JP2008526834A - リグナン系化合物の炎症性疾患の治療又は予防のための使用 - Google Patents

Abstract

本発明はリグナン系化合物の炎症性疾患の治療又は予防用途に関わるものにして、より詳細には一般式Ｉで表示されるリグナン系化合物を含む炎症性疾患の治療又は予防用薬学的組成物、これを利用した炎症性疾患の治療方法及び用途に関わるものである。本発明のリグナン系化合物は炎症媒介因子であるＮＯ、ｉＮＯＳ、ＰＧＥ_２、ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−αの生成又は発現を阻害させることにより、炎症反応を抑制する効果がある。従って、本発明のリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物は炎症性疾患の治療又は予防に極めて有用に使用できる。

Description

本出願は２００５年１月７日付にて出願された大韓民国特許出願番号第１０−２００５−０００１７６１号を優先権として主張し、この内容はここに引用いより取込む。

本出願はリグナン系化合物の炎症性疾患の治療又は予防のための使用に関わるものであり、より詳細には、式Ｉで表示されるリグナン系化合物を含有する炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物、このリグナン系化合物を用いる炎症性疾患の治療方法及び使用に関する。

炎症反応は、組織（細胞）の損傷や外部感染源の感染の結果生じ、局所血管と体液において種々の炎症媒介因子及び免疫細胞が関与している、酵素活性化、炎症媒介物質分泌、体液浸潤、細胞移動、組織破壊等の一連の複合的な生理的反応、および紅斑、浮腫発熱痛症等の外的症状を示す。また、ある場合には、これらの炎症反応は、急性炎症、肉芽腫（および慢性炎症（リウマチス関節炎および骨関節炎等）をもたらす（Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＩｍＭｕｎｏｌ．，９：２９５−３１４，１９８９）。

血液凝固と炎症に重要な影響を及ぼす酵素の中で、サイクロオキシゲナーゼ（以下「ＣＯＸ」と称す）は、二つの主要な産物、すなわち、プロスタグランジンおよびトロンボキサンを生成する。プロスタグランジンは、多様な生理活性を有する不飽和脂肪酸であり、ヒト体内において、炎症及疼痛伝達、血管拡張、体温調節、胃液分泌促進等の局所的ホルモン又は細胞機能調節因子として作用する（Ｍａｒｎｅｔｔ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２２９０３−２２９０６，１９９９）。ＣＯＸ−１は、胃腸管保護、腎臓の血流調節及び血小板凝集のような正常な生理的応答を維持することにより、細胞の恒常性維持に重要な役割を果たしている。一方、外部刺激により炎症が誘発され伝達される過程において、誘導性イソ酵素であるＣＯＸ−２が一時的に発現し、炎症が生ずる個所でプロスタグランジンを過量放出する。プロスタグランジンは、炎症の主要症状である紅斑、浮腫及び疼痛を起し、内因性炎症媒介物質であるヒスタミン等の作用を増加させる活性がある。したがって炎症部位におけるプロスタグランジンの生産抑制は炎症治療に大きく役立つ。

現在、商業的に入手できる非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）であるアスピリン、インドメタシン、ナプロキセン、イブプロヘン等は、ＣＯＸ−２酵素の活性を抑制してプロスタグランジン生成を阻害することにより、抗炎効果を示す（Ｍｅａｄｅ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：６６１０，１９９３）。しかしながら、これらＮＳＡＩＤ薬物は、炎症刺激により一時的に発現されたＣＯＸ−２の抑制に加え、胃腸管、腎臓血小板の正常機能維持に重要な役割をするＣＯＸ−１も抑制し、胃腸管出血、腎不全等の深刻な副作用を招く問題点がある（Ｓｕｒｈ Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８０−４８１：２４３−２６８，２００１）。従って、副作用を最小化しながら抗炎症作用を提供する天然物を見い出すことは産業上の観点から極めて重要である。

一方、リグナン（ｌｉｇｎａｎ）は、ｎ−フェニルプロパンがｎ−プロピール枝鎖のβ座で結合した天然化合物の群を指し、自然界に広く分布している。血糖降下作用、抗癌作用、抗喘息作用、美白作用等の、リグナンの多様な生理学的活性について研究されている。例えば、胡麻より分離されたリグナンであるセサミン、エピセサミン、セサミノール（、セサモリン及びエピセサミノールは、抗炎症効果のあることが報告されており（大韓民国公開特許公報第１９９７−７００１０４３号）、辛夷（Ｍａｇｎｏｌｉａｅ ｆｌｏｓ）から分離されたリグナン系化合物が抗喘息効能剤として使用できることが開示された（大韓民国登録特許第０２６３４３９号）。さらに、メイスリグナン（ｍａｃｅｌｉｇｎａｎ）はミリスチカ・フラグナンス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）より発見された代表的なリグナン系化合物であり（Ｔｕｃｈｉｎｄａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９：１６９−１７３，２００２）、アポトシスを誘導するカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３の活性化（Ｐａｒｋ Ｂ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２７（８）：１３０５−１３０７，２００４）及び抗酸化作用（Ｓａｄｈｕ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５１（９）：５９５−５９８，２００３）等の種々の活性を有することが報告された。しかしながら、前記メイスリグナンを初め、リグナン化合物の抗炎症活性については今まで全く報告されていない。

（発明の詳細な説明）
（技術的課題）
それゆえ、本発明者らは、抗炎症活性を有する天然由来の化合物を探す、長期間の研究を行い、その結果、ミリスチカ・フラグナンス抽出物から分離され精製されたリグナン系化合物が卓越な抗炎症活性を呈することを見い出し、本発明を完成した。

本発明は、リグナン系化合物の炎症性疾患の治療又は予防のための使用を提供することを目的とする。

（技術的解決方法）
前記の目的を達成する為に、一つの観点において、本発明は式Ｉで表示されるリグナン系化合物又は薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物を提供する。

（Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−５のアルコキシ又はヒドロキシ基であり、Ｒ_３は

である。

さらに、本発明は式Ｉで表示されるリグナン系化合物又は薬学的に許容可能な塩の有効量を投与することにより、炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

さらに、本発明は炎症性疾患を予防又は治療用薬学的組成物の製造のための式Ｉで表示されるリグナン系化合物の使用を提供する。

ここにおいて使用されている「有効量」は、個体に投与されたとき炎症性疾患を効果的に治療できる本発明のリグナン系化合物の量を意味する。

さらに、ここにおいて使用されている「個体」（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、哺乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。前記個体は治療が必要な患者でもあり得る。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、ミリスチカ・フラグナンス抽出物から分離され精製されたリグナン系化合物の新規使用の提供により特徴付けられる。

本発明によるリグナン系化合物は一般式Ｉで表示される。

（Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−５のアルコキシ又はヒドロキシ基であり、 Ｒ_３は

である。）
本発明において、好ましいリグナン系化合物は、Ｒ_１がメトキシ基であり、Ｒ_２がヒドロキシ基であり、Ｒ_３が

である、化学式１のメイスリグナン［（８Ｒ，８’Ｓ）−７−（３，４−メチレンジオキイシフェニル）−７’−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−８，８’−ジメチルブタン）］であり得る。

本発明によるリグナン系化合物は、塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩の形態で使用し得る。この塩は薬学的に許容可能な遊離酸により形成された酸付加塩が好ましい。本発明において使用される遊離酸は有機酸および無機酸であり得る。これら有機酸は、これらに制限されるものではないが、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、蟻酸、プロピオン酸、オキサル酸、トリフルオロアセト酸、安息香酸、グルコン酸、メタスルホン酸、グリコール酸、琥珀酸、４−トルエンスルホン酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含む。さらに、これら無機酸は、これらに制限されるのではないが、塩酸、臭酸、硫酸及びリン酸を含む。

本発明のリグナン系化合物は、物質を抽出して分離する通常の方法のいづれかにより植物又は植物の一部から収得できる。茎、根又は葉は目的とする抽出物を獲得する為に適宜脱水して柔らかくするか又は単に脱水し、当業者に知られている通常の精製方法のいずれかを用いて精製される。式Ｉにより表示されるリグナン系化合物に相応する合成化合物又はこれらの誘導体は、一般に購買可能な物質であり又は公知の合成方法を利用して製造し得る。

式Ｉで表示される本発明のリグナン系化合物はミリスチカ・フラグナンス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｎａｎｃｅ Ｈｏｕｔｔ）から分離精製できる（Ｊｕｎｇ Ｙｕｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ．２１（４）：２７０−２７３，１９９０；Ｍａｓａｏ Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３４（９）：３８８５−３８９３，１９８６；Ｍａｓａｏ Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３５（２）：６６８−６７４，１９８７）。好ましくは、ニクズク（ｎｕｔｍｅｇ）若しくは仮種皮（ａｒｉｌ）から分離精製できる。前記ニクズクはミリスチカ・フラグナンスの成熟した果実又は果実の中にある種子をいう。さらに、本発明のリグナン系化合物はニクズクを圧搾して得たオイルから分離・精製できる。さらに、他のニクズク科（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｅａｅ）のメンバーであるミリスチカ・アルゲンチアワルブ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｗａｒｂ）等からも分離精製できる（Ｆｉｌｌｅｕｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１６：１−７，２００２）。又は、厚朴（Ｍａｃｈｉｌｕｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）（Ｐａｒｋ Ｂ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．，２７（８）：１３０５−１３０７，２００４）、レウカス・アスペラ（Ｌｅｕｃａｓ ａｓｐｅｒａ）からでも分離精製できる（Ｓａｄｈｕ， Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５１（９）：５９５−５９８，２００３）。

本発明のリグナン系化合物の分離の為の抽出溶媒としては、水又はＣ_１−Ｃ_６の有機溶媒を使用できる。抽出溶媒の好ましい例は精製水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、エテル、ベンゼン、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等があり、これらは単独で又は混合して使用できる。より好ましくはメタノール又はヘキサンが使用され得る。ミリスチカ・フラグナンス抽出物からの本発明のリグナン系化合物の分離及び精製は、シリカゲル又は、活性化アルミナ等の各種合成樹脂を充填した、例えばカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を単独で又は組み合せて使用できる。しかしながら、有効成分の抽出及び分離精製方法は、必ずしもこれらのクロマトグラフィ法に限定されるものではない。

このように、本発明のリグナン系化合物は、純粋に分離され精製された化合物の形態で使用することができ、又は子の化合物を含む抽出物の形態で使用することができる。例えば、前述のように、ミリスチカ・フラグナンスの種子もしくは果実又は仮種皮抽出物の形態で又はミリスチカ・フラグナンスの種子を圧搾して得たオイルの形態で使用することができる。前述のように、この抽出物は、ミリスチカ・フラグナンスを水又はＣ_１−Ｃ_６の有機溶媒で抽出して得られる。好ましくはミリスチカ・フラグナンスの種子、つまりニクズクの抽出物でもあり得る。

本発明のリグナン系化合物は、炎症反応を媒介する多様な物質等を抑制することにより抗炎症活性を有する。

一酸化窒素（ＮＯ）は、神経伝達、血管の弛緩及び細胞媒介免疫反応に関与する物質であり、ＮＯＳ（一酸化窒素合成酵素）によりＬ−アルギニンから生成される（Ｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｘｉｅ，１９９ ４；Ａｌｄｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。特に、大食細胞がＩＦＮ−γ又はＬＰＳ（リポポリサッカライド）により刺激されると、ｉＮＯＳ（誘導性一酸化窒素合成酵素）が発現され、このｉＮＯＳにより大量のＮＯが生成される。本発明のリグナン系化合物は、大食細胞におけるＮＯの生成及びＮＯ生成に関与するｉＮＯＳの発現を濃度依存的に抑制することが示された（図８及び図９参照）。

