JP2009517072A - 細胞シグナリングのモジュレーターの同定方法 - Google Patents

Abstract

以下の段階：（ａ）第一の細胞型を2以上の反応条件に連続的に曝露することによって前駆細胞を経て第二の細胞型に分化することができる、該第一の細胞型の細胞を提供し；（ｂ）潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件への曝露を、前駆細胞が曝露された上記2以上の反応条件の少なくとも1つに追加するか、またはこれと置き換え；（ｃ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する；を含む、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法を記載する。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞シグナリング経路のモジュレーターの同定方法、特に細胞において分化を誘発する細胞シグナリング経路のモジュレーターの同定方法に関する。モジュレーターは、前駆細胞をモジュレーター候補物質に曝露することによって同定することができる。一態様において、前駆細胞は、分化の種々の段階で単離される多能性もしくは単能性の幹細胞であり、分化に対する細胞シグナリング経路の効果を促進または阻害することによって作用する分化プロセスの潜在的モジュレーターと共に、更に培養される。

再生医療の分野は、心血管疾患、神経変性疾患、筋骨格疾患、肝疾患または糖尿病等の症状を有する患者において、損傷した組織および器官をin vivoで再生させる現実的な展望を有している。損傷した組織の再生のための技術には、再生医薬を用いた現存する疾患組織のin vivoでの修復、または最初に再生医薬の使用により、もしくは使用なしにin vitroで調製し、次いでin vivoで移植した細胞を用いてこうした組織を置き換えるものがある。

いずれの場合においても、再生医療の目標は、細胞シグナリング経路、およびこれらが制御する下流の細胞プロセスを調整する特定の遺伝子、因子またはモジュレーターが同定できた場合にのみ実現できる。例えば、in vitroにおける幹細胞の制御された分化が、移植のための置換用細胞の供給源を提供し得ると考えられる。幹細胞の多能性および可塑性のために、特定の培養条件で処理した後にこれらが特定の細胞型に関わることができる。しかしながら、このようなアプローチは、系統分化の細胞および分子的事象を制御する因子またはモジュレーターが先に同定されていることが前提となる。これらの因子またはモジュレーターをex vivoで幹細胞に使用することで、移植後に幹細胞が多様な細胞系に自発的に分化する可能性が低下し、同時に胚性幹細胞の場合には奇形腫の形成の危険が低下し得るであろう。

このような因子もしくはモジュレーターはまた、内在性幹細胞をin vivoで移動させること、または損傷した組織の増幅、修復、保存、置換もしくはその他有益となり得る細胞型への分化を引き起こすことを目的とする治療の基礎を形成することができるであろう。細胞分化に影響し、治療に用いられている因子の例として、エリスロポエチン（EPO）がある。EPOは、造血前駆細胞の赤血球への分化を促進する天然のタンパク質因子である。組換えEPOは貧血症の治療に用いられており、およそ100億米ドルの世界市場を有している。

天然の分子もしくは因子に加えて、シグナリング経路の合成モジュレーター、特に分化を調節する経路のモジュレーターを用いて細胞の分化に影響を与えることが可能である。SB-497115は、血小板の増殖および産生を促進するタンパク質因子であるトロンボポエチン（TPO）の活性を模倣する、GSK社が開発中の小分子薬剤である。この薬剤は、血小板減少症(出血の際の凝固プロセスの成分として極めて重要である血小板産生の不全）の治療に用いることができるであろう。その市場機会はおよそ40-50億米ドルであると算定される。

EPOもしくはSB-497115等の再生医薬は幹細胞に作用するが、幹細胞、特に胚性もしくは胎生幹細胞を用いた再生医薬の発見のための一般的方法は提示されていない。

薬剤発見のために幹細胞を使用する単純な試みには、多能性胚性幹細胞、自己再生性成体幹細胞もしくは細胞系を、これらの細胞の分化に影響し得る薬剤を発見するための天然の産物または合成化合物の細胞ベースの表現型スクリーニングおよび経路特異的スクリーニングにおいて用いてきた実験が含まれる（Ding＆Shultzによる概説 (2004) Nature Biotechnology 22:833-840を参照のこと）。これらの細胞を使用する理由の１つは、これらはスクリーニングに必要な量を得るために容易に増殖させることができることである。しかしながら、自己再生性の未分化幹細胞もしくは細胞系を用いる先行技術におけるアプローチは、以下に論じる多くの理由のために薬剤発見方法論としての欠陥が見出されている。

第一に、先行技術において用いられている細胞型（特にES細胞および細胞系）は、in vivoにおける薬理学的介入に適切な生理的関連標的ではない可能性がある。例えば、心筋細胞（cardiomyocytes）へのES細胞の分化を引き起こし得る因子（Wu等, J Am Chem Soc. 2004:126(6):1590-1）は、ES細胞からin vitroで心筋細胞を作製することを可能とするためには有用であり得るが、ES細胞は成人には存在せず、ES細胞に対して特異的に活性を有するいかなる薬剤もin vivoにおいて再生医薬として作用しない可能性が高いであろう。

第二に、先行技術において用いられた細胞の型（特にES細胞および自己再生性の成体幹細胞）は、単一の薬剤の単回の適用に応答して標的の細胞系統への定方向性分化を実施するには、発達経路においてその系統のはるか上流に位置しすぎている。例えば、多くの因子のカクテルを連続して時限的に投与することが、ES細胞を特定の系統（特に、組織を特定する比較的複雑なプロセスの結果として、発達の比較的後期に特定されるもの）に分化させるために必要であることが知られている。

第三に、先行技術において用いられた細胞の型（特に成人の一次幹細胞）は、大規模な薬剤のハイスループットスクリーニングを実施するために十分な量を入手することが困難な場合がある。

最後に、先行技術において用いられた細胞の型（特に成人の一次幹細胞）は、起源または単離および調製方法に依存して、薬剤に応答して非常に多様な効果を示すことがある。

WO2004/031369には、細胞−例えば幹細胞の分化を可能にする方法および細胞シグナリング経路が記載されている。WO2004/031369に記載された技術においては、細胞は細胞経路をモジュレートする複数の条件下での複数の培養段階で培養され、上記方法は、種々の複数の培養段階が分化等の細胞プロセスに与える効果を決定する手段を提供する。

再生医薬を発見するための既存のアプローチは最適なものではなく、こうした薬剤を発見するための改良法に対する需要が存在している。本発明は、これらの問題に対する解決法を提示し、再生医薬等の薬剤の発見のための改良された方法を提供する。

本発明は、少なくとも部分的には、分化経路において幹細胞を停止させ、従ってスクリーニングに適した別の型の細胞を単離することが可能であるという知見に基づいている。一実施形態において、これは、第一の型の細胞を取得し、前駆細胞を経て目的のものである所与の標的表現型の出現に至る分化プロトコルを決定し、そして場合により、別の型の細胞、好ましくは前駆細胞が存在する段階で分化プロセスが停止するように、このプロトコルを更に改変することによって、典型的には細胞培養用の培地を変えることによって、達成される。第二の型の細胞、例えば前駆細胞の正体はわからなくてもよいが、調製物中におけるその存在は、本来の分化プロトコルが完了すれば目的の表現型が出現するという事実から推測することができる。従って、一実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて、in vivoにおけるその前駆細胞が未だ知られていない細胞型の発達上の前駆細胞を製造することができる。

こうした細胞を製造する1つの方法は、分化に至る、そして前駆細胞の単離に至るプロセスを改変もしくは省略する一連の培養段階を発見するためにWO2004/031369の方法を使用することである。本発明では、選択された薬剤に連続的に曝露することによって、in vivoにおける前駆細胞プールと実質的に同一である部分的に分化した状態で細胞を単離し、次いで更なる分化を誘導する因子についてスクリーニングすることができることが認識される。

本発明ではまた、天然の産物もしくは合成化合物の細胞ベースのスクリーニングにおいて生理的に関連する前駆細胞を用いれば、再生医薬の発見のためのスクリーニングアッセイで有効な薬剤候補物質を同定できる可能性がより高いことが認識される。生理的に関連する前駆細胞は、自己再生性の胚もしくは成体の幹細胞と比較して発達能が低く、発達経路において、これらの複能性細胞の下流に位置する。例えば、貧血の臨床治療におけるEPOの標的細胞型は、胚性幹細胞ではなく、自己再生性の成体造血幹細胞でもなく、むしろ、発達経路に沿ってより遠くに位置し、その発達上の能力がずっと制限されているより拘束された赤血球前駆細胞である（Fisher, Exp. Biol Med 2003 Jan;228(1):1-14）。この前駆細胞集団を薬剤発見スクリーニングアッセイにおける使用に利用できれば、赤血球の再生に対するEPOの効果はより明らかとなるであろう。一方、未分化のES細胞をスクリーニングに用いる場合には、適切なプロトコルを用いてこれらの細胞が赤血球に分化できるとしても、このEPOの再生効果はそれ程容易に明らかではない。従って、再生医薬を同定するための薬剤スクリーニングにおいては、複能性の自己再生性幹細胞よりはむしろ生理的に関連する前駆細胞を用いるべきである。

しかしながら、前駆細胞集団を使用する上での重要な問題は、これらが非常に調達困難であること、その増幅能が限定されていること、そして場合によっては完全には性状解析されていないことである。例えば、ある種の神経前駆細胞は周知であるが、生きた脳の中に存在するため、薬剤スクリーニングアッセイのために調達することは困難である。更に、肝臓はin vitroにおいて速やかに再生できる器官であり、肝生検は脳生検と比較して相対的に調達がより容易であるが、肝臓の再生に関連する前駆細胞集団はまだ決定的には同定されておらず、従って単離、培養、および薬剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができない。

本発明ではまた、再生医薬発見のスクリーニングアッセイに適した生理的に関連する前駆細胞は、自己再生性胚性もしくは成体幹細胞を関連前駆細胞の段階まで（しかしそれより先ではなく）分化させることができれば、これらの細胞から得ることができることが認識される。従って、当分野において、分化をモジュレートするのに用いることができる因子について後にスクリーニングするために、部分的に分化した細胞を単離する改良された技術に対する需要がある。

本発明は、生理的に関連する前駆細胞を含む部分的に分化した細胞型を単離する方法に関する。一実施形態において、これは、幹細胞を取得し、これを分化プロトコルを発見するためのWO2004/031369に記載された技術にかけ、更に、分化プロセスを標的の前駆細胞が存在する段階で留めるか、もしくはこれを通り過ぎないようにこのプロトコルを改変することで達成される。別の実施形態において、成体幹細胞プールからこれらを単離し、種々の発達段階に胎児もしくは動物を発達させ、場合によって、in vitroで増幅することができるようにこれを改変することに関する。更に、これらの前駆細胞は、天然産物および細胞シグナリングの小分子モジュレーター候補物質をスクリーニングするアッセイにおいて使用し、前駆細胞における細胞シグナリングに影響して、例えば動員、増幅もしくは分化を引き起こす薬剤であって、再生医療に発展させることができる薬剤を同定することができる。

本発明の態様および実施形態
第一の態様において、以下の段階：
（ａ）第一の細胞型を1以上、好ましくは2以上の反応条件に連続的に曝露することによって前駆細胞を経て第二の細胞型に分化させることができる、第一の細胞型の細胞を提供し；
（ｂ）潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件への曝露を、前駆細胞が曝露された上記2以上の反応条件の少なくとも1つに追加するか、またはこれと置き換え；そして
（ｃ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する；
を含む、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法が提供される。

更なる態様において、以下の段階：
（ａ）第一の細胞型を2以上の反応条件に連続的に曝露することによって前駆細胞を経て第二の細胞型に分化することができる、第一の細胞型の細胞を提供し；
（ｂ）潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件への曝露を、前駆細胞が曝露された上記2以上の反応条件の少なくとも1つに追加するか、またはこれと置き換え；そして
（ｃ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する；
を含む、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法であって、第二の細胞型への細胞の分化が、潜在的モジュレーターが細胞分化経路をモジュレートすることを示すものである、上記方法が提供される。

本発明はまた、発生の早期段階にある生物からの誘導によって、細胞を部分的に分化した状態で単離し、場合により増殖し、場合により更に分化させ、次いで標的の細胞系統または表現型への分化を誘導するモジュレーターについてスクリーニングできることを認識する。

従って、一実施形態において、第一の細胞型は胚もしくは胎児から得られるか、または得ることができ、場合によって増殖が可能なように改変される。

一実施形態において、前駆細胞は、第一の細胞型から、1以上（例えば2以上）の反応条件に曝露（例えば連続的に曝露）することによってin vitroで誘導される。

別の実施形態において、細胞は、細胞分化の代わりに細胞死についてモニタリングされる。従って、スクリーニングは毒性スクリーニングであり得る。

一実施形態において、反応条件は、潜在的モジュレーターのスクリーニング（例えば少なくとも100種の潜在的モジュレーター、少なくとも1000種の潜在的モジュレーター、または少なくとも10,000種の潜在的モジュレーターのスクリーニング）を含む。

別の実施形態において、第一の細胞型は自己再生性の幹細胞である。

本発明は細胞単位（cell units）を利用する。こうした単位は単一の細胞であっても良いが、有利には、スプリット−プール培養方法の間であっても破壊に対して抵抗性を有する形態に配置された2個以上の細胞のコロニーである。例えば、細胞は、後でより詳細に説明するように、ビーズ等の固相基体上で培養することができる。本発明において、細胞単位は、培地中への薬剤の連続的添加によって引き起こされる分化プロセスの任意の段階で単離することができる。従って、上記のように、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法であって、部分的に分化した細胞単位を次に単離し、細胞シグナリング経路に対するモジュレーターの効果を同定するために記載した方法において用いる、上記方法が提供される。

典型的には、用いる細胞単位は、細胞単位の実質的な破壊なしに液相中でのHTSスクリーニングシステムに移すために十分小さいマイクロキャリアである。このシステムによって、スクリーニングに適した量での分化した細胞の産生、またHTSアッセイの設置が非常に容易になる。特に、1つの容器からもう1つの容器へ細胞を移すことを可能とするためにタンパク分解的消化等によって細胞を予め破壊することをせずに、細胞をHTSに使用することも可能となり、このことは、こうしたプロセスが細胞の直後の分化状態または下流の分化能に影響し得ることから、有利である。更に、ロボットシステムを用いた細胞の自動化された移動が可能となる。

従って、スクリーニングに先立って細胞材料を調製するために細胞単位−例えばマイクロキャリア上で増殖した細胞単位−を使用することの重要な利点は、調製プロセス中に生じた、下流の分化スクリーニングのために重要であり得る、細胞ニッチ（niche）を保存することである。細胞材料を慣用方法で調製し、ウェルに分配するために崩壊させた場合、このニッチは崩壊するであろう。他方、スクリーニングのために細胞材料を別個のウェルで調製した場合、生じた調製物のウェルごとの変動によって、薬剤スクリーニングが解釈困難なものとなるであろう。

有利には、特定の応用例において細胞単位を標識することができる。標識によって、細胞が曝露された培養条件の追跡が可能となる。従って、任意の所与の細胞単位について、それが出発細胞プールもしくは培養物からいかにして得られたかを決定するために、その標識を読み取ることができる。標識は、表面もしくはマトリックス上の細胞単位の核酸標識、高周波コードタグ、マイクロスフェアタグ、バーコードタグ、および空間コード付けを含む、種々の形態のいずれをとっていても良い。

標識は、ウイルス、オリゴヌクレオチド、ペプチド、蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定同位体の混合物、バーコード、光学タグ、ビーズ、量子ドットおよび高周波コードタグからなる群より選択され得る。この群から2以上の標識、例えば蛍光化合物および／または量子ドットを含むビーズ、を選択し、組み合わせて用いて細胞単位を標識することもできる。標識方法、および細胞単位と共に用いられる特定の標識については、我々の同時に継続中の出願GB01517382.8（参照により本明細書に組み入れる）中で更に議論されている。

細胞は、それぞれが1以上の細胞を含む細胞単位中で培養され得る。別の実施形態において、細胞単位は単一の細胞である。細胞単位は、固相基体に付着した、もしくは結合された1個以上の細胞を含み得る。更なる実施形態において、固相基体はマイクロキャリアまたはビーズである。更に別の実施形態においては、固相基体はウェルまたは培地透過性のバリアである。培養条件は、細胞が曝露される培地であり得る。培地は、細胞プロセスに影響する1以上の特定の薬剤を含有し得る。

一実施形態において、反応条件は、細胞が単離・操作される任意の生理的もしくは化学的培地を包含するが、適切には、反応条件は、細胞が曝露される培養条件である。培養条件としては、増殖培地、温度、基体、大気条件、物理的細胞操作等が挙げられる。増殖培地は、細胞を育て、影響を与える天然および合成の物質を含み、基本培地、増殖因子、栄養素、緩衝剤、化学物質、薬剤等が挙げられるがこれらに限定されない。反応条件は、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターのスクリーニングを含むこともできる。

