KR101316398B1 - 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 장어 추출물은 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제함으로써, 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating inflammatory diseases comprising eel extract}

본 발명은 알레르기성 질환을 포함한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

천식은 비만세포와 같은 대표적인 염증세포와 호산구, T-림프구 등의 각종 체액성 염증 매개물에 의하여 발생되는 만성 염증성 질환으로 가역적인 기도폐색과 기관지 과민증을 특징으로 하며, 이의 병태에는 여러 가지 매개물질이 관여한다.

천식에 관여하는 물질로는 SRS-A(slow reacting substance of anaphylaxis)로 알려진 5-리폭시게나제(lipoxygenase)의 대사산물인 류코트리엔(Leukotriene, LT라 함)C₄, D₄, E₄ 이외, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨(Interleukin, IL라 함)-4, -5, -6 등이 관여함이 알려져 있다 (Barnes P. J, et al., Inflammatory mediators of asthma: an update, Pharmacol Rev, 50, pp 515-596, 1998; Galli S, et al., Mast-cell-leukocyte cytokine cascades in allergic inflammation, Allergy 50, pp 851-862, 1995).

기관지 천식 역시 일종의 염증반응으로 일어나는 질환으로, 염증은 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있으며, 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유 라디칼(free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다.

염증의 과정은 급성 염증 및 만성 염증의 두 가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 나타난다(Coico R, et al., Immunolgy-a Short Course, Wiely-Liss, INC. Fifth Edition, p16-18, 2003).

염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등의 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다.

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 PGA₂, PGB₂는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta. Physiol. Lat. Am, 1981;31, pp 85-91, 1981; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am. J. Physiol, 267, pp 602-608, 1994), PGD₂, PGE₁은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다(Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res. 449, pp281-293, 1988, Collins DR, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience, 110, pp 351-360, 2002).

특히 PGD₂는 기관지 천식환자의 평활근을 수축하여 천식을 악화시키는 주범으로 알려져 있다(Shiraishi Y, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J. Immunol., 180, pp 541-549, 2008). 류코트리엔(Leukotriens, LT라 함)은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭시드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기성 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

최근에는 알레르기성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur. J. Pharmacol., 533, pp 40-56, 2006; Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho., Suppl 8, pp28-33, 2005).

한편, 일반적으로 장어는 단백질 함량이 높고 칼로리도 높으면서 지방은 불포화 지방산이므로 고혈압 등의 성인병 예방이나 허약 체질, 원기 회복 등에 최고의 식품으로 인정받기 때문에 스태미너 식품으로 특히 여름철 남성들에게 인기가 매우 높다. 이와 같이 건강식품으로 인정받고 있는 장어는 비타민A가 많이 들어있다. 비타민A는 발육촉진, 시력회복, 피부와 점막의 건강유지, 정력제 등의 효능이 있다. 또한 DHA(Docosahexaenoic Acid) 및 EPA(Eicosapentaenoic Acid) 함량이 타 어종보다 높다. DHA의 효능을 보면 머리가 좋아지고, 치매 예방, 암 억제 등에 탁월한 효과를 발휘하기 때문에 옛날부터 생약재 및 천연재료를 사용하고 있다.

이러한 장어는 뱀장어, 붕장어, 갯장어, 먹장어 등과 같이 여러 종류가 있는데 사는 물이 민물이냐 바다냐에 따라 또는 지방에 따라 명칭이 다르게 불리고 있다. 즉 장어는 몸이 뱀처럼 긴 물고기를 뜻하며, 분류학적으로는 뱀장어목(Order Anguilliformes)에 속하는 모든 종류가 포함된다. 일반인들이 흔히 접할 수 있는 장어는 뱀장어뿐 아니라, 먹장어(곰장어), 붕장어(아나고), 갯장어 등이 있다.

본 발명자들은 알레르기성 질환을 포함한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 천연재료를 찾던 중, 장어 추출물을 이용하여 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제함으로써, 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 점을 밝혀내어 본 발명을 완성한 것이다.

본 발명의 목적은 알레르기 또는 천식 등을 포함한 염증성 질환 개선 효과를 갖는 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 장어 추출물을 함유하는 알레르기 또는 천식 등을 포함한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 이용한 기능성 건강식품 및 약제를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 장어는 민물장어, 뱀장어, 붕장어 및 먹장어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

상기 장어 추출물은 장어머리, 장어껍질, 장어뼈, 장어내장, 장어육 및 통장어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 부위를 포함한 추출물일 수 있다.

또한, 상기 장어 추출물은 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있다.

일 실시예로서, 상기 장어 추출물은 장어 부위를 준비하는 단계; 준비된 장어 부위를 에탄올로 추출하는 단계; 상기 에탄올 분획에 물을 가하여 용해하는 단계; 및 헥산을 가하여 추출하는 단계를 포함하는 장어 헥산 분획일 수 있다.

