KR101201134B1 - 해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 해면 추출물은 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하고, 또한 대식세포로부터 산화질소 (nitric oxide; NO) 생성을 억제함으로써, 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases comprising sponge extract}

본 발명은 알레르기성 질환을 포함한 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

천식은 비만세포와 같은 대표적인 염증세포와 호산구, T-림프구 등의 각종 체액성 염증 매개물에 의하여 발생되는 만성 염증성 질환으로 가역적인 기도폐색과 기관지 과민증을 특징으로 하며, 이의 병태에는 여러 가지 매개물질이 관여한다.

천식에 관여하는 물질로는 SRS-A(slow reacting substance of anaphylaxis)로 알려진 5-리폭시게나제(lipoxygenase)의 대사산물인 류코트리엔(Leukotriene, LT라 함)C₄, D₄, E₄ 이외, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨(Interleukin, IL라 함)-4, -5, -6 등이 관여함이 알려져 있다 (Barnes P. J, et al., Inflammatory mediators of asthma: an update, Pharmacol Rev, 50, pp 515-596, 1998; Galli S, et al., Mast-cell-leukocyte cytokine cascades in allergic inflammation, Allergy 50, pp 851-862, 1995).

기관지 천식 역시 일종의 염증반응으로 일어나는 질환으로, 염증은 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있으며, 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유 라디칼(free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다.

염증의 과정은 급성 염증 및 만성 염증의 두 가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 나타난다(Coico R, et al., Immunolgy-a Short Course, Wiely-Liss, INC. Fifth Edition, p16-18, 2003).

염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등의 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다.

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 PGA₂, PGB₂는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta. Physiol. Lat. Am, 1981;31, pp 85-91, 1981; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am. J. Physiol, 267, pp 602-608, 1994), PGD₂, PGE₁은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다(Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res. 449, pp281-293, 1988, Collins DR, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience, 110, pp 351-360, 2002).

특히 PGD₂는 기관지 천식환자의 평활근을 수축하여 천식을 악화시키는 주범으로 알려져 있다(Shiraishi Y, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J. Immunol., 180, pp 541-549, 2008). 류코트리엔(Leukotriens, LT라 함)은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭시드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기성 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

최근에는 알레르기성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur. J. Pharmacol., 533, pp 40-56, 2006; Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho., Suppl 8, pp28-33, 2005).

해면(海綿 ; Porifera)은 후생동물(後生動物) 중 가장 하등한 동물문에 속하며, 갯솜동물이라고도 하고, 원생동물에서 후생동물로 진화하는 과정 중 옆길로 발달한 동물이라고 생각하여 측생동물(側生動物)이라고도 한다. 이러한 해면은 수심 10 내지 9,000미터의 깊은 바다속까지 분포해 있으며, 멍게류, 패류 등의 갑각 위에 붙어 있기도 하고 진흙바닥에 꼿꼿이 서 있는 종류도 있다. 또한 해면동물은 움직임 없이 바위나 바닥에 붙은 채로 생활하기 때문에 얼핏보면 식물로 생각하기 쉽지만 소공과 대공을 통해 먹이를 섭취한다. 현생종은 여러 다른 모양과 색깔을 띠고 전세계에 약 1만종이 알려져 있으며, 목욕해면류(Spongia)가 섬유 골격질 탓에 자체를 표백 가공하여 주로 의용품, 화장용품, 청소용품, 가구용품 등에 이용되고 있으며, 최근에는 이러한 해면에서 항암 활성 물질을 도출하는 많은 연구가 진행되고 있으나, 지금까지 해면 추출물의 염증, 알레르기 또는 천식 질환 치료 및 예방 효과와 관련된 용도에 관해서는 어떠한 문헌에서도 교시되거나 기재된 바가 없다.