本発明を用いて、発生の任意の段階において第一の細胞型の分化をモニタリングすることができるが、本発明者等は、培養が比較的容易であること、多能性および治療能力のために、幹細胞が第一の細胞型として特に適していることを認識する。従って、一実施形態において、本発明は、第一の細胞型が、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された細胞である、上記の方法を提供する。

一実施形態において、細胞型は、一次細胞、細胞系または腫瘍由来の細胞系である。細胞型の起源組織は、脳、心臓、肝臓、肺、毛髪、眼、内臓、血液、耳、腎臓、皮膚、歯、膵臓、筋肉、骨および血管系からなる群より選択され得る。

別の実施形態において、部分的に分化した細胞型もしくは前駆体の細胞型の使用が提供される。上記細胞型は、生物から単離するか、または分化に対する培養条件の効果を決定する方法を用いて、多能性細胞から製造し；更に分化に影響する細胞シグナリング経路に対するモジュレーターの効果を同定する方法に供することができる。分化に影響する細胞シグナリング経路に対するモジュレーターの効果を同定する方法は、製薬会社が通常使用する薬剤探索技術を用いて潜在的モジュレーターをスクリーニングすることを含み得る（「薬剤探索の改革（Reinventing Drug Discovery）」 Executive Briefing, Accenture, 1997; 「高性能の薬剤探索（High Performance Drug Discovery）」 Executive Briefing, Accenture, 2001）。

別の実施形態において、前駆細胞または部分的に分化した細胞を潜在的モジュレーターに曝露し、次いで分化のプロセスに対するモジュレーターの効果をモニタリングする方法が提供される。一実施形態において、潜在的モジュレーターは細胞シグナリング経路の阻害剤である。別の実施形態において、潜在的モジュレーターは細胞シグナリング経路の促進剤である。分化に影響する細胞シグナリング経路を促進または阻害するモジュレーターの効果は、限定するものではないが、細胞の表現型、レポーター遺伝子の発現、遺伝子型、分子産生、生存能、代謝変化または増殖能をモニタリングすることを含む適切なアッセイによって評価することができる。

本発明は、発達しつつある胚および胎児の組織もしくは実際に成体の組織から前駆細胞または部分的に分化した細胞を得る方法を提供する。組織は胎児から成体の段階を通じて発達するため、それらは、発達する能力が次第に制限される幹細胞を発達させて、究極的には成体幹細胞になる。従って、生物の任意の発達時点で、前駆細胞は、組織から、例えば動物の胎児または人工妊娠中絶直後に得られたヒトの胎児から摘出することができる。例えば、ドーパミン産生細胞への前駆細胞を含む細胞は、胎児の発達中の中枢神経系の特定の領域から単離することができる。胎児の材料から得られる細胞は非常に少ないため、これらの細胞は増幅させることが必要である。この場合、例えばc-myc等の癌遺伝子を用いてこれらの細胞を形質転換させることで、その分化状態に影響を与えずに、これを行うことができる。適切には、形質転換は可逆的であり、前駆細胞の分化につながるものではない。本発明では、胎児もしくは成体幹細胞材料が、前駆細胞を産生するために更なる分化を必要とする場合があり、ES細胞等の他の幹細胞のために以下に開示する方法によってこれを達成できることが認識される。

本発明はまた、胚性幹細胞の系列を含むがこれに限定されない多能性細胞系から、分化プロトコルを決定し、これを一部実施することによって、前駆細胞または部分的に分化した細胞を得る方法を提供する。この場合、得られる細胞集団には、1以上の前駆細胞が含まれるであろう。集団中のどの程度の比率の細胞が前駆細胞であるかを知る必要もないし、これらを同定できる必要もないが、（停止させる代わりに）上記の分化プロトコルを完了させれば完全に分化した細胞がこれらから生じるという事実から、これらの存在を推測することができる。

分化プロトコルは、典型的には、細胞を時間的に特定された一連の適切な培養条件に付すことを含む。前駆細胞を生じる細胞は、この連続的な細胞培養方法を用いて所望の発達経路に沿って分化するように誘導され得る。細胞はその分化プロセスの任意の段階で停止させることができ、従って、一連の適切な培養条件を中断または改変することによって前駆細胞が得られる。例えば、ES細胞をマクロファージに分化させるために5つの細胞培養段階のシリーズを含む10日間の分化プロトコルが必要な場合、このシリーズの段階の3つのみを完全に実施すると、その系統に沿ったES細胞の部分的な分化が生じ、マクロファージ前駆細胞の単離が可能になるであろう。

複数の培養条件を同定するために記載した方法によって、数千種または数百万種の細胞培養条件および試薬を多重化ハイスループットアッセイで試験し、細胞の分化を達成するために必要な条件を決定することが可能である。

本発明の別の態様において、先に記載されたような細胞シグナリングのモジュレーターを同定するための方法であって、細胞シグナリングおよび／または細胞内の1以上の遺伝子の発現をモジュレートすることによって第一の細胞を第二の細胞型に分化させる方法が提供される。

細胞シグナリングおよび／または細胞内の遺伝子の発現は、例えば因子、増殖因子、モルフォゲン、ホルモン、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、脂質、抗体、薬剤等の生体分子の添加によって、あるいは合成薬剤、化学物質、小分子等の添加によってモジュレートすることができる。適切には、上記のモジュレーターは、細胞抽出物由来、共培養物由来、動物血清中、またはin vitroで調製したカクテル等の組み合わせで添加される。

細胞シグナリングおよび／または遺伝子の発現はまた、遺伝子が一時的、リガンド誘導的、または永久的に発現または過剰発現するように、遺伝子の細胞中へのトランスフェクトもしくは他の導入によってモジュレートすることができる。あるいはまた、標的をもったエンハンサー挿入または遺伝子の発現の上昇もしくは低下を引き起こす外来性薬剤の投与等によって、内在性遺伝子の発現を変えることもできる。更に、同じ結果を達成するために、遺伝子産物自体を細胞に投与してもよく、あるいはその活性を細胞から除去しても良い。遺伝子の発現を低下させ得るモジュレーターとしては干渉RNAもしくはアンチセンス化合物が挙げられ、タンパク質の活性を低下させ得るモジュレーターとしては薬剤、抗体、アプタマー等が挙げられる。

一態様において、細胞の分化は、細胞の表現型を観察するか、または細胞中の1以上の遺伝子の発現のモジュレーションを検出することによってモニタリングし、それによって該細胞の分化の状態を決定する。表現型の決定は、種々の技術により、例えば顕微鏡による細胞単位の外観検査により、または高含量スクリーニングおよび解析装置（Cellomics Inc; www.cellomics.comを参照のこと）を用いて実施することができる。あるいはまた、分化した細胞に特徴的なマーカー産物を観察することによって分化を検出することができる。このマーカーは、特定のDNAもしくはRNA配列、リガンドによって検出できる細胞タンパク質、酵素基質の変換、または特定の表現型マーカーを認識する抗体等の内在性マーカーであっても良い。分化マーカーはまた、外来性、すなわち、例えばトランスフェクションもしくはウイルス形質導入によって細胞集団に導入されたものであっても良い。外来性マーカーの例は、特定の細胞系統で通常は発現しないか、またはエピトープで改変されているか、もしくは異なる種由来である、蛍光タンパク質（例えばGFP）または細胞表面抗原である。転写調節エレメントと結合させた導入遺伝子もしくは外来性マーカー遺伝子は、表現型または分化状態を示す内在性遺伝子に代表的なパターンを反映するように発現させることができる。これは、遺伝子を、細胞型特異的プロモーターと結合させることによって、または特定の遺伝子座に導入遺伝子を組み込むことによって達成することができる（例えばヨーロッパ特許No.EP 0695351を参照のこと）。分化を示すマーカーは、顕微鏡による観察、アフィニティー精製（「パンニング」）、または蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を含む、手動および自動双方の種々の技術によって検出することができる。従って、本発明は、細胞の1以上の分化状態に応答する1以上のレポーター遺伝子の発現のモジュレーションを観察する、分化のモニタリング方法を提供する。

更なる実施形態において、関与する遺伝子の発現は遺伝子チップ上でモニタリングする。遺伝子発現は、Affymetrix等の供給業者から広範囲に入手できる遺伝子チップまたはアレイ技術を用いて都合良く解析することができる。

有利には、この解析で用いられる遺伝子は、例えばイムノアッセイによって検出できる細胞外マーカーをコードする。

本発明の別の実施形態において、細胞の分化を増殖能の消失によってモニタリングする。

本発明は更に、ビーズ等のマイクロキャリアに接着した幹細胞、およびin vitroにおいて幹細胞から得られる分化した細胞を培養する方法を提供する。マイクロキャリア培養は、培養のスケールアップを含む顕著な利点があり、また幹細胞の単位が、所望の増殖および／または分化状態を得るために必要な選択された培養条件に曝露されることを可能にする。

潜在的モジュレーターは、有機もしくは無機の小分子、天然もしくは誘導体化した炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質−核酸（PNA）を含み得る。別の実施形態において、潜在的モジュレーターは、薬剤様の性質を有する小分子のライブラリーから得られる。

更なる態様において、本明細書に記載の方法によって得られる、または得ることができる細胞シグナリング経路のモジュレーターが提供される。

別の態様において、モジュレーターを、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する医薬組成物が提供される。

更なる態様において、幹細胞からin vitroで分化し、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された、部分的に分化した細胞が提供される。部分的に分化した細胞は、神経細胞または造血細胞であって良い。部分的に分化した細胞は両能性（二系統への分化能を有する）細胞であって良い。部分的に分化した細胞は単能性細胞であって良い。

更なる態様において、前駆細胞の使用を含む、細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）の同定方法が提供される。

更なる態様において、幹細胞からin vitroで分化し、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された部分的に分化した細胞の使用を含む、細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）の同定方法が提供される。

更なる態様において、細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）を同定するための薬剤スクリーニングアッセイにおける前駆細胞の使用が提供される。

更なる態様において、細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）を同定するための薬剤スクリーニングアッセイにおける、幹細胞からin vitroで分化し、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された、部分的に分化した細胞の使用が提供される。

更なる態様において、ゼラチンマイクロキャリア（例えばCultiSpherマイクロキャリア）の使用を含む、胚性幹細胞の骨髄系統前駆細胞への分化のための方法が提供される。

更なる態様において、胚性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるためのゼラチンマイクロキャリア（例えばCultiSpherマイクロキャリア）の使用が提供される。

更なる態様において、幹細胞からin vitroで造血細胞を製造する方法であって、幹細胞を1以上、好ましくは2以上の反応条件に曝露することを含み、該反応条件が、幹細胞を（ａ）レチノイン酸、ジメチルスルホキシド（DMSO）および／もしくは幹細胞因子（SCF）；および（ｂ）インスリン、幹細胞因子（SCF）、TGFβ1、BMP2、BMP4および／もしくはTPO；および（ｃ）IL-3、IL-6、TPO、EPOおよび／もしくはM-CSFと共にインキュベートすることを含む、上記方法が提供される。

一実施形態において、幹細胞は、ゼラチンマイクロキャリア等のマイクロキャリア上にまかれる。

一実施形態において、幹細胞は、IMDM基本培地またはStreamline造血細胞増殖用培地（Haematopoietic Expansion Medium）中に含まれる。

一実施形態において、段階（ｂ）でインスリン単独を用いる。

一実施形態において、段階（ｂ）でSCF、TGFβ1、BMP2およびTPOを用いる。

一実施形態において、段階（ｃ）でIL-3およびIL-6を用いる。別の実施形態において、TPO、EPOおよび／またはM-CSFも用いる。

一実施形態において、段階（ａ）を1日目に実施する。

一実施形態において、段階（ｂ）を4日目に実施する。

一実施形態において、段階（ｃ）を6日目に実施する。

定義
培養条件
本明細書で用いる場合、用語「培養条件」とは、細胞の増殖もしくは分化を促進するために細胞がおかれる、または曝露される環境をいう。従って、この用語は、細胞の増殖および／または分化に影響し得る、培地、温度、大気条件、基体、攪拌条件等をいう。より特定すれば、この用語は、培地中に取り込まれ得る、そして細胞の増殖および／または分化に影響し得る特定の物質をいう。

細胞
本明細書においていう「細胞」とは、1以上の核、細胞質、および種々の細胞小器官から構成され、全てが半透性の細胞膜もしくは細胞壁で囲まれた、独立して機能し得る生物の最小構造単位、または単細胞生物として定義される。細胞は前核生物であっても、真核生物であっても、また古細菌であっても良い。例えば、細胞は真核生物細胞であり得る。哺乳動物細胞、特にヒトの細胞が適切である。細胞は、天然のものであっても、例えば遺伝的操作もしくは継代培養によって所望の性質を達成するように改変されたものであっても良い。「幹細胞」は、以下でより詳細に定義するものであり、2以上の分化した細胞型を生じることができる全能性、多能性（pluripotent）もしくは複能性（multipotent）細胞である。幹細胞はin vitroで分化して、それ自体が複能性であっても良く、もしくは最終的に分化したものでも良い、分化した細胞を生じることができる。in vitroで分化した細胞は、細胞分化を促進する1以上の薬剤に幹細胞を曝露することによって人工的に作製した細胞である。

第一の細胞型
一実施形態において、第一の細胞型は、細胞分裂を通じて自身を再生する能力を保持しており、広範囲の専門化した細胞型に分化し得る細胞である。別の実施形態において、第一の細胞型は、前駆細胞よりも分化の程度が低い細胞である。別の実施形態において、第一の細胞型は、本明細書において以下に記載する幹細胞である。幹細胞は、例えば胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。第一の型の細胞は、第二の細胞型の細胞をスクリーニングする前に第二の細胞型の特定の系統に分化し得る。従って、一実施形態において、第一の細胞型は、2以上（例えば3以上、4以上、または5以上）の反応条件に第一の細胞型を曝露（例えば連続的曝露）することによって第二の細胞型に分化する。

第二の細胞型
一実施形態において、第二の細胞型は、分化することのみはできるが、もはや自身の再生はできない細胞である。第二の細胞型は、第一の細胞型よりもなり得る細胞の種類がより限定され得る。第二の細胞は第一の細胞型よりもより分化していて良い。第二の細胞は前駆細胞よりもより分化していて良い。一実施形態において、第二の細胞型は、第一の細胞型からin vitroで分化し、第一の型の細胞（例えば幹細胞）と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された、部分的に分化した細胞である。別の実施形態において、第二の細胞型は、標的細胞の表現型を有する細胞である。

再生医療または医薬
用語「再生医薬」とは、幹細胞もしくは前駆細胞に作用し、従って体内の組織もしくは器官を再生・修復し得る天然または合成の物質をいう。「再生医療」とは、同じものをいうか、あるいは医学的処置として組織または器官を再生する分野をいう。再生医療には、細胞置換療法、および／または再生医薬の患者への投与が包含される。

前駆細胞
「前駆体」または「前駆細胞」は、より分化した細胞の上流であるが、真の幹細胞の下流に位置する細胞型である。前駆細胞は、典型的には真の幹細胞のようには長期の自己再生ができず、その分化能は幹細胞よりも制限されている。例えば、CFU-EおよびBFU-Eは赤血球に関与する前駆細胞集団であり、一方LT-HSCは自己再生性および複能性の造血幹細胞であり、ES細胞は自己再生性および多能性の幹細胞である。分化した赤血球はCFU-Eから得ることができるが、これはLT-HSCから得ることができ、LT-HSCはES細胞から得ることができる。

細胞シグナリング
用語「細胞シグナリング」とは、細胞が外部刺激を検出し、これに応答して、他の細胞にメッセージを送る分子メカニズムをいう。従って細胞シグナリングには、転写および翻訳の制御およびメカニズム、並びにシグナル伝達メカニズムが含まれる。

モジュレーター
用語「モジュレーター」とは、細胞の状態を変えることができ、それを1つの状態からもう1つの状態に変える任意の因子をいう。本発明の文脈において、これは細胞シグナリングプロセスのモジュレーションをいう。モジュレーターは特定の細胞シグナリング経路を阻害または促進し得る。それらは天然の産物または化学的に合成された分子；例えば有機もしくは無機の小分子、天然もしくは誘導体化した炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質−核酸（PNA）の形態をとり得る。モジュレーターはまた、アゴニストまたはアンタゴニストを含む。阻害剤であるモジュレーターには、限定するものではないが、非特異的、不可逆的、可逆的−競合的および非競合的阻害剤が含まれる。細胞シグナリングを促進するモジュレーターは、細胞に対する特定の分子経路の効果を刺激または増大するものであり、限定するものではないが、アゴニスト、アゴニスト模倣物、補助因子、プロモーター等が含まれる。

増幅
「増幅」とは、細胞、細胞成分もしくは細胞プロセスの規模または数の上昇が生じるプロセスをいう。特に、増幅とは、細胞培養システムにおける細胞数増加のプロセスをいう。これは、システム中の細胞の増殖または生存の比率を増大させることによって生じ得る。

