BR112020023816A2 - composição para prevenção ou tratamento de doença alérgica incluindo composto de inotodiol como ingrediente ativo - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, a composição incluindo um composto de inotodiol e um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo. Mais particularmente, descobriu-se que quando um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um dos ingredientes ativos é administrado a um modelo de camundongo em que uma alergia alimentar foi induzida, sintomas induzidos pela alergia foram aliviados e curados. Dessa forma, espera-se que o composto de inotodiol ou o extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo seja útil como uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica.

Description

“COMPOSIÇÃO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE DOENÇA ALÉRGICA INCLUINDO COMPOSTO DE INOTODIOL COMO INGREDIENTE ATIVO” CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente divulgação refere-se a uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, a composição incluindo um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo ou um composto de inotodiol.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] Uma alergia é uma reação de hipersensibilidade, que se refere a um fenômeno que ocorre rapidamente in vivo devido a uma reação antígeno-anticorpo quando um organismo entra em contato com um material estranho. Um antígeno que induz uma resposta alérgica é conhecido como alérgeno. Alérgenos típicos são pólen, medicamentos, fibras vegetais, bactérias, alimentos, corantes e produtos químicos.

[0003] Com o desenvolvimento da civilização moderna, a chance de exposição a vários alérgenos aumentou, e o número de pacientes com queixas de sintomas de alergia está aumentando rapidamente. Sabe-se que o número de pacientes com alergias é maior em países avançados, e na Coreia, embora não haja dados estatísticos precisos, o número de pacientes está aumentando a cada ano. Em particular, sabe-se que o número de pacientes pediátricos está aumentando rapidamente. Por esse motivo, muitas empresas farmacêuticas e institutos de investigação nacionais e estrangeiros têm investido muitos recursos no desenvolvimento de drogas causativas que possam reduzir a carga econômica, fisiológica e psicológica causada por doenças alérgicas. Porém, o desenvolvimento de tratamentos fundamentais ainda não foi alcançado.

[0004] Até agora, a hipersensibilidade imunológica foi classificada em quatro tipos principais. Hipersensibilidade do tipo I é a hipersensibilidade alérgica mediada por anticorpos IgE específicos. Os anticorpos IgE específicos se ligam a mastócitos ou receptores de superfície de basófilos, seguidos de secreção de mediadores das células, o que provoca reações de hipersensibilidade imediata, tais como asma, rinite alérgica e anafilaxia. A hipersensibilidade tipo II é uma resposta mediada por anticorpos IgG específicos, e a reação é iniciada por anticorpos que reagem com um componente antigênico em uma superfície celular. A hipersensibilidade do tipo III é uma reação citotóxica que ocorre quando há muito antígeno, em que antígenos e anticorpos formam complexos e ativam o complemento. Hipersensibilidade do tipo IV é hipersensibilidade mediada por células T mediada por células T.

[0005] Mastócitos são as principais células que causam reações alérgicas. Mastócitos são ativados quando a imunoglobulina E (IgE) se combina com um alérgeno. Os mastócitos secretam vários mediadores e causam edema de mucosa, contração do músculo liso brônquico e secreção de muco, contribuindo para a reação. Constatou-se que tais mastócitos desempenham um papel importante na manutenção e defesa do sistema imune do corpo humano, e estão localizados nos tecidos que circundam os órgãos respiratórios, órgãos digestivos, órgãos geniturinários, derme e vasos sanguíneos. (Rivera, J., et al., 2008; Moon,

T.C. , et al., 2010; Blank, U., et al., 2013; Boyce, J.A., 2004).

[0006] Devido à estimulação externa, os mastócitos produzem e secretam mediadores que causam respostas inflamatórias alérgicas. Tais mediadores incluem mediadores pré-formados em grânulos produzidos antes da estimulação e mediadores recém-sintetizados produzidos após estimulação (Schwartz, L.B., et al., 1998).

[0007] Histamina, proteoglicanos, serina- proteases, carboxipeptidase A, sulfatases, e exoglicosidases são pré-formadas e presentes em grânulos de mastócitos. Após a estimulação, esses materiais são secretados para o exterior das células. Um dos materiais mais importantes que são produzidos e sintetizados logo após a estimulação de mastócitos é um metabólito derivado de ácido araquidônico, por exemplo, prostaglandina D2 (PGD2) e leucotrieno C4 (LTC4), LTD4 e LTE4. Além disso, o fator de ativação plaquetária (PAF) também é importante (Kangmo Ahn, 2004).

[0008] Descobriu-se que mastócitos não estão apenas limitados a respostas alérgicas precoces, mas também profundamente relacionados a respostas alérgicas tardias e respostas alérgicas crônicas. Em outras palavras, o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) produzido e secretado a partir de mastócitos aumenta a expressão de moléculas de adesão de células endoteliais vasculares e promove o influxo de eosinófilos e linfócitos T em um órgão alvo. Além disso, a interleucina (IL)-4, IL-13 e IL-6 produzida por mastócitos aumenta a resposta de células T auxiliares tipo 2 (Th2) e, eventualmente, aumenta a produção de IgE, contribuindo assim para respostas alérgicas crônicas. Dessa forma, os mastócitos desempenham um papel central em causar e sustentar uma resposta inflamatória alérgica (Kangmo Ahn, 2004).

[0009] Tradicionalmente, três métodos de tratamento, tais como prevenção de alérgenos, terapia medicamentosa e imunoterapia com alérgenos são conhecidos como os principais métodos de tratamento de doenças alérgicas. Na verdade, a terapia farmacológica mais comumente utilizada para doenças alérgicas é o uso de inibidores (agente anti-histamínico, agente antileucotrieno etc.) para mediadores químicos (histamina, leucotrieno etc.) que estão envolvidos em respostas alérgicas ou o uso de drogas anti-inflamatórias (esteroides, imunossupressores etc.) que suprimem a inflamação de tecidos causada por respostas alérgicas. No entanto, essas terapias farmacológicas apresentam a desvantagem de só ser possível manter a melhora de sintomas clínicos quando a droga é administrada continuamente (Nahm, D.H., 2015). Sabe-se que o uso prolongado de esteroides causa vários efeitos colaterais. Dessa forma, muita atenção é necessária ao usar esteroides.

[0010] Recentemente, como agentes terapêuticos para doença alérgicas, há um interesse crescente por estabilizadores de mastócitos que inibem a desgranulação de mastócitos. Um estabilizador de mastócitos inibe a desgranulação de mastócitos e tem a vantagem de obter os efeitos de um agente anti-histamínico e um agente antileucotrieno ao mesmo tempo, mas foi desenvolvido de forma insuficiente em comparação com outras drogas.