さらに、ＣＯＸ−２は体内の炎症反応に関与する物質にして、炎症性ＰＧを生産する。ＣＯＸ−２は、細菌類により分泌される耐毒素であるＬＰＳによりおよび炎症性サイトカイン類であるＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ等により発現が誘導される。本発明のリグナン系化合物は、ＣＯＸ−２の発現を抑制するのみならず、ＰＧ類の１つであるＰＧＥ_２（プロスタグランジンＥ２）の生成もまた抑制する作用を有する（図１０及び図１１参照）。

ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）は、グラム陰性バクテリアおよび他の感染性微生物により引き起こされる急性炎症反応の主な媒介因子である。ＬＰＳにより刺激された大食細胞はＴＮＦ−αの合成を増加させる。生物学的作用において、ＴＮＦ−αは、低濃度で白血球および内皮細胞に作用して急性炎症を誘導する。中間濃度では、ＴＮＦ−αは、炎症の全身的反応を媒介し、高濃度では、敗血症ショックの病理学的異常により死亡を招く。さらに、ＴＮＦ−αは、ＰＧの合成を増加して熱を生成し、トロンボモジュリンの発現を抑制して血管閉塞を招く（Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＩｍＭｕｎｏｌｏｇｙ”ｔｈｅ ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ｐｐ．２４７−２５３，２００３）。本発明のリグナン系化合物は大食細胞およびヒト単核球細胞におけるＴＮＦ−αの生成を抑制する作用を有する（図１２及び図１３参照）。

本発明のリグナン系化合物を、ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート）により処理して浮腫を誘発させたラットの耳に局所塗布した結果、濃度依存的に浮腫生成率が抑制され、現在商業的な抗炎症剤として入手可能なインドメタシンより高い浮腫抑制率を呈した（表２参照）。さらに、リグナン系化合物を含むクリームを製造後これをラットの耳に局所塗布した結果、浮腫生成率が抑制された（表４参照）。

一方、本発明者等はミリスチカ・フラグナンス抽出物（メタノール及びヘキサン粗抽出物）を、ＴＰＡ処理により浮腫を誘発させたラットの耳に局所塗布した結果、濃度依存的に浮腫生成が抑制されることを観察することができた（表５参照）。

これらの結果は、本発明のリグナン系化合物が、ＣＯＸ−２のみならず、炎症反応を媒介する多様な因子を抑制して卓越な抗炎症作用を呈することを示している。さらに、ミリスチカ・フラグナンス抽出物もそれ自体同じ抗炎症効果を示し得ることをこの結果は示している。このような式Ｉで表示される本発明のリグナン系化合物及びミリスチカ・フラグナンス抽出物の抗炎症活性は本発明において初めて見い出されたものである。

現在、商業的に入手でき得る非ステロイド抗炎症剤が大部分ＣＯＸ−２酵素の活性を抑制して抗炎症効果を表す事実に鑑み、本発明のリグナン系化合物は従来の抗炎症剤よりさらに優れた効果を有する抗炎症剤として使用できることを知ることができる。

従って、本発明は式Ｉで表示されるリグナン系化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物を提供する。さらに、本発明はミリスチカ・フラグナンス抽出物を有効成分として含む炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物を提供する。前記ミリスチカ・フラグナンス抽出物の製造は前記の通りである。

さらに、本発明は式Ｉで表示されるリグナン系化合物又はその薬学的に許容可能な塩の有効量を炎症性疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与することを含む炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

加えて、本発明は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物の製造の為の、式Ｉで表示されるリグナン系化合物の使用を提供する。

本発明のリグナン系化合物又は薬学的に許容可能な塩は経口で又は非経口で投与することが可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用し得る。この一般的な医薬品製剤は、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、希釈剤（界面活性剤等）又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与の為の固形製剤は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等を含み、リグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物とおよび少なくとも１つの賦形剤（例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロス又はラクトース、ゼラチン等）とを混合することにより調剤される。さらに、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアラートまたはタルクのような潤滑剤等も使用される。経口投与の為の液状製剤には懸濁剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤等が含まれる。この液体製剤は、広く使用される単純希釈剤（例えば水）、液体パラフィンおよび種々の賦形剤（例えば、湿潤剤、甘味料、芳香剤および保存剤）を含み得る。非経口投与の為の製剤の例には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、軟膏剤およびクリーム剤が含まれる。非水性溶剤および懸濁溶剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等を用いて調整することができる。

さらに、本発明のリグナン系化合物又はその薬学的に許容可能な塩は非経口経路（皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射注入等）により投与することができる。非経口投与のために、式Ｉのリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物を安定剤又は緩衝剤と水中で混合して溶液又は懸濁液を調整し、これを単位投与形態をそれぞれ含むアンプル又はバイアルとして提供される。この投与単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍に、又は１／２、１／３又は１／４倍を含有できる。個別投薬量は好ましくは有効薬物の１回に投与される量を含み、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。

本発明の式Ｉで表示されるリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物は、０．１−５０ｍｇ／ｋｇの、好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇの有効投与量において、１日１〜３回投与され得る。本発明の化合物または抽出物の用量は、特定患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等により変化し得る。

本発明のリグナン系化合物は、ラットへの経口投与における毒性が試験された。その結果、５０％致死量（ＬＤ５０）は２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であることが観察された。

特に、リグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物を含む本発明の薬学的組成物は皮膚塗布用、すなわち軟膏およびクリームの形態で製剤化することができ、製剤物総重量に対して０．００１−１０．０重量％、好ましくは０．００５−５．０重量％の範囲内の薬剤の形態によって適正に配合できる。この組成物が０．００５重量％未満で使用される場合には、抗炎症活性が低くなり、１０．０重量％を超過して添加される場合には添加量が多くなるのみで抗炎症活性において大差がない。