化合物
用語「化合物」は、本明細書において、当分野で通常これに割り振られる意味に従って用いられる。用語「化合物」は、その最も広い意味、すなわち、分子および超分子複合体を含む、固定された比率で2以上の元素を含む物質、に用いられる。この定義は、医薬品の大部分を占める小分子（典型的には＜500ダルトン）を含む。しかしながら、この定義はまた、ポリマー、例えばポリペプチド、核酸および炭水化物、およびこれらの超分子複合体を含む、より大きな分子も含む。

ハイスループットスクリーニング
用語「ハイスループットスクリーニング」とは、並行的な標的ベースまたは細胞ベースのアッセイにおける、化合物の大規模な試行錯誤による評価をいう。

化合物ライブラリー
「化合物ライブラリー」は、薬剤発見プロセスにおいて新規なリード候補を同定するために使用することができる多様な化合物のグループである。化合物ライブラリーは、コンビナトリアル化学、化合物進化を含む、当分野において公知の任意の手段で作製するか、または市販品の供給元（例えばSigma Aldrich、Discovery Partners International、MaybridgeおよびTripos）から購入することができる。レパートリーは、有利には、少なくとも10²種、10³種、10⁴種、10⁵種、10⁶種、10⁷種、10⁸種、10⁹種、10¹⁰種、10¹¹種、またはより多くの異なる化合物を含み、これらは構造または機能において関連していても関連していなくても良い。

モジュレーション
用語「モジュレーション」は、モジュレートされているパラメーターの上昇および／または低下を示すために用いられる。従って、遺伝子発現のモジュレーションには、遺伝子発現の上昇および遺伝子発現の低下の双方が含まれる。

細胞プロセス
細胞プロセスは、生じるか観察される、または細胞に起因し得る、細胞内または細胞外での任意の特徴、機能、プロセス、事象、原因もしくは効果である。細胞プロセスの例として、限定するものではないが、生存能、老化、死、多能性、形態、シグナリング、結合、認識、分子産生もしくは破壊（分解）、変異、タンパク質の折り畳み、転写、翻訳、触媒、シナプス伝達、小胞輸送、細胞小器官機能、細胞周期、代謝、増殖、分裂、分化、表現型、遺伝子型、遺伝子発現、またはこれらのプロセスの調節が挙げられる。

細胞単位
細胞のグループであって、1種のグループであって良い。細胞単位のプールは、細胞単位が細胞のコロニーとして振る舞い、細胞単位中の各細胞が同じ培養条件に曝露されるように、細胞単位自体を実質的に分離することなく選別し、細分し、操作することができる。例えば、細胞単位は細胞のグループが接着したビーズを含み得る。

全能性
全能性細胞は、その生物内で見られる任意の型の体細胞または生殖細胞に分化する能力を有する細胞である。従って、全能性細胞から、何らかの手段によって所望の任意の細胞を得ることができる。

多能性（pluripotent）または複能性（multipotent）
多能性または複能性細胞は、2以上の、しかしおそらく全てではない細胞型に分化し得る細胞である。

標識
本明細書で用いる「標識」または「タグ」は、細胞単位を同定する、および／または細胞単位が曝露された培養条件、もしくは一連の培養条件を決定するための手段である。従って、標識は、標識のグループであって、各々が特定の培養段階で付けられたものであっても；実験の最初に付けられ、細胞単位が曝露される培養段階に従って改変されるか、培養段階の間追跡されるた標識であっても；あるいは単に用いた培養段階の推測を可能にする位置照会であっても良い。標識またはタグは、任意の1時点での細胞単位の位置もしくはアイデンティティーを報告もしくは記録し、または細胞単位に独特の識別子を割り当てるデバイスであっても良い。標識またはタグの例は、独特の配列、構造もしくは質量の分子；または蛍光分子もしくはビーズ等の物体；または高周波および他のトランスポンダー；または独特のマーク・色・形状を有する物体である。

培養条件への曝露
細胞は、細胞の増殖、分化、もしくは代謝状態等の1以上の細胞プロセスに影響する条件下で培地と接触しておかれた場合、または増殖させた場合、培養条件に曝露される。従って、培養条件が、細胞を培地中で培養することを含む場合、細胞は、培地が効果を発揮できる十分な時間培地中におかれる。同様に、条件が温度条件である場合、細胞は所望の温度で培養される。

プーリング
細胞単位の1以上のグループのプーリングは、グループを混合して、2以上のバックグラウンドの、すなわち2以上の異なるセットの培養条件に曝露した細胞単位を含む、単一のグループまたはプールを作製することを含む。プールは更にランダムもしくは非ランダムにグループに分割することができ、こうしたグループはそれ自体は本発明の目的の「プール」ではないが、例えば異なるセットの培養条件に曝露した後に組み合わせてそれ自体をプールすることができる。

増殖
本明細書において、細胞成長および細胞増殖は、別の細胞型または系統への分化なしの細胞数の増加を示すように互換可能に用いられる。換言すれば、この用語は、生存細胞数の増加を示す。一実施形態において、増殖は、表現型または遺伝子型の目に見える変化を伴わない。

分化
細胞分化は、ある細胞型から異なる細胞型への発達である。例えば、両能性、多能性または全能性細胞は、神経細胞に分化し得る。分化は、増殖が伴っていても良く、またそれと無関係であっても良い。用語「分化」は一般に、より発達度が低いと定義される細胞型からの成熟した細胞型の表現型の獲得をいう（例えばニューロンもしくはリンパ球）が、トランス分化を除外するものではなく、トランス分化によって、1つの成熟した細胞型がもう1つの成熟した細胞型に変換し得る（例えばニューロンからリンパ球）。本出願において「分化」は「脱分化」を意味するようにとられ、逆もまたあり得る。一般には、「脱分化」とは、より発達していると定義される細胞型からの成熟度の低い細胞型の表現型の獲得、例えばミオサイトが筋原性前駆細胞になる場合をいう。脱分化は更なる分化が続いて生じて本来の細胞型、または更に別の細胞型に戻ることがある［Ding & Shultz (2004) Nature Biotechnology 22: 833-840およびその参考文献］。

分化状態
細胞の分化状態は、細胞が特定の経路または系統に沿って分化したレベルである。

細胞プロセスの状態
細胞プロセスの状態とは、細胞プロセスが生じているか否かをいい、複雑な細胞プロセスではその細胞プロセスにおける特定の段階またはステージを示し得る。例えば、細胞における細胞分化経路は不活性であっても誘導されていても良く、酵素もしくは中間体の特徴的なセットの存在によって特徴付けられるシグナリング事象のように、多くの個別の段階または成分を含んでいても良い。

遺伝子
遺伝子は、遺伝子産物（ポリペプチドまたはRNA遺伝子産物）をコードする核酸である。本明細書において用いる場合、遺伝子は、少なくとも遺伝子産物をコードするコーディング配列を含み、場合によって、コーディング配列の転写および／または翻訳に必要な1以上の調節領域を含んでいても良い。

遺伝子産物
遺伝子産物は、典型的には、伝統的な方法で遺伝子によってコードされたタンパク質である。しかしながら、この用語はまた、遺伝子によってコードされるリボ核酸等の非ポリペプチド遺伝子産物も包含する。

核酸合成
核酸は、利用可能な任意の技術に従って合成することができる。一実施形態において、核酸合成は自動化される。更に、核酸は、当分野において公知の方法に従って、細菌または真核生物細胞におけるクローニングおよび複製等の生物学的複製によって製造することができる。

示差的発現
細胞培養条件に応答して異なるレベルで発現する遺伝子は、例えば当分野で公知の方法による遺伝子アレイ上での遺伝子発現解析によって同定することができる。示差的に発現する遺伝子は、総体的な遺伝子発現レベルと比較して、試験的条件下で、別の条件下よりも細胞中により多量もしくはより少量のmRNAまたは遺伝子産物を提示する。

トランスフェクション
遺伝子は、適切な任意の手段によって細胞中にトランスフェクトされ得る。この用語は、本明細書において、例えばリン酸カルシウムを用いた伝統的なトランスフェクションを意味するために用いるが、また、形質転換、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション等を含む、細胞中への核酸の導入のための他の技術を含むように用いられる。

細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイは現代の生命医科学の重要な部分であり、細胞を用いる段階を含む任意のアッセイを含む。細胞ベースアッセイは薬剤の発見および開発プロセスのほとんど全ての段階にわたって使用することができ、ある化合物が、単に単離された潜在的薬剤標的とどのように相互作用するかについてだけでなく、生物学的システムの中でどのように相互作用し得るかについての情報を提供する上で貴重である。

例えば、細胞ベースアッセイを使用して、潜在的薬剤標的を同定し、確認することができる。疾患プロセスに関与する遺伝子もしくは細胞経路を同定するため、標的遺伝子の機能を決定するため、または特定の遺伝子もしくはその産物の活性化後に誘導され得る表現型の変化を測定するために用いることができる細胞ベースアッセイが開発されている。

細胞ベースアッセイはまた、薬剤発見において、リード化合物の発見、選択、および最適化のために用いることができる。伝統的なハイスループットスクリーニングアッセイにおいてしばしば用いられる生化学的アッセイとは異なり、細胞ベースアッセイは、吸着、透過性、選択性、特異性、および代謝等の薬剤の性質に関する情報を提供することができる。結果として、細胞ベースのスクリーニングの後に選択されるリード化合物は、性状解析がより良くなされており、貴重なリード化合物を提供できる可能性が高く、薬剤発見プロセスの次の段階で排除される可能性がより低いと思われる。

細胞ベースアッセイの主要な用途は毒性スクリーニングにおいてである。薬剤発見および開発の重要な部分は、副作用を引き起こすであろう化合物を排除するための薬剤候補物質のスクリーニングである。しかしながら、現在の方法論は非常に不適切であり、特に毒性スクリーニングのための動物モデルの使用は高価であり、かつ多大な時間を必要とする。更に、動物モデルにおける結果は、化合物がヒトにおいていかに挙動するかを常に正確に予測するものではないため、信頼できない。従って、ヒトの細胞ベーススクリーニングが適切である。

スクリーニングアッセイおよびHTS
新規な薬剤標的についてスクリーニングするために、本発明においてハイスループットスクリーニング（HTS）を用いることができる。薬学研究活動の重点は、新規な化学クラスで新規な分子標的を意図的に発見することにシフトした。この重点の変化、および時宜に適った技術的ブレイクスルー（例えば分子生物学、実験室の自動化、コンビナトリアル化学）によってハイスループットスクリーニング、もしくはHTSが誕生し、今や生物薬剤工業全体に広まっている。

ハイスループットスクリーニングにはいくつかの段階が含まれる：特定の生理的応答を予測するアッセイを作製し；再現性良く多数回実施できるようにアッセイを自動化し；そして化学ライブラリーからのサンプルを順番に試験してアッセイで「ヒット」することができる化学構造を特定する。そのような構造は意図される生理的応答を誘発し得ることが示唆される。ハイスループットスクリーニングでヒットしたものは、種々の二次的アッセイで追跡され、人工的な結果、特に毒性化合物は排除される。従って、ハイスループットスクリーニングで使用されるアッセイは、特定の生物学的もしくは生化学的特性を有する化学的サンプル（例えば化合物、基質、分子）の存在を検出することが意図される。これらの特性は、in vivoで適用した場合に特定の生物学的応答を引き出す能力を有する化合物を同定するために選択される。ハイスループットスクリーニングによって、医薬そのものとして使用し得る薬剤、更に最終的に医薬として使用されるであろう医薬候補物質の双方が同定される。ハイスループットアッセイにおいて所望の生物学的特性をある程度有することが見出された特定の化学物質のクラスの化合物は、次いで化合物誘導体の合成の基礎となり得る。細胞ベースアッセイは培養中のインタクトな細胞を利用する。こうしたアッセイの例として、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイおよびカルシウムフラックスアッセイが挙げられる。

本発明において記載したように、分化モジュレーターおよび再生医薬の同定のために適した細胞ベースアッセイを実施する特に強力な方法は、分化の遺伝子マーカーをモニタリングすることによって前駆細胞の分化状態を決定することである。マーカーは、分化した細胞型において特異的に存在するが、その前駆細胞には存在しない、またスクリーニングのために用いる細胞集団に存在する他の任意の細胞にも存在しない、発現したヌクレオチド配列もしくはタンパク質等の内在性のものであっても良い。マーカーはまた、分化した細胞型において特異的に発現するが、その前駆細胞には発現しない、またスクリーニングのために用いる細胞集団に存在する他の任意の細胞にも発現しないように、スクリーニングのために用いる細胞集団中に導入される外来性マーカー（すなわちレポーター遺伝子）であっても良い。外来性マーカーの例は、LacZ等の酵素、または蛍光タンパク質（例えばGFP、YFP等）等の非酵素マーカー、または特定の細胞系統で通常は発現しないか、エピトープ改変した、もしくは異なる種由来の細胞表面抗原である。結合した転写調節エレメントを有する導入遺伝子もしくは外来性マーカー遺伝子は、内在性遺伝子に代表的なパターンを反映するように発現させることができる。これは、遺伝子を細胞型特異的プロモーターのエレメントと結合させることによって、または細胞型特異的に発現する特定の遺伝子座中に導入遺伝子を組み込むことによって達成することができる（例えばヨーロッパ特許No. EP 0695351を参照のこと）。

一実施形態において、本発明における出発物質として用いられる未分化の細胞型は、2種のマーカー／レポーター（例えばGFPおよびYFPの双方）を、一方のマーカーがHTSプロセスにかけられる前駆細胞型の存在を示し、他方のマーカーが適切なモジュレーターの添加によって製造される分化した細胞型の存在を示すように発現するために改変される。

デュアルレポーターシステムを含む、多くの適切なレポーター遺伝子のシステムおよび細胞スクリーニングアッセイが、Hill等［Current Opinion in Pharmacology (2001) 1:526-532］およびBlake［Current Opinion in Pharmacology (2001) 1:533-539］による概説（およびその中の参考文献）に開示されており、これらの全てを全体として本明細書に組み入れる。

前駆細胞
前駆細胞は、分化および増殖によって完全に分化した機能性の子孫を産生する能力を有する任意の体細胞である。前駆細胞としては、限定するものではないが、血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺等を含む任意の組織または器官系由来の前駆細胞が挙げられる。

前駆細胞は分化した細胞（すなわち増殖(自己複製)能を有しても有していなくても良いが、通常の生理的条件下において異なる細胞型に更に分化することはできない細胞）とは区別することができる。前駆細胞は更に、異常な細胞（増殖(自己複製)するが、未成熟もしくは未分化な外見をしているにも関わらず、一般には更に分化しない癌細胞、特に白血病細胞等）と区別することができる。

前駆細胞には、最も分化した、もしくは完全に成熟した細胞以前の分化および増殖の系統における全ての細胞が含まれる。

本発明の一実施形態に従って、「幹細胞」と「前駆細胞」との間に境界線を引く。幹細胞は、典型的には多能性および複能性であり、多くの系統を生じることができる。前駆細胞、および特に系統が拘束された前駆細胞は、単一の系統の細胞を産生できるだけである。従って前駆細胞の発達能力は、典型的には幹細胞のそれよりも、より限定されている。幹細胞と前駆細胞との間の第二の重要な違いは、幹細胞が−無制限に分裂できる正しい培養条件下で−顕著な増幅が可能であるのに対して、前駆細胞は限定された増殖能を有していることである。これらの差異は、例えば、造血幹細胞を使用して動物の造血系を再構成することは可能であるが、造血前駆細胞では不可能であるということを意味している。

例として、成熟した機能的赤血球の産生は「単能性前駆細胞」、すなわち血液細胞の1つの型のみを製造する能力を有する前駆細胞の増殖および分化から生じている。他の種々の造血前駆細胞（HPC）が性状解析されている。

HPCは、多能性幹細胞、リンパ球系幹細胞、CFU-GEMMコロニー形成単位顆粒球、赤血球、マクロファージもしくは巨核球、BFU-E、CFU-E、CFU-Meg、CFU-GMコロニー形成単位顆粒球もしくはマクロファージ、CFU-EoSコロニー形成単位好酸球、B細胞前駆体およびT細胞前駆体を含む多くのサブクラスから構成される。

幹細胞
幹細胞については、「幹細胞：科学的進歩および将来の研究方向（Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions.）」 Department of Health and Human Services, June 2001. http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htmに詳細に記載されている。この報告の内容は参照により本明細書に組み入れる。

幹細胞は、分化して少なくとも1種、時には多くの専門化した細胞型を形成することができる細胞である。幹細胞から形成され得る異なる細胞のレパートリーは網羅的であると考えられる；すなわち、生体を構成する全ての異なる細胞型が含まれる。幹細胞は、比較的豊富に見られる初期の胚から比較的まれな成人まで、生物の一生を通じて存在する。動物の成体の多くの組織に存在する幹細胞は、正常な組織修復およびホメオスタシスにおいて重要である。