Materiais cromogênicos, tais como cromoglicato e nedocromil, foram desenvolvidos como estabilizadores de mastócitos, mas seus usos são limitados devido ao inconveniente de uso devido à baixa biodisponibilidade quando administrados por via oral e à ambiguidade do mecanismo (Finn, D.F., et al., 2013) Portanto, há a necessidade de desenvolver um estabilizador de mastócitos que seja seletivo para mastócitos, seguro e eficaz.

[0011] Cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) pertence a Hymenochaetaceae (Basidiomycota, Aphyllophorales), que cresce selvagem em talos e tocos de bétula, amieiro e tramazeira no hemisfério norte, onde o clima é frio e úmido, como na Sibéria na Rússia, Finlândia, Noruega, Ucrânia, Hokkaido no Japão e Monte Odae na Coreia. Cogumelo Chaga é um fungo da podridão branca que decompõe lignina, celulose e hemicelulose. O cogumelo Chaga é conhecido por ser parasita e forma escleródios negros nos caules de um hospedeiro, tal como a bétula. (Guk MH., et al., 2013).

[0012] A partir do final da década de 1950, quando começaram as pesquisas na Rússia, foi relatado que materiais como β-glucano, polifenol e esterol extraído de corpos frutíferos de cogumelo Chaga apresentaram atividade fisiológica em corpos humanos. Além dos efeitos anticâncer (Youn MJ., Et al., 2008; Nomura M., et al., 2008), o cogumelo Chaga exibiu atividade antioxidante (Park YK, et al., 2004), atividade anti-hiperlipidêmica, atividade antidiabética (Kim MA, et al., 2009), atividade antifúngica, atividade antiviral, atividade anti- inflamatória e efeitos analgésicos.

[0013] Estudos foram realizados para isolar compostos úteis de cogumelos Chaga com várias atividades fisiológicas. Descobriu-se que vários compostos, tais como inotodiol, ácido trametenólico, lanosterol e inonotsulida, são isolados (Ma L., et al., 2013). Dentre esses compostos, o composto de inotodiol apresentou atividades anticâncer, anti-inflamatória e supressora de melanogênese.

[0014] Por conseguinte, os presentes inventores descobriram que um composto de inotodiol isolado de um extrato de cogumelo Chaga ou um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como ingrediente ativo melhora e trata os sintomas causados por uma alergia em um modelo de camundongo com alergia alimentar induzida e inibe a imunorreatividade de mastócitos, completando assim a presente divulgação.

[0015] Como técnica anterior, a publicação de patente japonesa aberta à inspeção pública 2006-347991 divulga que materiais derivados de micélios de cogumelo, incluindo cogumelo Chaga, inibem a liberação de histamina, que é um material relacionado à indução de alergia. A característica disso é semelhante àquela da presente divulgação; no entanto, o composto de inotodiol não é aqui descrito. Além disso, o Registro de Patente Coreano Nº. 11351054 divulga que uma composição herbácea contendo cogumelo Chaga tem um efeito de tratar a dermatite atópica, e cogumelo Chaga aumenta a imunidade geral para tratar fundamentalmente a dermatite atópica. No entanto, o composto de inotodiol não é descrito neste documento. A Publicação de Patente Coreana Nº. 2018-0003002 divulga que um composto de inotodiol isolado de um extrato de cogumelo

Chaga tem um efeito anti-inflamatório ou terapêutico. No entanto, os efeitos de prevenção, tratamento e inibidores de alergia sobre a imunorreatividade de mastócitos não são descritos nem implícitos.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES PROBLEMA TÉCNICO

[0016] É provida uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, em que a composição é eficaz, segura e sujeita à administração oral e inclui um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo ou um composto de inotodiol.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[0017] De acordo com um aspecto da presente divulgação, uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica pode incluir um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo. Fórmula 1

[0018] O extrato de cogumelo Chaga pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em frações de diclorometano ou frações de clorofórmio obtidas por adição de diclorometano ou clorofórmio a um extrato obtido extraindo cogumelo Chaga com 70 por cento (%) de etanol como um solvente, respectivamente.

[0019] De acordo com um aspecto da presente divulgação, uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica pode incluir um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo.

[0020] A composição farmacêutica pode suprimir a desgranulação de mastócitos.

[0021] A doença alérgica pode ser induzida por pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pólen, medicamentos, fibras vegetais, bactérias, alimentos, corantes e produtos químicos. Preferencialmente, a doença alérgica pode ser induzida por alimentos.

[0022] A doença alérgica pode ser pelo menos uma selecionado do grupo que consiste em urticária, anafilaxia, rinite alérgica, asma brônquica, e dermatite atópica.

[0023] De acordo com um aspecto da presente divulgação, uma composição de alimento funcional para a saúde para prevenção ou melhora de uma doença alérgica pode incluir um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo.

[0024] De acordo com um aspecto da presente divulgação, uma composição de alimento funcional para a saúde para prevenção ou melhora de uma doença alérgica pode incluir um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo.

[0025] A presente divulgação será descrita em maiores detalhes.

[0026] A presente divulgação refere-se a uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, em que a composição pode incluir um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo.

[0027] O extrato de cogumelo Chaga pode ser uma fração obtida por adição de um solvente orgânico a um extrato obtido extraindo cogumelo Chaga com 70 por cento (%) de etanol como um solvente.

[0028] O solvente orgânico pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um álcool C1 a C4 inferior, diclorometano, clorofórmio, etil acetato, dietil acetato, dietil éter, acetona e hexano. No entanto, o solvente orgânico não é limitado aos mesmos. Os álcoois C1 a C4 inferiores podem ser metanol, etanol, propanol, isopropanol ou butanol.

[0029] Preferencialmente, o extrato de cogumelo Chaga pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em frações de diclorometano ou frações de clorofórmio obtidas por adição de diclorometano ou clorofórmio a um extrato obtido extraindo cogumelo Chaga extraído com 70 por cento (%) de etanol como um solvente, respectivamente.

[0030] A presente divulgação refere-se a uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, em que a composição pode incluir um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo.

[0031] O composto de inotodiol pode ser sintetizado de acordo com um método comumente conhecido e preparado como um sal farmaceuticamente aceitável, ou isolado ou purificado de um extrato de cogumelo Chaga.

[0032] O composto de inotodiol isolado do cogumelo Chaga pode ser purificado por meio de cromatografia. A cromatografia pode ser selecionada de cromatografia em coluna de sílica gel, cromatografia em coluna HP-20, cromatografia em coluna RP-18, cromatografia em coluna LH-20, e cromatografia líquida de alta eficiência.

[0033] A alergia é um fenômeno que ocorre abruptamente in vivo, causado por uma reação antígeno- anticorpo ao contato com um alérgeno que é um material indutor de alergia. O alérgeno pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pólen, medicamentos, fibras vegetais, bactérias, alimentos, corantes e produtos químicos e, preferencialmente, alimentos. No entanto, o alérgeno não se limita a isso.