本発明で「炎症性疾患」はＮＯ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αのような一連の炎症反応を起こす多様な刺激因子により誘発される炎症に関与する疾患を言う。炎症性疾患の例には、浮腫、炎症性腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊椎関節病症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患を伴う脊椎炎、年少者性関節症、年少者性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染性関節炎、後−感染性関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウィルス性関節炎、真菌性関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎症候群」を伴う関節炎、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節症、仮性痛風、非−関節リウマチ、粘液嚢炎、乾草炎、上顆炎（テニスエルボー）、神経障害性関節疾患、出血性関節症（関節血症）、ヘノッポ・シェンライン紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性細網組織球腫、脊椎側弯症（ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ）、血色素症、異常血色素症、高脂蛋白血症、低減マグロブリン血症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、急性肺損傷及び気管支肺形成障碍等のような一般的な炎症症状を含む（これらに制限されない。）。さらに、炎症性疾患の例は、急性、慢性湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、剥奪皮膚炎、日光皮膚炎および乾癬等炎症性皮膚疾患を含む。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するのみの目的であり、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきでないことが理解されるべきである。これらの実施例及び実験例において、特に指定されていない限り百分率は重量％を示す。活性分析は３回以上繰返し行い、その結果は平均値±標準偏差で表示した。さらに、統計分析はＳｔｕｄｅｎｔｓ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行い、ｐ値は＜０．０５以下の場合に統計的に有意なものと判定した。

ミリスチカ・フラグナンスからリグナン系化合物の分離及び精製
＜１−１＞リグナン系化合物の分離及び精製
乾燥粉砕したニクズク１００ｇ（乾燥重量）に７５容量％メタノール４００ｍｌを加え、溶液て常温で２日間置いた。この溶液をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙第２番に通して濾過した。この濾過段階を２回繰り返した。メタノール濾液を真空下は濃縮して凍結乾燥し、ニクズクのメタノール粗抽出物（７ｇ）を用意した。このメタノール粗抽出物をエチルアセテート、ブタノール、水で順に分画してエチルアセテート分画物（４．２ｇ）を得た。このエチルアセテート分画物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６６；７０−２３０メッシュ）によりヘキサンとエチルアセテートを１０：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した溶媒を用いて溶出し、分画物III（１．０ｇ）を得た。溶媒を真空回転蒸発器を用いて完全に除去してニクズクの粗抽出物を製造した。次いで、分画物IIIをシリカゲルコラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６６；７０−２３０メッシュ）によりヘキサンとエチルアセテートを２０：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した溶媒を用いて溶出させ、分画物III−Ｂ（０．５２ｇ）を得た。分画物III−ＢをＲｐ−１８コラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ；２５−４０μｍ）により８０％メタノールを用いて溶出させ、単一物質分画物III−Ｂ−２（０．５ｇ）を得た。この分離工程を図１に示した。

＜１−２＞構造分析
前記分離された単一物質III−Ｂ−２の構造を決定する為に、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ６００ＭＨｚと１５０ＭＨｚ（溶媒：ＤＭＳＯ）で測定した。その結果を図２と図３にそれぞれ示した。^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を基に^１Ｈ−^１Ｈの相関関係と^１Ｈ−１３Ｃの相関関係を測定する為に、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルと^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＢＣスペクトルを解析した。その結果を図４と図５にそれぞれ示した。^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＢＣの結果を総合的に分析して表１に示した。

＜１−３＞質量分析
上述の分離された単一物質の質量分析のために行われたＥＩ／ＭＳの結果を図６に示した。この分離された化合物は、ＥＩ／ＭＳにおいて［Ｍ］^＋がｍ／ｚ３２８で観測され、分子量３２８および分子式Ｃ_２０Ｈ_２４Ｏ_４を有していることを示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＢＣ及びＥＩ／ＭＳの結果を、既に発表された研究報告（Ｗｏｏ，Ｗ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１５４２−１５４３，１９８７）と比較して分析した結果、分離された単一物質は下記化学式１で表示されるメイスリグナン（ｍａｃｅｌｉｇｎａｎ）であることが見い出された。

本発明のリグナン系化合物の細胞毒性作用の調査
＜２−１＞ＲＡＷ２６４．７細胞株の培養
実施例１で得たメイスリグナンが炎症反応媒介物質の生成に及ぼす影響を調べる為に、大食細胞ＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。大食細胞ＲＡＷ２６４．７細胞株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入して使用した。この細胞株を、１０％熱非活性化ＦＢＳ（胎児ウシ血清Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／mlペニシリンＧ及び１００μｇ／mlストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）中で、５％ＣＯ_２恒温器中３７℃で培養した。

＜２−２＞細胞毒性測定
本発明のメイスリグナンがＲＡＷ２６４．７細胞の生存率に及ぼす影響を調べる為に、ミトコンドリア脱水素酵素により紫ホルマザン生成物に変えたＭＴＴ還元を基にした分析を行った（Ｈａｙｏｎ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．４４（１１）：１９５７−１９６２，２００３）。１×１０^６細胞／mlのＲＡＷ２６４．７細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に接種し、６時間後に、１ｍｌ当り１〜８０μｍまでの濃度の本発明のメイスリグナンで処理した。２４時間後にＭＴＴ分析法を利用して細胞生存率を測定した。

その結果、図７に示した通り、本発明のメイスリグナンは１−２０μＭ濃度において、ＲＡＷ２６４．７細胞の生存率に大きな影響を与えなかった。これら結果を基に以降の炎症実験では１−２０μＭ濃度のメイスリグナンを使用した。

