用的信息。
例如，基于细胞的测定可用于鉴定和验证潜在的药物靶。已开发了基于细胞的测定，其可用于鉴定涉及疾病过程的基因或细胞途径，确定靶基因功能，或测量在活化某些基因或其产物时可诱导的表型变化。
基于细胞的测定还可以用于针对领先化合物发现、选择和优化的药物发现。与经常被用于传统高通量筛选测定的生物化学测定不同的是，基于细胞的测定可提供关于药物特性(例如吸收性、渗透性、选择性、特异性和代谢)的信息。因此，在基于细胞的筛选后选择的领先化合物被更好地表征，更有可能提供有价值的领先化合物，并且基本没有可能在药物发现过程的后继阶段中被除去。
基于细胞的测定的主要应用是在毒性筛选中。药物发现和开发的决定性部分是药物候选物的筛选，以除去将产生副作用的化合物。然而，现在的方法大多是不够的，特别是利用动物模型进行毒性筛选是昂贵且费时的。此外，动物模型可能不可靠，因为这些模型中的结果不总是准确预测化合物在人类中将如何表现。因此基于人细胞的筛选是适宜的。
筛选测定和HTS
本发明可使用高通量筛选(HTS)，以便筛选新的药物靶。药学研究活动的重点已转向有目的的发现新化学物质类别和新分子靶。重点的这种改变以及适时的技术突破(例如分子生物学、实验室自动化、组合化学)产生了高通量筛选(或HTS)，目前其在整个生物制药工业中广泛应用。
高通量筛选包括几个步骤：建立预示特定生理响应的测定；自动化该测定，使得其可以重复地多次执行；以及随后由化学物质文库测试样品，以鉴定能够“命中”该测定的化学结构，提示这些结构可能能够激起预期的生理反应。在多个次级测定中追踪高通量筛选的命中结果，以消除人为结果，尤其是毒性化合物。因此，拟将用于高通量筛选的测定用于检测具有特异性生物或生物化学特性的化学样品(例如化合物、物质、分子)的存在情况。对这些特性进行选择，以鉴定在体内施用时具有激发特异性生物反应潜力的化合物。高通量筛选既鉴定自身可用作药物的物质，也鉴定将最终用作药物的药物候选物。然后，在高通量测定中被发现具有一定水平的需要生物特性的某些化学物质类别的化合物可作为衍生化合物的合成基础。基于细胞的测定利用完整的培养细胞。此测定的实例包括萤光素酶报告基因测定和钙流测定。
如本发明所述，实施适于鉴定分化调节物和再生药物的基于细胞的测定的特别强的方法是通过监测分化的遗传标记确定祖细胞的分化状态。标记可为内源的，例如表达的核苷酸序列或蛋白质，其特异性存在于分化细胞类型中，但不在其祖代中，在用于筛选的细胞群中也不存在任何其它细胞。标记还可以为外源标记(即报告基因)，其被导入到用于筛选的细胞群中，导入方式使得其在分化细胞类型中特异性表达，但在其祖代中不表达，在用于筛选的细胞群中也不存在任何其它细胞的表达。外源标记的实例为酶，例如Lac Z，或者为非酶性标记，例如荧光蛋白(例如GFP、YFP等)，或者为细胞表面抗原，其在特定细胞谱系中一般不表达或者为表位修饰或者来自不同种属。与转录控制元件结合的转基因或外源标记基因的表达方式可以反映代表内源基因的模式。这可以如下实现：使基因与细胞类型特异性启动子的元件结合，或者通过将转基因整合入以细胞类型特异性方式表达的特定基因座(例如参见欧洲专利号EP 0695351)。
在一个实施方案中，修饰在本发明中用作起始物质的未分化细胞类型，以表达两种标记/报告体(例如GFP和YFP这二者)，使得一个标记指示提交至HTS过程祖细胞类型的存在，另一个标记指示通过加入适宜的调节物产生分化细胞类型的存在。
许多适宜的报告基因系统和细胞筛选测定，包括双报告体系统，公开于Hill等[Current Opinion in Pharmacology(2001)1：526-532]和Blake[Current Opinion in Pharmacology(2001)1：533-539]的综述(以及其中的参考文献)，所有这些文献都整体在此引入作为参考。
祖细胞
祖细胞是通过分化和增殖具有产生完全分化的功能性后代能力的任何体细胞。祖细胞包括任何组织或器官系统的祖代，包括但不限于血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨、肾脏、肝脏、胰腺、胸腺等。
祖细胞可以与分化细胞(即可具有或不具有增殖(即自我复制)能力但不能在正常生理条件下进一步分化为不同细胞类型的那些细胞)区分开来。祖细胞还可以与异常细胞(例如癌细胞，尤其是白血病细胞)区分开来，异常细胞增殖(自我复制)，但一般不进一步分化，尽管看起来是不成熟的或未分化的。
祖细胞包括分化和增殖谱系中最大分化的或完全成熟的细胞之前的所有细胞。
按照本发明的一个实施方案，指出‘干细胞’和‘祖细胞’之间的差别。干细胞通常为多潜能和多能的，可产生众多谱系。祖细胞，尤其是谱系定型的祖细胞，仅能够产生单一谱系的细胞。因此，祖代的发育潜能通常比干细胞的发育潜能更受限。干细胞和祖代细胞之间的第二个主要差异在于，干细胞在它们可无限分裂的合适培养条件下能够显著扩增，而祖细胞具有有限的增殖能力。这些差异意味着，例如有可能使用造血干细胞而不是造血祖细胞重建动物的造血系统。
作为实例，成熟的功能性红细胞的生产由“单能祖代”的增殖和分化引起，单能祖代即为那些能够产生仅一类血细胞的祖代。业已表征了多种其它造血祖代(HPC)。
HPC由许多亚类组成，包括多潜能干细胞、淋巴干细胞、CFU-GEMM集落形成的单位粒细胞、类红细胞、巨噬细胞或巨核细胞、BFU-E、CFU-E、CFU-Meg、CFU-GM集落形成的单位粒细胞或巨噬细胞、CFU-EoS集落形成的单位嗜酸性细胞、B祖细胞和T祖细胞。
干细胞
干细胞详述于Stem Cells： Scientific Progress and Future ResearchDirections，Department of Health and Human Services.2001年6月，http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。报告的内容在此引入作为参考。
干细胞是能够分化形成至少一种和有时形成多种特化细胞类型的细胞。可从干细胞形成的不同细胞的库被认为是完全的；即它包括组成生物体的所有不同的细胞类型。从干细胞相对充足的早期胚胎到它们相对稀少的成体，干细胞存在于生物体的终生。存在于成体动物的许多组织中的干细胞对正常的组织修复和稳态很重要。
这些细胞的存在提升了它们可提供在体外产生特化功能细胞的方法的可能性，所述特化功能细胞可被移植到人中，并在患病组织中替代死亡细胞或无功能细胞。所述细胞可向疾病提供治疗的名单包括帕金森氏症、糖尿病、脊髓损伤、中风、慢性心脏病、晚期肾病、肝衰竭和癌症。为了使细胞代替治疗成为可行的，在干细胞研究中需要许多重大突破，包括干细胞生长的改良、干细胞分化和干细胞免疫排斥的避免。
为此，考虑了开发干细胞用于治疗的替代方法。如本文所述，公开了用于发现化合物的方法，所述化合物可被开发成使内源干细胞转化为再生机体组织的药物(例如再生药物)。
干细胞的类型
关于什么构成干细胞仍有相当多的争论，然而，就本论述目的而言，关键特征是分化成不同细胞类型的能力。任选的特征是自我更新的能力，在某些情况下不确定地允许扩增细胞数。下文给出了干细胞的实例。
不同的干细胞具有形成多种细胞类型的不同潜能：精子发生干细胞是单潜能的，因为它们天然地仅产生精子，而造血干细胞是多能的，胚胎干细胞被认为能够产生所有的细胞类型，是全能性的或多潜能的。
迄今为止已经分离了3种类型的哺乳动物多潜能干细胞。这些细胞能够产生通常来源于胚胎的全部3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞类型。干细胞的3种类型是：来源于睾丸肿瘤的胚胎性癌(EC)细胞；来源于胚胎植入前(通常为胚囊)的胚胎干(ES)细胞；以及来源于胚胎植入后(通常肯定会成为生殖腺部分的胎儿细胞)的胚胎生殖(EG)细胞。恰好因为它们是多潜能的，所以这些细胞在指导分化的作用中受到特别的关注。
干细胞也存在于成年生物体中。成年干细胞是存在于分化(特化)组织中、自我更新并能够分化产生更特化细胞的未分化细胞。最近已经表明成年干细胞具有可塑性，即它们能够分化产生其驻留组织非特有的细胞类型，这些细胞类型实际上也不是该组织起源的胚层特有的。例如，已经表明血液干细胞(来源于中胚层)能够分化成为神经元(通常来源于外胚层)。Toma等(2001，Nature Cell Biol.3，778-784页)最近已经描述了来源于皮肤真皮的新型干细胞的鉴定和分离。这些干细胞被定义为皮肤衍生的前体(SKP)细胞。可通过在聚赖氨酸上培养和变化培养基中的血清浓度诱导SKP细胞分化。当没有血清时，它们分化成为神经元和胶质细胞；加入3％血清它们分化成为平滑肌细胞；增加血清至10％导致SKP细胞分化成为脂肪细胞。迄今为止已经报道成年干细胞存在于诸如神经系统、骨髓和血液、肝脏、骨骼肌、皮肤和消化系统的各种组织中。
如本文所述，除成年干细胞之外，还存在许多类型的祖细胞或前体细胞。这些细胞的分化潜能部分受限，并且可能存在于机体的所有组织中，它们能够分化，但是与干细胞的不同在于，它们的所有组成成分不是如此广泛，并且根据定义它们不能自我更新。
最近的证据甚至提示，分化的细胞类型能够改变表型。此现象被定义为转分化，是一种分化细胞类型在有或没有介入细胞分裂的情况下转化为另一种细胞类型。先前普遍接受的是终末分化状态是固定的，但是现在明白有时候分化可被逆转或改变。现在可用诱导细胞系以便转分化的体外方法(参见Shen，Slack和Tosh，2000，Nature CellBiol.，第2卷，879-887页；Horb等，2003，Current Biol.，第13卷，105-115页)。最后，已经报道了可去分化而产生具有潜能分化为其它细胞类型的干细胞样细胞的特化细胞类型。
