KR101170279B1

KR101170279B1 - 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101170279B1
Application number: KR1020100005360A
Authority: KR
Inventors: 장현욱; 손종근
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-20
Filing date: 2010-01-20
Publication date: 2012-07-31
Also published as: KR20110085517A

Abstract

본 발명은 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연물에서 분리한 안트라퀴논 유도체들은 알러지 반응 및 천식반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂(PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제(5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄(LTC₄)생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하였다. 그리고 PMA/A23187로 유도한 비만세포에서 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6) 및 IL-1β의 생성을 억제하였다. 또한 IgE/항원으로 유도한 알레르기 동물모델에서도 그 효과가 입증됨으로써 천식을 포함한 다양한 알레르기 질환의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating allergic diseases comprising anthraquinone derivatives}

본 발명은 천식을 포함한 알레르기성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 알레르기는 면역과잉반응을 나타내는 증후로서, 위장관알레르기, 담마진, 위축성 피부염, 알러지성 비염 및 천식 등의 증상을 나타낸다.

이 중 천식은 비만세포와 같은 대표적인 염증세포와 호산구, T-림프구 등의 각종 체액성 염증 매개물에 의하여 발생되는 질환으로 가역적인 기도폐색과 기관지 과민증을 특징으로 하며, 이의 병태에는 여러 가지 매개물질이 관여한다.

천식에 관여하는 물질로는 SRS-A(slow reacting substance of anaphylaxis)로 알려진 5-리폭시게나제(lipoxygenase)의 대사산물인 류코트리엔(Leukotriene, LT라 함)C₄, D₄, E₄ 이외, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨(Interleukin, IL라 함)-4, -5, -6 등이 관여함이 알려져 있다 (Barnes P. J, et al., Inflammatory mediators of asthma: an update, Pharmacol Rev, 50, pp 515-596, 1998; Galli S, et al., Mast-cell-leukocyte cytokine cascades in allergic inflammation, Allergy 50, pp 851-862, 1995).

천식과 같은 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등의 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다.

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 PGA₂, PGB₂는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta. Physiol. Lat. Am, 1981;31, pp 85-91, 1981; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am. J. Physiol, 267, pp 602-608, 1994), PGD₂, PGE₁은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다(Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res. 449, pp281-293, 1988, Collins DR, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience, 110, pp 351-360, 2002).

특히 PGD₂는 기관지 천식환자의 평활근을 수축하여 천식을 악화시키는 주범으로 알려져 있다(Shiraishi Y, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J. Immunol., 180, pp 541-549, 2008). 류코트리엔(Leukotriens, LT라 함)은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E4(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭시드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기성 반응 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

최근에는 알레르기성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur. J. Pharmacol., 533, pp 40-56, 2006; Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho., Suppl 8, pp28-33, 2005).

그러나, 아직까지도 이러한 질환의 치료와 예방은 의학계의 중요한 업무 중의 하나로 대두되고 있지만 근본적인 치료가 이루어지지 못하고 고식적인 처치만이 이루어지고 있어 근본적인 치료법 및 치료제의 개발이 절실하다.

이에, 본 발명자는 안트라퀴논 유도체가 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 의존적인 류코트리엔 C₄ 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하고, PMA/A23187로 유도한 비만세포에서 종양괴사인자-α, 인터루킨-6 및 인터루킨-1β의 생성을 억제하는 것을 규명하였고, 특히, IgE/항원으로 유도한 알레르기 동물모델에서 항알레르기 효과를 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 안트라퀴논 유도체의 항알레르기 효과를 검토함으로써 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물과 알레르기 질환 개선용 건강식품을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R¹ 및 R²는 각각 수소, C1 내지 C4의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시, C1 내지 C4의 알코올 또는 하이드록시에서 선택된 어느 하나이며, R³는 단당류이다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 안트라퀴논 유도체를 0.1 내지 50 중량부로 함유하는 것이 바람직하다. 만약, 안트라퀴논 유도체를 상기 함량 범위를 벗어나 소량으로 함유하면 원하는 항알레르기 활성을 얻기 곤란하며, 과량으로 함유하면 용량에 비해 알레르기 질환의 치료 및 예방 효과가 둔화될 것이며, 부작용도 야기될 수 있고, 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.