本発明のリグナン系化合物のＮＯ抑制作用の調査
＜３−１＞ＮＯ生成の抑制
ＩＦＮ−γ又はＬＰＳにより刺激された大食細胞は、ｉＮＯＳを高度に発現し、炎症反応の媒介物質であるＮＯを大量に生成する（Ｍｉｙａｓａｋａ ａｎｄ Ｈｉｒａｔａ．，ＩｍＭｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，１６：１２８−１３０，１９９５；Ｇｕｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４（４）：４６９−４８７，２００３）。従って、本発明のメイスリグナンがＬＰＳにより活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ生成にどのような影響を及ぼすかを調べた。

ＲＡＷ２６４．７細胞を、１×１０^６細胞／mlの濃度に希釈し、次いでＲＰＭＩ１６４０培地に接種した。５時間後、本発明のメイスリグナンを１〜２０μｍの各濃度で培地に添加して２時間温置した。次いで、培地をＬＰＳ（１０μｇ／ml）で処理して２４時間温置した。対照群はＬＰＳのみで処理した。ＮＯの生成量は細胞培養濾液を用いて、ＮＯの反応産物であるＮＯ_２ ⁻を測定することにより定量した（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，７５（６）：６７５−６８４，２００４）。細胞培養濾液１００μｌおよび同一容量のＧｒｅｉｓｓ試薬（０．５％スルファニリアミド（ｓｕｌｆａｎｉｌｙａｍｉｄｅ），０．０５％Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミン２塩酸塩／２．５％Ｈ_３ＰＯ^４）を９６−ウェル組織培養プレート上で相互に混合して暗所で１０分間反応させた。次いで、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて試料の吸光度を５５０ｎｍにて測定した。ＮＯ_２ ⁻の濃度はＮａＮＯ_３を用いて標準曲線を作り、これと比較してＮＯの生成量を測定した。全ての実験は３回繰返しそれぞれをｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより定量した。

その結果、図８に示した通り、ＬＰＳ単独による処理によりＮＯの生成が大きく増加されたが、このＮＯ生成は本発明のメイスリグナンの処理により濃度依存的に抑制された。特に、１μＭと５μＭの低い濃度においてもＮＯ生成の優れた抑制効果を観察できた（Ｐ＜０．０１）。また、２０μＭのメイスリグナンにより処理した場合、どれにも処理されなかった群とほぼ同じ程度にＮＯの生成が抑制された。

＜３−２＞ｉＮＯＳ発現の抑制
ＬＰＳで大食細胞を刺激すると、ｉＮＯＳが過量発現され、多量のＮＯを生成する。従って、実施例＜３−１＞で確認された本発明のメイスリグナンのＮＯ生成抑制とｉＮＯＳとの関係を調べる為に、メイスリグナンがｉＮＯＳ発現に及ぼす影響を測定した。

この目的のために、本発明のメイスリグナンおよびＬＰＳにより処理されたＲＡＷ２６４．７細胞を溶解し、ブラッドフォード方法で蛋白質を定量した。蛋白質１０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、分離した蛋白質を転移溶液（２０％メタノール、２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３）を利用してニトロセルロース膜に移した（Ｈａｌｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６１：１６７−１７４，２００４）。このニトロセルロース膜をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルと密着させ、ミニ−ゲルトランファーキッドに装着した。次に、このキットにサンプルを負荷し、１００Ｖで１時間電気泳動させた。次いで、ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓで緩衝化された生理食塩−Ｔｗｅｅｎ−２０）溶液で１回洗滌し、前記膜を乾燥された濾紙に移して常温で乾燥させた。非特異的な反応を除去する為に、５％の非脂肪スキムミルクを含むＴＢＳＴ中で４℃で２４時間以上十分に振りながら置いた。次いで、膜をＴＢＳＴ溶液で３回洗滌し、抗−ｉＮＯＳ抗体（１：２，０００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を注入して１時間室温で反応させた。次いで膜をＴＢＳＴ溶液でそれぞれの洗滌時間１０分にて３回間洗滌した。洗滌された膜にＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が取付けられた抗−ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２，０００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を注入し、１時間振盪器の上で反応させた。次いで、膜をＴＢＳＴ溶液で３回洗滌し、ＥＣＬ（増強された化学ルミネッセンス）溶液に漬けて１分間振りながら満遍なく浸した。前記ＥＣＬ溶液のは溶液Ａ（ルミノール及び増強剤を含む）と溶液Ｂ（過酸化水素を含む）との同量を混合し、この混合液を１分間振盪することにより製造した。ＥＣＬ溶液から膜を取出し水気を除去し、暗室でＸ線フィルムに走査した。

その結果、図９で示した通り、本発明のメイスリグナンは大食細胞におけるｉＮＯＳの発現を濃度依存的に抑制し、５μＭの濃度から顕著な抑制作用を示した（Ｐ＜０．０１）。

上記結果から、本発明のメイスリグナンが炎症誘発因子であるＮＯの生成を抑制するのみならず、これを生成するｉＮＯＳの発現も抑制することを見出すことができた。

本発明のリグナン系化合物のＣＯＸ−２抑制作用の調査
＜４−１＞ＰＥＧ２生成の抑制
ｉＮＯＳが炎症反応と密接な関連があるのと同様に、ＣＯＸ−２は、炎症反応を媒介するＰＧ類生成に必須的な酵素であり、ｉＮＯＳおよびＣＯＸの発現及び活性は相互に関連性があることが知られている（Ｓｕｒｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４８１：２４３−２６８，２００１）。従って、本発明のメイスリグナンはＬＰＳにより活性化された大食細胞においてＰＧＥ_２の生成になんらかの影響を及ぼすかを調べた。

先ず、ＲＡＷ２６４．７細胞の１×１０^６細胞／ｍｌを９６−ウェル組織培養プレートに接種して５時間室温に置いた。次いで、本発明のメイスリグナンをそれぞれ１〜２０μＭの濃度でこの細胞に添加して２時間温置した。陰性対照群は何等の処理もせず、陽性対照群はＰＧＥ_２抑制活性を有すると報告されているフルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）（クルクマ・ロンガ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）から分離された、Ｓｉｇｍａ社）にて処理した。次いで、細胞を１μｇ／ｍｌＬＰＳにて処理して１８時間培養した。大食細胞におけるＰＧＥ_２の生成をアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅｏｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）によりＥＬＩＳＡ法を用いて定量した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６８：１０８９−１１００，２００２）。