干细胞的生长和分化
干细胞的重要特性是它们在培养中对称分裂产生2个子细胞的能力，所述子细胞是源自干细胞的精确拷贝。这容许干细胞在培养中以其未分化状态扩增，产生足够用于筛选用途、生物研究乃至细胞治疗的物质。可以理解的是，干细胞实现上述目的的的途径成为深入研究的目标，然而对于促进干细胞自我更新的因知之甚少。通常，多潜能干细胞系保持在无有丝分裂活性的成纤维细胞滋养层上，或由这些细胞条件化的培养基中。假定饲养细胞除去/中和培养基中的一些未知因子，和/或它们提供抑制干细胞分化和促进干细胞自我更新的因子。一种这样的因子是白血病抑制因子(LIF)，其是与IL-6相关的细胞因子家族成员，在没有饲养细胞时能够促进小鼠ES细胞自我更新。在缺乏饲养细胞(和/或LIF)时生长的干细胞经常自发地和不规则地分化，产生分化细胞类型的混合物。最近，已经产生能够在无饲养层培养中和在限定条件下生长的ES细胞系。
影响干细胞自我更新的因子可为刺激性或抑制性的，并且可以在胞外或胞内发挥作用。就分泌因子LIF来说，已知其胞外受体为gp130，而且该蛋白质的活化足以抑制鼠ES细胞分化。在该细胞中，gp130的关键性下游效应物是信号转导和转录激活因子-3(STAT-3)。另一个对保持干细胞多潜能性特别重要的分子是转录因子Oct-4，其在被人工下调时导致小鼠ES细胞中多潜能性状态丧失。还阐明了天然抑制ES细胞自我更新的其它信号转导分子，例如有丝分裂原活化蛋白激酶。干细胞研究的主要目的是发现天然的和合成的因子、药物、多肽、基因、寡核苷酸、组织培养基和条件、特定条件化培养基、饲养细胞以及对促进多种类型的干细胞的扩展和保持其分化潜能有作用的其它刺激。这包括成年干细胞，其目前在细胞培养中没有可感知的扩增。
干细胞研究的第二大挑战是指导干细胞向特定细胞类型的分化，所述特定细胞类型为功能性的、可替代在多种疾病状态中损失的细胞以及产生积极的临床结果。诱导干细胞开始分化实际上是一个相当简单的过程。例如，从饲养培养物移出并在附着基质上生长至汇合的ES细胞将开始自发分化。类似地，从饲养培养物移出并在非附着基质上生长的ES细胞将形成胚状体-来自全部3个胚层的未分化细胞和部分分化细胞的簇。随后可分离这些细胞，接种为单层培养物，并接触促进定向分化的因子。与包括许多不同细胞类型的混合物的分化细胞的胚状体或未处理的培养物相比，接触这些因子的培养物更有可能被较少的分化细胞类型定居。尽管如此，迄今为止已设计了即便有也是极少数的产生大致纯的分化细胞培养物的条件。此外，还不清楚设计用于干细胞分化的任何方案是否产生适于细胞置换治疗的细胞-可能所述细胞不能终末分化为需要的准确表型，或者分化细胞在体内不再有生存力。
已用于诱导干细胞定向分化的因子包括：视黄酸、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白质(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、活化素-A、转化生长因子β-1(TFGβ-1)、肝细胞生长因子、神经生长因子、音猬因子(sonic hedgehog，SHH)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、维生素D3、地塞米松、β-巯基乙醇、丁基化羟基苯甲醚、5-氮杂胞苷、DMSO、胰岛素、甲状腺激素(T3)、LIF、胎牛血清、血管内皮生长因子(VEGF)、青灰因子、氧浓度改变、抗坏血酸、β-磷酸甘油、烟酰胺、血小板衍生生长因子(PDGF)、cAMP、多种细胞粘附分子和底物等。除这些限定因子外，未限定的提取物，例如条件培养基、人和动物组织匀浆物或植物提取物，有可能可以用于指导干细胞分化。这些未限定提取物的渐进性分级分离可以产生活性部分乃至具有高效力的纯组分。可将这些因子单独或组合或以对实验结果至关重要的限定顺序加入用于特定实验的生长培养基。
已设计用于体外干细胞分化的许多系统是复杂的多步程序，其中多种步骤的准确特征以及多种步骤的时序是重要的。例如，Lee等(2000，Nature Biotechnology，第18卷，675-679页)使用5步方案从小鼠ES细胞衍生出多巴胺能神经元：1)使未分化的ES细胞在涂有明胶的组织培养表面上存在LIF的ES细胞培养基中扩增；2)在ES细胞培养基中悬浮培养4天产生胚状体；3)由在组织培养表面上接种后8天的ITSFn培养基中的胚状体选择巢蛋白阳性细胞；4)在含有bFGF/层粘蛋白的N2培养基中扩增巢蛋白阳性细胞达6天；5)最后通过从含有层粘蛋白的N2培养基取出bFGF诱导扩增的神经元前体细胞分化。
在连续细胞培养的第二个实施例中，Bonner-Weir等[Proc.Natl.Acad.Sci.(2000)97：7999-8004]如下由人胰腺导管细胞衍生出产胰岛素的细胞：1)在存在血清2-4天的情况下，根据在固体表面上选择性粘附选择覆盖胰岛细胞的导管细胞；2)随后取出血清，并加入角质细胞生长因子达5-10天，以选择覆盖成纤维细胞的导管上皮细胞；以及3)用胞外基质制品‘Matrigel’覆盖细胞3-6周。
在连续细胞培养的另一个实施例中，Lumelsky等[Science(2001)292：1389-1394]如下通过定向分化小鼠胚胎干(ES)细胞衍生出分泌胰岛素的细胞：1)在存在LIF时扩增ES细胞2-3天；2)在没有LIF超过4天时产生胚状体；3)利用ITSFn培养基选择巢蛋白阳性细胞6-7天；4)在含有B27培养基添加剂和bFGF的N2培养基中扩增胰腺内分泌前体达6天；以及5)通过取出bFGF并加入烟酰胺诱导分化为分泌胰岛素的细胞。
然而，不只是多个步骤的顺序和持续时间或不同因子的加入系列对于决定细胞分化是重要的。因为胚胎发育受赋予定位信息的信号转导因子的梯度作用调节，所以预期单个信号转导因子的浓度以及两种或更多种因子的相对浓度对确定体外和体内细胞群的命运将是重要的。因子浓度在发育期间发生变化，干细胞对于相同分子的不同浓度产生不同应答。例如，从晚期胚胎的CNS分离的干细胞对不同浓度的EGF产生不同应答：低浓度EGF产生增殖信号，而较高浓度的EGF导致增殖和分化为星形胶质细胞。
已经发现在体外影响干细胞的自我更新和分化的许多因子是天然存在的分子。这是可以预期的，因为分化被沿着信号转导途径起作用的信号转导分子和受体诱导和控制。然而，出于相同原因，很可能许多合成化合物对干细胞分化有影响。常规合成这类具有与发信号和信号转导途径内的细胞靶(所谓的药物靶)相互作用的高可能性的合成化合物，例如用于医药公司的药物筛选。一旦知晓，这些化合物就可以用于引导干细胞离体分化，或者可体内给药，在此情况下它们会用于患者靶器官中的定居干细胞。
组织培养中的常见变化
在开发用于成功培养特定细胞类型的条件时，或为了实现或调节细胞过程，考虑多种因素通常是很重要的。
一个重要因素为决定是悬浮增殖细胞还是作为附着于基质的单层增殖细胞。大多数细胞优选附着于基质，尽管某些细胞可悬浮增殖，包括转化细胞、造血细胞和来自腹水的细胞。
假定培养物属于贴壁细胞，则一个重要因素是选择粘附基质。大多数实验室使用一次性塑料作为组织培养用基质。已经使用的塑料包括聚苯乙烯(最常见的类型)、聚乙烯、聚碳酸酯、珀斯佩、PVC、特氟隆、玻璃纸和醋酸纤维素。有可能使用任何塑料，但是其中许多塑料需要处理，以使它们可润湿并适于细胞附着。此外，非常有可能使用任何适当制备的固体基质为细胞提供支持，迄今为止已使用的基质包括玻璃(例如硼硅酸铝玻璃和钠钙玻璃)、橡胶、合成纤维、聚合葡聚糖、金属(例如不锈钢和钛)等。
一些细胞类型，例如支气管上皮细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞和神经元，需要涂有生物制品的生长基质，通常为胞外基质材料，例如纤连蛋白、胶原、层粘蛋白、多熔素等。生长基质和应用方法(湿或干被覆或凝胶化)可对诸如细胞的生长和分化特性的细胞过程有影响，而这些影响必须如上所述凭经验确定。
在细胞培养中可能明显最重要的变化因素是培养基和补充物如血清的选择。这些为细胞生长提供了水性区室连同营养物和多种因子，其中一些已在上文列出，其它的极少限定。这些因子中有一些对粘附必不可少，另一些对传递信息必不可少(例如激素、有丝分裂原、细胞因子)，另一些为解毒物。通常使用的培养基包括RPMI 1640、MEM/Hank′s盐、MEM/Earle′s盐、F12、DMEM/F12、L15、MCDB 153等。多种培养基就其成分而言具有很大差异，一些常见的差异包括碳酸氢钠浓度、二价离子如Ca和Mg的浓度、缓冲液组成、抗生素、微量元素、核苷、多肽、合成化合物、药物等。众所周知，不同的培养基是选择性的，意味着它们只促进某些细胞类型的生长。培养基补充物，例如血清、脑垂体提取物和其它提取物，经常是培养物中的细胞生长必需的，此外经常负责决定培养细胞的表型，即它们能够决定细胞生存或引导分化。补充物在例如分化的细胞过程中的作用是复杂的，取决于它们的浓度、它们加入培养物的时间点、细胞类型和所使用的培养基。这些补充物的不确定特性及其影响细胞表型的潜力刺激了无血清培养基的发展。对于所有培养基而言，它们的开发主要通过如上所述的反复试验进行。