상기 안트라퀴논 유도체는 R¹ 및 R²가 각각 수소, 메틸, 메톡시, 메탄올, 하이드록시에서 선택된 어느 하나이며, R³는 글루코오스일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 안트라퀴논 유도체는 에모딘, 시트레오로세인, 에모딘-8-O-β-D-글루코사이드, 피시온 또는 크리소파놀에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따른 안트라퀴논 유도체는 비만세포에서 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6) 및 인터루킨-1β(interleukin-1β; IL-1β) 등과 같은 염증성 사이토카인 생성을 억제하고, 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제할 수 있다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따른 안트라퀴논 유도체는 알레르기 반응 및 천식 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂(Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄(LTC₄)생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제작용을 나타내었다. 그리고 PMA/A23187로 유도한 비만세포에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등과 같은 염증성 사이토카인 생성을 억제하였다. 또한 IgE/항원으로 유도한 알레르기 동물모델에서도 항알레르기 활성을 나타내었다.

상기 알레르기성 질환으로는, 천식, 과민증, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 약학조성물은 경구 흡입 또는 비강내 투여 제제로 사용하는 것이 보다 바람직하다. 경구 흡입 투여를 위한 제제는 정량 흡입기(metered dose inhaler; MDI), 드라이 파우더 흡입기(DPI), 젯트-네블라이저(jet-nebulizer), 초음파 네블라이저 등을 이용하여 액상 또는 분말상의 조성물로서 투여할 수가 있다. 또, 비강내 투여를 위한 제제는 가압식 정량 분무기, 드라이 파우더 분무기, 적하용기 등을 이용하여 액상 또는 분말상의 조성물로서 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 유효성분인 안트라퀴논 유도체의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 안트라퀴논 유도체의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 안트라퀴논 유도체은 천연약재인 호장근으로부터 유래하는 안전한 물질이며, 특히 50% 치사량(LC50)이 2 g/kg 이상으로 안정성이 확보된 것으로서, 본 발명의 약학조성물에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기성 질환 개선용 건강식품을 제공한다:

[화학식 1]

상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있다.

상기 건강식품은 안트라퀴논 유도체 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 안트라퀴논 유도체의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 안트라퀴논 유도체는 알레르기 반응 및 천식 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂(PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제(5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄(LTC₄)생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제할 뿐 아니라, PMA/A23187로 유도한 비만세포에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β(IL-1β) 등과 같은 염증성 사이토카인 생성의 생성도 억제할 수 있다. 특히, IgE/항원으로 유도한 알레르기 동물모델에서도 항알레르기 활성을 나타냄으로써 천식을 포함한 알레르기성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 에모딘 처리에 따른 COX-2 의존적인 PGD₂ 생성 억제 및 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 각각 검토한 것이고,
도 2는 에모딘 처리에 따른 5-LOX 의존적인 LTC₄ 생성 효과를 검토한 것이고,
도 3은 에모딘 처리에 따른 비만세포 탈과립 억제 효과를 검토한 것이고,
도 4는 에모딘 처리에 따른 생체내 알레르기 반응 억제 효과를 검토한 것이고,
도 5 내지 도 7은 각각 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성 억제 효과를 검토한 것이다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예 등은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 안트라퀴논 유도체의 제조

안트라퀴논 유도체인 에모딘, 시트레오로세인, 피시온, 에모딘-8-O-β-D-글루코사이드는 호장근(Reynoutria japonica)의 뿌리에서 분리하였으며, 크리소파놀은 ChromaDex(U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다.

<참고예 1> 실험용 세포 배양

마우스 골수 유래 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3(마우스의 비장세포에 포크위드 마이토겐(pokeweed mitogen)으로 자극하여 얻은 상층액을 최종 20% 되도록 넣은 배양액)으로 약 3주 정도 배양하여 95% 이상의 균질한 BMMC를 얻었다.

<실험예 1> COX-2 의존적인 프로스타글란딘 D ₂ 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 제조한 안트라퀴논 유도체들의 알레르기 및 천식 질환에 대한 저해정도를 확인하기 위하여, 프로스타글란딘 D₂ EIA 키트 (Cayman, PGD2-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하여 프로스타글란딘 D₂(PGD₂)의 생성량을 측정하였다.

상기 참고예 1에 따라 준비된 마우스 골수 유래 비만세포(BMMC) 배양 3주 후, 세포농도 2×10⁵cells/well에 상기 실시예에서 제조한 안트라퀴논 유도체들(최종농도 20μM)를 30분간 전 처리한 후, IgE/Ag로 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후 상층액의 프로스타글란딘 D₂를 프로스타글란딘 D₂ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 COX-1에 의해서 생성되는 프로스타글란딘 D₂의 생성을 억제시키기 위하여 마우스 골수 유래 비만세포에 아스피린 10㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전 처리한 후 사용하였다.