これらの細胞の存在によって、ヒトに移植して、疾患組織の死んだ、もしくは機能していない細胞に置き換わり得る特殊化した機能細胞をin vitroで作製する手段を提供できる
可能性が高まった。これによって治療が提供できる疾患のリストとして、パーキンソン病、糖尿病、脊髄損傷、脳卒中、慢性心疾患、末期腎疾患、肝不全および癌が挙げられる。細胞置換療法が実現可能となるためには、幹細胞の増殖、幹細胞の分化および幹細胞の免疫学的拒絶の回避における改善を含め、幹細胞研究における数多くの大きな進展が必要である。

この理由のために、治療に幹細胞を利用する別のアプローチが考えられている。本明細書に記載したように、内在性幹細胞に体内組織の再生をさせる薬剤（例えば再生医薬）に発展し得る化合物の発見のための方法を開示する。

幹細胞の型
何が幹細胞を構成しているかについてはまだ考慮すべき議論があるが、本議論の目的のために鍵となる特徴は、異なる細胞型に分化する能力である。随意的特徴としては、細胞数の増幅を可能にする、場合によっては無制限の、自己再生能力である。幹細胞の例を以下に挙げる。

異なる幹細胞は、種々の細胞型を形成するための異なる能力を有する。精子形成幹細胞は、天然では精子のみを産生するため単能性であり、一方造血幹細胞は複能性であり、胚性幹細胞は全ての細胞型を生じることができると考えられており、全能性もしくは多能性であると言われている。

今日までに、3つの型の哺乳動物多能性幹細胞が単離されている。これらの細胞は、通常胚の3種の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の全てから得られる細胞型を生じることができる。3つの型の幹細胞とは、精巣腫瘍に由来する胎児性癌腫（EC）細胞；着床前の胚（通常胚盤胞）に由来する胚性幹（ES）細胞；および着床後の胚（通常生殖腺の一部となるように運命づけられた胎児の細胞）に由来する胚性生殖（EG）細胞である。これらの細胞は、多能性であるがために、分化を方向付けるための努力において特別な注目を集めている。

幹細胞は、生物の成体にも存在する。成体の幹細胞は、分化した（専門化した）組織に生じる未分化細胞であり、自己再生し、分化してより専門化した細胞を産生できる。近年、成体幹細胞に可塑性があり得ること、すなわち分化してそれらが存在する組織の特徴ではなく、またその組織の起源である胚葉の特徴でもない細胞型を産することができることが示された。例えば、血液幹細胞（中胚葉由来）がニューロン（通常は外胚葉由来）に分化できることが示されている。Toma等（2001, Nature Cell Biol. 3, p778-784）は近年、皮膚の真皮由来の新規な型の幹細胞の同定および単離を報告している。これらの幹細胞は皮膚由来前駆（SKP）細胞と呼ばれる。SKP細胞は、ポリリシン上で培養し、培地中の血清濃度を変化させることによって分化を誘導することができた。血清の非存在下において、これらはニューロンおよびグリア細胞に分化する；3％の血清の添加で、これらは平滑筋細胞に分化する；そして血清を10％まで上昇させるとSKP細胞の脂肪細胞への分化が生じる。成体幹細胞は、これまでのところ、神経系、骨髄および血液、肝臓、骨格筋、皮膚および消化系等の多様な組織で報告されている。

成体幹細胞に加えて、本明細書に記載するように、多くの型の前駆体もしくは前駆細胞がある。これらは、その分化能が一部制限されており、おそらく体内の全ての組織で生じている。これらは分化する能力を有するが、そのレパートリーがそれ程広くなく、そして定義により自己再生できないという点で幹細胞とは異なる。

最近の証拠から、分化した細胞型が表現型を変えることができることまで示唆されている。トランス分化（transdifferentiation）と呼ばれるこの現象は、細胞分裂が介在するか、介在しないでの、１つの分化した細胞型からもう1つへの変換である。従来、最終分化状態は固定されていると一般に認識されていたが、現在は、分化は時には逆転し、あるいは変化し得ることが明らかである。細胞系にトランス分化を誘導し得るin vitroのプロトコルが今や利用可能である（Shen, Slack & Tosh, 2000, Nature Cell Biol. 第2巻, p.879-887; Horb等, 2003, Current Biol. 第13巻, p105-115を参照のこと）。最後に、脱分化して更なる細胞型に分化する能力を有する幹細胞様の細胞を産生することができる特殊な細胞型の報告があった。

幹細胞の増殖および分化
幹細胞の重要な性質は、培地中で対称的に分裂し、それらが由来する幹細胞の正確なコピーである2つの娘細胞を生じる能力である。このために、幹細胞は未分化の状態で培地中で増殖し、スクリーニング目的、生物学的研究または細胞療法のためにさえ十分な材料を提供することが可能である。幹細胞にこうした能力を付与する手段は、当然のことながら集中的な研究の対象であるが、幹細胞の再生を促進する因子は未だほとんど知られていない。典型的には、多能性幹細胞系は分裂が不活性な線維芽細胞のフィーダー層、またはこのような細胞によって条件付けられた培地の上で維持される。フィーダー細胞は培地から何らかの未知の因子を除去／中和し、および／または幹細胞の分化を抑制し、自己再生を促進する因子を提供すると考えられる。こうした因子の1つは、フィーダー細胞の非存在下でマウスES細胞の自己再生を促進できる、IL-6に関連するサイトカインファミリーのメンバーである、白血病阻害因子（LIF）である。フィーダー細胞（および／もしくはLIF）の非存在下で増殖させた幹細胞はしばしば自発的かつ偶然的に分化し、分化した細胞型の混合物を提供する。より近年、フィーダーのない培地中、規定の条件下で増殖することができるES細胞系が作製された。

幹細胞の自己再生に影響する因子は刺激性もしくは阻害性のいずれかであり、細胞外または細胞内で機能し得る。分泌された因子LIFの場合、その細胞外受容体がgp130であり、このタンパク質の活性化がマウスのES細胞の分化を阻害するのに十分であることが知られている。細胞内では、gp130の重要な下流エフェクターは転写-3のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（STAT-3）である。幹細胞の多能性を維持する上で特に重要なもう1つの分子は転写因子Oct-4であり、これが人工的にダウンレギュレートされるとES細胞またはマウスにおける多能性状態の喪失につながる。マイトジェン-活性化タンパク質キナーゼ等のES細胞の自己再生を天然で阻害する他のシグナリング分子も解明されている。幹細胞研究の主要な目標は、種々の型の幹細胞の増殖を促進し、分化能を保持させる効果を有する、天然および合成の因子、薬剤、ポリペプチド、遺伝子、オリゴヌクレオチド、組織培養の培地および条件、特殊な条件付け培地、フィーダー細胞、および他の刺激の発見であろう。これには現在は細胞培養で感知できる程の増殖をしない成体幹細胞が含まれる。

幹細胞研究の第二の大きな挑戦は、機能性であり、種々の疾患状態において失われた細胞を置換でき、陽性の臨床結果を生じる特定の細胞型への幹細胞の分化を方向付けることである。幹細胞を誘導して分化を始めることは、実際にはかなり単純なプロセスである。例えば、フィーダー培養から分離され、接着性基体上でコンフルエントまで増殖したES細胞は、自発的に分化を始めるであろう。同様に、フィーダー培養から分離され、非接着性基体上で増殖したES細胞は胚様体−3種の胚葉全てに由来する未分化細胞および部分的に分化した細胞のクラスター−を形成するであろう。これらの細胞を次に解離し、単層培養中におき、定方向分化を促進する因子に曝露することができる。これらの因子に曝露された培養物は、胚様体または多くの異なる細胞型の混合物を含む分化中の細胞の未処置培養物と比較して、より数少ない型の分化した細胞によって占められる場合が多いであろう。にも関わらず、これまでのところ、分化した細胞の実質的に純粋な培養物を生成する条件はあるとしてもごくわずかしか考案されていない。更に、幹細胞分化のために考案されたプロトコルのいずれが細胞置換療法に適した細胞を産するかは明らかではない−細胞が必要とされる正確な表現型に最終的に分化していない場合があり、また分化した細胞がもはやin vivoでは生存できない場合がある。

幹細胞の定方向分化を誘導するために用いられてきた因子として、以下のものが挙げられる：レチノイン酸、上皮成長因子（EGF）、骨形成タンパク質（bone morphogenic proteins）(BMP)、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、アクチビン-A、トランスフォーミング増殖因子β-1（TFGβ-1）、肝細胞成長因子、神経成長因子、ソニック ヘッジホッグ（sonic hedgehog）（SHH）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポエチン、ビタミンD3、デキサメタゾン、β-メルカプトエタノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、5-アザシチジン、DMSO、インスリン、甲状腺ホルモン（T3）、LIF、ウシ胎児血清、血管内皮成長因子（VEGF）、スチール因子、酸素濃度変化、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、ニコチンアミド、血小板由来成長因子（PDGF）、cAMP、種々の細胞接着分子および基質等。これらの規定された因子に加えて、例えば条件付け培地、ヒトおよび動物組織ホモジネート、または植物抽出物等の規定されていない抽出物を使用して幹細胞の分化を方向付けることができるようである。これらの規定されていない抽出物の連続的分画化によって、活性画分、または高い有効性を有するより純粋な成分を得ることができる。これらの因子は、特定の実験において用いられる増殖培地に単独もしくは組み合わせて、または実験結果に重要な規定の順序で添加することができる。

幹細胞のin vitroにおける分化のために考案された多くのシステムは複雑な多段階方法であり、種々の段階の正確な性質、並びに種々の段階の順番（chronology）が重要である。例えば、Lee等（2000, Nature Biotechnology, 第18巻, p675-679）はマウスES細胞からドーパミン作用性ニューロンを誘導するための5段階のプロトコルを用いている：
1)未分化のES細胞をゼラチン被覆組織培養表面上、ES細胞培地中でLIFの存在下で増殖させ；
2)ES細胞培地中、4日間の懸濁培養物中で胚様体を生成させ；
3)組織培養表面上にまいた後、8日間ITSFn培地中で胚様体からネスチン陽性細胞を選択し；
4)ネスチン陽性細胞をbFGF/ラミニンを含有するN2培地中で6日間増殖させ；
5)最後に増殖したニューロン前駆細胞を、ラミニンを含有するN2培地からbFGFを除去することで誘導して分化させる。

連続的細胞培養の第二の例において、Bonner-Weir等［Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 7999-8004］は、1)2-4日間の血清の存在下で固相表面上への選択的接着によって島（islet）細胞から腺管（ductal）細胞を選択し；2)次いで血清を除去し、ケラチノサイト増殖因子を添加して5-10日間で線維芽細胞から腺管上皮細胞を選択し；そして3)細胞外マトリクス調製物「Matrigel」を用いて3-6週間細胞を重層する、ことによって、ヒト膵臓腺管細胞からインスリン産生細胞を派生させた。

連続的細胞培養の更なる例において、Lumelsky等［Science (2001) 292: 1389-1394］は、1)2-3日間のLIFの存在下でES細胞を増殖させ；2)4日間にわたるLIFの非存在下で胚様体を生成させ；3)ITSFn培地を6-7日間用いてネスチン陽性細胞を選択し；4)B27培地添加剤およびbFGFを含有するN2培地中で6日間膵臓内分泌前駆細胞を増殖させ；そして5)bFGFを除去し、ニコチンアミドを添加してインスリン分泌細胞への分化を誘導する；ことによって、マウス胚性幹（ES）細胞の定方向分化によってインスリン分泌細胞を派生させた。

しかしながら、細胞分化の決定において重要なことは、種々の段階の順序および時間、また種々の因子の添加順序だけではない。胚の発達は、位置情報を付与するシグナリング因子の勾配の作用によって制御されているため、単一のシグナリング因子の濃度、また2以上の因子の相対濃度が、in vitroおよびin vivoにおける細胞集団の運命を特定する上で重要であることが予測される。因子の濃度は発達の間に変化し、幹細胞は同じ分子の異なる濃度に対して異なって応答する。例えば、後期胚のCNSから単離された幹細胞は、EGFの異なる濃度に対して異なって応答する：低濃度のEGFは増殖のためのシグナルを生じるが、より高濃度のEGFでは増殖および星状細胞への分化を生じる。

幹細胞のin vitroにおける自己再生および分化に影響することが見出されている因子の多くは天然に生じる分子である。分化はシグナル伝達経路に沿って作用するシグナリング分子および受容体によって誘導および調節されているため、これは予測され得ることである。しかしながら、同じ理由によって、多くの合成化合物が幹細胞分化に対して効果を有することがあり得る。シグナリングおよびシグナル伝達経路内の細胞標的（いわゆる薬剤化可能な（drugable）標的）と相互作用する可能性が高いこのような合成化合物は、例えば製薬会社による薬剤スクリーニングのために日常的に合成されている。一旦知られると、これらの化合物は幹細胞の分化をex vivoにおいて方向付けるために用いることができ、あるいはin vivoで投与することができ、その場合は患者の標的器官中の在留幹細胞に作用するであろう。

組織培養における共通変数（common variables）
特定の細胞型の培養を成功させるための条件を開発する上で、あるいは細胞プロセスを達成もしくはモジュレートするためには、種々の因子を考慮することがしばしば重要である。

1つの重要な因子は、細胞を懸濁液中で増殖させるか、または基体に接着した単層として増殖させるかの決定である。ほとんどの細胞は基体に接着することを好むが、形質転換細胞、造血細胞、および腹水由来の細胞を含むいくつかは、懸濁液中で増殖させることができる。

培養を接着細胞で想定すると、重要な因子は接着基体の選択である。ほとんどの研究室では組織培養のための基体として使い捨てのプラスティックを使用している。使用されてきたプラスティックとしては、ポリスチレン（最も一般的な型）、ポリエチレン、ポリカーボネート、Perspex、PVC、テフロン、セロフェーン（cellophane）およびセルロースアセテートが挙げられる。いずれのプラスティックを使用しても良いが、これらの多くは、湿潤可能で、細胞接着に適するように処理することが必要であろうと考えられる。更に、任意の適切に調製された固相基体を使用して細胞のための支持体を提供できると考えられ、今日までに使用された基体として、ガラス（例えばアルム−ホウケイ酸塩およびソーダ−石灰ガラス）、ゴム、合成繊維、多量体化したデキストラン、金属（例えばステンレススチールおよびチタン）等が挙げられる。

気管支上皮、血管内皮、骨格筋およびニューロン等のいくつかの細胞型は、増殖基体が生物学的産物、通常はフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン等の細胞外マトリクス物質で被覆されていることが必要である。増殖基体および適用方法（湿潤もしくは乾燥被覆、またはゲル化）は細胞の増殖および分化性能等の細胞プロセスに対して影響を有し得るため、これらは先に論じたように経験的に決定しなければならない。

細胞培養における変数でおそらく最も明らかに重要なことは、培地、および血清等の添加剤の選択である。これらは細胞増殖のための水性コンパートメントを提供し、栄養素および種々の因子（そのいくつかは上記で挙げてあり、他のものはあまり規定されていない）と競合する。これらの因子のいくつかは接着のために必須であり、他のものは情報を伝えるために必須であり（例えばホルモン、マイトジェン、サイトカイン）、その他は解毒剤として必須である。一般的に使用される培地としては、RPMI 1640、MEM/ハンクス塩、MEM/アール塩、F12、DMEM/F12、L15、MCDB153等が挙げられる。種々の培地はその構成成分が大きく異なり得る−一般的な違いのいくつかには、重炭酸ナトリウム濃度、CaおよびMg等の二価イオン濃度、緩衝剤の組成、抗生物質、微量元素、ヌクレオシド、ポリペプチド、合成化合物、薬剤等が挙げられる。種々の培地が選択的であることは周知であり、これはこれらがいくつかの細胞型のみの増殖を促進することを意味する。血清、脳下垂体（pituitary brain）および他の抽出物等の培地添加剤は培養中の細胞の増殖にしばしば必須であり、更に培養中の細胞の表現型を決定するのに重要であることが多い。すなわち、これらは細胞の生存を決定し、または分化を方向付けることができる。分化等の細胞プロセスにおける添加剤の役割は複雑であり、その濃度、培養中に添加する時点、細胞型および使用する培地に依存する。これらの添加剤の性質がまだ明らかでないこと、そして細胞の表現型に影響する能力によって、無血清培地の開発に動機が与えられた。全ての培地と同様に、それらの開発は、先に論じたように、主として試行錯誤によって実現した。

組織培養の気相も重要であり、用いるべきその組成および体積は、使用する培地の型、必要な緩衝液の量、培養容器が開口しているか密閉されているか、特定の細胞プロセスがモジュレートを必要としているか否か、に依存し得る。共通変数として、二酸化炭素および酸素の濃度が挙げられる。

組織培養にとって重要な他の条件としては、培養用容器の選択、ヘッドスペースの量、接種密度、温度、培地交換の頻度、酵素処理、振とうもしくは攪拌の速度および方式が挙げられる。