组织培养的气相也是重要的，其应使用的组成和体积可取决于所用培养基的类型、需要的缓冲量、培养容器敞开还是密封以及特定的细胞过程是否需要调节。常见变化包括二氧化碳和氧的浓度。
对组织培养重要的其它条件包括选择培养容器、顶部空间容量、接种密度、温度、培养基更换频率、酶处理、振荡或搅拌的速率和模式。
因此，变化细胞培养条件是获得所需细胞过程的方法。本发明的一个方面认识到，以连续方式改变细胞培养条件可能是获得细胞效应的高度有效方法。在多种应用中，例如在细胞分化研究中，需要一系列特定的不同组织培养条件实现细胞过程就经常是正常情况。不同的条件可包括向/从培养基加入或取出或在特定时间点更换培养基。这样的一组条件(实例在下文给出)通常是通过如上所述的反复试验进行开发的。
细胞单元的形成
本发明的一个重要方面是细胞群(细胞集落)能够在多种条件下生长在细胞培养物中，并且当受到干扰以及与其它集落混合时该集落可在多种条件下很大程度上保持其完整性。这种群体或集落在此称为细胞单元。举例来说，使细胞在例如载体的固体基质上作为附着培养物生长可实现细胞单元的形成。如果细胞增殖发生在接种于载体上之后，则子细胞将附着在同一载体上，并构成相同集落的组成部分。一般而言，活的贴壁细胞不容易从其生长基质上解离下来，因此不管对载体进行任何机械操作、搅拌培养基或转移到另一个组织培养系统中，细胞集落的完整性都得以保留。类似地，如果在任一时刻多个载体处于同一容器中(例如合并珠子)，则不存在细胞从一个珠子向另一个珠子的显著转移。
生长细胞在单元或集落中的一个优点是如果将单元连续地置于一组不同的组织培养基中，则集落包含的所有细胞都将按相同顺序和相同时段暴露于相同的系列培养条件。
该方法的另一个优点是能够使组织培养小型化：与甚至最小的组织培养瓶相比，也只需要相对很少的细胞来集落化微载体珠(参见下文)。
自身不一定贴附组织培养容器的单元中的培养细胞具有另外的优势：单个菌落可被随意取出并转移至不同的培养容器。这在本发明中特别重要，因为其允许将含有祖代的分化细胞转移至适于药物筛选的微量滴定板。因此，祖代可大量制备，例如通过先前使用公开于WO2004/031369的技术确定的方法，然后将主要通过液体转移的相同细胞单元转移至HTS平台。这(i)极为有利于HTS程序，(ii)保持可整合的单元的3D(多)细胞组织结构，以进一步分化，(iii)并避免了自身可引起细胞分化的细胞组织结构的任何解离。
在载体上形成的生长细胞单元的又一个优点是可放大细胞培养。干细胞在载体上生长提供了为高通量筛选提供足够材料的放大生产方法。这种细胞培养的放大可能需要至少1g(干重)的微载体，例如10g、50g或以上。
在固体基质上形成细胞单元的另一个重要优点是可通过多种方式标记基质，并因此由于缔合而标记附着细胞。
3mm和5mm的玻璃球已广泛用作细胞粘附基质，特别是在使用玻璃珠生物反应器(例如由Meredos Gmbh制造)放大细胞培养物时。这些珠子一般用于填充床而不是分批培养，以避免对贴壁细胞的机械损伤。尽管这样的基质适于本发明目的，但下述的其它载体甚至可能更适合。
特别是当细胞在较小载体上生长时，它们可被视为悬浮培养物。重要之处在于，在小载体上生长细胞的常见方法被称为微载体细胞培养(参见‘Microcarrier cell culture，Principles and Methods’，版本AA，可从Amersham Biosciences(18-1140-6)获得；在此全部引入作为参考)。微载体培养物在商业上用于在高达4000升的发酵罐中生产抗体和干扰素。可利用多种微载体，其以形状和大小分类，并由不同材料制成。其中由聚苯乙烯(Biosilon，Nunc)、玻璃(Bioglass，Solohill Eng)、胶原(Biospheres，Solohill Eng)、DEAE sephadex(Cytodex-1，Pharmacia)、葡聚糖(Dormacell，Pfeifer & Langen)、纤维素(DE-53，Whatman)、明胶(Gelibead，Hazelton Lab)和DEAE葡聚糖(Microdex，Dextran Prod.)制成的微载体珠是市售可得的。基于珠子的比重、直径和适于细胞生长的表面积这些载体是充分表征的。此外，可利用许多具有极大增加细胞生长用表面积的多孔(微)载体。这些多孔载体的其它特征是它们适合于锚定依赖性细胞以及悬浮细胞的生长，悬浮细胞通过捕获在互连开孔网络中而被携带。多孔载体可用的材料例如为明胶(Cultispher G，Percell)、纤维素(Cytocell，Pharmacia)、聚乙烯(Cytoline 1和2，Pharmacia)、硅橡胶(Immobasil，Ashby Scientific)、胶原(Microsphere，Cellex Biosciences)和玻璃(Siran，Schott Glassware)。这些载体各自适合于搅拌、流化或固定床培养系统。
由于载体的物理性能众所周知，所以很容易计算出用于实验的载体数。所述的一些载体和除此之外的许多载体都可作为干制品使用，所述干制品可准确称重，并随后通过在液体培养基中膨润而制备。此外，可以计算并改变用于接种微载体培养物的细胞数。例如，以每个珠6个细胞接种的Cytodex 3(2g/升)培养物将产生含8百万个微载体的培养物，在所述微载体上4.8×107个细胞/升以5×104个细胞/cm2的密度生长。
如有需要，可通过细胞的酶促分离和/或在适宜的情况下通过消化载体：可通过胰蛋白酶和/或EDTA溶解明胶载体、利用胶原酶溶解胶原载体以及利用葡聚糖酶溶解葡聚糖载体，来收获在微载体上生长的细胞，或从微载体释放标记(参见下文)。
除固体或多孔的微载体之外，细胞还可以通过禁闭来分型，即限制在培养基可渗透的屏障之内。已经开发了膜培养系统，其中可渗透的透析膜保留细胞群体，但是容许培养基及其组成成分在内部和外部区室自由交换。还已经开发了在中空纤维柱中的细胞培养，大量的纤维甚至完整系统都是可商购的(例如来自Amicon，Cellex Biosciences)。还已经开发了在半固体基质中的细胞囊化，其中通过吸附、共价键合、交联或捕获在聚合基质中固定细胞。已使用的材料包括明胶、聚赖氨酸、藻酸盐和琼脂糖。通常的方法是在40℃将5％琼脂糖与在其正常生长培养基中的细胞悬液混合，利用等体积的石蜡油使该混合物乳化，并在冰浴中冷却，产生80-200μm直径的球状体。可从油中分离这些球状体，并转入组织培养容器中的培养基。
细胞截留是用于固定细胞群的简单方法，类似于微载体或多孔基质的应用。一种简单的技术是使细胞陷入纤维素纤维，例如DEAE、TLC、QAE、TEAE(全部都得自Sigma)。其他更复杂的装置是适于悬浮细胞的陶瓷柱芯，如光学(Opticel)培养系统(Cellex Biosciences)中的陶瓷柱芯。
除上述产生细胞单元的方法之外，本领域技术人员还会设想其它建立细胞分型的方法，包括形成细胞的3D培养物，例如神经的球状体或胚状体，或利用组织和实际上完整的生物体，例如果蝇或秀丽线虫。
细胞单元或包括细胞单元的基质可与特定因子结合，所述因子包括但不限于蛋白质、核酸或其它化学品，例如药物。可通过许多途径实现基质的预条件化，例如仅仅通过使基质与目标因子孵育，或通过共价或非共价地使因子附着于基质。可通过浸渗使可溶性因子掺入干燥材料中。此技术依赖于携带可溶性因子的液体快速进入干燥的多孔材料中，其附随地变得溶胀并备用。例如可在形成含有所述因子的纤维蛋白凝块时，将所述因子混合在含凝血酶的纤维蛋白原溶液中而掺入固体因子。除浸渗之外，可设计使因子与细胞群缔合的多种其它方法，将因子连同细胞一起捕获或囊化。
用于使细胞群与许多不同因子缔合的方法是预先形成因子的混合物，其随后与特定细胞群缔合。第二个方法应是以许多因子连续地条件化细胞群。利用细胞群生长基质的干燥制剂作为实例，该方法应包括首先在包含第一因子的溶液中部分溶胀该基质，随后进一步地在包含第二因子的溶液中再溶胀该基质，使两种因子都变成与基质缔合的。通过设计使细胞群与不同因子的不同组合缔合的系统性方法，有可能对任何组合的一组因子对细胞群的作用进行采样。
不考虑用于条件化细胞单元与因子的方法，所述因子被含有该细胞单元的细胞吸收。将渗入生长培养基的因子稀释至这种程度：它们的浓度低于生理学相关限度，并且它们对与它们接触的任何其它细胞群都无作用。在例如部分细胞单元形成的基质之外的因子扩散取决于下列参数，例如材料的特性和大小、平均孔径以及因子的分子量和浓度。必要时校准该过程，可通过物理测定(如HPLC分析或标记因子向培养基的释放)或通过生物测定(如针对神经营养因子的背根神经节长出生物测定)来测量因子释放。
细胞的组合连续培养
本发明还解决了包含多个步骤和物质的细胞培养技术如果不可能通过常规试验确定的话就很困难的问题，在现有技术中常规试验包括反复试验。在复杂的多步骤程序中以经验确定组织培养条件在实践中是不可行的。有利地，可首先使用下文所述方法鉴定分化细胞类型所需要的培养条件。
(a)裂分-汇合细胞培养
裂分-汇合培养允许细胞经历一系列培养条件，并接触培养基中的一系列物质，为系统性和高产方式，详述于WO2004/031369。