또다른 일 실시예로서, 상기 장어 추출물은 장어 부위를 준비하는 단계; 준비된 장어 부위를 에탄올로 추출하는 단계; 상기 에탄올 분획에 물을 가하여 용해하는 단계; 및 에틸아세테이트를 가하여 추출하는 단계를 포함하는 장어 에틸아세테이트 분획일 수 있다.

상기 장어 추출물은 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제함으로써, 염증 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 만성 염증성 질환, 급성 염증성 질환 등을 포함하며, 보다 상세하게는 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 알레르기성 질환은 과민증, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에서, 상기 조성물은 장어 추출물이 그 자체적으로 항염증, 항천식 및 항알레르기 효과가 있으므로 알레르기 또는 천식을 포함한 염증성 질환 개선효과를 지니는 기능성 식품으로 장어 추출물 자체를 이용할 수 있고, 염증성 질환 개선 효과가 있는 천연추출물들을 함유하는 다른 기능성 식품에 첨가하거나 이러한 천연물들을 추출하는데 사용하는 형태로도 이용이 가능하다.

본 발명의 기능성 식품은 건강 기능식품 또는 건강음료로 사용할 수 있으며, 기능성 음료, 환제, 정제 또는 상기 성분을 건조 분말화하여 충진한 연질 또는 경질 캡슐제의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 장어 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어 각종 식품류, 캔디, 초코릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 건강 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 장어 추출물을 함유하는 것 이외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 이때, 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등의 폴리사카라이드. 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올을 들 수 있다. 또, 상기 향미제로는 천연향미제 예를 들어 타우마틴, 스테비아 추출물, 헤바우디오시드 A, 글리시르히진과 합성 향미제 예를들어 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 장어 추출물은 널리 섭취되는 장어를 이용한 천연물로서, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 장어 추출물을 염증성 질환 개선을 위한 목적으로 식품에 첨가할 경우에는 일반적으로 전체 식품 중량의 20 내지 70 중량%로 첨가할 수 있으며, 음료에 첨가할 경우에는 100 mL를 기준으로 1 내지 100 mL, 바람직하게는 10 내지 80 mL의 함량 비율로 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 장어 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물 총 중량에 대하여 장어 추출물을 1 내지 70 중량부로 함유하는 것이 바람직하다. 만약, 장어 추출물을 상기 함량 범위를 벗어나 소량으로 함유하면 원하는 염증성 질환 치료 또는 예방 효과를 얻기 곤란한 반면, 과량으로 함유하면 용량에 비해 염증성 질환의 치료 또는 예방 효과가 둔화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 장어 추출물의 사용량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 비강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 장어 추출물은 염증 및 알레르기 반응에 관련이 있는 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D₂ (Prostaglandin D₂, PGD₂) 생성을 억제하고, 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 억제하며, 동시에 비만세포로부터 탈과립 반응을 억제하는 효능이 있기 때문에, 천식 또는 알레르기를 포함한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1e는 본 발명에 따른 장어 추출물의 각 분획 제조공정을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 장어 추출물 각 분획의 비만세포로부터 탈과립 반응 억제 효과를 검토한 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 장어 추출물 각 분획의 비만세포로부터 탈과립 반응 억제 효과를 분획 농도별로 검토한 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 장어 추출물 각 분획의 COX-2 의존적인 PGD₂ 생성 억제 효과를 검토한 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 장어 추출물 각 분획의 COX-2 발현 억제 효과를 검토한 것이고,
도 6은 본 발명에 따른 장어 추출물 각 분획의 5-LOX 의존적인 LTC₄ 생성 억제 효과를 검토한 것이다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 장어 추출물 제조

1. 장어 부위 준비

본 실시예에서 사용한 장어는 (주)대동선가 (경기도 성남시 분당구 백현동 472-80 백현빌딩 202호)에서 제공한 검체를 사용하여 실험을 실시하였다. 이때, 검체 제조방법은 우선 국내 장어 양식장에서 구입한 활어상태의 장어를 전기로 기절시킨 후 활복하여 장어육(살, 근육부위)과 머리, 뼈 및 내장, 껍질부위를 각각 제조하였다.

2. 장어 추출물 준비

모든 검체에 100% 에탄올(EtOH)을 가하여 3회 24시간 추출하였다. 그 후 건조시킨 검체에 물을 가하여 용해시킨 후 동량의 헥산(Hex)을 가하여 3회 24시간 추출하였다. 다시 남아있는 수층에 에틸아세테이트(EtOAc)를 동량을 가하여 3회 추출하였다. 최종적으로 남아있는 수층에 부탄올(BuOH)을 동량 가하여 3회 추출하여 분획을 만들고 남아 있는 부분을 수층(H₂O)으로 하여 실험에 사용하였다.