[0034] Além disso, a doença alérgica é causada por alergia, e exemplos incluem asma brônquica, rinite alérgica, dermatite atópica, urticária, alergia alimentar, alergia a drogas, doença do soro e semelhantes. A doença alérgica possui vários tipos, dependendo do tipo de alérgeno e do tipo de tecido que causa uma resposta alérgica.

[0035] Uma doença alérgica pode ser pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em urticária, anafilaxia, rinite alérgica, asma brônquica e dermatite atópica. No entanto, a doença alérgica não se limita a isso.

[0036] O composto de inotodiol ou o extrato de cogumelo Chaga contendo um ingrediente ativo pode suprimir a desgranulação de mastócitos.

[0037] Quando o mastócito recebe uma estimulação de um alérgeno, um material indutor de resposta inflamatória de alergia, tal como histamina, serina- proteases, proteoglicanos, prostaglandinas D2 e leucotrienos pode ser secretado para fora de uma célula, e essa reação é referida como desgranulação de mastócitos. Portanto, a inibição da desgranulação de mastócitos pelo composto de inotodiol ou pelo extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo pode inibir a secreção de um material indutor de resposta inflamatória alérgica devido à estimulação alérgica, assim prevenindo ou tratando a alergia. Isso é conhecido como “estabilizador de mastócitos”.

[0038] Particularmente, o composto de inotodiol da presente divulgação não influencia na regulação da atividade de célula T CD4+, e célula CD8+, célula B e macrófago, mas inibe seletivamente a desgranulação de mastócitos apenas, entre célula T CD4+, célula CD8+, célula B, macrófago e um mastócito, que estão relacionados ao tratamento de alergia.

[0039] A presente divulgação refere-se a uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, em que a composição farmacêutica pode incluir um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo.

[0040] A composição farmacêutica pode incluir um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo em uma faixa de 0,001 por cento em peso (% em peso) a 100% em peso.

[0041] A composição farmacêutica pode ser formulada sob a forma de preparações orais, tais como pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes, e aerossóis, preparações externas, supositórios, ou soluções injetáveis esterilizadas, de acordo com um método convencional. A composição farmacêutica pode incluir um veículo, um excipiente e um diluente, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinil pirrolidona, água, hidroxibenzoato de metil, hidroxibenzoato de propil, talco, estearato de magnésio ou óleo mineral. No caso da formulação, um diluente ou um excipiente, por exemplo, um enchimento, um extensor, um aglutinante, um agente umectante, um desintegrante e um tensoativo, que são tipicamente usados, pode ser usado. Uma preparação sólida para administração oral pode incluir um comprimido, uma pílula, pó, grânulos e uma cápsula. Tal preparação sólida pode ser preparada misturando o composto de inotodiol ou extrato de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo com pelo menos um selecionado de um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose ou gelatina. Além de excipientes simples, lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco. Uma preparação líquida para administração oral pode incluir uma suspensão, uma solução oral, uma emulsão e xarope e ainda incluir vários excipientes, por exemplo, um umectante, um adoçante, um agente aromatizante e um conservante, além de diluentes simples, por exemplo, água e parafina líquida, que são geralmente utilizados. Uma preparação para administração parenteral pode incluir soluções aquosas esterilizadas, soluções não aquosas, suspensões, emulsões, preparações liofilizadas ou supositórios. Exemplos de suspensão e solução não aquosa incluem propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal, tal como óleo de oliva, éster injetável, tal como oleato de etil, e semelhantes. Uma base do supositório pode ser witepsol, macrogol, tween 61, manteiga de cacau, manteiga de laurina ou glicerogelatina.

[0042] A dosagem da composição farmacêutica da presente divulgação pode variar dependendo da idade, sexo, peso corporal do indivíduo a ser tratado, a doença ou condição patológica particular a ser tratada, a gravidade da doença ou condição patológica, a via de administração, e o julgamento do prescritor. A dosagem pode ser determinada com base nesses fatores dentro do nível de alguém com habilidade comum na técnica e geralmente a dosagem pode ser em uma faixa de 0,01 mg/kg/dia a aproximadamente 2,000 mg/kg/dia. Uma dose preferida está na faixa de 1mg/kg/dia a 500mg/kg/dia. A composição pode ser administrada uma ou várias vezes ao dia. A dose não limita o escopo da presente divulgação em nenhum aspecto.

[0043] A composição farmacêutica pode ser administrada a mamíferos, tais como ratos, gado ou seres humanos por várias rotas. Todos os modos de administração podem ser esperados. Por exemplo, a administração pode ser por injeção oral, retal ou intravenosa, intramuscular, subcutânea, endocervical ou intracerebral. Uma vez que o composto da presente divulgação tem pouca toxicidade e efeitos colaterais, o composto pode ser usado com segurança a longo prazo para fins preventivos.

[0044] A presente divulgação refere-se a uma composição de alimento funcional para a saúde para prevenção ou melhora de uma doença alérgica, em que o composto funcional de alimento funcional para a saúde pode incluir um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo e um aditivo alimentar aceitável como alimento.

[0045] O composto de alimento funcional para a saúde pode incluir o composto de inotodiol ou o extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo em uma faixa de 0,001% em peso a 100% em peso.

[0046] O alimento funcional para a saúde pode ser na forma de um comprimido, uma cápsula, uma pílula ou uma preparação líquida. Alimentos que podem ser adicionados ao extrato da presente divulgação, por exemplo, diversos alimentos, bebidas, chicletes, chás, complexos vitamínicos.

EFEITOS VANTAJOSOS DA DIVULGAÇÃO

[0047] A presente divulgação refere-se a uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, em que a composição pode incluir um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga contendo o composto de inotodiol como um ingrediente ativo. Descobriu-

se que, quando o composto de inotodiol ou o extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo é administrado a um modelo de camundongo com alergia alimentar induzida, sintomas induzidos pela alergia são aliviados e curados, e a imunorreatividade de mastócitos é inibida.

[0048] Por conseguinte, espera-se que o composto de inotodiol e o extrato de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol como um ingrediente ativo seja útil como uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0049] A Figura 1 mostra melhora de sintoma de alergia seguido de indução de alergia alimentar e tratamento com um composto de inotodiol e uma fração de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol; a Figura 1(A) mostra mudança na temperatura retal; A Figura 1(B) mostra um nível de alívio ou tratamento de sintomas de anafilaxia; e a Figura 1(C) mostra a pontuação da diarreia;

[0050] A Figura 2 mostra a mudança em (A) o número de eosinófilos infiltrados no intestino delgado; e (B) o número de mastócitos no intestino delgado seguido de indução de alergia alimentar e tratamento com um composto de inotodiol e uma fração de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol;

[0051] A Figura 3 mostra a mudança na concentração de IgE (A) relacionada à alergia; e MCPT-1 (B) em um soro seguido de indução de alergia alimentar e tratamento com um composto de inotodiol e uma fração de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol;

[0052] A Figura 4 mostra os resultados de teste de imunorreatividade de células T CD4+ seguida de indução de alergia alimentar e tratamento com um composto de inotodiol e uma fração de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol; a Figura 4(A) mostra alterações de expressão em IL-13, IL-5 e IFN-γ, que são citocinas produzidas por células T CD4+ Th2; e a Figura 4(B) mostra um nível de ativação por ovalbumina de células T CD4+ que expressam D011.00TCR, isto é, um receptor de célula T específico de peptídeo derivado de ovalbumina e um nível da seguinte divisão celular; e

[0053] A Figura 5 mostra os resultados de teste de imunorreatividade de mastócitos seguido de indução de alergia alimentar e tratamento com um composto de inotodiol e uma fração de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol, e mostra a mudança na temperatura retal em camundongos, em que desgranulação de mastócitos é induzida (A), e a alteração de MCPT-1 no sangue, por um método de anafilaxia sistêmica passiva.