従って、細胞培養条件の変更は、所望の細胞プロセスを達成するための方法である。本発明の一態様により、細胞培養条件を連続的に変更させることが、細胞効果を達成するための非常に有効な方法であり得ることが認識される。種々の応用において、例えば細胞分化の研究において、特定のシリーズの異なる組織培養条件が細胞プロセスをもたらすのに必要である場合が多いであろう。様々な条件には、特定の時点における培地への添加／培地からの除去、または培地の変更が含まれ得る。こうした条件のセットは、その例を以下に挙げるが、上記で議論したように、一般に試行錯誤によって開発される。

細胞単位の形成
本発明の重要な観点は、細胞のグループ（細胞コロニー）が種々の条件の細胞培養で増殖することができ、そのコロニーが、乱され、また他のコロニーと混合された場合、種々の条件下でその統合性をおおむね維持できることである。このようなグループまたはコロニーを、本明細書において細胞単位と言う。細胞単位の形成は、例えば、キャリア等の固相基体上の接着培養として細胞を増殖させることによって達成することができる。キャリア上にまいた後に細胞増殖が生じた場合、娘細胞は同じキャリア上に接着し、同じコロニーの一部を形成するであろう。一般に、生きた接着細胞はその増殖基体から容易には解離せず、従って、キャリアのいかなる機械的操作、培地の攪拌、または別の組織培養システムへの移動にかかわらず、細胞コロニーの統合性は存続する。同様に、いかなる時点で複数のキャリアを同じ容器中においたとしても（例えばビーズをプールする）、1つのビーズからもう1つへの細胞の実質的な移動はないであろう。

単位またはコロニー中で細胞を増殖させる利点の一つは、ある単位を異なる組織培養用培地のセット中に順番においた場合、コロニーを含む細胞の全てが同じシリーズの培養条件に、同じ順番で、同じ時間だけ曝露されるであろうということである。

この方法の別の利点は、組織培養が小型化できることである：マイクロキャリアビーズ（下記参照）のコロニー形成には、最小の組織培養用フラスコと比較しても、相対的に必要な細胞が少ない。

必ずしもそれ自体組織培養用容器に接着していない単位中の増殖細胞は、個々のコロニーを自在に取り出し、別の培養用容器に移すことができるという更なる利点を有している。薬剤スクリーニングに適したマイクロタイタープレートに前駆細胞を含む分化した細胞を移すことが可能であるため、このことは、本発明において特に重要である。従って、前駆細胞は、例えばWO2004/031369に開示された技術を用いて先に決定された方法によって、バルクで調製することができ、次に本質的にHTSプラットフォーム中への液体移動によって同じ細胞単位を移すことができる。これによって、(i)HTS法が非常に容易になり、(ii)更なる分化に不可欠であり得る単位の3D（マルチ-）細胞機構が維持され、そして(iii)それ自体が細胞分化を引き起こし得る細胞機構の解離が未然に防がれる。

キャリア上に形成される増殖細胞単位の更なる利点は、細胞培養の規模を大きくできることである。キャリア上での幹細胞の増殖により、ハイスループットスクリーニングに十分な材料を提供するためのスケールアップした製造方法が提供される。このような細胞培養のスケールアップには、少なくとも1g（乾燥重量）−例えば10g、50g、またはそれ以上−のマイクロキャリアが必要な場合がある。

固相基体上に細胞単位を形成するもう1つの重要な利点は、基体−従って会合によって接着した細胞−が種々の手段によって標識できることである。

3mmおよび5mmのガラス球が、特に細胞培養のスケールアップのために用いられるガラスビーズのバイオリアクター（例えばMeredos Gmbhによって製造されているもの等）において、細胞接着基体として広く使用されてきた。これらのビーズは、接着細胞への機械的な損傷を避けるため、典型的にはバッチ培養よりも充填したベッドで使用される。こうした基体は本発明の目的に適しているが、以下に記載する他のキャリアがずっと好適である場合がある。

特に、細胞をより小さなキャリア上で増殖させる場合、これらは懸濁培養として取り扱うことができる。重要なことは、小さなキャリア上で細胞を増殖させる一般的な方法を、マイクロキャリア細胞培養という（「マイクロキャリア細胞培養 原理と方法(Microcarrier cell culture, Principles and Methods)」 Edition AA, Amersham Biosciencesより入手可能。(18-1140-62)を参照のこと。参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。マイクロキャリア培養は、4000リットルまでの発酵槽における抗体およびインターフェロン産生のために商業的に使用されている。形状、サイズ、および種々の材質にわたる、様々なマイクロキャリアが入手できる。中でも、ポリスチレン（Biosilon, Nunc）、ガラス（Bioglass, Solohill Eng）、コラーゲン（Biospheres, Solohill Eng）、DEAE セファデックス（Cytodex-1、Pharmacia）、デキストラン（Dormacell, Pfeifer & Langen）、セルロース（DE-53, Whatman）、ゼラチン（Gelibead, Hazelton Lab）、およびDEAE デキストラン（Microdex, Dextran Prod.）製のマイクロキャリアビーズが市販のものを入手可能である。これらのキャリアはビーズの比重、直径および細胞増殖のために利用できる表面積について性状が良くわかっている。更に、細胞増殖のための表面積が非常に増大した多くの多孔質（マイクロ）キャリアが利用可能である。これらの多孔質キャリアの更なる特徴は、これらが足場依存性細胞、並びに開口して相互に結合した孔のネットワーク中に取り込まれて保持されている懸濁細胞の双方の増殖に適していることである。多孔質キャリアは、例えばゼラチン（Cultispher G, Percell）、セルロース（Cytocell, Pharmacia）、ポリエチレン（Cytoline 1および2, Pharmacia）、シリコンラバー（Immobasil, Ashby Scientific）、コラーゲン（Microsphere, Cellex Biosciences）、およびガラス（Siran, Schott Glassware）等の材料で入手できる。これらのキャリアーは、攪拌した、流動化した、または固定化したベッド培養システムに様々に適している。

キャリアの物理的特性は周知であるため、実験に用いるキャリアの数を計算することは容易である。記載したキャリアのいくつかとその他の多くのものが、正確に計量し、その後に液体培地中に膨張させて調製することができる乾燥品として入手できる。更に、マイクロキャリア培養に接種するために用いる細胞の数は算出でき、また変更できる。例えば、ビーズ1個あたり細胞6個を接種するCytodex 3の培養物（2g/リットル）は、800万個のマイクロキャリアを含有する培養物となり、4800万個の細胞/リットルが5×10⁴細胞/cm²の密度で増殖している。

必要であれば、マイクロキャリア上で増殖した細胞の回収、マイクロキャリアからの標識の解放（下記参照）は、細胞の酵素的分離、および／または適用可能な場合にはキャリアの消化によって達成することができる。ゼラチンキャリアはトリプシンおよび／もしくはEDTAによって可溶化することができ、コラーゲンキャリアはコラゲナーゼを使用して、デキストランキャリアはデキストラナーゼを使用して可溶化できる。

固体もしくは多孔質マイクロキャリアに加え、細胞は閉じ込め（immurement）によって、すなわち媒体透過性バリア内に閉じ込めてグループ分けすることができる。透過性の透析膜が細胞のグループを保持するが、内部および外部コンパートメントで培地およびその成分が自由に交換できる膜培養システムが開発されている。中空のファイバーカートリッジ中での細胞培養も開発されており、数多くのファイバーや、ターンキーシステムまでもが市販されている（例えばAmicon, Cellex Biosciencesより）。半固体マトリックス中への細胞のカプセル化も開発されており、細胞は吸着、共有結合、架橋もしくは包括によってポリマーマトリックス中に固定されている。使用されている材料としてはゼラチン、ポリリシン、アルギン酸塩およびアガロースが挙げられる。典型的なプロトコルは、5％のアガロースを40℃で通常の増殖培地中の細胞懸濁液と混合し、等量のパラフィン油を用いて混合物を乳化し、氷浴中で冷却するものであり、直径80-200μmの球体を生成する。これらの球体を油から分離して組織培養容器中の培地に移すことができる。

細胞の包括化（entrapment）は、マイクロキャリアもしくは多孔質基体の使用に通じる、細胞グループの固定化のための単純な方法である。単純な技術は、DEAE、TLC、QAE、TEAE（全てSigmaから入手可能）等のセルロースファイバー中に細胞を絡ませることである。他のより洗練されたデバイスは、Opticel培養システム（Cellex Biosciences）におけるような、懸濁細胞に適したセラミックカートリッジである。

当業者は、上記の細胞単位の作製方法に加えて、神経球もしくは胚様体等の細胞の3D培養の形成、または組織および生物全体、例えばショウジョウバエ（Drosophila）もしくはC. エレガンス（elegans）の使用を含む、細胞集団の他の作製方法を認識するであろう。

細胞単位、またはそれらが含まれる基体は、限定するものではないが、タンパク質、核酸もしくは薬剤等の他の化学物質を含む、特定の因子と結合させることができる。基体の予備コンディショニングは、多くの方法で、例えば基体を目的の因子と共に単にインキュベートすることによって、または因子を基体に共有的もしくは非共有的に結合させることによって達成することができる。可溶性因子は含浸によって乾燥材料中に組み込むことができる。この技術は、可溶性因子を含む液体を、同時に膨潤し、使用可能となる乾燥多孔質材料中に急速注入することによる。固体の因子は、例えばフィブリノーゲン中の因子をトロンビン溶液と混合する（その時点で因子を含有するフィブリン凝塊が形成する）ことによって取り込むことができる。因子を細胞と共に含浸、包括またはカプセル化することのほかに、因子を細胞グループと結合させるための他の複数の方法が考案できる。

細胞グループを多数の異なる因子と結合させるある方法は、因子のカクテルを予め調製し、次いでこれを特定の細胞グループと結合させるものである。第二の方法は、細胞グループを多数の因子中に連続して条件付けするものであろう。一例として細胞グループ増殖基体の乾燥製剤を用いると、この方法は、まず基体を第一の因子を含有する溶液中で部分的に膨潤させ、続いてこれを第二の因子を含有する溶液中で更に膨潤させることを含み、双方の因子が結合した基体が生じるものであろう。細胞グループを種々の因子の種々の組み合わせと結合させる系統的プロトコルを考案することによって、任意の組み合わせの因子のセットの細胞グループに対する効果をサンプリングすることが可能であろう。

細胞単位を因子で条件付けするために用いる方法に関わらず、因子はその細胞単位を含む細胞によって取り込まれる。増殖培地中に漏出した因子は、その濃度が生理的に関連する上限以下となり、それらが曝露される更なる細胞グループに対して効果を有さない程度まで希釈される。例えば細胞単位の一部を形成する基体からの因子の拡散は、材料の性質および大きさ、平均孔径、および因子の分子量および濃度等のパラメーターによって規定される。必要な場合には、プロセスを較正するために、HPLC分析もしくは標識した因子の培地中への放出等の物理学的アッセイにより、あるいは向神経性因子のための後根神経節成長（outgrowth）バイオアッセイ等の生物学的アッセイにより、因子の放出を測定することができる。

細胞の組み合わせ連続培養
本発明は更に、複数の段階および薬剤が関わる細胞培養技術は、先行技術においては試行錯誤で行われていた、伝統的な実験によって決定することが不可能でないとしても、困難であるという問題に対処する。複雑な、多段階の方法において組織培養条件を経験的に決定することは、現実的には可能ではない。有利には、細胞型を分化させるために必要な培養条件は、本明細書において以下に記載する方法を用いて最初に同定することができる。

(a)スプリット−プール細胞培養
スプリット−プール培養は、組織的かつ非常に生産的な方法で、細胞が一連の培養条件にかけられ、培地中で一連の薬剤に曝露されることを可能とするものであり、WO2004/031369に詳細に記載されている。

スプリット−プール細胞培養の第一段階は、各細胞単位が種々の細胞培養条件に曝露され得る容易に操作される単位を構成するように細胞単位（特に微細な細胞単位）を形成することである。簡単にするために、この議論において、我々は、マイクロキャリア培養中で細胞を増殖させることで細胞集団を製造するものとし、用語「細胞単位」、「細胞グループ」、「コロニー」および「ビーズ」は互換可能に使用する。しかしながら、記載した方法は任意の細胞単位に等しく適用され得る。多数の細胞培養条件のサンプリングのための特に有効な方法は、コンビナトリアル細胞培養もしくはスプリット−プール細胞培養といい、一実施形態において、細胞培養条件の複数の組み合わせをサンプリングするために細胞単位のグループを連続的に分割および組み合わせることを含む。本発明の一態様において、この方法は、細胞単位の初期のスターター培養（または種々のスターター培養）を、異なる培養条件下で別個に増殖させる複数のビーズ（グループ／コロニー／キャリア）をそれぞれ含むX₁個のアリコートに分割することによって行われる。所定の時間の細胞培養の後、異なるアリコートのビーズを組み合わせて混合することで、細胞単位をプールすることができる。このプールを再びX₂個のアリコートにスプリットし、各々を異なる条件下である時間だけ培養した後、またプールすることができる。細胞単位をスプリット、培養およびプールする（あるいはプール、スプリットおよび培養；どこで周期に入るかに依存する）この反復的方法によって、細胞培養条件の多くの異なる組み合わせの組織的なサンプリングが可能である。実験の複雑さ、換言すれば試験する細胞培養条件の異なる組み合わせの数は、各回においてサンプリングされる異なる条件の数の積（X₁×X₂×...X_n）と等しい。後に続くスプリットに先立つ全ての細胞単位のプールの段階は任意であり得ること−限定された数の細胞単位がプールされる段階が同じ効果を有し得ること、に留意されたい。従って本発明は、細胞単位のグループをバルクで操作する細胞培養条件の複数の組み合わせを組織的にサンプリングする多くの関連方法を具現化するものである。

細胞培養条件の多様性がこの手段でサンプリングされる厳密な方法に関係なく、複数の細胞単位が単一の容器を共用でき、そこで同一の条件下で培養されるため、この方法は効率的であり、一度に2〜3個の培養容器のみを用いて実施することができる（使用する培養容器の数はスプリットされたサンプルの数と等しい）。多くの観点において、この方法の原理は、化学的ビルディングブロックグループ間のリンケージの可能な全ての組み合わせをサンプリングする、大きな化学ライブラリーのスプリット合成（コンビナトリアル化学として知られる）のものと類似している（例えば「コンビナトリアル化学（Combinatorial Chemistry）」 Oxford University Press (2000), Hicham Fenniri(編者)を参照のこと）。スプリット−プール細胞培養は任意の回数だけ繰り返すことができ、各回において任意の数の条件をサンプリングすることができる。細胞単位（またはこの例ではコロニー形成したビーズ）の数が全ての回でサンプリングした異なる条件の数と等しいかそれより大きい限り、そして細胞単位のスプリットが全くランダムに生じると仮定すると、実験でサンプリングされた培養条件の種々の組み合わせの各々に従って少なくとも1つの細胞単位が培養されると予測される。この手法を用いて、任意の細胞型についての増殖または分化条件、あるいは任意の細胞型による生体分子の産生（例えばエリスロポエチンもしくはインターフェロンの産生）の効率をサンプリングすることができる。この手法は反復的であるため、複数段階の組織培養プロトコル−例えば幹細胞分化と関連して上記したもの−を試験するのに理想的である。この技術を用いてサンプリングすることができる変数としては、細胞型、細胞集団（例えばマイクロキャリア培養、細胞のカプセル化、生物全体）、増殖基体（例えばマイクロキャリア上のフィブロネクチン）、細胞培養の時間、温度、種々の培地（構成成分の濃度の差異を含む）、増殖因子、条件付け培地、種々の細胞型（例えばフィーダー細胞）との共培養、動物もしくは植物抽出物、薬剤、他の合成化学物質、ウイルス感染（トランスジェニックウイルスを含む）、導入遺伝子の添加、アンチセンスもしくはアンチ遺伝子（anti-gene）分子（例えばRNAi、三重らせん）の添加、感覚入力（sensory inputs）（生物の場合）、電気、光、もしくは酸化還元（red-ox）刺激等が挙げられる。

一実施形態において、第一の細胞型を分化させるために必要な培養条件は、まず、以下の段階：
(a)1以上の細胞をそれぞれ含有する細胞単位の第一のセットのグループを提供し、該グループを所望の培養条件に曝露し；
(b)該グループの1以上を分割して細胞単位の更なるセットのグループを作製し；
(c)該更なるグループを更なる所望の培養条件に曝露し；
(d)場合により、段階(b)-(c)を繰り返し；そして
(e)所与の細胞単位に対する、それが曝露された培養条件の効果を評価する；
を含む方法において同定される。