在裂分-汇合细胞培养中的第一步是形成细胞单元(特别是显微细胞单元)，因为每个细胞单元均构成了可暴露于各种细胞培养条件的容易处理的单元。为简单起见，在本文讨论中我们假定通过在微载体培养中培养细胞产生细胞分型，而术语细胞单元、细胞群、集落和珠可互换使用。然而，所述方法同样适用于任何细胞单元。用于采样大量细胞培养条件的特别有效的方法被称为组合细胞培养或裂分-汇合细胞培养，在一个实施方案中，包括为了采样多重组合的细胞培养条件而连续重分并组合细胞单元群。在本发明的一个方面，如下实施该方法：将细胞单元的初始起始培养物(或不同的起始培养物)分成X1数目的等分试样，每个等分试样均包含分别在不同的培养条件下生长的多个珠子(群/集落/载体)。在细胞培养给定时间后，可通过组合和混合来自不同等分试样的珠子汇合细胞单元。该汇合可被再次裂分为X2数目的等分试样，每个等分试样在不同条件下培养一段时间，随后再汇合。此裂分、培养和汇合(或汇合、裂分和培养；取决于在何处进入循环)细胞单元的重复步骤容许系统采样许多不同细胞培养条件的组合。实验的复杂性，或换言之待测试的细胞培养条件的不同组合数，等于在每轮采样的不同条件数的乘积(X1×X2×...Xn)。注意，在随后的裂分前汇合所有细胞单元的步骤可以是任选的-其中汇合有限数目的细胞单元的步骤可能具有相同作用。因此，本发明包含许多系统地采样多个细胞培养条件组合的相关方法，在这些方法中，成批地处理细胞单元群。
不管用这种方法采样多种细胞培养条件的确切方式，该方法都是有效的，因为多个细胞单元可共享单个容器，在该容器中它们在相同条件下培养，并且可在任一时刻只利用少量培养容器进行培养(所用培养容器数等于裂分样品数)。在许多方面，该方法的原理类似于大型化学文库的裂分合成(被称为组合化学)，其采样在化学结构单元群之间的所有可能的键组合(参见例如：Combinatorial Chemistry，OxfordUniversity Press(2000)，Hicham Fenniri(编辑))。裂分-汇合细胞培养可重复许多轮，并且可在每一轮中采样任意数目的条件。只要细胞单元数(或在这个实例中为集落化的珠子)大于或等于所有轮次中采样的不同条件数，并且假定细胞单元的裂分完全随机发生，则预期至少有一个细胞单元已按照通过实验采样的多种培养条件组合中的每一种培养。该方法可用于采样针对任何细胞类型的生长或分化条件，或任何细胞类型的生物分子生产(例如促红细胞生成素或干扰素的生产)的效率。因为该方法是重复的，所以理论上它适合于测试多步组织培养程序-例如上述那些与干细胞分化相关的方法。可利用此技术采样的变量包括细胞类型、细胞分型(例如微载体培养、细胞囊化、完整生物体)、生长基质(例如微载体上的纤连蛋白)、细胞培养轮次的持续时间、温度、不同的培养基(包括不同浓度的组成成分)、生长因子、条件培养基、多种细胞类型(例如饲养细胞)的共培养、动物或植物提取物、药物、其它合成化学品、病毒感染(包括转基因病毒)、转基因的添加、反义或抗基因分子(例如RNAi、三链螺旋)的添加、感官输入(就生物体来说)、电、光或红外(red-ox)刺激等。
在一个实施方案中，首先以包含以下步骤的方法鉴定分化第一种细胞类型所需要的培养条件：(a)提供第一组细胞单元群，每个细胞单元含有一个或多个细胞，并使所述群暴露于期望的培养条件；(b)再划分一个或多个所述群，以产生进一步的再一组细胞单元群；(c)使所述进一步的细胞群暴露于另外的期望培养条件；(d)任选地，重复步骤(b)-(c)；和(e)评价给定细胞单元已暴露的培养条件对该细胞单元的作用。
在另一个实施方案中，首先以包含以下步骤的方法鉴定部分或完全分化第一种细胞类型所需要的培养条件：(a)提供第一组细胞单元群，每个细胞单元含有一个或多个细胞，并使所述群暴露于期望的培养条件；(b)汇合两个或更多个所述群，以形成至少一个第二合并群；(c)再划分所述第二合并群，以产生进一步的再一组细胞单元群；(d)使所述进一步的细胞群暴露于期望的培养条件；(e)任选地，重复步骤(b)-(d)；和(f)评价给定细胞单元已暴露的培养条件对该细胞单元的作用。
适宜地，分离部分分化的细胞单元，并用于本文所述方法。
适宜地，标记细胞单元，而标记反映出该细胞单元已暴露于培养条件。标记可在空间上编码。标记可选自病毒、寡核苷酸、肽、荧光化合物、仲胺、卤代烃、稳定同位素的混合物、条形码、光学标记、珠子、量子点和射频编码标记，或包含这些标记中的至少两个的组合。可选择两个或更多个标记，并组合用于标记细胞单元。
适宜地，细胞以细胞单元培养，每个细胞单元含有一个或多个细胞，细胞单元可为单种细胞。每个细胞单元可含有一种或多种粘附至固体基质或由固体基质结合的细胞。固体基质可为微载体或珠。固体基质甚至可为孔或介质可穿透的屏障物。
在一个实施方案中，培养条件为细胞接触的介质。适宜地，所述介质含有一种或多种影响细胞过程的特异性物质。
细胞培养条件可包括在一个或多个特定温度或者氧或二氧化碳分压下的培养。细胞培养条件可包括在一种或多种特定基质上的培养。
(b)裂分-裂分细胞培养
对细胞单元实施裂分-汇合方法的目的是将这些细胞单元系统地暴露于预定条件组合。本领域技术人员将设想出许多不同的方式来实现此结果。除裂分-汇合方法及其变化之外，还值得简要论述裂分-裂分方法。裂分-裂分方法包括将细胞单元群再划分至少两次，而不插入细胞单元汇合。如果使用很多轮的裂分-裂分方法，则产生的单独样本数呈指数增加。在此情况下，重要的是使用一定水平的自动化，例如利用机器人平台和复杂的样品追踪系统。裂分-裂分步骤的优势在于(因为不组合细胞单元)，有可能根据它们的细胞培养史分离多种细胞单元的谱系。因此，裂分-裂分步骤可用于推导特定细胞培养条件是否决定了任何给定的细胞过程，并因此用于推导细胞单元的培养史(在‘细胞单元培养史的确定’之下详细阐述)。
预定方案
可完全随机地或者可按照预定方案完成细胞单元的裂分和/或汇合。细胞单元在何处随机裂分和/或汇合、给定细胞单元在何处分离进入任何群体不能以任何方式预定或预见。为了产生使至少一个细胞单元已暴露于细胞培养条件的每一种可能组合的高可能性，最好使用大于待测细胞培养条件的组合总数的细胞单元数。因此，在某些情况下，根据预定方案裂分和/或汇合细胞单元是有利的，总体效应是防止了组合的偶发重复或遗漏。任选地，可预先计划细胞单元的预定处理，并记录在电子表格或计算机程序上，利用自动化方法如机器人执行裂分和/或汇合操作。可通过任何方式标记细胞单元(参见下文)，例如通过RFID、光学标记物或空间编码进行标记。能够确定样品身份并因此根据预定方案分配样品的机器人装置已有描述(参见‘CombinatorialChemistry，A practical Approach’，Oxford University Press(2000)，H.Fenniri编辑)。或者，标准的实验室流体处理和/或组织培养机器人(例如由：Beckman Coulter Inc，Fullerton，CA；The Automation Partnership，Royston，UK制造)能够空间编码多个样本的标识，并根据预先编程的方案对其进行加入、除去或移位。
细胞单元的分析和/或分离
在每轮细胞培养后，或在限定轮数后，可研究细胞单元，以观察可能受到组织培养条件影响的任何给定细胞过程。下文的实例是例证性的，无意限制本发明的范围。
在每轮细胞培养后，或在限定轮数后，可测定细胞单元，以确定是否存在显示增加的细胞增殖的成员。这可通过各种技术实现，例如通过在显微镜下目检细胞单元，或通过定量细胞的标记产物特征。此标记可以是内源标记，例如特定的DNA序列，或者可以通过配体或抗体检测的细胞蛋白质。或者，可将外源标记如绿色荧光蛋白(GFP)导入待测定细胞单元中，以提供(活)细胞的具体读数。可利用各种活体染色剂显现活细胞，或相反地，利用各种方法如利用碘化丙锭标记死细胞。此外，可通过各种人工和自动化技术，包括亲合纯化(‘淘选’)，或通过荧光激活细胞分拣(FACS)或广泛类似的技术，将标记的细胞单元与未标记的细胞单元分离开来。根据应用有可能使用标准实验室设备，或者使用特殊的仪器可能是有利的。例如，某些分析和分拣仪器(例如参见Union Biometrica Inc.，Somerville MA，USA)具有达到1毫米的流式细胞直径，其容许流式分拣直径达到500微米的珠子。这些仪器提供珠子大小和光密度以及来自标记物如GFP、YFP或DS-红的2种荧光发射波长的读数。每小时180,000个珠子的分拣速度和分配进入多孔平板或进入批量受体是有可能的。
在每轮细胞培养后，或在限定轮数后，可测定细胞单元，以确定是否存在显示特定基因型或表型的成员。可利用众所周知的技术进行基因型确定，例如聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(FISH)、DNA测序等。可通过各种技术进行表型确定，例如通过在显微镜下目检细胞单元，或通过检测细胞的标记产物特征。此标记可以是内源标记，例如特定DNA或RNA序列，或者可通过配体、酶底物转化检测的细胞蛋白，或识别特定表型标记的抗体(例如参见Stem Cells：ScientificProgress and Future Research Directions附录E，健康和人类服务部，2001年6月；附录在此引入作为参考)。遗传标记也可以是外源的，即例如通过转染或病毒转导而导入细胞群体中的遗传标记。外源标记的实例是荧光蛋白质(例如GFP)，或通常不在特定细胞谱系中表达或为表位修饰的或来自不同种属的细胞表面抗原。与转录调控元件结合的转基因或外源标记基因的表达方式可以反映出代表内源基因的模式。这可如下实现：使基因与最小的细胞类型特异性启动子缔合，或将转基因整合到特定基因座(例如参见欧洲专利号EP 0695351)。可通过各种人工和自动化技术，包括亲合纯化(‘淘选’)或通过荧光激活细胞分拣(FACS)，将标记细胞单元与未标记细胞单元分离开来。Nishikawa等(1998，Development，第125卷，1747-1757页)使用由抗体识别的细胞表面标记物追踪鼠全能ES细胞的分化。利用FACS，它们能够鉴定和纯化在它们的分化中的不同阶段的造血谱系。