이에, 해면 추출물이 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 의존적인 류코트리엔 C₄ 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하고, 또한 대식세포로부터 산화질소 생성을 억제하는 것을 밝힘으로써, 해면 추출물의 항염증 또는 항알레르기 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 해면 추출물의 항염증 또는 항알레르기 효과를 검토함으로써 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물과 염증성 질환 개선용 건강식품을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 해면 추출물을 0.1 내지 50 중량부로 함유하는 것이 바람직하다. 만약, 해면 추출물을 상기 함량 범위를 벗어나 소량으로 함유하면 원하는 항염증 또는 항알레르기 활성을 얻기 곤란하며, 과량으로 함유하면 용량에 비해 염증성 질환의 치료 및 예방 효과가 둔화될 것이며, 부작용도 야기될 수 있고, 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.

또한, 상기 해면 추출물은 물, 헥산, C1 내지 C4의 알코올, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 추출할 수 있고, 특히 상기 해면 추출물은 해면 열수 추출물이거나, 에틸아세테이트 추출물일 수 있다. 이때, 상기 해면 에틸아세테이트 추출물은 해면 알코올 추출물에 물을 가하여 물분획을 얻은 후, 상기 물분획에 에틸아세테이트를 가하여 추출할 수 있다.

또한, 상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 만성 염증성 질환, 급성 염증성 질환 등을 포함하며, 보다 상세하게는 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 알레르기성 질환은 과민증, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 해면 조추출물은 해면 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간 동안 침지시킨 후, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 약 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 3회 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 해면 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 각종 해면 추출 분획물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 알코올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명에 따른 각종 해면 추출 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 제조된 해면 추출물을 대상으로 한 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성 억제실험, 5-리폭시게나제 의존적인 류코트리엔 C₄ 생성 억제 실험, 비만세포로부터 탈과립 반응 억제 실험 및 대식세포로부터 산화질소 생성 억제 실험을 통해 해면 추출물의 항염증 또는 항알레르기 효과를 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 해면 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 해면 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 해면 추출물은 천연약재로서 안전한 물질이며, 특히 50% 치사량(LC50)이 2g/kg 이상으로 안정성이 확보된 것으로서, 본 발명의 약학조성물에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 해면 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있다.

상기 건강식품은 해면 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 해면 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명의 해면 추출물은 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 의존적인 류코트리엔 C₄ 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하고, 또한 대식세포로부터 산화질소 생성을 억제함으로써, 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1 및 도 2는 각각 일실시예에서 따라 제조한 해면의 각종 분획물 및 열수추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이고,
도 3은 해면 에틸아세테이트(EtoAC) 분획 및 부탄올(BuOH) 분획 처리에 따른 비만세포 탈과립 억제 효과를 검토한 것이고,
도 4는 해면 에틸아세테이트 분획에 따른 NO 생성 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과를 검토한 것이고,
도 5는 해면 에틸아세테이트 분획 처리에 따른 NF-κB의 p65 유닛의 핵내 전이 억제 효과를 검토한 것이다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예 등은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 해면 메탄올 조추출물의 제조

동해안에서 채취한 신선한 호박해면(Cliona celata) 260g을 물로 세척하여 100% 메탄올 1ℓ를 넣고 60℃에서 24시간 침지시키고, 실온에서 2시간동안 3회 추출한 후, 감압, 농축 및 건조하여 해면 메탄올 조추출물 13g(수율 : 5%)을 얻었다.

<실시예 2> 해면 비극성용매 가용 추출 분획물의 제조

2-1. 해면 헥산 추출 분획물의 제조

상기 실시예 1의 메탄올 추출물 중 12.8g을 500mL의 증류수에 현탁시킨 후, 2000mL의 분획깔대기에 부은 다음, 동량의 헥산을 넣어 잘 섞이도록 흔들어 물층과 헥산층으로 분리하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 감압, 농축 및 건조하여 해면의 헥산 추출 분획물 1.2g(수율 : 10% 이하) 및 수가용성 분획물을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

2-2. 해면 에틸아세테이트 추출 분획물의 제조

상기 실시예 2-1의 수가용성 분획물에 에틸아세테이트 500 mL를 넣어 3회 반복 추출한 것을 제외하고, 실시예 2-1과 동일한 공정을 수행하여 해면 에틸아세테이트 추출 분획물 0.25g(수율 : 2.31% 이하) 및 가용성 분획물을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

<실시예 3> 해면 극성용매 가용 추출 분획물의 제조

상기 실시예 2-2의 수가용성 분획물에 부탄올 500 mL를 넣어 3회 반복 추출한 것을 제외하고, 실시예 2-1과 동일한 공정을 수행하여 해면 부탄올 추출 분획물 2.0g(수율 : 18.96% 이하) 및 수가용성 분획물 7.48g(수율 : 86.55% 이하)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

상기 실시예에서 수득한 추출 분획물들을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹여서 활성검정에 사용하였다.