MELHOR MODO

[0054] Doravante, a presente divulgação será descrita em mais detalhes com referência a Exemplos preferíveis. No entanto, a presente divulgação não é limitada ao Exemplo aqui descrito, mas pode ser incorporada em outras formas. Em vez disso, os exemplos são fornecidos neste documento de modo que a descrição aqui apresentada seja abrangente e completa, e o conceito da presente divulgação seja totalmente transmitido a alguém ordinariamente versado técnica.

Exemplo 1. Isolamento de composto de inotodiol Exemplo 1-1. Preparação de extração de cogumelo Chaga e verificação de teor de composto de inotodiol

[0055] O composto de inotodiol da presente divulgação foi isolado de um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus).

[0056] 630 gramas (g) de cogumelo Chaga foram pulverizados em finas partículas, 3.000 ml de 70% [v/v] de etanol foram adicionados, e a extração foi realizada sob agitação ultrassônica a 40ºC e 90 hertz (Hz) três vezes para obtenção de extrato de etanol 70% (3 × 3,0 litros (L)). Em seguida, 58 g de extrato de etanol 70% marrom desidratado foram obtidos em evaporador rotativo.

[0057] 58 g de extrato de etanol 70% de cogumelo Chaga foram dissolvidos em água, seguido da adição de (diclorometano, CH2Cl2) para obter 6,0 g de uma fração de diclorometano. Após o isolamento da fração de diclorometano, acetato de etil (EtOAc) foi adicionado à fração remanescente para obter 3,2 g de uma fração de acetato de etil e 48,5 g de uma fração de água.

[0058] Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada para medir um teor do composto de inotodiol incluído no extrato de cogumelo Chaga obtido e nas frações. HPLC foi realizada sob uma condição de um gradiente de concentração de acetonitrila (0-30 minutos; 60%  95% [v/v], 30-60 minutos; 95% [v/v] constantemente) usando LC-10AD (Shimadzu Co. Kyoto, Japão). Cada um de extrato de cogumelo Chaga e fração foi dissolvido em metanol para uma concentração de 2 mg/ml, seguido de filtração com filtro de seringa de 0,2 µm. Em seguida, 10 µL do mesmo foram injetados. O conteúdo do composto de inotodiol foi medido usando uma coluna de HECTOR-M C18 (4,6 × 250 mm, tamanho de partícula 5 µm, RStech, Coreia), a um fluxo de 1 ml/minuto, com detecção UV (210 nm). Como resultado, descobriu-se que cerca de 1% do composto de inotodiol estava presente no extrato de etanol 70% (Ext. EtOH), 7,8% do composto de inotodiol estava presente na fração de diclorometano (Fração CH2Cl2), 0,9% do composto de inotodiol estava presente na fração de acetato de etil (Fração EtOAc), e 0,05% do composto de inotodiol estava presente na fração de água (Fração H2O) tendo o teor de composto de inotodiol mais baixo.

[0059] No caso de uma fração clorofórmio obtida usando clorofórmio em vez de diclorometano, verificou-se que a fração de clorofórmio continha uma quantidade semelhante do composto de inotodiol à fração de diclorometano. Exemplo 1-2. Isolamento de composto de inotodiol

[0060] O composto de inotodiol foi isolado da fração de diclorometano de cogumelo Chaga obtido no Exemplo 1-1.

[0061] 2,5 g da fração de diclorometano foram submetidos à fração por cromatografia de coluna de sílica gel utilizando 1 litro de cada um dos solventes mistos, em que n-hexano foi misturado com acetato de etil na proporção de 20:1, 9:1, 4:1, 2:1 e 1:2 [v/v] de acordo com uma condição de dissolução de gradiente de concentração, obtendo-se 13 frações menores (Frações C1-C13). Fração C6 foi misturada com Fração C7, e a mistura foi submetida à cromatografia de coluna de sílica gel de acordo com uma condição de solvente de uma solução em que n-hexano é misturado com acetato de etil a 20:1 [v/v], isolando assim 210 mg do composto de inotodiol. Exemplo 2. Confirmação da estrutura físico-química de composto de inotodiol

[0062] Inotodiol;

[0063] Pó amorfo branco;

[0064] ESI-MS: [M+ Na]+ 465,37 m/z (C30H50O2: 442,27);

[0065] 1HNMR e 13 C RMN (ver Tabela 1 para os dados);

[0066] De acordo com o resultado da análise de 13 ESI-MS e dos dados de C RMN, a fórmula molecular encontrada foi C30H50O2. 13

[0067] Em C-RMN para inotodiol, 30 picos de carbono foram observados, e descobriu-se que nos picos de δC121,2, 134,0, 134,4 e 134,8, 2 ligações duplas estavam presentes, e nos picos de δC73,2 e 78,7, 2 grupos hidroxil 1 estavam presentes (ver Tabela 2). No espectro de H-RMN (ver Tabela 2), em 0,67, 0,76, 0,82, 0,88, 0,93, 1,60, e 1,69 (3H, s), foi observado um pico de metil singleto, e em δH0,88, foi observado um pico de metil dupleto. Além disso, um pico olefínico correspondente a H-24 foi observado em δH 5,16 (1H, t, J = 7,2 Hz), e um pico de oximetina ligado ao oxigênio observado em δH 3,18 (1H, m, H-3) e em δH 3,65 (1H, H-22).

[0068] O resultado acima foi comparado com os dados relatados em um artigo (Du. D., et al., 2011) para verificar a estrutura do composto de inotodiol.

Tabela 1 Exemplo Experimental 1. Preparação de modelo de camundongo de alergia e administração de extrato

[0069] Para preparar modelos de camundongo de alergia, foram usados camundongos BALB/C machos de 5 semanas de idade. Os modelos de alergia alimentar foram preparados utilizando ovalbumina de frango como material indutor de alergia (alérgeno).