その結果、図１０に示した通り、ＬＰＳ単独処理によりＰＧＥ_２の生成は、大きく増大したが、本発明のメイスリグナンの処理により濃度依存的に抑制されることが観察された。この抑制効果は５μＭででも示された。本発明のメイスリグナンのＰＧＥ_２生成抑制効果は、クルクミンにて処理した場合とほぼ似ていて、実施例３において確認したＮＯ及びｉＮＯＳの抑制効果と同じパターンを示した（Ｐ＜０．０５）。

＜４−２＞ＣＯＸ−２発現抑制
本発明者等は、ＰＧＥ_２生成に直接的影響を有するＣＯＸ−２の発現をウェストンブロット分析を用いて調査した。１次抗体として抗−ＣＯＸ−２抗体（１：２，０００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を、２次抗体として抗−羊ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２，０００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いたことを除いて、前記実施例＜３−２＞に記載された方法と同じ方法で行った。

その結果、図１１に示した通り、本発明のメイスリグナンはＣＯＸ−２蛋白質の発現を濃度依存的に抑制した。特に、メイスリグナンの濃度１０−２０μＭで有意にＣＯＸ−２蛋白質の発現量が減少した。

上述の結果から、本発明のメイスリグナンが炎症誘発因子であるＰＧＥ_２生成を抑制するのみならず、ＰＥＧ_２を生成するＣＯＸ−２の発現も抑制することを見出し得た。

本発明のリグナン系化合物のＴＮＦ−α抑制作用の調査
ＴＮＦ−αは炎症反応に重要な作用をする炎症性サイトカインである。従って、本発明のメイスリグナンがＴＮＦ−αの生成に及ぼす影響を調査した。

＜５−１＞大食細胞株におけるＴＮＦ−α生成の抑制
先ず、ＲＡＷ２６４．７細胞の１×１０^６細胞／ｍｌを９６−ウェル組織培養プレートに接種し、５時間常温に置いた。次いで、本発明のメイスリグナンをそれぞれ１〜２０μｍの濃度で細胞に添加して２時間置いた。陰性対照群には何も処理を施さず、陽性対照群にはクルクミン（Ｓｉｇｍａ社）により処理した（Ａｒａｕｊｏ ａｎｄ Ｌｅｏｎ，Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ．Ｃｒｕｚ．，９６（５）：７２３−７２８，２００１；Ｃｈａｉｎａｎｉ−Ｗｕ，Ｊ．Ａｌｔｅｒｎ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．，９（１）：１６１−１６８，２００３）。次いで、細胞を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処理して１８時間培養した。大食細胞におけるＴＮＦ−αの生成をアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅｏｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の方法を用いてＥＬＩＳＡ法で定量した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．２９：９７−１０３，２００２）。

その結果、図１２に示した通り、５μＭの濃度の本発明のメイスリグナン処理から開始してＴＮＦ−αの生成が有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。

＜５−２＞ヒト単核球細胞におけるＴＮＦ−α生成の抑制
本発明者等により、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）により活性化されたヒト単核球Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦ−αの生成を実施例＜５−１＞と同じ方法により測定した。但し、陽性対照群はインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社）により処理した（Ｗａｌｃｈ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４３（９）：３２７６−３２８３，２００２）。

その結果、図１３に示した通り、ヒト単核球細胞におけるＴＮＦ−α生成が本発明のメイスリグナンにより濃度依存的に減少することを観察することができた（Ｐ＜０．０１）。

上記の結果から、本発明のメイスリグナンが急性炎症及び炎症の全身的反応を誘導及び／又は媒介するＴＮＦ−αの生成を抑制することを知ることができた。

動物モデルにおける本発明のリグナン系化合物の抗炎症活性の調査
上述の実施例１において分離され精製されたリグナン系化合物の抗炎症活性を動物実験を通じて試験した。抗炎症活性はラットに対する浮腫抑制実験により測定した。実験動物として５週令のＷｉｓｔａｒラット（大韓バイオリンク、韓国）を使用した。これらの動物は飼料は標準ペレット形態のラット飼料（第一製糖）が供給され、飼料と水は自由給食させた。また、これら動物は１２時間の光照射／１２時間暗サイクル、２５±２℃及び湿度６０±１０％の条件下で飼育された。災症誘起剤としてＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート；Ｓｉｇｍａ社）をアセトンに２００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。ラットの耳の浮腫はＴＰＡ溶液を局所的に耳の外面と内面にそれぞれ１０μｌ／耳を加えて誘導した（４μｇ／耳）。実施例１にて精製されたメイスリグナンおよび対照物質としての非ステロイド抗炎症剤であるインドメタシンをアセトンに溶解し、２０，２００，２０００μｇ／耳になるように使用した。メイスリグナンとインドメタシンはそれぞれ、ＴＰＡ処理して３０分後にラットの耳にそれぞれ局所塗布した。対照群はアセトンを局所塗布した。ラットの耳の厚さは各物質を処理した後、８時間後にノギスを用いて測定した。試料により処理された群の耳の厚さの増加を試料により処理されていない群のそれと比較し、浮腫抑制率を算出することにより、炎症抑制効果を測定した。その結果を表２に示した。

メイスリグナン含有クリームの製造及びこれの抗炎症活性の調査
＜７−１＞メイスリグナン含有クリームの調整
本発明のメイスリグナンを利用して表３に記載された多様な組成を有するクリームをそれぞれ製造した。先ず下記表３でＢで表示された物質を７５−８０℃で溶解させた。また、表３でＣで表示された物質の内セチルアルコールと保存料を同温度で溶解させた。Ｃで示された物質をＢで示された物質中に乳化させた。次いで、表３でＡで表示された本発明のメイスリグナンを５．０、０．５、０．０５、０．００５％の濃度でそれぞれ乳化物に投入して混合した。最後に、香料を入れ精製水で残部を合わせてクリームを製造した。