別の実施形態において、第一の細胞型を部分的もしくは完全に分化させるために必要な培養条件は、まず、以下の段階：
(a)1以上の細胞をそれぞれ含有する細胞単位の第一のセットのグループを提供し、該グループを所望の培養条件に曝露し；
(b)該グループの2以上をプールして少なくとも1つの第二のプールを作製し；
(c)第二のプールを分割して細胞単位の更なるセットのグループを作製し；
(d)該更なるグループを所望の培養条件に曝露し；
(e)場合により、段階(b)-(d)を繰り返し；そして
(f)所与の細胞単位に対する、それが曝露された培養条件の効果を評価する；
を含む方法において同定される。

適切には、部分的に分化した細胞単位は単離され、本明細書に記載の方法において用いられる。

適切には、細胞単位は標識され、その標識は、その細胞単位が曝露された培養条件を反映するものである。標識は、空間的にコード付けされていても良い。標識は、ウイルス、オリゴヌクレオチド、ペプチド、蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定同位体の混合物、バーコード、光学タグ、ビーズ、量子ドットおよび高周波コードタグもしくはこれらの標識の少なくとも2種を含む組み合わせからなる群より選択することができる。2以上の標識を選択し、細胞単位を標識するために組み合わせて用いることができる。

適切には、細胞は、それぞれが1以上の細胞を含有する細胞単位中で培養される。細胞単位は単一の細胞であり得る。各細胞単位は、固相基体に接着した、またはそれに結合された1以上の細胞を含み得る。固相基体はマイクロキャリアまたはビーズであり得る。固相基体は更にウェルまたは培地透過性バリアであっても良い。

一実施形態において、培養条件は、細胞が曝露される培地である。適切には、培地は細胞プロセスに影響する1以上の特定の薬剤を含有する。

細胞培養条件は、1以上の特定の温度または酸素もしくは二酸化炭素の部分圧における培養を含み得る。細胞培養条件は、1以上の特定の基体上での培養を含み得る。

(b)スプリット−スプリット細胞培養
細胞単位に対してスプリット−プールプロセスを行う目的は、これらを予め規定された組み合わせの条件に系統的に曝露することである。当業者は、この成果を得るための異なる多くの手段を考え付くであろう。スプリット−プールプロセスおよびその変形に加えて、スプリット−スプリットプロセスを簡単に論じることは価値がある。スプリット−スプリットプロセスは、細胞単位のプールが介在せずに、細胞単位のグループを少なくとも2回分割することを含む。スプリット−スプリットプロセスを多数回にわたって使用すると、作製される別個のサンプルの数は指数関数的に増大する。この場合、ある程度の自動化（例えばロボットプラットフォームおよび高度なサンプルトラッキングシステムの使用）を利用することが重要である。スプリット−スプリット段階の利点は、（細胞単位が組み合わされていないため、）種々の細胞単位の系統をその細胞培養履歴に基づいて分離することが可能なことである。従って、スプリット−スプリット段階は、特定の細胞培養条件が所与の細胞プロセスに関与しているかどうかを推測するために用いることができ、従って細胞単位の培養履歴を推測するために用いることができる（「細胞単位の培養履歴の決定」の欄で詳細に説明する）。

規定のプロトコル
細胞単位のスプリットおよび／またはプールは、完全にランダムに行っても良く、あるいは規定のプロトコルに従っても良い。細胞単位がランダムにスプリットおよび／またはプールされる場合、所与の細胞単位の任意のグループへの分離は、いかなる意味においても規定されず、また偏りのある（prejudiced）ものではない。少なくとも1つの細胞単位が細胞培養条件の可能な組み合わせのそれぞれに曝露されたという高い確率が生じるためには、試験されている細胞培養条件の組み合わせの総数よりも多い数の細胞単位を用いることが有利である。従って、特定の状況下において、規定のプロトコルに従って細胞単位をスプリットおよび／またはプールすることが有利であり、その全体的な効果は、組み合わせの偶発的な重複または脱落が防止されるということである。細胞単位の規定の操作は、場合によっては前もって計画し、スプレッドシートまたはコンピュータープログラム上に記録することができ、スプリットおよび／またはプールの操作は自動化されたプロトコル、例えばロボット工学を用いて実施することができる。細胞単位の標識（下記参照）は多くの手段、例えばRFIDによる標識、光学的タグ付け、または空間的コード付けのいずれで行っても良い。サンプルのアイデンティティーを決定し、したがって規定のプロトコルに従ってサンプルを区分けすることができるロボット利用のデバイスは、既に記載されている（「コンビナトリアル化学 実用的アプローチ(Combinatorial Chemistry, A practical Approach)」 Oxford University Press (2000), H. Fenniri編を参照のこと）。あるいはまた、標準的な実験室的液体操作および／または組織培養ロボット工学（例えばBeckman Coulter Inc, Fullerton, CA; The Automation Partnership, Royston、UKによって製造されたもの）は、複数のサンプルのアイデンティティーを空間的にコード付けし、予めプログラムされたプロトコルに従ってこれらを追加、除去、もしくは移動させることができる。

細胞単位の分析および／または分離
各回の細胞培養の後、または規定回数の後、細胞単位を調べ、組織培養条件によって影響を受けた可能性のある任意の所与の細胞プロセスを観察することができる。以下の例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

各回の細胞培養の後、または規定回数の後、細胞単位をアッセイして、細胞増殖の上昇を示すメンバーがあるか否かを決定することができる。これは、種々の技術によって、例えば顕微鏡による細胞単位の外観検査により、またはその細胞に特徴的なマーカー産物の定量によって、達成することができる。このマーカーは、リガンドもしくは抗体で検出し得る特定のDNA配列または細胞タンパク質等の内在性マーカーであって良い。あるいはまた、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の外来性マーカーをアッセイされる細胞単位中に導入して（生きた）細胞の特定の読み出しを提供することができる。生きた細胞は、種々の生体染色法を用いて可視化することができ、逆に死んだ細胞は種々の方法、例えばヨウ化プロピジウムを用いて標識することができる。更に、標識した細胞単位は、アフィニティー精製（「パンニング」）、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）または広範囲の類似技術を含む、手動および自動双方の種々の技術によって、未標識のものから分離することができる。適用法に依存して、標準的な実験室の設備を使用することが可能な場合があり、あるいは特殊な装置を使用することが有利な場合がある。例えば、ある種の分析および選別装置（例えばUnion Biometrica Inc., Somerville MA, USA）は1mmまでのフローセル径を有し、500μまでの直径を有するビーズのフローソーティングが可能である。これらの装置は、ビーズのサイズおよび光学密度、並びにGFP、YFPもしくはDS-赤等のタグからの2種の蛍光放出波長の読み取りを提供する。1時間あたり180,000個のビーズの選別速度、マルチウェルプレートもしくはバルク容器中への分配が可能である。

各回の細胞培養の後、または規定回数の後、細胞単位をアッセイして、特定の遺伝子型もしくは表現型を示すメンバーがあるか否かを決定することができる。遺伝子型の決定は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、DNA配列決定等の周知の技術を用いて実施することができる。表現型の決定は、種々の技術によって、例えば顕微鏡による細胞単位の外観検査により、またはその細胞に特徴的なマーカー産物の検出によって実施することができる。このマーカーは、リガンド、酵素基質の変換、もしくは特定の表現型マーカーを認識する抗体によって検出できる特定のDNAもしくはRNA配列、または細胞タンパク質等の内在性マーカーであって良い（例えば「幹細胞：科学的進歩および将来の研究方向(Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions.)」Department of Health and Human Services. June 2001の別表（Appendix）Eを参照のこと；参照により別表を本明細書に組み入れる）。遺伝子マーカーは外来性、すなわち、例えばトランスフェクションもしくはウイルス形質導入によって細胞集団中に導入されたものであっても良い。外来性マーカーの例は、特定の細胞系統において通常は発現しないか、もしくはエピトープで改変されたか、あるいは異なる種由来の、蛍光タンパク質（例えばGFP）または細胞表面抗原である。結合した転写調節エレメントを有する導入遺伝子もしくは外来性マーカー遺伝子は、内在性遺伝子に代表的なパターンを反映するように発現させることができる。これは、遺伝子を最小の細胞型特異的プロモーターと結合させて、あるいは導入遺伝子を特定の遺伝子座内に組み込んで達成することができる（例えばヨーロッパ特許No. EP 0695351を参照のこと）。標識した細胞単位は、アフィニティー精製（「パンニング」）、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を含む、手動および自動双方の種々の技術によって、未標識のものから分離することができる。Nishikawa等（1998, Development 第125巻, p1747-1757）は、抗体によって認識される細胞表面マーカーを用いてマウスの全能性ES
細胞の分化を追跡した。彼等はFACSを用い、造血系統の細胞をその分化の種々の段階で同定および精製することができた。

特定の遺伝子型もしくは表現型の細胞単位を増やすための代替的または補完的技術は、所望のグループを遺伝子的に選択することである。これは、例えば細胞単位中に選択マーカーを導入し、選択条件下での生存をアッセイすることによって達成することができる。例えば、分化したES細胞からインスリン分泌細胞を選択するこうしたシステムを用いたSoria等（2000, Diabetes 第49巻, p1-6）を参照のこと。Li等（1998, Curr Biol 第8巻, p971-974）は、マウスES細胞での相同組み換えによって二官能性選択マーカー／レポーターβgeo（β-ガラクトシダーゼ活性およびG418耐性を付与する）をSox2座中に組み込み、神経前駆細胞を同定した。神経前駆細胞の特徴の１つはSox2（従って組み込まれたマーカー遺伝子）の発現であるため、これらの細胞は、レチノイン酸を用いて分化を誘導した後、G418の添加によって非ニューロン系統から選択することができた。細胞の生存は、顕微鏡により検査するか、β-gal活性をモニタリングすることで決定することができた。適切なリガンドもしくは抗体の利用可能性によって制限を受け得る表現型に基づく選択方法と異なり、遺伝子的選択は任意の示差的発現遺伝子に適用することができる。

マイクロキャリア
形状およびサイズ、および種々の材質の様々なマイクロキャリアが入手可能である。

例として、マイクロキャリアは、Cytoporeマイクロキャリア（例えばCytopore 1マイクロキャリアもしくはCytopore 2マイクロキャリア）、Cultispherマイクロキャリア、Cultispher-Gマイクロキャリア、Cultispher-GLマイクロキャリアおよびCultispher-Sマイクロキャリア、Informatrixマイクロキャリア、マイクロスフェアマイクロキャリア、Siranマイクロキャリア、およびMicroporous MCマイクロキャリアからなる群より選択される多孔質のマイクロキャリアであり得る。

更なる例として、マイクロキャリアは固体マイクロキャリア、例えばCytodexマイクロキャリア（例えばCytodex 1、Cytodex 2もしくはCytodex 3マイクロキャリア）、Biosilonマイクロキャリア、Bioglassマイクロキャリア、FACT IIIマイクロキャリアまたはDE 52/53マイクロキャリアであり得る。

マイクロキャリア培養は、培養の大規模化を含め、顕著な利点を有しており、所望の増殖および／または分化条件を得るために必要に応じて選択された培養条件に細胞単位を曝露することが可能である。

マイクロキャリアの表面は、例えば所望の電荷もしくは他の所望の性質を有する分子的部分（entities）の吸着または共有的架橋等の物理的／化学的処理によって更に改変することができる。

Cultispherマイクロキャリア
CultiSpherは、医薬品等級のブタゼラチンから、機械的および熱的安定性が高い高度に架橋したゼラチンマトリックスが得られるプロセスを介して製造される。細胞培養で用いる場合、細胞は、マトリックスの外表面および内表面の双方に接着することができる。マトリックスの表面積が増大し、同時にマトリックス内部の細胞にストレスからの防御が与えられる結果、細胞産生能が増大する。この製品の更なる利点は、マトリックスをタンパク分解酵素で溶解させることができ、その結果ほとんど100％の生存率を有する細胞が回収できることである。

一実施形態において、マイクロキャリアはCultispher-Gマイクロキャリアである。Cultispher-Gは、粒径130-380μm、体積12-18ml/g乾燥分、密度1.04g/mlで、平均孔径が20μmである。

Cultispher-Gマイクロキャリアを調製・使用するために、特にBiotech. Bioeng. (2000) 68, 1 p59-70; Brit. J. Cancer. Suppl. XXVII, S-78-S82 (1996);および製造業者のウェブサイトwww. percell.se.を参照することができる。

Cytopore 2マイクロキャリア
CytoporeマイクロキャリアはGE Healthcare（以前のAmersham）（www.microcarriers.com）から入手できる。Cytoporeは、細胞にとって無毒であり、生分解性がある100％セルロース製である。N,N,-ジエチルアミノエチル基のために陽性に荷電している。非常に緻密な粒径分布とネットワーク構造を有しており、粒子に対する表面積の比率は95:1より大きい。ネットワーク構造によって、マイクロキャリア内で増殖する間、染色された細胞を密接して観察することができる。典型的な粒径は200-280μmであり、有効表面積は1.1m²/g乾燥分である。相対密度は1.03g/ml、孔の開口部の平均径は30μm、体積は40ml/g乾燥分である。Cytoporeマイクロキャリアを調製・使用するために、特にApplied Microbiology and Biotechnology (1997) 47, 4 p352-7; Cytotechnology (1999) 30 p143-147; Chinese Journal of Biotechnology (1999) 15, 4 p239-44およびActa Oto-Laryngologica (2002) 122, 5 p541-5を参照することができる。

Cytopore 2は、約1.8meq/gの電荷密度を必要とする足場依存性細胞のために最適化されている。

いくつかの実施形態において、マイクロキャリアはブタゼラチンのマイクロキャリアである。

いくつかの実施形態において、マイクロキャリアは100％セルロース製である。

一実施形態において、分化した細胞は、以下の段階：
(a)マイクロキャリアに接着した幹細胞を培地中で増殖させ；
(b)マイクロキャリアを1つの培地からもう1つの培地に移し；
(c)場合により段階(b)を必要なだけ繰り返し；そして
(d)マイクロキャリアに接着した分化した細胞を取得する；
を含む方法によってin vitroで幹細胞から取得することができる。

幹細胞または部分的に分化した細胞は、上記マイクロキャリアに接着したままで潜在的モジュレーターに曝露することができる。従って本発明は、マイクロキャリアに接着したままでHTS中でこれらの細胞を使用する、例えばロボット工学を使用して細胞移動段階を実施するための方法を提供する。分化した細胞は、マイクロキャリアから酵素的に分離することによって単離しても良い。分化した細胞は、マイクロキャリアの消化によって単離しても良い。

本発明の方法は、乾燥重量で50gより多いマイクロキャリアを用いて実施することができる。

多能性幹細胞は、以下の段階：
(a)上記細胞をマイクロキャリア上にまき；そして
(b)キャリアに接着したままで細胞を増殖させる；
を含む方法によって、in vitroで増殖させることができる。

細胞単位のアイデンティティーまたは細胞培養履歴の決定
多数の細胞単位を操作する場合、そのアイデンティティー(identity)および／または細胞培養履歴（例えば任意の1グループもしくは単位が曝露された可能性のある一連の培養条件の順番および正確な性質）は混乱したものとなり得る。例えば、細胞培養のスプリット−プールプロトコルは、各回で細胞単位を混合することを必ず含んでおり、そのために個々の単位を追跡することが困難である。複数の培養条件にかけられた細胞単位の混合物における、ある細胞単位の細胞培養履歴を決定することは、細胞培養履歴の「デコンボリューション」といわれることがある。これを行う1つの方法は細胞単位を標識することであり、従って、細胞単位を標識することは有利である。標識は、実験の最初、または実験の各回の間に行うことができ、独特の標識（実験の間に改変されてもされなくても良い）または独特の集合体を含む一連の標識を含み得る。同様に、標識の読み取りは、各回の間、または単純に実験の最後に行うことができる。一実施形態において、RFID標識等の独特の標識は各回の間に読み取られるが、各回で順番に追加される標識は実験の最後に読み取られる。

細胞単位の標識は、種々の手段、例えば細胞自体、または細胞が接着もしくは他の方法で結合している任意の物質を標識することで達成し得る。合成コンビナトリアルライブラリーをコードするために用いられる化学的および非化学的方法のいずれをこの目的のために適合させても良く、これらのうちのいくつかはMethods in Enzymology 第267巻 (1996) 「コンビナトリアル化学」John N. Abelson（編者）；「コンビナトリアル化学」Oxford University Press (2000), Hicham Fenniri（編者）；K. Braeckmans等,「コード走査（Scanning the code）」 Modern Drug Discovery (Feb. 2003)；K. Braeckmans等, 「マイクロキャリアのコード付け：現在および未来の技術（Encoding microcarriers: Present and Future Technologies）」；Nature Reviews Drug Discovery, 第1巻, p.447-456 (2002)（これらの全てを参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。標識方法のいくつかの例を以下に示す。

細胞単位を標識する1つの方法は、細胞単位を、異なる培養条件に置かれたときに順に改変されるようになるタグと結合させることを含む。これには、例えば立体化学、配列もしくは質量が変化するようなタグへの更なる単位の追加もしくは除去；あるいは記録再生RFトランスポンダー（下記参照）におけるような電気的記憶の変更が含まれ得る。