[0070] Para a imunização dos camundongos, 20 µg de ovalbumina foram misturados com 2 mg de alúmen, e a mistura foi injetada intraperitonealmente nos camundongos duas vezes a cada duas semanas. A indução de alergia alimentar foi induzida realizando a segunda injeção de imunização e, duas semanas depois, 50 mg de ovalbumina foram administrados por via oral cinco vezes a cada três dias para causar uma resposta alérgica.

Além disso, para confirmar o efeito terapêutico da alergia, o extrato de cogumelo Chaga, a fração e o composto de inotodiol obtido no Exemplo 1 foram administrados oralmente aos ratos todos os dias durante o período de administração de ovalbumina.

Aqui, como controle positivo, um grupo de camundongos foi usado, ao qual dexametasona foi administrada todos os dias. 50mg de ovalbumina sozinha ou o extrato de cogumelo Chaga, a fração ou o composto de inotodiol foi administrado por último, seguido de observação dos sintomas causados por alergia uma hora depois.

Para cada grupo experimental, seis camundongos foram usados, e cada grupo experimental é mostrado na Tabela 2. Tabela 2 Grupo Tratamento de amostra Normal Não tratado Indução de Ovalbumina (indução de alergia alergia (Alergia) alimentar) Controle Positivo 20mg/kg de ovalbumina e dexametasona (Dexa.) 320 mg/kg de ovalbumina e extrato de Fração EtOH etanol 70% de cogumelo Chaga Fração CH2Cl2 320 mg/kg de ovalbumina e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga

Fração H2O 320 mg/kg de ovalbumina e a fração de água de cogumelo Chaga Inotodiol 20mg/kg de ovalbumina e composto de inotodiol

Exemplo Experimental 2. Confirmação de melhora em sintomas de alergia Exemplo Experimental 2-1. Confirmação de mudança na temperatura retal

[0071] Para verificar a alteração da temperatura retal seguida de indução de alergia alimentar e tratamento medicamentoso, os ratos correspondentes a cada grupo foram submetidos à medição da temperatura retal. A temperatura retal foi medida inserindo a ponta do sensor de um termômetro retal no reto. Os seus resultados são apresentados na Figura 1(A).

[0072] Como mostrado na Figura 1(A), descobriu-se que um grupo induzido por alergia (Alergia) tinha uma temperatura retal mais baixa do que um grupo normal (Normal). Por outro lado, descobriu-se que o grupo tratado com dexametasona (Dexa.) Ou o grupo tratado com o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Inotodiol), o grupo tratado com o extrato de etanol de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol (Ext. EtOH), e o grupo tratado com a fração de diclorometano (Fração CH2Cl2) da presente divulgação apresentou temperatura retal mais elevada do que o grupo induzido por alergia alimentar (Alergia). Em particular, o grupo tratado com composto de inotodiol e o grupo tratado com a fração de diclorometano apresentaram um nível de temperatura retal semelhante ao grupo normal. Por outro lado, o grupo tratado com a fração aquosa de cogumelo Chaga (Fração H2O) apresentou um nível de temperatura retal semelhante ao grupo induzido por alergia alimentar.

[0073] Por conseguinte, descobriu-se que o composto de inotodiol e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol da presente divulgação melhoraram uma temperatura retal baixa, ou seja, um dos sintomas causados pela indução de alergia. Exemplo Experimental 2-2. Observação de anafilaxia

[0074] Para ver melhora ou efeito terapêutico do composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo o composto de inotodiol da presente divulgação com relação a um sintoma de anafilaxia causado por alergia alimentar, respostas de camundongos de cada grupo experimental foram observados, e os sintomas de anafilaxia foram pontuados de acordo com a Tabela 3. Os resultados dos mesmos são apresentados na Figura 1(B). Tabela 3

SINTOMAS DE ANAFILAXIA PONTUAÇÃO NORMAL 0 RESPOSTA LENTA 1 NENHUMA RESPOSTA 2 TREMOR 3 MORTE 4

[0075] Como mostrado na Figura 1(B), o grupo com alergia alimentar induzida (Alergia) apresentou uma pontuação de anafilaxia maior do que o grupo normal (Normal). Por outro lado, o grupo tratado com dexametasona (Dexa.), o grupo tratado com extrato de etanol de cogumelo Chaga (Ext. EtOH), o grupo tratado com a fração de diclorometano (Fração CH2Cl2), e o grupo tratado com o composto de inotodiol (Inotodiol) tiveram uma pontuação de anafilaxia mais baixa do que o grupo com alergia alimentar induzida. Em particular, o grupo tratado com a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e o grupo tratado com o composto de inotodiol apresentaram menores pontuações de anafilaxia. Por outro lado, o grupo tratado com a fração aquosa de cogumelo Chaga (Fração H2O) apresentou nível semelhante de pontuação de anafilaxia ao grupo com alergia alimentar induzida.

[0076] Por conseguinte, descobriu-se que o composto de inotodiol e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol da presente divulgação melhoraram os sintomas de anafilaxia causados por indução de alergia. Exemplo Experimental 2-3. Observação de fezes no intestino grosso

[0077] A mudança no formato das fezes foi observada devido à alergia alimentar após tratamento com o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo o composto de inotodiol da presente divulgação. As formas das fezes no intestino grosso dos camundongos de cada grupo experimental foram observadas a olho nu, e os sintomas foram pontuados de acordo com a Tabela 4, e os resultados dos mesmos são apresentados na Figura 1(C). Tabela 4 Sintoma de diarreia Pontuação Normal 0 Normal/fezes aquosas 1 Fezes aquosas frequentes e 2 descontroladas

Diarreia grave 3 Morte 4

[0078] Como mostrado na Figura 1(A), descobriu-se que um grupo com alergia alimentar induzida (Alergia) teve uma pontuação de sintomas de diarreia mais alta do que um grupo normal (Normal). Pontuações de sintomas de diarreia do grupo tratado com dexametasona (Dexa.) ou do grupo tratado com o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Inotodiol) e do grupo tratado com fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol (Fração CH2Cl2) foram mais baixas do que as do grupo com alergia alimentar induzida. Por outro lado, o grupo tratado com o extrato de etanol de cogumelo Chaga (Ext. EtOH) e o grupo tratado com a fração aquosa (Fração H2O) tiveram menores efeitos de alívio de sintomas de diarreia do que a fração de diclorometano de cogumelo Chaga. No caso da fração de água, apresentou nível semelhante ao do grupo com alergia induzida.

[0079] Por conseguinte, descobriu-se que o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol da presente divulgação melhoraram os sintomas de diarreia causados por indução de alergia.

[0080] Além disso, embora não seja mostrado na Figura 1, um grupo tratado com a fração de clorofórmio de cogumelo Chaga apresentou temperatura retal, pontuação de anafilaxia e pontuação de sintomas fecais semelhantes à fração de diclorometano da presente divulgação. Por outro lado, quando um grupo é tratado com 20 mg/kg de colesterol,

que tem uma estrutura semelhante ao composto de inotodiol, descobriu-se que, ao contrário do composto de inotodiol, o grupo apresentou um nível de temperatura retal semelhante, pontuação de anafilaxia, e pontuação de sintomas fecais como o grupo com alergia induzida.