用于富集特定基因型或表型的细胞单元的备选或补充技术是遗传选择所需要的群体。这可通过例如将选择标记导入到细胞单元中并测定选择条件下的存活力而实现，例如参见Soria等(2000，Diabetes，第49卷，1-6页)，其使用该系统从分化的ES细胞选择分泌胰岛素的细胞。Li等(1998，Curr Biol，第8卷，971-974页)通过在鼠ES细胞中经同源重组将双功能选择标记/报告体βgeo(其提供β-半乳糖苷酶活性和G418抗性)整合到Sox2基因座中来鉴定神经祖代。因为神经祖代的其中一个特征是表达Sox2，并因此表达整合标记基因，所以可在利用视黄酸诱导分化后通过添加G418从非神经元谱系中选择这些细胞。可通过在显微镜下观察或通过监测β-gal活性来确定细胞存活力。不同于可受合适的配体或抗体的利用度限制的基于表型的选择方式，遗传选择可应用于任何差异表达的基因。
微载体
可利用多种微载体，其以形状和大小分类，并由不同材料制成。
作为实例，微载体可为选自以下的多孔微载体：Cytopore微载体(例如Cytopore 1微载体或Cytopore 2微载体)、Cultispher微载体、Cultispher-G微载体、Cultispher-GL微载体和Cultispher-S微载体、Informatrix微载体、Microsphere微载体、Siran微载体和MicroporousMC微载体。
作为又一个实例，微载体可为固体微载体-例如Cytodex微载体(例如Cytodex 1、Cytodex 2或Cytodex 3微载体)、Biosilon微载体、Bioglass微载体、FACT III微载体或DE 52/53微载体。
微载体培养具有明显优势，包括培养放大，还允许细胞单元暴露于根据需要选定的培养条件，以便获得需要的生长和/或分化条件。
微载体表面还可以通过物理或化学处理修饰，例如吸附或共价交联具有需要的电荷或其它需要特征的分子实体。
Cultispher微载体
CultiSpher经产生具有高机械稳定性和热稳定性的高度交联的明胶基质的方法由药用级猪明胶制造。当用于细胞培养时，可将细胞连接至基质的外表面和内表面。增加的基质表面积连同基质内部给予细胞的应激的保护作用产生增强的细胞生产能力。产物的额外优势在于基质可用蛋白水解酶溶解，导致收获具有几乎100％存活力的细胞。
在一个实施方案中，微载体为Cultispher-G微载体。Cultispher-G具有130-380μm的粒径、12-18ml/g干物质的容积、1.04g/ml的密度和20μm的平均孔径。
为了制备和使用Cultispher-G微载体，尤其可参考Biotech.Bioeng.(2000)68，1 59-70页；Brit，J.Cancer.Suppl.XXVII，S-78-S82(1996)；以及生产商的站点www.percell.se。
Cytopore2微载体
Cytopore微载体可得自GE Healthcare(以前为Amersham)(www.microcarriers.com)。Cytopore由100％纤维素制造，对细胞无毒，可生物降解。其由于N，N，-二乙基氨基乙基而带正电。其具有非常精确的粒度分布和网状结构，表面积对颗粒材料的比率超过95∶1。网状结构能够使染色的细胞在它们于微载体内部生长的同时被更密切地观察。典型粒径为200-280μm，有效表面积为1.1m2/g干物质。相对密度为1.03g/ml，开孔的平均直径为30μm，容积为40ml/g干物质。为了制备和使用Cytopore微载体，尤其可参考Applied Microbiologyand Biotechnology(1997)47，4 352-7页；Cytotechnology(1999)30143-147页；Chinese Journal of Biotechnology(1999)15，4 239-44页和Acta Oto-Laryngologica(2002)122，5 541-5页。
Cytppore 2已针对需要约1.8meq/g电荷密度的贴壁依赖性细胞进行了优化。
在某些实施方案中，微载体为猪明胶微载体。
在某些实施方案中，微载体由100％纤维素制造。
在一个实施方案中，分化细胞可通过包含以下步骤的方法得自体外干细胞：(a)在培养基中培养附着至微载体的干细胞；(b)将微载体由一种培养基转移至另一种培养基；(c)任选地，根据需要重复步骤(b)；和(d)获得附着至微载体的分化细胞。
干细胞或部分分化的细胞可接触潜在调节物，同时仍附着至所述微载体。本发明由此提供在HTS中使用这些同时仍附着至微载体的细胞的方法，例如使用机器人实施细胞转移步骤。分化细胞可通过酶促分离从微载体分离。分化细胞可通过消化微载体来分离。
本发明的方法可使用50g以上干重的微载体来实施。
多潜能干细胞可通过包含以下步骤的方法在体外生长：(a)将所述细胞接种在微载体上；和(b)在细胞附着至载体的同时增殖细胞。
细胞单元的身份或细胞培养史的确定
当处理大量细胞单元时，它们的身份和/或细胞培养史(例如任何一个群体或单元可能已暴露于一系列培养条件的时序和确切特性)可能变得混乱。例如，细胞培养的裂分-汇合方法必定包括在每轮混合细胞单元，这使得难以跟踪个体单元。确定已经受多个培养条件的细胞单元混合物中的细胞单元的细胞培养史有时被称为细胞培养史的‘反演(deconvolution)’。实施此过程的一个方法是标记细胞单元，因此标记细胞单元是有利的。标记可在实验开始时或在每轮实验期间进行，并且可以包括独特的标记(其在实验过程中可修饰或可以不修饰)或含有独特聚集物的一系列标记。类似地，可在每轮实验期间或仅仅在实验结束时读取标记。在一个实施方案中，在每轮当中读取独特的标记，例如RFID标记，而在实验结束时读取在每一轮连续加入的标记。
可通过各种方式实现细胞单元的标记，例如标记细胞本身，或细胞附着或结合的任何物质。用于编码合成的组合文库的任何化学和非化学方法都可能适合此目的，其中一些描述于Methods in Enzymology，第267卷(1996)，‘Combinatorial Chemistry’，John N.Abelson(编辑)；Combinatorial Chemistry，Oxford University Press(2000)，HichamFenniri(编辑)；K.Braeckmans等，‘Scanning the code’，Modern DrugDiscovery(2003年2月)；K.Braeckmans等，‘Encoding microcarriers：Present and Future Technologies’；Nature Reviews Drug Discovery，第1卷，447-456页(2002)，所述文献全部在此引入作为参考，以下是一些标记方法的实例。
一个标记细胞单元的方法包括使细胞单元与标记物缔合，该标记物在处于不同培养条件中时序贯地被改变。这可包括例如向标记物加入或减少其它单元，使得标记的立体化学、序列或质量发生改变；或在读写RF转发器中的电子存储发生变化(参见下文)。
另一个标记细胞单元的方法包括每当在不同条件下培养时序贯地使独特的标记物与细胞单元缔合，使得标记物的后继检测和鉴定提供细胞单元已暴露于细胞培养条件的时序和身份的明确记录。标记物可被细胞吸收，或通过吸附、或合适的配体或抗体附着于细胞表面，或通过吸附、胶体力或多种键(例如共价键或非共价键，例如生物素-链霉抗生物素键)缀合至与细胞缔合的基质如载体。例如，可导入细胞或附着于与细胞缔合的基质的一个简单标记物是限定长度和/或序列的寡核苷酸。寡核苷酸可包括任何种类的核酸(例如线性的、环状的或病毒的RNA、DNA、PNA)，并且可包含用于扩增的特异性序列(例如用于PCR的引物序列)或用于检测的标记(例如荧光团或猝灭剂或同位素标记)。这些标记的检测可以是直接的，例如通过对寡聚物测序或使它们与互补序列杂交(例如在阵列或芯片上)，或是间接的，例如通过监测编码寡核苷酸的基因产物或核苷酸对细胞活性的干扰(例如特定基因的反义抑制)。扩增核酸的有利方法是通过滚环扩增(RCA；2002，V.Demidov，Expert Rev.Mol.Diagn.2(6)，89-95页)，其中核酸标记物可包括RCA模板、延伸引物或帮助小环模板环化的支持物。
可使用任何分子或大分子标记物，只要其能被检测，包括肽标记物、显色或荧光化合物、仲胺、卤代烃、稳定同位素的混合物等。标记物可以直接或借助于中间体(例如针对细胞单元成分产生的抗体)或借助于相互作用对(例如生物素-链霉抗生物素)而附着于细胞单元。此外，可以通过细胞培养成分，例如化学或其它修饰，或通过囊化，保护标记物抵抗降解。标记物的囊化可在许多不同的培养基如珠子中进行，许多类型的珠子可从例如Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN，USA)的供应商获得，并且囊化除提供用于标记物扩增和/或检测的成分(例如通过提供用于DNA标记物的PCR引物)之外还用于标准化标记物剂量。一种标记细胞单元的方法使用荧光珠，例如由Luminex Corporation(Austin，TX，USA)制造的珠子。Luminex系统包括聚苯乙烯珠，其可以是或可以不是外部衍生化的(例如用抗生物素蛋白或抗体)，其内部用不同比率的2种光谱不同的荧光团染色，以及能够表征每个珠的光谱特征的读取器。又一个方法使用例如由Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN，USA)制造的珠子。Bangs系统包括能够基于不同大小而区分的珠子组(例如4.4μm和5.5μm直径的珠子组)。而且，每组内的珠子基于由差异负载单种荧光染料产生的不同荧光强度而可以彼此区分。有可能使用许多具有不同吸收或发射特性的不同染料，其可以通过许多方式内部加载或外部附着于载体。此外，有可能使用‘量子点’，以获得可方便读取的极高数量的不同荧光标记。