＜７−２＞抗炎症活性の調査
実施例＜７−１＞で製造されたメイスリグナン含有クリームの抗炎症活性をラットに対する浮腫抑制実験を通じて測定した。浮腫抑制実験は実施例６と同じ方法で実施した。その結果を表４に示した。

表４の結果から、本発明のメイスリグナン含有クリームはクリーム内に含有されたメイスリグナンの濃度に依存的にＴＰＡで誘発されたラットの浮腫を抑制することが分かる。

ミリスチカ・フラグナンス抽出物の抗炎症活性の調査
＜８−１＞メタノール抽出物の調製
乾燥粉砕したニクズク１００ｇ（乾燥重量）に９５容量％メタノール４００ｍｌを加えて室温で２日間置いた。溶液をワットマン濾紙２番を用いて濾過した。この濾過を２回繰返した。メタノール濾液を真空下に濃縮して凍結乾燥し、メタノール粗抽出物（１６．２ｇ）を製造した。

＜８−２＞ヘキサン抽出物製造
乾燥粉砕したニクズク１００ｇ（乾燥重量）に１００容量％ヘキサン４００ｍｌを加えて室温で２日間置いた。この溶液をワットマン濾紙２番を用いて濾過した。濾過を２回繰返した。ヘキサン濾過液を真空下に濃縮して凍結乾燥し、ヘキサン粗抽出物（３７．０ｇ）を製造した。

＜８−３＞動物モデルにおけるミリスチカ・フラグナンス抽出物の抗炎症活性の調査
実施例＜８−１＞及び＜８−２＞において調製されたミリスチカ・フラグナンス抽出物の抗炎症活性を動物モデルにおいて試験した。抗炎症活性は前記実施例６と同じ方法によりラットに対する浮腫抑制実験により測定した。その結果を表５に示した。

表５に示されているように、本発明のミリスチカ・フラグナンスのメタノール粗抽出物およびヘキサン粗抽出物は全てＴＰＡで誘発されたラット浮腫を濃度依存的に抑制することが観察できた（統計学的有意性ｐ＜０．０１）。

＜調製例１＞
本発明の、炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物を含有する薬剤調合物の調製
＜１−１＞錠剤の調製
本発明のリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物の２５ｍｇを、錠剤直打用ラクトース２６ｍｇとアビセル（微結晶セルロース）３．５ｍｇ、崩解補助剤であるナトリウム澱粉グリコネート１．５ｍｇおよび結合剤である錠剤直打用Ｌ−ＨＰＣ（低ヒドロキシプロピルセルロース）８ｍｇと共に、Ｕ型混合機に入れて２０分間混合した。混合完了後滑濁剤としてマグネシウムステアレート１ｍｇを追加して添加し、３分間混合した。定量試験と湿度含量試験に付して打錠し、膜被覆して錠剤を製造した。

＜１−２＞シロップ剤の調製
本発明のメイスリグナン又はその薬学的に許容可能な塩の２％（ｗ／ｖ）を有効成分として含むシロップを次の方法により調製した。本発明のメイスリグナンの酸付加塩２ｇ、サッカリン０．８ｇ及び糖２５．４ｇを熱水８０ｇに溶解させた。この溶液を冷却後、これにグリセリン８．０ｇ、香味料０．０４ｇ、エタノール４．０ｇ、ソルビン酸０．４ｇ及び適量の蒸留水を添加した。この混合物に水を添加して１００ｍｌにした。

＜１−３＞カプセル剤の調製
本発明のリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物の５０ｍｇ、乳糖５０ｍｇ、澱粉５０ｍｇ、タルク１ｍｇ及び適量のステアリン酸マグネシウムを混合し、これを硬質ゼラチンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製した。

＜１−４＞注射液剤の調製
有効成分１０ｍｇを含む注射液剤を次のような方法で調製した。本発明のメイスリグナンの塩酸塩１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸留水に溶解させて１００ｍｌを製造した。前記溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱滅菌した。

＜適用例１＞
胃炎症性消化器疾患
胃炎症は多様な外部要因の作用と不規則な食習慣が関与するものの、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染により主に引き起こされる。ヘリコバクター・ピロリは胃潰瘍、胃炎だけでなく、胃癌も引き起こす。ヘリコバクター・ピロリが増殖する過程でＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）が同時に増加する（Ｎａｍ Ｎ．Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（２３）：８１０５−８１１３，２００４）。ヘリコバクターに感染すると、胃の粘膜細胞が増殖して癌細胞になるＣＯＸ−２抑制剤は胃粘膜細胞が増殖して癌細胞になるのを阻止し、正常組織が癌組織に変わるのを抑制する役割をすることが知られていた。ＣＯＸ−２抑制剤が投与された群は、投与されていない群に比べてアポプトシス方法により癌組織を死滅させる効果が優れていることが見出された（Ｎａｍ Ｎ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（２３）：８１０５−８１１３，２００４）。従って、本発明のリグナン系化合物のＣＯＸ−２抑制効果は、胃癌を早期に予防できる胃炎症治療に役立つので、十分な治療効果を有することを提示している。