[0081] Portanto, através da temperatura retal, do sintoma de anafilaxia e da observação de fezes, o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga foi considerado um dos principais ingredientes ativos que aliviam os sintomas de alergia. Além disso, a fração de diclorometano e a fração de clorofórmio de cogumelo Chaga incluindo o composto de inotodiol como um ingrediente ativo demonstraram ter excelentes efeitos no alívio dos sintomas de alergia. Exemplo Experimental 3. Observação sobre alterações nas células do intestino delgado devido à alergia alimentar Exemplo Experimental 3-1. Observação de eosinófilos no intestino delgado

[0082] Os eosinófilos são conhecidos por desempenharem um papel importante na alergia alimentar. Ou seja, os eosinófilos induzem inflamação alérgica no intestino delgado. Ao observar alterações de eosinófilos no intestino delgado, a prevenção de alergia e os efeitos terapêuticos do composto de inotodiol e da fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo o composto de inotodiol da presente divulgação foram confirmados.

[0083] Os camundongos de cada grupo experimental no Exemplo Experimental 1 foram anestesiados e tiveram o abdômen cortado. Em seguida, o intestino delgado foi retirado, fixado com formalina, tratado com parafina,

permeado com parafina e microsseccionado em micrótomo, obtendo-se seções de tecido. As seções de intestino delgado obtidas foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para observação de células eosinófilas. Seus resultados são apresentados na Figura 2(A).

[0084] De acordo com os resultados de medição do número de células eosinófilas coradas por coloração de tecido, como mostrado na Figura 2(A), o grupo com alergia alimentar induzida (Alergia) apresentou aumento da infiltração de eosinófilos no intestino delgado, em comparação com o grupo normal, e o grupo tratado com dexametasona (Dexa.), o grupo tratado com o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Inotodiol), e a fração de diclorometano incluindo um composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Fração CH2Cl2) mostrou diminuição da infiltração de eosinófilos. No entanto, a fração de água de cogumelo Chaga (Fração H2O) teve poucos efeitos redutores.

[0085] Por conseguinte, descobriu-se que o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol da presente divulgação previnem ou tratam a alergia aliviando a inflamação causada pela alergia. Exemplo Experimental 3-2. Observação de mastócitos no intestino delgado

[0086] Ao observar mastócitos, que são conhecidos como indutores de uma resposta alérgica, foram confirmados os efeitos terapêuticos e preventivos de alergia do composto de inotodiol e fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo a fração de composto de inotodiol da presente divulgação.

[0087] Para observar mastócitos, as seções de tecido de intestino delgado obtidas no Exemplo Experimental 3-1 foram coradas com toluidina. Em seguida, os mastócitos foram observados ao microscópio, e o número de mastócitos foi medido, os quais são mostrados na Figura 2(B).

[0088] De acordo com os resultados da medição do número de mastócitos corados pela coloração com toluidina, como mostrado na Figura 2(B), o grupo com alergia alimentar induzida (Alergia) apresentou aumento do número de mastócitos no intestino delgado, em comparação com o grupo normal, e o grupo tratado com dexametasona (Dexa.), o grupo tratado com o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Inotodiol) e a fração de diclorometano incluindo um composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga (Fração CH2Cl2) apresentou diminuição do número de mastócitos. No entanto, a fração de água (Fração H2O) teve poucos efeitos redutores.

[0089] Além disso, embora não seja mostrado na Figura 2, um grupo tratado com a fração de clorofórmio mostrou um nível similar de redução no número de eosinófilos e mastócitos semelhante ao da fração de diclorometano de cogumelo Chaga da presente divulgação. Por outro lado, quando um grupo é tratado com 20 mg/kg de colesterol, que possui uma estrutura semelhante ao composto de inotodiol, descobriu-se que, ao contrário do composto de inotodiol, o grupo apresentou pequena diminuição no número de eosinófilos e mastócitos.

[0090] Por conseguinte, descobriu-se que o composto de inotodiol isolado de cogumelo Chaga e a fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo um composto de inotodiol da presente divulgação previnem ou tratam alergia. Exemplo Experimental 4. Confirmação de expressão de IgE e MCPT-1 devido à alergia

[0091] Uma resposta alérgica deve-se à expressão de IgE responsiva a alérgeno e, pela combinação de alérgeno e IgE, os mastócitos secretam materiais granulares associados à inflamação alérgica, tais como histamina, serina protease ou proteoglicano. Portanto, para confirmar a prevenção de alergia e efeito terapêutico do composto de inotodiol e da fração de diclorometano de cogumelo Chaga incluindo o composto de inotodiol da presente divulgação, uma concentração de cada um de IgE e uma protease-1 de mastócito (MCPT-1), ou seja, uma serina protease específica de mastócitos, no soro de um camundongo, foi medida.

[0092] O soro foi obtido do sangue de um camundongo um dia após a administração de 50 mg de ovalbumina sozinha ou do extrato de cogumelo Chaga, da fração ou do composto de inotodiol no Exemplo Experimental

1. O soro obtido foi diluído 100 vezes e usado.

[0093] A concentração de IgE no soro foi medida usando um kit de ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA). 100 µL de um tampão de revestimento de carbonato (pH 9,5) contendo 2 µg/ml de ovalbumina foram adicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades, e então submetidos à reação a uma temperatura de 4ºC durante a noite para revestimento. A placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem (0,05% de tween 20 em PBS), solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) foi adicionada a 200 µL por cavidade,

seguido de tratamento à temperatura ambiente por 1 hora e bloqueio. Em seguida, foram realizadas três lavagens com tampão de lavagem. Após a lavagem, foram adicionados 100 µL de soro em cada cavidade, reagidos em temperatura ambiente por 2 horas, e lavados com tampão de lavagem. 100 µL de 1 µg/ml de IgE anticamundongo conjugado com biotina foram adicionados a cada cavidade e reagidos por uma hora, seguido de lavagem com tampão de lavagem e tratamento com estreptavidina-HRP ao qual uma peroxidase de rábano silvestre (HRP) é conjugada por 30 minutos. A placa foi lavada cinco vezes com tampão de lavagem, e 100 µL de tetrametilenbenzidina foram tratados para induzir o desenvolvimento de cor. Após o desenvolvimento de cor, ácido sulfúrico 2N (H2SO4) foi adicionado a cada cavidade para interromper a reação de cor. Absorbância a 450 nm foi medida e a concentração de IgE no soro foi analisada. Os seus resultados são apresentados na Figura 3(A).