<실시예 4> 해면 열수추출물 제조

호박해면 190g을 500 ml의 물을 넣은 후 90℃에서 24시간 3회 추출하여 추출물 13 g(수율 : 6.8%)을 수득하여, 하기 실험에 시료로 사용하였다.

<참고예 1> 실험재료의 준비

세포 배양액인 RPMI-1640, Modified Eagle Medium(MEM), non-essential amino acids solution, 우태혈청(fetal bovine serum; FBS), 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사(Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 c-kit ligand(KL)은 STEMCELL Technologies(vancouver, Canada)에서, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS), 인터루킨(IL)-10, PBS 등은 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 프로스타글란딘 D2 및 류코트리엔 C4의 EIA 키트는 Cayman사(Ann Arbor, USA)에서 구입하였다.

<참고예 2> 실험용 세포 배양

마우스 골수 유래 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3(마우스의 비장세포에 포크위드 마이토겐(pokeweed mitogen)으로 자극하여 얻은 상층액을 최종 20% 되도록 넣은 배양액)으로 약 3주 정도 배양하여 95% 이상의 균질한 BMMC를 얻었다.

<참고예 3> 대식세포주인 RAW264.7 세포 배양

대식세포 유래의 세포주인 RAW264.7 세포(한국세포주은행, 5×10⁵ cells)를 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지 (pH 7.6)에서 배양하였다.

<실험예 1> 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D ₂ 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 수득한 해면 열수추출물 및 각종 분획물의 각종 염증성 질환에 대한 저해정도를 확인하기 위해 프로스타글란딘 D₂ EIA 키트 (Cayman, PGD2-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하여 프로스타글란딘 D₂(PGD₂)의 생성량을 측정하였다.

상기 참고예 2에 따라 준비된 마우스 골수 유래 비만세포(BMMC) 배양 3주 후, 세포농도 2×10⁵cells/well에 상기 실시예에서 수득한 해면 열수추출물 및 각종 분획물(최종농도 125μg/ml)을 30분간 전 처리한 후, 100ng/ml의 KL(c-kit ligand, 비만세포증식인자), 100ng/ml의 LPS(비만세포활성화제)및 100 U/ml의 IL-10(비만세포활성화제)을 포함한 혼합자극제를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후 상층액의 프로스타글란딘 D₂를 프로스타글란딘 D₂ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 사이클로옥시게나제-1에 의해서 생성되는 프로스타글란딘 D2의 생성을 억제시키기 위하여 마우스 골수 유래 비만세포에 아스피린 10㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전 처리한 후 사용하였다.

세정 완충용액(washing buffer)으로 4회 세정하고, 기질용액(substrate solution)을 200㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50㎕의 반응정지 용액(stop solution)을 처리한 후에 450nm에서 흡광도를 ELx800 (BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 해면 에틸아세테이트 분획이 가장 뛰어난 사이클로옥시게나제-2 의존적인 프로스타글란딘 D₂ 생성 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 2> 류코트리엔 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 수득한 해면 열수추출물 및 각종 분획물이 류코트리엔 C₄ 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다(Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp.474-476, 2004).

상기 참고예 2에서 준비한 마우스 골수 유래 비만세포 배양 3주 후 비만세포(2×10⁵cells/well)에 상기 실시예에서 수득한 해면 열수추출물 및 각종 분획물을 일정농도(12.5, 25, 50, 100 μg/ml)로 미리 30분간 전처리 한 후 KL자극제 100 ng/ml를 15분 처리하였다. 세포 자극 후 상층액의 류코트리엔 C₄ 정량은 류코트리엔 C₄ EIA 키트(Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 해면 에틸아세테이트 분획이 가장 뛰어난 류코트리엔 C₄ 생성 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 3> 비만세포 탈과립 반응 억제 효과 검토

상기 참고예 2에서 준비한 마우스 골수유래의 비만세포(BMMC) 2Ｘ10⁵ cells/ml에 일정농도의 해면 열수추출물 및 각종 분획물(125 μg/ml)로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분간 동안 전배양(preincubation)한 후, KL(100 ng/ml)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다.