＜適用例２＞
関節炎
関節炎は自己免疫異常により引き起こされ、関節炎の進行の間、関節間の滑液腔に生じた慢性炎症が血管新生を誘導して軟骨が破壊される。関節炎には感染性関節炎、退行性関節炎、リウマチ性関節炎および（大腿骨頭無血管性壊死、硬直性脊椎炎および先天性奇形による）関節炎を含む。関節炎の原因を問わず、関節炎の進行の間に滑液腔に生じる慢性炎症が血管新生を誘導することが知られており、新な毛細血管が関節を侵襲して軟骨が損傷されることが特徴である（Ｋｏｃｂ Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．，２９：４７１−４７９，１９８６；Ｓｔｕｐａｃｋ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｃｓ．，３２：５７８−２８１，１９９９；Ｋｏｃｈ Ａ．Ｅ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４１：９５１−９６２，１９９８）。この場合、軟骨を破壊する病気の種類に依存していくつかの段階で生じる炎症反応は、この病気の進行に重要な役割をし、関節内への新生血管の形成が重要な病理メカニズムとして作用することが報告されている（Ｃｏｌｖｉｌｌｅ−Ｎａｓｈ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，５１，９１９−９２５，１９９２；Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，４９：１−１９，１９９１）。関節炎の治療は、原因に伴う治療よりは、疼痛を抑制し、炎症現象を抑制して、関節または筋肉の破壊速度を抑え、機能消失を最小化することを優先する。従って、本発明のリグナン系化合物又はメリスチカ・フラグランス抽出物は関節炎の進行防止と治療に極めて効果的である。

（産業上の利用可能性）
上に述べたように、本発明のリグナン系化合物は炎症媒介因子であるＮＯ、ｉＮＯＳ、ＰＧＥ_２、ＣＯＸ−２及びＴＮＦ−αの生成又は発現を阻害することにより、炎症反応を抑制する作用を有する。従って、本発明のリグナン系化合物又はミリスチカ・フラグナンス抽出物は炎症性疾患の治療又は予防に極めて有用である。

図１はミリスチカ・フラグナンス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）からリグナン系化合物を分離する工程を示す。 図２は本発明のリグナン系化合物の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図３は本発明のリグナン系化合物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 図４は本発明のリグナン系化合物の^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルを示す。 図５は本発明のリグナン系化合物の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＢＣスペクトルを示す。 図６は本発明のリグナン系化合物のＥＩ−Ｍａｓｓスペクトルを示す。 図７は本発明のリグナン系化合物の細胞毒性作用を示す。 図８は本発明のリグナン系化合物のＮＯ生成抑制作用を調査した結果を示す。 図９は本発明のリグナン系化合物のｉＮＯＳ発現抑制作用を調査した結果を示す。Ａ：ウェストンブロット分析結果。Ｂ：ＬＰＳにより刺激された対照群を基準にして相対的なｉＮＯＳ蛋白質水準を示すグラフ。 図１０は本発明のリグナン系化合物（Ａ）及びクルクミン（Ｂ）の ＰＧＥ_２生成抑制作用を調査した結果を示す。 図１１は本発明のリグナン系化合物のＣＯＸ−２発現抑制作用を調査した結果を示す。Ａ：ウェストンブロット分析結果。Ｂ：ＬＰＳにより刺激された対照群を基準にして相対的なＣＯＸ−２蛋白質水準を示したグラフ。 図１２は本発明のリグナン系化合物（Ａ）及びクルクミン（Ｂ）のＴＮＦ−α生成抑制作用をＬＰＳで刺激された大食細胞において調査した結果を示す。 図１３は本発明のリグナン系化合物（Ａ）及びインドメタシン（Ｂ）のＴＮＦ−α生成抑制作用をプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）で刺激されたヒト単核球Ｕ９３７細胞において調査した結果を示す。

Claims (10)

1. 式Ｉで表示されるリグナン系化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物。
   

   

   （Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−５のアルコキシ又はヒドロキシ基であり、Ｒ_３は
   

   

   である。）
2. Ｒ_１がメトキシ基であり、Ｒ_２がヒドロキシ基であり、Ｒ_３が
   

   

   である、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. メリスチカ・フラグランス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）を水又はＣ_１−Ｃ_６の有機溶媒で抽出した抽出物を有効成分として含む炎症性疾患の治療又は予防のための薬学的組成物。
4. 前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、嚢胞性繊維症、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊椎関節病症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、炎症性腸疾患を伴う脊椎炎、年少者性関節症、年少者性強直性脊椎炎、反応性関節症、感染性関節炎、後−感染性関節炎、淋菌性関節炎、結核性関節炎、ウィルス性関節炎、真菌性関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、「血管炎症候群」を伴う関節炎、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節症、仮性痛風、非−関節リウマチ、粘液嚢炎、乾草炎、上顆炎（テニスエルボー）、神経障害性関節疾患、出血性関節症（関節血症）、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性細網組織球腫、脊椎側弯症、血色素症、異常血色素症、高脂蛋白血症、低減マグロブリン血症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、急性肺損傷、気管支肺形成障碍及び炎症性疾患からなる群より選ばれるいずれか一つである請求項１又は３に記載の薬学的組成物。
5. 式Ｉで表示されるリグナン系化合物又はその薬学的に許容可能な塩の有効量を、炎症性疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与して炎症性疾患を予防又は治療する方法。
   

   

   （Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−５アルコキシ又はヒドロキシ基であり、Ｒ_３は
   

   

   である。）
6. Ｒ_１はメトキシ基であり、Ｒ_２がヒドロキシ基であり、Ｒ_３が
   

   

   である、請求項５に記載の方法。
7. ミリスチカ・フラグナンス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）を水又はＣ_１−Ｃ_６の有機溶媒で抽出した抽出物の有効量を、炎症性疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与して炎症性疾患を予防又は治療する方法。
8. 炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物の製造のための、式Ｉで表示されるリグナン系化合物の使用。
   

   

   （Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立してＣ_１−５のアルコキシ又はヒドロキシ基であり、Ｒ_３は
   

   

   である。）
9. Ｒ_１はメトキシ基であり、Ｒ_２はヒドロキシ基であり、Ｒ_３は
   

   

   である、請求項８に記載の使用。
10. 炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物の製造のための、ミリスチカ・フラグナンス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）を水又はＣ_１−Ｃ_６の有機溶媒で抽出した抽出物の使用。

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