이러한 추출방법 및 이렇게 추출된 각 분획의 수율을 각각 도 1과 표 1에 나타내었다.

		EtOH 추출물 대비	부위별 대비
장어머리	150 g
장어머리 EtOH	2.6025 g
장어머리 Hex	124.1 mg	4.77 %	0.083%
장어머리 EtOAc	192.6 mg	7.40 %	0.128%
장어머리 BuOH	287.8 mg	11.06 %	0.192%
장어머리 H2O	1.5233 g	58.53 %	1.016%
장어껍질	231 g
장어껍질 EtOH	4.7099 g
장어껍질 Hex	635.3 mg	13.49 %	0.275%
장어껍질 EtOAc	258.2 mg	5.48 %	0.112%
장어껍질 BuOH	374.4 mg	7.95 %	0.162%
장어껍질 H2O	2.9284 g	62.18 %	1.268%
장어뼈&내장	164 g
장어뼈&내장 EtOH	4.0507 g
장어뼈&내장 Hex	283.1 mg	6.99 %	0.173%
장어뼈&내장 EtOAc	252.7 mg	6.24 %	0.154%
장어뼈&내장 BuOH	1.6088 g	39.72 %	0.981%
장어뼈&내장 H2O	1.6962 g	41.87 %	1.034%
장어육	507 g
장어육 EtOH	12.0813
장어육 Hex	1.1557 g	9.57 %	0.228%
장어육 EtOAc	439.3 mg	3.64 %	0.087%
장어육 BuOH	3.0046 g	24.87 %	0.593%
장어육 H2O	6.8045 g	56.32 %	1.342%
통장어	299 g
통장어 EtOH	7.2664 g
통장어 Hex	1.3093 g	18.02 %	0.438%
통장어 EtOAc	244.1 mg	3.36 %	0.082%
통장어 BuOH	957 mg	13.17 %	0.32%
통장어 H2O	4.1685 g	57.37 %	1.394%

<참고예 1> 실험재료의 준비

세포 배양액인 RPMI-1640, Modified Eagle Medium(MEM), non-essential amino acids solution, 우태혈청(fetal bovine serum; FBS), 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사(Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 c-kit ligand(KL)은 STEMCELL Technologies(vancouver, Canada)에서, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS), 인터루킨(IL)-10, PBS 등은 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 프로스타글란딘 D₂ 및 류코트리엔 C₄의 EIA 키트는 Cayman사(Ann Arbor, USA)에서 구입하였다.

<참고예 2> 실험용 세포 배양

마우스 골수 유래 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3[마우스의 비장세포에 포크위드 마이토겐(pokeweed mitogen)으로 자극하여 얻은 상층액을 최종 20% 되도록 넣은 배양액]으로 약 3주 정도 배양하여 95% 이상의 균질한 BMMC를 얻었다.

<실험예 1> 비만세포 탈과립 반응 억제 효과 검토

상기 참고예 2에서 준비한 마우스 골수유래의 비만세포(BMMC) 2Ｘ10⁵ cells/ml에 장어 추출물을 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1시간 동안 전배양(preincubation)한 후, KL(100 ng/ml)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다.

상층액을 β-헥소스 아미니다아제(β-Hexosaminidase; β-HEX)[100mM 구연산 완충용액(구연산 0.955%, 구연산 나트륨 이수화물 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-니트로페닐-N-아세틸-b-D-글루코사미나이드]와 1:2 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2M 글리신(glycine)(pH 10.7)으로 반응을 정지시켜 ELISA를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 탈과립(release) %로 환산하였다.

[수학식 1]

탈과립(%) = [배양상층액 중 유리된 β-hex 활성/(배양상층액 중 유리된 β-hex 활성 + 세포내 β-hex 활성)] X 100

그 결과, 하기 도 2(장어 추출물의 처리 농도: 최종농도 100 μg/ml)와 같이 장어 추출물 중 헥산 분획과 에틸아세테이트 분획에서 전반적으로 β-헥소스 아미니다아제 유리 억제 효과를 나타내었으며, 특히 도 3과 같이 장어머리 헥산 분획이 13.62의 IC₅₀를 나타내어 가장 우수한 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 2> 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D ₂ 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 준비한 장어 추출물의 각종 염증성 질환에 대한 저해정도를 확인하기 위해 프로스타글란딘 D₂ EIA 키트 (Cayman, PGD₂-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하여 프로스타글란딘 D₂(PGD₂)의 생성량을 측정하였다.