细胞生长基质，例如与形成细胞单元有关的那些所述基质，可以是衍生化的，或涂有便于标记且不防碍细胞生长的物质。一种衍生化载体的方法是用生物素共价或非共价地修饰载体，标记物可借助于链霉抗生物素或抗生物素蛋白与生物素附着。一般来说，重要的是使用本身不会诱导细胞效应的标记物(即惰性标记物)，其可与存在于细胞单元或培养基中的分子区分开来，能够附着于其靶，并且随后在这种分子的背景中可被检测到。为利于检测，从细胞单元选择性洗脱标记物或利用选择性条件从细胞单元剥落细胞可能是有利的。还可以设想更复杂的分子标记策略，包括‘二进制代码’策略，其中，通过指定到一组分子标记物及其混合物的一组二进制代码来记录信息。
标记物的检测可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现。这些方法包括质谱、核磁共振、测序、杂交、抗原检测、电泳、分光术、显微术、图像分析、荧光检测等。
特别令人感兴趣的是其中只进行一次标记或其中标记和/或检测是非物理性的并因此是非侵入性的标记或编码策略。射频鉴定(RFID)是展现出这些特性的系统的实例。RFID使用转发器(RF标记物)、天线和读取器。RF标记物是小的电子线路，通常包埋在玻璃或塑料中，其以它的最简单的形式获取通过合适的电子设备可以‘读取’的独特标识码，而不需接触或观测线。标记也可储存由使用者产生的信息，也不需要接触或观测线。‘读取器’是往返于一个或多个标记物转移信息的电子元件(应该注意到，术语读取器可互换地用于两个意思：只读和读/写单元)。读取器的大小和构造可以有相当大的变化，并且可以独立地或连接远程计算机系统操作。使用天线来将信息从读取器传送到标记物，并且接收由RF标记物发送的信息。天线的大小和规格形式将反映特定的应用，可从小的圆形线圈到大的平面结构变化。RFID系统可独立地或连接远程计算机操作，用于对来源于标记物的标识数据和相关数据进行更全面的解码和操作。用于组合化学的一个RFID策略描述于Nicolaou等(1995，Angew Chem Intl Ed Engl，第34卷，2289页)，其包括：(i)包含合成基质和半导体标记物的多孔封闭体；(ii)固相合成树脂；(iii)玻璃包埋的单个或多个可访问的射频标记半导体单元，其能够接收、储存和发射射频信号。类似装置仅仅通过用组织培养微载体或合适的细胞单元替代固相合成树脂就可以适合于生长和追踪细胞单元。可预计的此策略的更多变化包括但不限于其上直接生长细胞的(涂履或未涂履的)RF标记物，或植入到细胞单元或生物体中的RF标记物。
因此，标记物最初未必一定通过其化学或分子结构来区分。可设计非化学标记策略的多种变化，以确定混合物中给定细胞单元的身份，或推导包括混合物的不同细胞单元的身份。例如，已经描述了标记的光学或目测法，其中不同形状的对象、图形编码的对象或不同颜色指示样品的身份(例如参见1998，Guiles等，Angew.Chem.Intl EdEngl，第37卷，926页；Luminex Corp，Austin TX，USA；BDBiosciences；Memobead Technologies，Ghent，Belgium)，或其中将图案或条形码蚀刻到例如陶瓷棒或纳米线的基质上，并利用图形识别技术识别(例如参见1997，Xiao等，Angew.Chem.Intl Ed Engl，第36卷，780页；SmartBead Technologies，Babraham，UK；Oxonica Ltd，Kidlington，UK)。
追踪或标记细胞单元的其它方法是在空间上(即通过其在空间的位置)编码它们的身份。在该方法中，在限定的相对位置分离不同的细胞单元，这些位置表示或编码该单元的身份。例知，可以在阵列中培养细胞单元，借此了解每个单元的身份和/或培养史，并使其与阵列中的特定位置相关联。这些阵列以其最简单的形式可包括一批组织培养瓶、多孔板的孔或者载玻片或其它表面上的位置。可在Geysen等(1984，Proc Natl Acad Sci USA，第81卷，3998-4002页)、Fodor等(1991，Science，第251卷，767-773页)、Ziauddin和Sabatini(2001，Nature，第411卷，107-110页)以及Wu等(2002，Trends Cell Biol.，第12卷，12(10)，485-8页)中发现定位编码策略的实例。
本发明具有许多方面，每个方面都可以具有许多形式，这些形式可以组合，以形成本发明的众多改变。显而易见的是，为了能够推断关于由细胞培养方法组合产生的结果的信息，不一定要标记所有细胞单元。因此，在不标记细胞单元的情况下，应当仍有可能测定符合本发明的细胞培养条件的大量组合，并确定这些组合的一种或多种是否能够产生特定的细胞效应。然而，在一个实施方案中，标记细胞单元。标记细胞单元容许由实验得出有关通过标记细胞单元而采样的特定条件的结果的有用信息，与所有的细胞单元形成对比。或者，有时最好标记已全部暴露于某些培养方案的细胞单元的一个或几个群，例如在特定的裂分或汇合步骤当中已分离到同一培养基中的细胞单元群。还显而易见的是，标记某些细胞单元容许人们推断其它(或许是未标记的)细胞单元的身份。
类似地，显然，进行其中省略了多种条件的细胞培养试验可以产生关于针对特定实验性结果的那些条件的应用的信息。因此，应有可能通过多次重复实验评估以本发明方式采样的每个条件，每次试验都省略不同组别的条件。
还可以使用裂分-裂分细胞培养步骤确定一组特定条件对实验结果的作用。实际上，裂分-裂分步骤导致形成在分支时已各自暴露于独特细胞培养条件的特定细胞单元谱系。通过研究不同的谱系，有可能针对特定实验结果确定在分支点研究的组织培养条件的用途。
造血细胞
在又一方面，提供在体外由干细胞(例如胚胎干细胞)生产造血细胞的方法，包括使所述干细胞暴露于一种或多种、优选两种或更多种反应条件，其中所述反应条件包括将所述干细胞与以下物质温育：(a)视黄酸、二甲基亚砜(DMSO)和/或干细胞因子(SCF)；和(b)胰岛素、干细胞因子(SCF)、TGFβ1、BMP2、BMP4和/或TPO；和(c)IL-3、IL-6、TPO、EPO和/或M-CSF。
干细胞可接种在微载体如明胶微载体上。
通常，干细胞包含在培养基中，所述培养基例如为IMDM基础培养基或流线型造血扩增培养基(Streamline Haematopoietic ExpansionMedium)。
适宜地，在步骤(a)中使用视黄酸或二甲基亚砜(DMSO)或干细胞因子(SCF)；适宜地，在步骤(b)中使用单独的胰岛素。适宜地，在步骤(b)中使用SCF、TGFβ1、BMP2和TPO。适宜地，在步骤(c)中使用IL-3和IL-6，并任选地使用TPO、EPO和/或M-CSF。
通常，步骤(a)在第1天实施。通常，步骤(b)在第4天实施。通常，步骤(c)在第6天实施。
在一个具体实施方案中，所述条件为使干细胞与视黄酸、二甲基亚砜(DMSO)或干细胞因子(SCF)温育；然后使干细胞与胰岛素、干细胞因子(SCF)、TGFβ1、BMP2或BMP4和TPO温育，或者使干细胞与单独的胰岛素温育，和/或与SCF、TGFβ1、BMP2和TPO的组合温育；然后使干细胞与IL-3、IL-6和任选的TPO、EPO和/或M-CSF温育。
在另一个具体实施方案中，所述条件为在第1天使干细胞与视黄酸或二甲基亚砜(DMSO)或干细胞因子(SCF)温育；在第4天使干细胞与干细胞因子(SCF)、TGFβ1、BMP2、BMP4和TPO温育，或者使干细胞与单独的胰岛素温育，和/或与SCF、TGFβ1、BMP2和TPO的组合温育；在第6天使干细胞与IL-3、IL-6和任选的TPO、EPO和/或M-CSF温育。
其它方面
本发明的其它方面在以下段落中提供：
1.一种用于鉴定细胞信号转导途径的潜在调节物的方法，包括以下步骤：
(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中可通过使所述第一种细胞类型序贯暴露于一种或多种反应条件将所述第一种细胞类型分化为第二种细胞类型；
(b)以暴露于一种或多种含所述潜在调节物的不同反应条件加入或置换所述一种或多种不同反应条件中的至少一种；和
(c)监测第一种细胞类型的分化，以确定第二种细胞类型的形成。
2.一种用于鉴定细胞信号转导途径的潜在调节物的方法，包括以下步骤：
(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中所述第一种细胞类型得自胚胎或胎儿，并可以分化为第二种细胞类型；
(b)任选地扩增所述第一种细胞类型；
(c)使所述第一种细胞类型序贯暴露于一种或多种反应条件进一步分化所述第一种细胞类型；
(d)使第一种细胞类型暴露于含所述潜在调节物的一种或多种不同反应条件；和