細胞単位を標識する別の方法は、異なる条件で培養されるときは常に独特なタグを細胞単位と順次に結合させ、その後のタグの検出および同定によって、細胞単位が曝露された細胞培養条件の順番およびアイデンティティーの明確な記録が提供されるようにすることが含まれる。タグは、細胞によって取り込まれ、または吸着、もしくは適切なリガンドもしくは抗体によって細胞表面に付着し、または吸着、コロイド力もしくは共有結合もしくは非共有結合（例えばビオチン−ストレプトアビジン結合）等の種々の結合によってキャリア等の細胞結合マトリクスにコンジュゲートすることができる。例えば、細胞に導入できる、または細胞と結合したマトリクスに接着できる単純なタグの1つは、規定の長さおよび／または配列のオリゴヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチドは、任意のクラスの核酸（例えばRNA、DNA、PNA、線状、環状もしくはウイルス）を含み、増幅のための特定の配列（例えばPCRのためのプライマー配列）または検出のための標識（例えば蛍光団もしくはクエンチャー、または同位体タグ）を含み得る。これらの検出は、例えばオリゴヌクレオチドの配列決定、もしくはこれらを相補的配列（例えばアレイもしくはチップ上のもの）とハイブリダイズさせることによって直接的に行っても、あるいはオリゴヌクレオチドがコードする遺伝子産物、または細胞活性を有するヌクレオチドの妨害（例えば特定の遺伝子のアンチセンス阻害）をモニタリングすることによる等、間接的に行っても良い。核酸を増幅する有利な方法は、核酸タグがRCA鋳型、伸長プライマー、もしくはミニサークル鋳型の環状化を助ける支柱（struts）を含み得るローリングサークル増幅（RCA; 2002, V. Demidov, Expert Rev. Mol. Diagn. 2(6), p.89-95）によるものである。

分子または高分子タグは、検出可能である限り使用することができ、ペプチドタグ、着色もしくは蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定同位体の混合物等が含まれる。タグは、細胞単位に直接、または仲介物、例えば細胞単位の成分に対して作られた抗体を介して、もしくはビオチン−ストレプトアビジン等の相互作用対を介して接着することができる。更に、タグは、例えば化学的もしくは他の改変によって、またはカプセル化によって、細胞培養の成分による分解から保護することができる。タグのカプセル化は、多くの異なる媒体中、例えばその多くの型がBangs Laboratories Inc.（Fishers IN, USA）等の業者から入手できるビーズ中で行うことができ、カプセル化を利用して、タグの増幅および／または検出のための成分を提供する（例えばDNAタグと共に使用するためのPCRプライマーの提供によって）ことに加えてタグの使用量を標準化することができる。細胞単位を標識する1つの方法では、Luminex Corporation（Austin, TX, USA）によって製造されたもの等の蛍光ビーズが使用される。Luminexのシステムは、（例えばアビジンもしくは抗体で）外部から誘導体化してもしなくても良いポリスチレンビーズを含み、2種のスペクトルが識別可能で比率の異なる蛍光団と、各ビーズのスペクトルサインの性状解析が可能なリーダーとを用いて内部染色する。更なる方法では、Bangs Laboratories Inc.（Fishers IN, USA）によって製造されたもの等のビーズが使用される。Bangsのシステムは、サイズの違いに基づいて識別できるビーズセット（例えば直径4.4μmおよび5.5μmのビーズセット）を含む。各セット内のビーズは、単一の蛍光色素の負荷量の差のために異なる蛍光強度に基づいて互いに更に識別することができる。吸収または放出特性が異なる多くの別の色素を使用することが可能であり、それらは様々な手段によって内部負荷またはキャリアに外部から結合させることができる、る。更に、読み取りが便利にできる非常に多くの異なる蛍光標識を得るために、「量子ドット」を用いることが可能である。

細胞単位の形成と関連して記載したもののような細胞増殖基体は、タグ付けを容易にし、かつ細胞増殖を妨害しない物質で誘導体化または被覆することができる。キャリアを誘導体化する1つの方法は、これをビオチンで共有的もしくは非共有的に改変し、これにストレプトアビジンもしくはアビジンを介してタグを結合させ得るものである。一般に、それ自体は細胞効果を誘導せず（すなわち不活性タグ）、細胞単位もしくは培地中に存在する分子から識別可能であり、そしてその標的に結合し、その後こうした分子のバックグラウンドの中で検出可能なタグを使用することが重要であろう。検出を容易にするために、細胞単位からタグを選択的に溶出させること、または選択的条件を用いて細胞単位から細胞を剥ぎ取ることが有利であり得る。分子的タグのセットおよびその混合物に割り当てられたバイナリーコードのセットによって情報を記録する「バイナリーコード付け」の戦略を含め、より複雑な分子的タグ付け戦略も考案することができる。

タグの検出は、当業者によく知られた種々の方法によって達成することができる。これらの方法には、質量分析、核磁気共鳴、配列解析、ハイブリダイゼーション、抗原検出、電気泳動、分光法、顕微鏡観察、画像解析、蛍光検出等がある。

特に興味深いのは、標識を1回だけ実施するか、標識および／もしくは検出が非物理的であり、従って非侵入的である標識またはコーディング戦略である。高周波同定（RFID）はこれらの特性を示すシステムの例である。RFIDはトランスポンダー（RFタグ）、アンテナおよびリーダーを使用する。RFタグは通常ガラスもしくはプラスティックで覆われた小さな電子回路であり、その最も単純な形態において、適切なエレクトロニクスによって、接触もしくは視野方向なしに「読み取る」ことができる独特な識別コードにアクセスできる。タグはまた使用者によって作製される情報を、再び接触もしくは視野方向なしに保存することができる。「リーダー」は、1以上のタグに、また1以上のタグから情報を移動させる電子単位である（用語「リーダー」は読み取りのみの単位、および読み取り／書き込みの単位の双方を意味するように互換可能に使用されることに留意すべきである）。リーダーの大きさおよび性質は大きく変動でき、分離して作動することができ、また遠隔コンピューターシステムに連結されていても良い。アンテナは、リーダーからタグへ情報を送信し、RFタグから送られる情報を受信するために使用される。アンテナの大きさおよび形式は特定の応用を反映し、小さな円形コイルから大きな平面構造のものまであり得る。RFIDシステムは、分離して作動することができ、また識別およびタグから得られる関連データのより総合的な解釈および操作のために遠隔コンピューターに連結しても良い。コンビナトリアル化学において用いられるRFID戦略の１つが、Nicolaou等（1995, Angew Chem Intl Ed Engl, 第34巻, p.2289）に記載されており、これは(i)合成基体および半導体タグを含む多孔質の囲い；(ii)固相合成樹脂；(iii)高周波シグナルを受信、保存、および発信し得るガラスに覆われた単一もしくは複数のアドレス可能な高周波タグ半導体単位；を含む。固相合成樹脂を組織培養マイクロキャリアもしくは適切な細胞単位と単に置き換えて、類似のデバイスを、細胞単位を増殖かつ追跡するために適合させることができるであろう。限定するものではないが、細胞が直接その上で増殖する（被覆された、もしくは被覆されていない）RFタグ、または細胞単位もしくは生物中に埋め込まれたRFタグを含む更なる変更を考えることができる。

従って、タグは必ずしもまずその化学的もしくは分子的構造によって識別されなければならない訳ではない。混合物中の所与の細胞単位のアイデンティティーを決定するため、また混合物を含む別の細胞単位のアイデンティティーを推測する非化学的タグ付け戦略の複数の変更を考案することができる。例えばタグ付けの光学的もしくは視覚的方法が記載されており、それには種々の形状の物体、図形的にコードされた物体もしくは種々の色がサンプルのアイデンティティーを示していたり（例えば1998, Guiles等, Angew. Chem. Intl Ed Engl, 第37巻, p926；Luminex Corp, Austin TX, USA；BD Biosciences；Memobead Technologies, Ghent, Belgiumを参照のこと）、あるいはセラミックバーやナノワイヤー等の基体上にパターンやバーコードをエッチングし、パターン認識技術を用いて認識する（例えば1997, Xiao等, Angew. Chem. Intl Ed Engl, 第36巻, p780；SmartBead Technologies, Babraham, UK；Oxonica Ltd, Kidlington, UKを参照のこと）。

細胞単位を追跡もしくは標識する更なる方法は、そのアイデンティティーを空間的に、すなわちその空間における位置によってコード付けすることである。この方法において、異なる細胞単位は規定の相対位置に分離され、これらの位置によってその単位のアイデンティティーが示され、もしくはコード付けされる。例えば、細胞単位をアレイ中で培養することができ、それによって各単位のアイデンティティーおよび／または培養履歴がわかり、これをアレイ中の特定の位置に関連付けることができる。最も単純な形態において、こうしたアレイは、組織培養フラスコの集合体、マルチウェルプレートのウェル、またはガラススライドもしくは他の表面上の位置を含み得る。位置的にコード付けする戦略の例は、Geysen等（1984, Proc Natl Acad Sci USA 第81巻, p3998-4002）、Fodor等（1991, Science 第251巻, p.767-773）、ZiauddinおよびSabatini（2001, Nature, 第411巻, p.107-110）、およびWu等（2002, Trends Cell Biol. 第12(10)巻, p.485-8）に見ることができる。

本発明は多くの様相を有しており、その各々が、本発明の多くの置換体を形成するように組み合わせることができる多くの形態を有し得る。細胞培養プロトコルの組み合わせから得られる結果についての情報を推測することができるように、細胞単位の全てを標識する必要はないことは明らかであろう。従って、細胞単位を標識しなくても、本発明に従って細胞培養条件の大きな組み合わせをアッセイし、これらの1つ以上が特定の細胞効果を生じ得るか否かを決定することが可能であろう。しかしながら、一実施形態において、細胞単位を標識する。細胞単位の標識によって、全ての細胞単位ではなく、標識した細胞単位からサンプリングした特定の条件の結果に関して実験から有用な情報を引き出すことが可能となる。あるいはまた、特定の培養プロトコルに全てが曝露された細胞単位の1もしくは2〜3のグループ、例えば特定のスプリットもしくはプール段階の間に同じ培地中に分離された細胞単位の1グループを標識することが有利な場合がある。特定の細胞単位の標識によって、他の（おそらくは未標識の）細胞単位のアイデンティティーが推測できることも明らかであろう。

同様に、種々の条件が省略された細胞培養実験を実施することによって、特定の実験結果に関してのこれらの条件の有用性に関する情報が得られることは明らかであろう。従って、実験を多数回繰り返し、各回で異なる条件セットを省略することによって、本発明に従った方法でサンプリングされた条件のそれぞれを評価することが可能であろう。

スプリット−スプリット細胞培養段階を用いて、実験結果に対する特定の条件セットの効果を決定することもできる。事実上、スプリット−スプリット段階は、分岐時点で独特な細胞培養条件にそれぞれ曝露された細胞単位の特定の系統の形成を生じる。異なる系統を研究することによって、特定の実験結果に関し、分岐時点における、研究された組織培養条件の有用性を決定することが可能である。

造血細胞
更なる態様において、幹細胞−例えば胚性幹細胞−から造血細胞をin vitroで製造する方法であって、該幹細胞を1以上、好ましくは2以上の反応条件に曝露することを含み、該反応条件が、該幹細胞を（ａ）レチノイン酸、ジメチルスルホキシド（DMSO）および／もしくは幹細胞因子（SCF）；および（ｂ）インスリン、幹細胞因子（SCF）、TGFβ1、BMP2、BMP4および／もしくはTPO；および（ｃ）IL-3、IL-6、TPO、EPOおよび／もしくはM-CSFと共にインキュベートすることを含む、上記方法が提供される。

幹細胞は、ゼラチンマイクロキャリア等のマイクロキャリア上にまくことができる。

典型的には、幹細胞は、IMDM基本培地またはStreamline造血細胞増殖用培地（Haematopoietic Expansion Medium）等の培地中に含まれる。

好適には、段階（ａ）においてレチノイン酸もしくはジメチルスルホキシド（DMSO）もしくは幹細胞因子(SCF)を用い；好適には段階（ｂ）においてインスリンを単独で用いる。好適には、段階（ｂ）においてSCF、TGFβ1、BMP2およびTPOを用いる。好適には、段階（ｃ）においてIL-3およびIL-6を用い、場合によってTPO、EPOおよび／またはM-CSFを用いる。

典型的には、段階（ａ）は1日目に実施する。典型的には、段階（ｂ）は4日目に実施する。典型的には、段階（ｃ）は6日目に実施する。

特定の一実施形態において、条件は、幹細胞をレチノイン酸、ジメチルスルホキシド（DMSO）、もしくは幹細胞因子（SCF）と共にインキュベートし；次いで幹細胞をインスリン、幹細胞因子（SCF）、TGFβ1、BMP2もしくは4およびTPOと共にインキュベートするか、または幹細胞をインスリン単独、および／もしくはSCF、TGFβ1、BMP2およびTPOの組み合わせと共にインキュベートし；次いで幹細胞をIL-3、IL-6、および場合によってTPO、EPOおよび／もしくはM-CSFと共にインキュベートするものである。

別の特定の実施形態において、条件は、1日目に幹細胞をレチノイン酸もしくはジメチルスルホキシド（DMSO）、もしくは幹細胞因子（SCF）と共にインキュベートし；4日目に幹細胞を幹細胞因子（SCF）、TGFβ1、BMP2、BMP4およびTPOと共にインキュベートするか、または幹細胞をインスリン単独、および／もしくはSCF、TGFβ1、BMP2およびTPOの組み合わせと共にインキュベートし；6日目に幹細胞をIL-3、IL-6、および場合によってTPO、EPOおよび／もしくはM-CSFと共にインキュベートするものである。

更なる態様
本発明の更なる態様を、以下の段落に提示する：
１．以下の段階：
（ａ）第一の細胞型を1以上の反応条件に連続的に曝露することによって該第一の細胞型を第二の細胞型に分化させることができる、該第一の細胞型の細胞を提供し、
（ｂ）潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件への曝露を、上記1以上の反応条件の少なくとも1つに追加するか、またはこれと置き換え、
（ｃ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する、
を含む、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法。

２．以下の段階：
（ａ）胚もしくは胎児から得られ、第二の細胞型に分化させることができる第一の細胞型の細胞を提供し；
（ｂ）場合によって該第一の細胞型を増幅し；
（ｃ）該第一の細胞型を1以上の反応条件に連続的に曝露することによって更に分化させ；
（ｄ）該第一の細胞型を、潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件に曝露し；そして
（ｅ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する、
を含む、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法。

３．反応条件が、細胞が曝露される培養条件である、段落１または２記載の方法。

４．第一の細胞型が、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された細胞である、段落２または３記載の方法。

５．細胞型が一次細胞、細胞系または腫瘍由来の細胞系である、段落１または３記載の方法。

６．細胞型の起源組織が脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、皮膚、髪、目、歯、膵臓、筋肉、骨および血管系からなる群より選択される、段落４または５記載の方法。

７．潜在的モジュレーターが細胞シグナリング経路の阻害剤である、段落１〜６のいずれかに記載の方法。

８．潜在的モジュレーターが細胞シグナリング経路の促進剤である、段落１〜６のいずれかに記載の方法。

９．細胞型の分化に必要な培養条件が、以下の段階を含む方法において最初に同定される、段落３〜８のいずれか記載の方法：
（ａ）それぞれ1以上の細胞を含む細胞単位の第一セットのグループを提供し、該グループを所望の培養条件に曝露し；
（ｂ）該グループの1以上を分割して細胞単位の更なるセットのグループを作製し；
（ｃ）更なるグループを更なる所望の培養条件に曝露し；
（ｄ）場合により、段階（ｂ）−（ｃ）を必要な回数反復し；そして
（ｅ）曝露された培養条件が所与の細胞単位に与える効果を評価する。

１０．細胞型の部分的もしくは完全な分化に必要な培養条件が、以下の段階を含む方法において最初に同定される、段落３〜８のいずれか記載の方法：
（ａ）それぞれ1以上の細胞を含む細胞単位の第一セットのグループを提供し、該グループを所望の培養条件に曝露し；
（ｂ）該グループの2以上をプールして少なくとも1つの第二のプールを形成し；
（ｃ）第二のプールを分割して細胞単位の更なるセットのグループを作製し；
（ｄ）更なるグループを所望の培養条件に曝露し；
（ｅ）場合により、段階（ｂ）−（ｄ）を必要な回数反復し；そして
（ｆ）曝露された培養条件が所与の細胞単位に与える効果を評価する。

１１．部分的に分化した細胞単位を次に単離し、段落１〜８のいずれか記載の方法において用いる、段落９または１０記載の方法。

１２．段落１〜１１のいずれか記載の方法における、段落９または１０で同定された部分的に分化した細胞型の使用。

１３．細胞単位が標識されており、該標識が、細胞単位が曝露された培養条件を反映するものである、段落９〜１２のいずれか記載の方法。

１４．標識が空間的にコードされている、段落１３記載の方法。

１５．標識が、ウイルス、オリゴヌクレオチド、ペプチド、蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定同位体の混合物、バーコード、光学的タグ、ビーズ、量子ドットおよび高周波コードタグからなる群より選択される、段落１３または１４記載の方法。