세정 완충용액(washing buffer)으로 4회 세정하고, 기질용액(substrate solution)을 200㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50㎕의 반응정지 용액(stop solution)을 처리한 후에 450nm에서 흡광도를 ELx800 (BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다. 이때 자극제로 사용한 항체로는 IgE[Monoclonal anti-dinitrophenyl(DNP); Sigma, D8406]와 항원(Ag)으로는 DNP-HSA(Sigma, A6661)를 사용하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 에모딘, 시트레오로세인 및 크리소파놀을 포함한 안트라센 유도체가 뛰어난 COX-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성 억제 효과를 나타내었다. 특히, 도 1a와 같이 에모딘은 농도의존적으로 COX-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하였다.

<실험예 2> COX-2 단백질 발현 억제 효과 검토

24-well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 배양된 BMMC에 라이시스 완충용액(lysis buffer; 20mM Tris, 137mM NaCl, 5mM Na₂EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤X-100, 1m MEGTA, 10mM NaF, 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄)을 넣고 얼음에서 30분 둔 후(5분마다 진탕함) 원심 분리하여 상층액을 취하였다.

전체 세포의 단백질을 SDS-PAGE로 전기 영동을 하고 20% 메탄올, 25 mM Tris (pH7.4), 192 mM 글리신이 포함된 완충액을 사용하여 나트로셀룰로오스 페이퍼로 전기이동 하였다. 단백질이 이동된 멤브레인은 Ponceau 용액으로 이동유무를 확인한 후, 5% 탈지유 용액으로 30분간 실온에서 블로킹 하였다. 그리고 TTBS(0.05 M Tris, 0.75 M NaCI, 0.25% Tween 20) 완충액으로 희석한 COX-2 항체(1: 1000 희석, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers,MA,USA)와 멤브레인을 12 시간 이상 반응하였다. 반응이 끝난 후 TTBS로 3회 세척하였다.

다시 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체(Cell Signaling Technology, Inc. Danvers,MA,USA)와 2시간 반응시키고 TTBS로 3회 세척하였다. 세척이 끝나면 증류수로 세척하고 화학발광(chemiluminesence; ECL) 시스템(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ,USA) 용액으로 2분간 반응한 후 필름에 감광하여 나타난 밴드의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.

그 결과, 도 1b와 같이 에모딘은 농도의존적으로 COX-2 단백질 발현을 억제하였다.

<실험예 3> 류코트리엔 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 제조한 안트라퀴논 유도체들의 류코트리엔 C₄ 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다(Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp.474-476, 2004).

상기 참고예 1에서 준비한 마우스 골수 유래 비만세포 배양 3주 후 비만세포(2×10⁵cells/well)에 상기 실시예에서 제조한 안트라퀴논 유도체들을 일정농도(2.5, 5, 10, 20 μM)로 미리 30분간 전처리 한 후 IgE/Ag로 처리하였다. 세포 자극 10분 후 상층액의 류코트리엔 C₄ 정량은 류코트리엔 C₄ EIA 키트(Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211)를 이용하여 측정하였다. 이때 자극제로 사용한 항체로는 IgE[Monoclonal anti-dinitrophenyl(DNP); Sigma, D8406]와 항원(Ag)으로는 DNP-HSA(Sigma, A6661)를 사용하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 에모딘, 시트레오로세인 및 크리소파놀을 포함한 안트라센 유도체가 뛰어난 류코트리엔 C₄ 생성 억제 효과를 나타내었다. 특히, 도 2와 같이 에모딘은 농도의존적으로 류코트리엔 C₄ 생성을 억제하였다.

<실험예 4> 비만세포 탈과립 반응 억제 효과 검토

상기 참고예 1에서 준비한 마우스 골수유래의 비만세포(BMMC) 2Ｘ10⁵ cells/ml에 일정농도의 제조한 안트라퀴논 유도체들로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분간 동안 전배양(preincubation)한 후, IgE/Ag로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다.

상층액을 β-헥소스 아미니다아제(β-Hexosaminidase; β-HEX)[100mM 구연산 완충용액(구연산 0.955%, 구연산 나트륨 이수화물 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-니트로페닐-N-아세틸-b-D-글루코사미나이드]와 1:2 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2M 글리신(glycine)(pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELISA를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 탈과립(release) %로 환산하였다. 이때 자극제로 사용한 항체로는 IgE[Monoclonal anti-dinitrophenyl(DNP); Sigma, D8406]와 항원(Ag)으로는 DNP-HSA(Sigma, A6661)를 사용하였다.