(e)监测第一种细胞类型细胞的分化，以确定第二种细胞类型的形成。
3.按照段落1或2的方法，其中所述反应条件为细胞暴露的培养条件。
4.按照段落2或3的方法，其中第一种细胞类型为已沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞的细胞。
5.按照段落1或3的方法，其中细胞类型为原初细胞、细胞系或肿瘤衍生细胞系。
6.按照段落4或5的方法，其中所述细胞类型的起源组织选自脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、皮肤、毛发、眼、牙齿、胰腺、肌肉、骨和血管系统。
7.按照前述任一段落的方法，其中潜在调节物为细胞信号转导途径的抑制剂。
8.按照段落1-6的方法，其中潜在调节物为细胞信号转导途径的促进物。
9.按照段落3-8的方法，其中首先以包括以下步骤的方法鉴定分化细胞类型所需的培养条件：
(a)提供第一组细胞单元群，每个细胞单元含有一个或多个细胞，并使所述群暴露于需要的培养条件；
(b)再划分一个或多个所述群，以产生进一步的再一组细胞单元群；
(c)使所述进一步的细胞群暴露于另外的需要的培养条件；
(d)任选地，根据需要反复地重复步骤(b)-(c)；和
(e)评价给定细胞单元已暴露的培养条件对该细胞单元的作用。
10.按照段落3-8的方法，其中首先以包括以下步骤的方法鉴定部分或完全分化细胞类型所需的培养条件：
(a)提供第一组细胞单元群，每个细胞单元含有一个或多个细胞，并使所述群暴露于需要的培养条件；
(b)汇合两个或更多个所述群，以形成至少一个第二合并群；
(c)再划分所述第二合并群，以产生再一组细胞单元群；
(d)使所述进一步的细胞群暴露于需要的培养条件；
(e)任选地，根据需要反复地重复步骤(b)-(d)；和
(f)评价给定细胞单元已暴露的培养条件对该细胞单元的作用。
11.按照段落9或10的方法，其中部分分化的细胞单元随后进行分离，并用于权利要求1-8中任一项的方法。
12.在段落9或10中鉴定的部分分化的细胞类型在任一前述权利要求的方法中的用途。
13.按照段落9-12的方法，其中标记细胞单元，而标记反映出该细胞单元已暴露的培养条件。
14.按照段落13的方法，其中标记在空间上被编码。
15.按照段落13或14的方法，其中标记选自病毒、寡核苷酸、肽、荧光化合物、仲胺、卤代烃、稳定同位素的混合物、条形码、光学标记、珠子、量子点和射频编码标记。
16.按照段落15的方法，其中选择两个或更多个标记，并组合用于标记细胞单元。
17.按照段落9-16的方法，其中细胞以细胞单元培养，每个细胞单元含有一个或多个细胞。
18.按照段落9-16的方法，其中细胞单元为单细胞。
19.按照段落9-17的方法，其中每个细胞单元含有一个或多个附着至固体基质或由固体基质结合的细胞。
20.按照段落19的方法，其中固体基质为微载体或珠子。
21.按照段落19的方法，其中固体基质为孔或介质可穿透的屏障物。
22.按照段落9-21的方法，其中培养条件为细胞接触的介质。
23.按照段落22的方法，其中介质含有影响细胞过程的一种或多种特定物质。
24.按照段落3-23的方法，其中细胞培养条件包括于一种或多种特定温度时或者氧或二氧化碳分压下培养。
25.按照段落3-24的方法，其中细胞培养条件包括在一种或多种特定基质上培养。
26.按照任一个前述段落的方法，其中通过调节细胞信号转导和/或一种或多种基因在细胞中的表达使第一种细胞分化为第二种细胞类型。
27.按照段落26的方法，其中细胞中的基因表达调节包括将所述一种或多种基因转染入细胞中。
28.按照段落26的方法，其中基因表达的调节包括外源给予基因产物。
29.按照任一个前述段落的方法，其中细胞的分化通过观察细胞表型或通过检测细胞中的一种或多种基因的表达调节来监测，由此确定所述细胞的分化状态。
30.按照段落29的方法，其中观察一种或多种报告基因的表达调节，其中报告基因对应于所述细胞的一种或多种分化状态。
31.按照段落29或30的方法，其中所涉及基因的表达在基因芯片上进行监测。
32.按照段落29的方法，其中所述一个或多个基因编码标记。
33.按照段落32的方法，其中所述标记可通过免疫测定检测。
34.按照任一个前述方法段落的方法，其中细胞的分化通过增殖能力的丧失来监测。
35.按照段落4或5的方法，其中通过包括以下步骤的方法培养干细胞或体外得自干细胞的细胞：
a)组合一种或多种在不同条件下生长的细胞培养物；和
b)培养所述细胞。
36.按照段落35的方法，其中所述干细胞经受至少一种培养条件的改变。
37.按照段落36的方法，其中所述培养条件的改变包括培养基的改变。
38.按照段落4的方法，其中分化细胞通过包括以下步骤的方法在体外得自干细胞：
(a)在培养基中培养附着至微载体的干细胞；
(b)将微载体由一种培养基转移至另一种培养基；
(c)任选地根据需要重复步骤(b)；和
(d)获得附着至微载体的分化细胞。
39.按照段落38的方法，其中干细胞或部分分化的细胞接触所述潜在调节物，同时仍附着至所述微载体。
40.按照段落38的方法，其中分化细胞通过酶促分离从微载体分离。
41.按照段落38、39或40的方法，其中所述过程被放大，使得使用至少50g(干重)微载体。
42.按照段落38或41的方法，其中分化细胞通过消化微载体分离。
43.按照段落4的方法，其中多潜能干细胞已通过包括以下步骤的方法在体外生长：
(a)将所述细胞接种在微载体上；和
(b)增殖细胞，同时附着至载体。
44.按照任一前述段落的方法，其中潜在调节物包括有机或无机小分子、天然或衍生化的糖、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、RNA、寡核苷酸或蛋白质-核酸(PNA)。
45.按照任一前述段落的方法，其中潜在调节物得自具有药物样特性的小分子文库。
46.化合物文库鉴定任一前述段落的潜在调节物的用途。
47.一种药物组合物，其含有按照任一前述段落鉴定的调节物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
48.在任一前述段落中鉴定的调节物用于生产治疗疾病的药物的用途。
49.按照段落48的调节物的用途，其中治疗为细胞置换治疗。
50.部分分化的细胞，其已在体外由干细胞分化，并沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞。
现在将利用实施例进一步描述本发明，实施例意在帮助本领域普通技术人员实施本发明，无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例
进行筛选，以鉴定能够刺激造血系统的骨髓谱系的再生药物。筛选如下进行：使用一系列培养步骤，以分化接种在微载体上的小鼠胚胎干细胞(mESC)为骨髓谱系的祖代，随后在存在或不存在谱系特异性造血生长因子TPO、M-CSF和IL-5或对照化合物维生素C的情况下对这些祖代实施培养条件，据报告维生素C影响细胞存活但不是造血生长因子。在48小时后，使用巨噬细胞的出现作为替代测定评价对骨髓细胞分化的作用。该筛选将TPO和M-CSF鉴定为能够刺激骨髓谱系的造血再生药物。
材料和方法
试剂
鼠干细胞因子(SCF)(R&D Systems)
鼠血小板生成素(TPO)(R&D Systems)
人红细胞生成素(EPO)(R&D Systems)
人白介素6(IL-6)(R&D Systems)
人转化生长因子β1(TGFβ1)(R&D Systems)
鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(R&D Systems)
鼠白介素3(IL-3)(R&D Systems)
视黄酸(Sigma)
人骨形成蛋白2(BMP2)(R&D Systems)
小鼠白介素5(IL-5)(R&D Systems)
抗坏血酸(维生素C)(Sigma)
mESC的微量培养
按照生产商的推荐对CultiSpher-G微载体(Percell Biolytica AE)进行水合和灭菌。
D3 ES细胞(ATTC编号CRL-1934)在涂覆明胶的塑料上于包含15％敲除血清置换(KOSR)、1％非必需氨基酸(NEAA)、1％Glutamax、0.5％青霉素/链霉素、0.1mM β-巯基乙醇(β-ME；Sigma)和1000U/ml白血病抑制因子(LIF；Chemicon)的KODMEM中生长；除非另有说明，否则所述成分都得自Invitrogen。
在试验第1天的前1天，将用培养基A(IMDM(Gibco)、15％KOSR、1％NEAA、0.5％青霉素/链霉素、0.1mM β-ME、1000U/ml LIF和1.5×10-4 M 1-硫代甘油(MTG；Sigma))平衡的约1.5×104个生物素化微载体加入100ml含有约4.5×106个ES细胞的培养基A中，分为三等份试样，置于100mm正方形皮氏培养皿(Bibby Sterilin)的孔中，并过夜温育。
由mESC制备祖代
为了制备骨髓祖代，使用2步法。用如上所述的mESC接种的珠子在含有10-8M视黄酸的IMDM中温育72小时。然后用PBS洗涤珠子，转移至含有40ng/ml SCF、2.5ng TGFβ1、5ng/ml BMP2和20ng/mlTPO的StemlineTM造血扩增培养基(Sigma)，并温育48小时。
用于再生药物的基于细胞的测定