１６．2以上の標識が選択され、細胞単位を標識するために組み合わせて用いられる、段落１５記載の方法。

１７．細胞を細胞単位で培養し、各細胞単位が1以上の細胞を含む、段落９〜１６のいずれか記載の方法。

１８．細胞単位が単一の細胞である、段落９〜１６のいずれか記載の方法。

１９．各細胞単位が、固相基体に接着もしくは結合した1以上の細胞を含む、段落９〜１７のいずれか記載の方法。

２０．固相基体がマイクロキャリアまたはビーズである、段落１９記載の方法。

２１．固相基体がウェルまたは培地透過性のバリアである、段落１９記載の方法。

２２．培養条件が、細胞が曝露される培地である、段落９〜２１のいずれか記載の方法。

２３．培地が、細胞プロセスに影響する1以上の特定の薬剤を含有する、段落２２記載の方法。

２４．細胞培養条件が、1以上の、特定の温度、または酸素もしくは二酸化炭素の部分圧で培養することを含む、段落３〜２３のいずれか記載の方法。

２５．細胞培養条件が、1以上の特定の基体上で培養することを含む、段落３〜２４のいずれか記載の方法。

２６．第一の細胞を、細胞シグナリングおよび／または細胞中の１以上の遺伝子の発現をモジュレートすることによって第二の細胞型に分化させる、段落１〜２５のいずれか記載の方法。

２７．細胞における遺伝子発現のモジュレーションが、上記１以上の遺伝子の細胞中へのトランスフェクションを含む、段落２６記載の方法。

２８．遺伝子発現のモジュレーションが、遺伝子産物の外部からの投与を含む、段落２６記載の方法。

２９．細胞の分化を、細胞の表現型を観察するか、もしくは細胞内の1以上の遺伝子の発現のモジュレーションを検出することによってモニタリングし、それによって細胞の分化の状態を決定する、段落１〜２８のいずれか記載の方法。

３０．上記細胞の１以上の分化状態に応答する１以上のレポーター遺伝子の発現のモジュレーションを観察する、段落２９記載の方法。

３１．関与する遺伝子の発現が遺伝子チップ上でモニタリングされる、段落２９または３０記載の方法。

３２．上記1以上の遺伝子がマーカーをコードする、段落２９記載の方法。

３３．上記マーカーがイムノアッセイによって検出可能なものである、段落３２記載の方法。

３４．細胞の分化を増殖能の喪失によってモニタリングする、段落１〜３３のいずれか記載の方法。

３５．幹細胞、または幹細胞からin vitroで得られた細胞を、以下の段階：
（ａ）異なる条件下で増殖した細胞の1以上の培養物を組み合わせ；そして
（ｂ）細胞を培養する；
を含む方法によって培養する、段落４または５記載の方法。

３６．上記幹細胞を培養条件の少なくとも１つの変更にかける、段落３５記載の方法。

３７．培養条件の変更が培地の変更を含む、段落３６記載の方法。

３８．分化した細胞が、以下の段階：
（ａ）マイクロキャリアに接着した幹細胞を培地中で増殖させ；
（ｂ）マイクロキャリアを１つの培地から別の培地に移し；
（ｃ）場合により段階（ｂ）を必要な回数反復し；そして
（ｄ）マイクロキャリアに接着した分化した細胞を取得する：
を含む方法によって幹細胞からin vitroで得られたものである、段落４記載の方法。

３９．幹細胞または部分的に分化した細胞を、上記マイクロキャリアに接着したままで潜在的モジュレーターに曝露する、段落３８記載の方法。

４０．分化した細胞をマイクロキャリアからの酵素的分離によって単離する、段落３８記載の方法。

４１．少なくとも50g（乾燥重量）のマイクロキャリアを用いるようにプロセスをスケールアップする、段落３８、３９または４０記載の方法。

４２．分化した細胞をマイクロキャリアの消化によって単離する、段落３８または４１記載の方法。

４３．多能性幹細胞が、以下の段階：
（ａ）細胞をマイクロキャリア上にまき；そして
（ｂ）キャリアに接着したままで細胞を増殖させる；
を含む方法によってin vitroで増殖させたものである、段落４記載の方法。

４４．潜在的モジュレーターが、有機もしくは無機小分子、天然もしくは誘導体化した炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質−核酸（PNA）を含む、段落１〜４３のいずれか記載の方法。

４５．潜在的モジュレーターが、薬剤様の性質を有する小分子のライブラリーから得られる、段落１〜４４のいずれか記載の方法。

４６．段落１〜４５のいずれかの記載に従って潜在的モジュレーターを同定するための、化合物ライブラリーの使用。

４７．段落１〜４６のいずれかの記載に従って同定されたモジュレーターを、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する医薬組成物。

４８．疾患の治療のための医薬の製造における、段落１〜４７のいずれか記載の方法で同定されたモジュレーターの使用。

４９．治療が細胞置換療法である、段落４８記載のモジュレーターの使用。

５０．幹細胞からin vitroで分化し、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止された、部分的に分化した細胞。

以下に、実施例を用いて本発明を更に説明するが、本実施例は、当業者が本発明を実施する上での補助となることを意味するものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

造血系の骨髄系統を刺激することができる再生医薬を同定するためのスクリーニングを実施した。スクリーニングを実施するにあたって、マイクロキャリア上に播いたマウス胚性幹細胞（mESC）を骨髄系統の前駆細胞に分化させるための一連の培養段階を用い、続いてこれらを系統特異的造血性増殖因子TPO、M-CSFおよびIL-5、もしくはコントロール化合物ビタミンC（細胞の生存に影響すると報告されているが、造血性増殖因子ではない）の存在下または非存在下で培養条件に供した。48時間後、骨髄細胞の分化に及ぼす効果を、代理アッセイとしてマクロファージの出現を用いて評価した。このスクリーニングによって、骨髄系統を刺激することができる造血性再生医薬としてTPOおよびM-CSFが同定された。

材料および方法
試薬
マウス幹細胞因子（SCF）（R＆D Systems）
マウストロンボポエチン（TPO）（R＆D Systems）
ヒトエリスロポエチン（EPO）（R＆D Systems）
ヒトインターロイキン６（IL-6）（R＆D Systems）
ヒトトランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）（R＆D Systems）
マウスマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）（R＆D Systems）
マウスインターロイキン３（IL-3）（R＆D Systems）
レチノイン酸（Sigma）
ヒト骨形成タンパク質２（BMP2）（R＆D Systems）
マウスインターロイキン５（IL-5）（R＆D Systems）
アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Sigma）
mESCのミクロ培養
CultiSpher-Gマイクロキャリア（Percell Biolytica AB）を、製造業者の推奨に従い、水和、滅菌した。

D3 ES細胞（ATCC no. CRL-1934）を、ゼラチン被覆プラスティック上にて、15％ノックアウト血清置換物（KOSR）、1％非必須アミノ酸（NEAA）、1％Glutamax、0.5％ペニシリン／ストレプトマイシン(pen/strep)、0.1mM β-メルカプトエタノール（β-ME；Sigma）および1000U/ml 白血病抑制因子（LIF；Chemicon）（他に示さない限り全てInvitrogen社製）を含有するKO-DMEM中で増殖させた。

実験の一日目の前日に、培地A（IMDM(Gibco)、15％ KOSR、1％ NEAA、0.5％ pen/strep、0.1mM β-ME、1000U/ml LIFおよび1.5×10^-4M 1-チオグリセロール(MTG; Sigma)）中で平衡化したおよそ1.5×10⁴個のビオチニル化マイクロキャリアを、およそ4.5×10⁶個のES細胞を含有する100mlの培地Aに添加し、3つの等量のアリコートに分けて100mm²のペトリ皿（Bibby Sterilin）のウェルに入れ、一晩インキュベートした。

mESCからの前駆細胞の調製
骨髄前駆細胞を調製するために、2段階法を用いた。上記のようにmESCを播いたビーズを、10^-8Mのレチノイン酸を含有するIMEM中で72時間インキュベートした。次いでビーズをPBS中で洗浄し、40ng/ml SCF、2.5ng TGFβ1、5ng/ml BMP2および20ng/ml TPOを含有するStemline（商標）造血細胞増殖用培地（Haematopoietic Expansion Medium）（Sigma）に移した。

再生医薬のための細胞ベースアッセイ
上記のようにして調製した骨髄前駆細胞を保持するビーズを混合し、PBS中で洗浄し、試験増殖培地（30ng/ml IL-3および20ng/ml IL-6を添加したStemline(商標)造血細胞増殖用培地(Sigma)）に移した。およそ100個のビーズの等量のアリコートを48ウェルプレートのウェル中に分配し、50μg/ml ビタミンC、10ng/ml IL-5、20ng/ml TPOおよび20ng/ml M-CSFの存在下または非存在下でインキュベートした。スクリーニングは、同じインキュベーターに置かれた別個のプレートのウェルで３回反復して行った。

48時間後、マクロファージアッセイ試薬DQ-オボアルブミン（Molecular Probes）1mgを0.4ml PBS中に入れ、各ウェルに1:100希釈で添加した。少なくとも4時間インキュベーションした後、培地を吸引し、PBSと交換した。サンプルを、FITCフィルターセットを用いてNikon TE2000-S倒立落射蛍光（epifluorescent）顕微鏡で調べ、緑色蛍光で内部標識された大きな円形の細胞を保持しているマイクロキャリアを定量した。

スクリーニングの結果は、マクロファージが付着したマイクロキャリアーの平均数（パーセント）で報告する。試験増殖培地のみでは（すなわち、いかなる試験試薬も存在しない）マクロファージへの平均変換率は1％であり、これを自発分化のための基底変換レベルとした。ネガティブなコントロール化合物であるビタミンCを試験試薬として用いた場合、マクロファージへの平均変換率は0％、すなわち基底レベルより低く、分化に対して効果がないことが示された。造血性増殖因子IL-5を試験試薬として用いた場合、マクロファージへの平均変換率は0％、すなわちまたも基底レベルより低く、このアッセイにおいて骨髄細胞の分化に対して効果がないことが示された。IL-5はリンパ球性造血系統に影響することが知られているが、骨髄系には注目すべき影響を有していない。しかしながら、TPOまたはM-CSFのいずれかを試験試薬として用いた場合、マクロファージへの平均変換率は6％まで上昇し、バックグラウンドを超える有意な増加を示した。

従って、このmESCに基づくアッセイによって、骨髄前駆細胞を分化させるように作用する試薬を同定することができ、従って化学的化合物のライブラリーをスクリーニングして新規再生医薬を同定するために使用することができるであろう。

上記の明細書中で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れる。本発明の記載の方法およびシステムの種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに当業者に明らかであろう。本発明は、特定の実施形態と関連付けて記載されているが、請求の範囲記載の通りの本発明がこうした特定の実施形態に不当に制限されるべきでないことが理解されるべきである。事実、分子生物学または関連分野における熟練者には明らかな、本発明を実施するための記載の形式の種々の改変は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (43)

1. 細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターの同定方法であって、
   （ａ）第一の細胞型を2以上の反応条件に連続的に曝露することによって、該第一の細胞型を、前駆細胞を経て第二の細胞型に分化させることができる、該第一の細胞型の細胞を提供し；
   （ｂ）潜在的モジュレーターを含む1以上の異なる反応条件への曝露を、前駆細胞が曝露された上記2以上の反応条件の少なくとも1つに追加するか、またはこれと置き換え；
   （ｃ）第一の細胞型の分化をモニタリングして第二の細胞型の形成を決定する；
   ことを含む、上記方法。
2. 第一の細胞型が胚もしくは胎児から得られるか、または得ることができ、場合により増幅可能に改変されている、請求項１記載の方法。
3. 前駆細胞が、1以上の反応条件に曝露することで第一の細胞型からin vitroで誘導される、請求項１または２記載の方法。
4. 第一の細胞型が自己再生性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
5. 細胞単位の一部である細胞上で分化段階を実施する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 細胞単位がマイクロキャリアまたは他の足場を含む、請求項５記載の方法。
7. 反応条件が、細胞が曝露される培養条件である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 反応条件が、細胞シグナリング経路の潜在的モジュレーターのスクリーニングを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 第二の細胞型が、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止されている細胞である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 細胞型が一次細胞、細胞系または腫瘍由来の細胞系である、請求項１〜９のいずれか1項記載の方法。
11. 細胞型の起源組織が脳、心臓、肝臓、肺、毛髪、目、腸、血液、耳、腎臓、皮膚、歯、膵臓、筋肉、骨および血管系からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 潜在的モジュレーターが細胞シグナリング経路の阻害剤または促進剤である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 第一の細胞が、細胞シグナリングのモジュレーションおよび／または細胞中の1以上の遺伝子発現のモジュレーションによって、第二の細胞型に分化する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 細胞における遺伝子発現のモジュレーションが該細胞中への1以上の遺伝子のトランスフェクションを含む、請求項１３記載の方法。
15. 遺伝子発現のモジュレーションが遺伝子産物の外部からの投与を含む、請求項１３記載の方法。
16. 細胞の表現型を観察するか、または細胞中の1以上の遺伝子の発現のモジュレーションを検出することによって細胞の分化をモニタリングし、それによって該細胞の分化状態を決定する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
17. 細胞の1以上の分化状態に応答する1以上のレポーター遺伝子の発現のモジュレーションを観察する、請求項１６記載の方法。
18. 関与する遺伝子の発現を遺伝子チップ上でモニタリングする、請求項１６または１７記載の方法。
19. 上記1以上の遺伝子がマーカーをコードする、請求項１６または１７記載の方法。
20. 上記マーカーがイムノアッセイによって検出可能なものである、請求項２１記載の方法。
21. 細胞の分化を増殖能の喪失によってモニタリングする、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
22. 潜在的モジュレーターが有機もしくは無機の小分子、天然もしくは誘導体化した炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質−核酸（PNA）を含む、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
23. 潜在的モジュレーターが薬剤様の性質を有する小分子のライブラリーから得られるか、得ることができる、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
24. 請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって得られるか、または得ることができる細胞シグナリング経路のモジュレーター。
25. 請求項２４記載のモジュレーターを製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する医薬組成物。
26. 幹細胞からin vitroで分化し、幹細胞と分化した細胞型との間の分化経路に沿って停止している、部分的に分化した細胞。
27. 細胞が二系統への分化能を有する細胞である、請求項２６記載の細胞。
28. 細胞が単能性細胞である、請求項２７記載の細胞。
29. 前駆細胞の使用を含む、細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）の同定方法。
30. 細胞シグナリング経路のモジュレーター（例えば再生医薬）を同定するための薬剤スクリーニングアッセイにおける前駆細胞の使用。
31. ゼラチンマイクロキャリア（例えばCultiSpherマイクロキャリア）の使用を含む、胚性幹細胞の骨髄系統前駆細胞への分化方法。
32. 胚性幹細胞の骨髄系統前駆細胞への分化のためのゼラチンマイクロキャリア（例えばCultiSpherマイクロキャリア）の使用。
33. 1以上、好ましくは2以上の反応条件に幹細胞を曝露することを含む、in vitroにおける幹細胞からの造血細胞の作製方法であって、該反応条件が、幹細胞を以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）レチノイン酸、ジメチルスルホキシド（DMSO）および／または幹細胞因子（SCF）；および
    （ｂ）インスリン、幹細胞因子（SCF）、TGFβ1、BMP2、BMP4および／またはTPO；および
    （ｃ）IL-3、IL-6、TPO、EPOおよび／またはM-CSF；
    と共にインキュベートすることを含むものである、上記方法。
34. 上記幹細胞をマイクロキャリア上にまく、請求項３３記載の方法。
35. マイクロキャリアがゼラチンマイクロキャリアである、請求項３４記載の方法。
36. 上記幹細胞がIMDM基本培地またはStreamline Haematopoietic Expansion培地中に含まれている、請求項３３〜３５のいずれか１項記載の方法。
37. 段階（ｂ）においてインスリンのみを用いる、請求項３３〜３６のいずれか１項記載の方法。
38. 段階（ｂ）においてSCF、TGFβ1、BMP2およびTPOを用いる、請求項３３〜３６のいずれか１項記載の方法。
39. 段階（ｃ）においてIL-3およびIL-6を用いる、請求項３３〜３８のいずれか１項記載の方法。
40. TPO、EPOおよび／またはM-CSFも用いる、請求項３９記載の方法。
41. 段階（ａ）を1日目に実施する、請求項３３〜４０のいずれか１項記載の方法。
42. 段階（ｂ）を4日目に実施する、請求項３３〜４１のいずれか１項記載の方法。
43. 段階（ｃ）を6日目に実施する、請求項３３〜４２のいずれか１項記載の方法。