상기 참고예 2에 따라 준비된 마우스 골수 유래 비만세포(BMMC) 배양 3주 후, 세포농도 2×10⁵ cells/well에 상기 실시예에서 준비한 장어 추출물을 일정농도로 1시간 동안 전처리한 후, 100 ng/ml의 KL(c-kit ligand, 비만세포증식인자), 100 ng/ml의 LPS(비만세포활성화제) 및 100 U/ml의 IL-10(비만세포활성화제)을 포함한 혼합자극제를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후 상층액의 PGD₂를 PGD₂ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 COX-1에 의해서 생성되는 프로스타글란딘 D₂의 생성을 억제시키기 위하여 마우스 골수 유래 비만세포에 아스피린 10 ㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전처리한 후 사용하였다.

세정 완충용액(washing buffer)으로 4회 세정하고, 기질용액(substrate solution)을 200㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50㎕의 반응정지 용액(stop solution)을 처리한 후에 450nm에서 흡광도를 ELx800 (BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다.

그 결과, 도 4(장어 추출물의 처리 농도: 최종농도 100 μg/ml)와 같이 장어 추출물의 헥산 분획이 PGD₂ 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 특히 장어 뼈 및 내장의 헥산 분획에서 가장 우수한 억제 효과를 나타내었다.

한편, 앞서와 같이 세포 자극 8시간 후 얻어진 세포를 이용하여 웨스턴 블롯을 통해 COX-2의 발현을 분석하였다. 즉, 장어껍질, 장어뼈 및 내장, 장어육 및 통장어의 헥산 분획을 최종 농도 100 ㎍/ml에서 COX-2 단백질 발현을 웨스턴 블롯 하였다.

그 결과, 도 5와 같이 COX-2/β-액틴 밴드를 밀도측정기(densitometer)로 측정하여 상대밀도(relative density)로 표시하였으며, 헥산 분획은 COX-2 단백질 발현을 억제함으로써 COX-2 의존적인 PGD₂의 생성을 억제함을 알 수 있었다.

<실험예 3> 류코트리엔 생성 억제 효과 검토

상기 실시예에서 준비한 장어 추출물이 류코트리엔 C₄(LTC₄)생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다(Chang HW et al.. Planta. Medica., 70(5), pp.474-476, 2004).

상기 참고예 2에서 준비한 마우스 골수 유래 비만세포 배양 3주 후 비만세포(2×10⁵cells/well)에 상기 실시예에서 준비한 장어 추출물을 일정농도로 미리 1시간 동안 전처리 한 후 KL자극제 100 ng/ml를 15분 처리하였다. 세포 자극 후 상층액의 LTC₄ 정량은 LTC₄ EIA 키트(Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6과 같이 장어껍질 및 통장어의 에탄올 분획, 장어껍질, 장어육 및 통장어의 부탄올 분획 및 수층에서 LTC₄ 생성 억제 활성을 나타내었다.

하기에 본 발명에 따른 장어 추출물 중 장어머리 헥산 분획을 포함하는 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 건강식품의 제조

비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎), 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎) 및 실시예에 따른 장어머리 헥산 분획을 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 한 후, 농축하여 얻어진 농축물을 이용하여 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<제제예 2> 건강음료의 제조

구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 실시예에 따른 장어머리 헥산 분획을 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

<제제예 3> 산제의 제조

유당 100 mg, 탈크 10 mg 및 실시예에 따른 장어머리 헥산 분획을 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 한 후, 이를 농축한 농축물을 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 4> 정제의 제조

옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg 및 실시예에 따른 장어머리 헥산 분획을 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 혼합한 후, 이를 농축한 농축물을 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 5> 캅셀제의 제조

옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg, 스테아린산 마그네슘 2mg 및 실시예에 따른 장어머리 헥산 분획을 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 혼합한 후, 이를 농축한 농축물을 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 장어머리, 장어껍질, 장어뼈, 장어내장, 장어육 및 통장어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 부위에 대한 추출물을 유효성분으로 함유하고, 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D2 (Prostaglandin D2, PGD2) 생성을 억제하고 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C4 (LTC4) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 추출물은 장어머리 헥산 분획, 장어껍질 에탄올 분획, 장어 뼈 및 내장의 헥산 분획, 장어육 수층 분획 및 장어육 부탄올 분획으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 분획 추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 삭제
6. 청구항 2에 있어서, 상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 두드러기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 장어머리, 장어껍질, 장어뼈, 장어내장, 장어육 및 통장어로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 부위에 대한 추출물을 유효성분으로 함유하고, 사이클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2; COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D2 (Prostaglandin D2, PGD2) 생성을 억제하고 5-리폭시게나제 (5-lipoxygenase; 5-LOX) 의존적인 류코트리엔 C4 (LTC4) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선용 기능성 식품 조성물.
   

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