상층액을 β-헥소스 아미니다아제(β-Hexosaminidase; β-HEX)[100mM 구연산 완충용액(구연산 0.955%, 구연산 나트륨 이수화물 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-니트로페닐-N-아세틸-b-D-글루코사미나이드]와 1:2 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2M 글리신(glycine)(pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELISA를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 탈과립(release) %로 환산하였다.

[수학식 1]

탈과립(%) = [배양상층액 중 유리된 β-hex 활성/(배양상층액 중 유리된 β-hex 활성 + 세포내 β-hex 활성)] X 100

그 결과, 하기 표 1과 같이 해면 열수추출물 및 각종 분획물의 β-헥소스 아미니다아제 유리 억제 효과를 나타내었고, 도 3에 도시된 바와 같이, 해면 에틸아세테이트 분획과 해면 부탄올 분획은 각각 87.5 ㎍/ml 및 92.3 ㎍/ml의 IC₅₀을 나타내었다.

<실험예 4> LPS로 유도한 대식세포로부터 방출된 NO 라디칼의 제거 효과 검토

상기 실시예에서 제조한 해면 열수추출물 및 각종 분획물의 NO 라디칼 제거 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

대식세포 유래의 세포주인 RAW264.7 세포(5×10⁵ cells)에 세포 배양을 위해 준비된 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지(pH 7.6)에 용해시킨 검체를 미리 일정농도의 해면 열수추출물 및 각종 분획물(125 μg/ml)에 가하여 30분간 전 처리한 후 LPS(200 ng/ml)를 가하여 24시간 배양하였다. 배양 후, NO의 농도는 그리스 분석법을 이용하여 측정하였다.

산화질소의 양은 배양된 상층액에서 아질산염을 분석함으로써 확인 하였다. Raw 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 5Ｘ10⁵개로 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨 후, 배양액을 교체하고 에틸아세테이트 분획을 농도별로 30분 전처리한 다음 LPS(200 ng/ml)을 처리하여 활성화시켰다.

24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양한 후 120xg, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 취했다. 배양 상층액을 100ml 그리스시약(Griess reagent; 1% 설파닐아마이드, 0.1% 나프틸에틸렌디아민 2염화물, 2.5% 인산)와 1:1로 혼합하여 상온에서 10분 반응하였다. 반응 후 발색된 흡광도는 ELISA 리더(reader)를 사용하여 570nm 파장에서 측정하였다. 새로운 배양액 배지를 모든 실험에서 공시료로 사용하였으며 아질산염의 농도는, 질산나트륨(NaNO₂) 반응으로부터 얻어진 표준 곡선으로부터 환산하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 해면 에틸아세테이트 분획이 가장 뛰어난 NO 라디칼 제거 효과를 나타내었다.

호박해면 분획 (최종농도 125 μg/ml)	COX-2 의존적인 PGD2 생성억제 (%)	5-LOX 의존적인 LTC4 생성억제 (%)	β-헥소스아미니데이즈 유리억제 (%)	NO 생성 억제(%)
메탄올 분획	59.1	3	3.3	5
헥산 분획	72.4	5	82.1	11.5
에틸아세테이트 분획	76.8	87.6	47.8	44.1
부탄올 분획	64.3	70	62.6	10
물 분획	22.1	50	33	5
열수추출물	12.5	74.9	56.5	10

앞선 실험예의 결과로부터 염증성 질환에 가장 효과가 좋은 것으로 나타난 해면 에틸아세테이트 분획을 이용하여 이하의 실험을 수행하였다.