[0094] A concentração de uma protease-1 de mastócitos (MCPT-1), ou seja, uma serina protease foi medida usando um kit ELISA mMCP-1 (eBioscience) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Os seus resultados são apresentados na Figura 3(B).

[0095] Conforme mostrado na Figura 3, o grupo com alergia alimentar induzida (Alergia) apresentou aumento nas concentrações de IgE específica para proteína da clara de ovo (Figura 3(A)) e MCPT-1 (Figura 3(B)) no soro, em comparação com o grupo normal (Normal). O grupo tratado com extrato de etanol de cogumelo Chaga (Ext. EtOH) e o grupo tratado com a fração de diclorometano (Fração CH2Cl2) tiveram concentrações significativamente reduzidas de IgE e

MCPT-1. O grupo tratado com a fração de água de cogumelo Chaga (Fração H2O) não apresentou alteração substancial nas concentrações de IgE e MCPT-1. O grupo tratado com dexametasona (Dexa.) e o grupo tratado com o composto de inotodiol (Inotodiol) não teve alteração substancial na concentração de IgE, entretanto, a concentração de MCPT-1 desses grupos diminuiu significativamente.

[0096] Além disso, embora não seja mostrado na Figura 3, um grupo tratado com a fração de clorofórmio apresentou um nível semelhante de diminuição na concentração de IgE e MCPT-1 no soro como a fração de diclorometano de cogumelo Chaga da presente divulgação.

[0097] Esse resultado mostra que os efeitos da regulação/inibição da atividade dos mastócitos estão mais diretamente relacionados à prevenção ou tratamento dos sintomas de alergia do que aos efeitos redutores da expressão de IgE específica de alérgeno. Exemplo Experimental 5. Confirmação dos efeitos de inibição específicos dos mastócitos Exemplo Experimental 5-1. Confirmação dos efeitos da regulação da atividade de células T CD4+

[0098] Sabe-se que as citocinas produzidas pelas células T CD4+ auxiliares 2 (Th2) promovem a produção de IgE e promovem a diferenciação de mastócitos e eosinófilos, aprofundando os sintomas alérgicos. Também foi relatado que extratos vegetais, que apresentaram efeitos antialérgicos, têm efeitos inibidores da ativação de células T CD4+ e produção de citocinas de células T CD4+ Th2.

[0099] A fim de examinar o efeito de um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol na regulação da atividade de células T CD4+, s análise do nível de expressão de citocinas + produzidas por células T CD4 Th2 e experimentos de transferência adotiva usando células transgênicas T CD4+ TCR que expressam DO11.00 TCR, ou seja, o receptor de célula T específico de peptídeo derivado de ovalbumina (TCR), foram realizadas.

[0100] Para a expressão de citocina, uma amostra foi tratada da mesma maneira que no Exemplo Experimental 1, e as células foram isoladas do linfonodo mesentérico (mLN) de camundongos de cada grupo após um dia. Nesse momento, um grupo tratado com 10 mg/kg de dexametasona, um grupo tratado com 20 mg/kg de imatinib (Gleevec), que é usado como agente terapêutico para hipertermia de mastócitos, e cada grupo tratado com 20 mg/kg de colesterol, que é semelhante em estrutura ao composto de inotodiol, foram adicionados. As células isoladas foram dispensadas em cavidades de uma placa de 96 cavidades a uma taxa de 1 × 106 células/cavidade. Meio completo de RPMI (contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina, estreptomicina e glutamina) contendo ovalbumina ou meio completo de RPMI contendo 100 µg/ml de ovalbumina foi inoculado em cultura por três dias sob uma condição de 37ºC e 5% de CO2. Após três dias, a solução de cultura celular foi coletada, seguida de análise em kit ELISA de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante para análise da quantidade de IL- 5, IL-13 e IFN-γ correspondente a cada citocina secretada como um solução de cultura de células. Os seus resultados são apresentados na Figura 4(A).

[0101] Experimentos para medir um grau de resposta imune de células T específica de peptídeo derivado de ovalbumina de um experimento animal foram realizados como segue. As células foram isoladas dos linfonodos de camundongos transgênicos expressando DO11.10TCR. As células isoladas foram coradas por fluorescência com carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE), e 2 × 106 células foram injetadas por via intravenosa em camundongos BALB/C. As células foram injetadas intraperitonealmente com ovalbumina (50 µg) e alúmen para induzir a divisão de células T CD4+ expressando DO11.00 TCR. Administração oral de 20 mg/kg do composto de inotodiol, 320 mg/kg do extrato de etanol de cogumelo Chaga, 10 mg/kg de dexametasona, 10 mg/kg de imatinib, ou 20 mg/kg do colesterol foi realizada uma vez ao dia por quatro dias começando um dia após a injeção de ovalbumina. Após cinco dias de injeção de ovalbumina, as células foram isoladas de linfonodos BALB/C, coradas com anticorpo anti-CD4 e anticorpo anti-DO11.10, e intensidade de fluorescência de CFSF medida da célula T CD4+ que expressa DO11.00 TCR usando citometria de fluxo para determinar o grau de divisão celular. Em seguida, o número de células foi medido. Os resultados são apresentados na Figura 4(B), respectivamente. Aqui, a intensidade de fluorescência CFSF diminuiu à medida que a divisão celular aumentou.

[0102] Conforme mostrado na Figura 4(A), nenhuma expressão substancial de IL-5, IL-13 e IFN-γ em todos os grupos foi observada no caso de células cultivadas em meio completo de RPMI sem ovalbumina (Sem OVA). Porém, no caso de células cultivadas em meio completo de RPMI incluindo ovalbumina (OVA), a quantidade de cada IL-5, IL-13 e IFN-γ foi aumentada no grupo com alergia induzida (Alergia). No entanto, a quantidade de citocina do grupo tratado com o extrato de etanol de cogumelo Chaga (Ext. EtOH) Foi semelhante à do grupo normal (Normal). No entanto, a quantidade de citocinas do grupo tratado com o composto de inotodiol (Inotodiol) não foi substancialmente diferente da quantidade de expressão de IL-5, IL-13 e IFN-γ.

[0103] Além disso, como na análise de células T CD4+ expressando DO11.00TCR, ou seja, um TCR específico de peptídeo derivado de ovalbumina mostrado na Figura 4(B), o grupo tratado com ovalbumina (Alergia) teve uma intensidade de fluorescência de CFSE significativamente reduzida de + células T CD4 expressando DO11.00 TCR de um número significativamente elevado de células T CD4+, em comparação com o grupo não imune à ovalbumina (Normal). Porém, o grupo tratado com extrato de etanol de cogumelo Chaga (Fração EtOH) e o grupo tratado com imatinib (Imat.) não apresentaram diferença na intensidade de fluorescência CFSE e no número de células, em comparação com o grupo não imune. O grupo tratado com o composto de inotodiol (Inotodiol) teve um nível semelhante de diminuição na intensidade de fluorescência CFSE de células T CD4+ expressando DO11.00 TCR, em comparação com o grupo tratado com ovalbumina, e número significativamente aumentado de células T CD4+.