[수학식 1]

탈과립(%) = [배양상층액 중 유리된 β-hex 활성/(배양상층액 중 유리된 β-hex 활성 + 세포내 β-hex 활성)] X 100

그 결과, 하기 표 1과 같이 에모딘, 시트레오로세인을 포함한 안트라센 유도체가 뛰어난 β-hex 유리 억제 효과를 나타내었다. 특히, 도 3과 같이 에모딘은 농도의존적으로 β-hex 유리를 억제하였다.

화합물 (최종농도 20 μM)	PGD ₂ 생성억제 (%)	LTC ₄ 생성억제 (%)	β-헥소스아미니데이즈 유리억제 (%)
에모딘	99.9	99.9	100
시트레오로세인	99.9	99.9	99.2
피시온	59.6	59.6	68.1
에모딘-8-O-β-D-글리코사이드	46.1	23.5	35.2
크리소파놀	99.9	99.9	72.8

<실험예 5> 동물모델에서의 항알레르기 효과 검토

상기 실시예에서 제조한 에모딘의 생체내(in vivo)에서의 항알레르기 효과를 확인하기 위해, 문헌에 개시된 수동피부 감작 아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다(Katayama S, Shionoya H and Ohtake S, Microbiol Immunol, 22, pp.89-101, 1978).

마우스(ICR mouse, (주)샘타코 BIO KOREA에서 주문)에 단일클론 항 DNP 마우스 IgE(Sigma 사)를 1000배 희석하여 24시간 전에 100㎕ 투여한 후, 항원(DNP, Sigma 사) 투여 30분 전에 CMC(Carboxymethylcellulose)에 녹인 에모딘을 항원 투여 1시간 전에 50㎎/㎏/100㎕를 경구 투여하였다.

그 다음 1mg DNP-BSA(항원용액)/1% 에반스 블루(Evans blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 30분 후 피부에 유출된 색소를 측정하였다. 대조군으로 CMC(Carboxymethylcellulose)만 50㎎/㎏/100㎕를 경구 투여하였다.

그 결과, 도 4와 같이, 에모딘은 생체내 알레르기 동물모델에서 약 48%의 알레르기 반응 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 6> 염증성 사이토카인의 생성 억제 효과 검토

상기 참고예 1에서 준비한 마우스 골수유래의 비만세포(BMMC) 2Ｘ10⁵ cells/ml에 일정 농도의 에모딘으로 처리하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 1시간 동안 전배양(preincubation)한 후 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma)/A23187(Calcium Ionophore A23187)로 자극하여 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 생성량은 6시간 동안, IL-6의 경우는 3시간 동안, IL-1β의 경우는 24시간 동안 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 EIA kit를 사용하여 측정하였다. 이때 대조군으로는 NF-κB 경로 억제제인 PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate, Sigma)를 사용하였다. 그리고, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성량 측정을 위하여 모두 R&D systems 사(U.S.A)의 제품을 사용하였다.

그 결과, 도 5 내지 도 7과 같이 에모딘은 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 각각 농도의존적으로 억제하였다.

<실험예 7> 독성실험

웅성 Balb/c 마우스에 실시예에서 제조한 에모딘을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 0.5g/kg, 1g/kg 및 2g/kg의 용량으로 1회 단회 경구투여하고 7일간 마우스의 생존율 및 체중을 조사하였다.

이러한 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 에모딘은 랫트에서 2g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 2g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명에 따른 에모딘을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

에모딘 20 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

에모딘 20 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

에모딘 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

에모딘 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<제제예 5> 건강식품의 제조

에모딘 200 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<제제예 6> 건강음료의 제조

에모딘 200 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

Claims

삭제
삭제
에모딘 또는 시트레오로세인에서 선택된 어느 하나의 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 안트라퀴논 유도체는 비만세포에서 염증성 사이토카인 생성을 억제하고, 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하는 천식 예방 및 치료용 약학조성물.
삭제
에모딘 또는 시트레오로세인에서 선택된 어느 하나의 안트라퀴논 유도체를 유효성분으로 함유하는 천식 개선용 건강식품.
청구항 6에 있어서, 상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료인 천식 개선용 건강식품.