<실험예 5> LPS로 유도한 대식세포로부터 방출된 NO 생성 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과 검토

6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양된 대식세포(RAW264.7 cell)에 라이시스 완충용액(lysis buffer; 20mM Tris, 137mM NaCl, 5mM Na₂EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤X-100, 1m MEGTA, 10mM NaF, 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄)을 넣고 얼음에서 30분 둔 후(5분마다 진탕함) 원심 분리하여 상층액을 취하였다.

전체 세포의 단백질을 SDS-PAGE로 전기 영동을 하고 20% 메탄올, 25 mM Tris(pH7.4), 192 mM 글리신이 포함된 완충액을 사용하여 나트로셀룰로오스 페이퍼로 전기이동 하였다. 단백질이 이동된 멤브레인은 Ponceau 용액으로 이동 유무를 확인한 후, 5% 탈지유 용액으로 30분간 실온에서 블로킹 하였다. 그리고 TTBS(0.05 M Tris, 0.75 M NaCI, 0.25% Tween 20) 완충액으로 희석한 iNOS 항체(1:1000 희석, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers,MA,USA)와 멤브레인을 12시간 이상 반응하였다. 반응이 끝난 후 TTBS로 3회 세척하였다.

다시 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체(Cell Signaling Technology, Inc. Danvers,MA,USA)와 2시간 반응시키고 TTBS로 3회 세척하였다. 세척이 끝나면 증류수로 세척하고 화학발광(chemiluminesence; ECL) 시스템(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ,USA) 용액으로 2분간 반응한 후 필름에 감광하여 나타난 밴드의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 해면 에틸아세테이트 분획은 농도 의존적으로 LPS로 유도한 대식세포로부터 방출된 NO 생성을 억제하였고, 50% 억제에 필요한 농도(IC50)는 80.5 μg/ml 이었으며, 이는 iNOS 단백질의 발현 억제에 의한 것으로 확인되었다.

<실험예 6> LPS로 유도한 대식세포에서 전사인자인 NF-κB 단위인 p65의 핵내 이동 억제 효과 검토

상기의 방법에 따라 LPS를 처리한 대식세포에 핵 추출 키트(nuclear extract kit, Panomics 사, CA, USA)를 사용하여 핵을 추출한 후 전사인자인 핵인자(Nuclear factor; NF)-κB가 세포질에서 핵내로 이동 억제능에 대하여 검토하였다.

이때 대조군으로서는 NF-κB 경로 억제제인 PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate)를 사용하였다. 전사인자인 NF-κB는 세포에 자극이 없을 때는 세포질에서 IκB와 결합한 상태로 있지만, LPS의 자극을 받게 되면 IκB는 분해되어 NF-κB의 p65 분획은 핵으로 이동하여 iNOS 단백질의 전사를 촉진하게 된다.

그 결과, 도 5와 같이 해면 에틸아세테이트 분획은 LPS로 유도한 대식세포에서 전사인자인 NF-κB의 p65 유닛의 핵내 이동을 억제함으로써 iNOS 발현을 억제시키고 따라서 NO의 생성이 억제됨을 알 수 있었다.

<실험예 7> 독성실험

웅성 Balb/c 마우스에 실시예에서 제조한 해면 에틸아세테이트 분획을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 0.5g/kg, 1g/kg 및 2g/kg의 용량으로 1회 단회 경구투여하고 7일간 마우스의 생존율 및 체중을 조사하였다.

이러한 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 해면 추출물은 마우스에서 2g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 2g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명에 따른 해면 에틸아세테이트 분획을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 50 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 20 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 20 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<제제예 5> 건강식품의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 200 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<제제예 6> 건강음료의 제조

해면 에틸아세테이트 분획 200 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

Claims (9)

1. 호박해면(Cliona celata) 추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 호박해면 추출물은 호박해면 알코올 추출물에 물을 가하여 물분획을 얻은 후, 상기 물분획에 에틸아세테이트를 가하여 추출한 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 호박해면 추출물을 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학조성물.
   
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5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 호박해면 추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 호박해면 추출물은 호박해면 알코올 추출물에 물을 가하여 물분획을 얻은 후, 상기 물분획에 에틸아세테이트를 가하여 추출한 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 천식 개선용 건강식품.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료인 천식 개선용 건강식품.

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