混合如上所述制备的带有骨髓祖代的珠子，用PBS洗涤，并转移至测试生长培养基(补加30ng/ml IL-3和20ng/ml IL-6的StemlineTM造血扩增培养基(Sigma))。将约100个珠子的等份试样分配入48孔板的孔中，并在有或没有50μg/ml维生素C、10ng/ml IL-5、20ng/ml TPO和20ng/ml M-CSF的情况下温育。在置于同一温育器中的单独平板的孔中以一式三份进行筛选。
在48小时后，将1mg巨噬细胞测定试剂DQ-卵清蛋白(MolecularProbes)溶解在0.4ml PBS中，并以1∶100的稀释度加入每个孔。在温育至少4小时后，吸出培养基，并用PBS置换。样品在使用FITC滤光片组件的Nikon TE2000-S倒置落射荧光显微镜上检查，以定量携带内部以绿色荧光标记的圆形大细胞的微载体。
筛选结果报告为点缀有巨噬细胞的微载体的平均数(百分率)。在单独的测试生长培养基中(即在没有任何测试试剂的情况下)，向巨噬细胞的平均转变为1％，其被视为归因于自发分化的基础转变水平。当阴性对照化合物维生素C用作测试试剂时，向巨噬细胞的平均转变为0％，即在基础水平之下，表明其对分化没有影响。当造血生长因子IL-5用作测试试剂时，向巨噬细胞的平均转变为0％，即也在基础水平之下，表明其在该测定中对骨髓细胞的分化没有影响。已知IL-5影响淋巴造血谱系，但对骨髓分支没有显著作用。然而，当TPO或M-CSF用作测试试剂时，向巨噬细胞的平均转变增加至6％，代表了超过背景的显著增加。
因此，此基于mESC的测定能够鉴定作用分化骨髓祖代的试剂，并因此可用于筛选化合物文库，以鉴定新的再生药物。
在以上说明书中提及的所有出版物都通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变更对本领域技术人员是显而易见的。尽管已联系特定实施例描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应过度限于这些具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述方式的各种修改对分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的，意在以下权利要求的范围之内。

Claims (43)

1.一种用于鉴定细胞信号转导途径的潜在调节物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供第一种细胞类型的细胞，其中可通过使所述第一种细胞类型序贯暴露于两种或更多种反应条件将所述第一种细胞类型经祖细胞分化为第二种细胞类型；
(b)以暴露于一种或多种含所述潜在调节物的不同反应条件加入或置换祖细胞已暴露的所述两种或更多种反应条件中的至少一种；和
(c)监测第一种细胞类型的分化，以确定第二种细胞类型的形成。
2.权利要求1的方法，其中所述第一种细胞类型得自或者可得自胚或胎儿，并任选地被修改以允许扩增。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述祖细胞通过暴露于一种或多种反应条件而在体外衍生于第一种细胞类型。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一种细胞类型为自我更新干细胞。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分化步骤对为细胞单元组成部分的细胞实施。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞单元含有微载体或其它支架。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述反应条件为细胞暴露的培养条件。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述反应条件包括筛选细胞信号转导途径的潜在调节物。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二种细胞类型为沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞的细胞。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞类型为原初细胞、细胞系或肿瘤衍生细胞系。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞类型的来源组织选自脑、心脏、肝脏、肺、毛发、眼、肠、血液、耳、肾脏、皮肤、牙齿、胰腺、肌肉、骨和血管系统。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述潜在调节物为细胞信号转导途径的抑制剂或促进剂。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中通过调节细胞信号转导和/或在细胞中表达一种或多种基因使第一种细胞分化为第二种细胞类型。
14.权利要求15的方法，其中细胞中的基因表达调节包括将所述一种或多种基因转染入细胞中。
15.权利要求15的方法，其中基因表达的调节包括外源给予基因产物。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的分化通过观测细胞表型或通过检测细胞中一种或多种基因表达的调节来监测，由此确定所述细胞的分化状态。
17.权利要求16的方法，其中观测到一种或多种报告基因的表达调节，其中所述报告基因对应于所述细胞的一种或多种分化状态。
18.权利要求16或权利要求17的方法，其中所涉及的基因表达在基因芯片上进行监测。
19.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述一种或多种基因编码标记。
20.权利要求21的方法，其中所述标记可通过免疫测定检测。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞的分化通过增殖能力的丧失来监测。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述潜在调节物包括有机或无机小分子、天然或衍生化的糖、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、RNA、寡核苷酸或蛋白质-核酸(PNA)。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述潜在调节物得自或可得自具有药物样特性的小分子文库。
24.一种细胞信号转导途径的调节物，所述调节物通过前述权利要求中任一项的方法获得或可获得。
25.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求24的调节物连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
26.一种部分分化的细胞，所述细胞在体外由干细胞分化，并沿着干细胞和分化细胞类型之间的分化途径停滞。
27.权利要求26的细胞，其中所述细胞为双能细胞。
28.权利要求27的细胞，其中所述细胞为单能细胞。
29.一种用于鉴定细胞信号转导途径的调节物的方法，所述调节物例如为再生药物，所述方法包括使用祖细胞。
30.祖细胞在药物筛选测定中用于鉴定细胞信号转导途径的调节物的用途，所述调节物例如为再生药物。
31.一种将胚胎干细胞分化为骨髓谱系祖代的方法，所述方法包括使用明胶微载体，所述明胶微载体例如为CultiSpher微载体。
32.明胶微载体用于将胚胎干细胞分化为骨髓谱系祖代的用途，所述明胶微载体例如为CultiSpher微载体。
33.一种体外由干细胞生产造血细胞的方法，所述方法包括使所述干细胞暴露于一种或多种、优选两种或更多种反应条件，其中所述反应条件包括将所述干细胞与以下物质温育：
(a)视黄酸、二甲基亚砜(DMSO)和/或干细胞因子(SCF)；和
(b)胰岛素、干细胞因子(SCF)、TGFβ1、BMP2、BMP4和/或TPO；
和
(c)IL-3、IL-6、TPO、EPO和/或M-CSF。
34.权利要求33的方法，其中所述干细胞接种在微载体上。
35.权利要求34的方法，其中所述微载体为明胶微载体。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中所述干细胞包含在IMDM基础培养基或流线型造血扩增培养基中。
37.权利要求33-36中任一项的方法，其中在步骤(b)中使用单独的胰岛素。
38.权利要求33-36中任一项的方法，其中在步骤(b)中使用SCF、TGFβ1、BMP2和TPO。
39.权利要求33-38中任一项的方法，其中在步骤(c)中使用IL-3和IL-6。
40.权利要求39的方法，其中还使用TPO、EPO和/或M-CSF。
41.权利要求33-40中任一项的方法，其中步骤(a)在第1天进行。
42.权利要求33-41中任一项的方法，其中步骤(b)在第4天进行。
43.权利要求33-42中任一项的方法，其中步骤(c)在第6天进行。
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