[0104] Além disso, embora não seja mostrado na Figura 4, um grupo tratado com a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e um grupo tratado com a fração de clorofórmio de cogumelo Chaga de acordo com a presente divulgação demonstraram inibir a expressão de citocinas devido a células T CD4+ Th2 assim como o fazem o extrato de cogumelo Chaga.

[0105] Por conseguinte, dos resultados anteriores, descobriu-se que a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e a fração de clorofórmio de cogumelo Chaga, de acordo com a presente divulgação, têm capacidade significativa de regulação da atividade de células T CD4+ Th2 (induzida por alérgeno), enquanto o composto de inotodiol não. Exemplo Experimental 5-2. Confirmação dos efeitos da regulação da imunorreatividade de mastócitos

[0106] No Exemplo Experimental 4, descobriu-se que a redução da expressão de MCPT-1 de um composto de inotodiol ou um extrato de cogumelo Chaga contendo um composto de inotodiol é relacionada à inibição de imunorreatividade de mastócitos devido a um composto de inotodiol.

[0107] A fim de confirmar os efeitos de inibição de desgranulação de mastócitos do composto de inotodiol ou do extrato de cogumelo Chaga contendo o composto de inotodiol da presente divulgação, foi realizado um experimento de anafilaxia sistêmica passiva.

[0108] O composto de inotodiol (20 mg/kg), o extrato de etanol de cogumelo Chaga (320 mg/kg), colesterol (20 mg/kg) semelhante em estrutura ao composto de inotodiol, dexametasona (10 mg/kg) como um controle positivo, e imatinib (20 mg/kg) foram administrados por via oral a camundongos BALB/C machos com 5 semanas de idade do Exemplo Experimental 1 uma vez por dia durante 3 dias. No terceiro dia após a administração oral, 3 µg de antidinitrofenol (DNP)-IgE foram injetados por via intravenosa e, após 24 horas, a desgranulação dos mastócitos foi induzida por injeção intravenosa de 80 µg de albumina sérica bovina conjugada com DNP (BSA). A temperatura retal de camundongos induzida por desgranulação dos mastócitos foi medida e a quantidade de MCPT-1 no sangue foi analisada. Os resultados disso são mostrados na Figura 5.

[0109] Conforme mostrado na Figura 5, ao medir a temperatura retal de camundongos (Figura 5 (A)), quando a desgranulação de mastócitos foi induzida (tratada com DNP- BSA), a temperatura do reto foi diminuída, enquanto o composto de inotodiol (Inotodiol) e o extrato de etanol de cogumelo Chaga (EtOH Ext.) não diminuiu a temperatura retal.

[0110] Além disso, foi analisada a quantidade de MCPT-1 secretada durante a desgranulação de mastócitos (Figura 5(B)), e quando a desgranulação de mastócitos foi induzida (tratada com DNP-BSA), a concentração de MCPT-1 no sangue do camundongo aumentou. Quando tratado com dexametasona (Dexa.), Imatinib (Imat.), o composto de inotodiol (Inotodiol), e o extrato de etanol de cogumelo Chaga (Ext. EtOH), um nível de aumento na concentração de MCPT-1 foi significativamente diminuído. Quando o colesterol, que é semelhante em estrutura ao composto de inotodiol (Chol.), é tratado, ao contrário do composto de inotodiol, o MCPT-1 não diminuiu.

[0111] Embora não seja mostrado na Figura 5, a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e a fração clorofórmio de cogumelo Chaga, de acordo com a presente divulgação, do composto de inotodiol também reduziram a quantidade de MCPT-1 em um grau semelhante.

[0112] Por conseguinte, descobriu-se que a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e a fração de clorofórmio de cogumelo Chaga, de acordo com a presente divulgação, inibiram a desgranulação de mastócitos.

[0113] Portanto, a partir dos resultados acima, descobriu-se que a fração de diclorometano de cogumelo Chaga e a fração de clorofórmio, de acordo com a presente divulgação, regulam a atividade de células T CD4+ e inibem a desgranulação de mastócitos, possuindo, portanto, inibição imune múltipla. Por outro lado, ao contrário da dexametasona ou da fração de diclorometano e da fração de clorofórmio tendo inibição imune múltipla, o composto de inotodiol, de acordo com a presente divulgação, inibe seletivamente a desgranulação de mastócitos, provendo assim um tratamento relativamente seletivo e seguro de uma doença alérgica. Exemplo de Preparação 1. Preparação farmacêutica Exemplo de Preparação 1-1. Preparação de Comprimido

[0114] 200 g da fração de diclorometano de cogumelo Chaga, de acordo com a presente divulgação, foram misturados com 175,9 g de lactose, 180 g de amido de batata, e 32 g de ácido silícico coloidal. Adicionou-se a essa mistura uma solução de gelatina 10% que foi, em seguida, pulverizada e passada por uma peneira de 14 mesh. O resultado foi seco, e 160 g de amido de batata, 50 g de talco e 5 g de estearato de magnésio foram adicionados para preparar uma mistura que foi, então, transformada em comprimidos. Exemplo de Preparação 1-2. Preparação de solução injetável

[0115] 1 g do composto de inotodiol da presente divulgação, 0,6 g de cloreto de sódio, e 0,1 g de ácido ascórbico foram dissolvidos em água destilada de forma que a solução tivesse 100 ml. A solução foi adicionada a um frasco e aquecida por 30 minutos a 20ºC para esterilização. Exemplo de Preparação 2. Preparação de alimentos Exemplo de Preparação 2-1. Preparação de condimentos alimentares

[0116] O composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a um condimento alimentar a 1% em peso para preparar um condimento alimentar para promoção de saúde. Exemplo de Preparação 2-2. Preparação de farinhas

[0117] O composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a farinha de trigo a 0,1% em peso, e pão, bolo, biscoitos, bolachas e macarrão foram preparados usando essa mistura para preparar alimentos para promoção de saúde. Exemplo de Preparação 2-3. Preparação de sopas e molhos

[0118] O composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a sopas e molhos a 0,1% em peso para preparar sopas e molhos para promoção de saúde. Exemplo de Preparação 2-4. Preparação de laticínios

[0119] O composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a leite a 0,1% em peso, e esse leite foi usado para preparar vários laticínios, tais como manteiga e sorvete.

Exemplo de Preparação 2-5. Preparação de suco de vegetais

[0120] 0,5 g do composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a 1.000 ml de suco de tomate ou suco de cenoura para preparar sucos de vegetais para promoção de saúde. Exemplo de Preparação 2-6. Preparação de suco de frutas

[0121] 1 g do composto de inotodiol da presente divulgação foi adicionado a 1.000 ml de suco de maçã ou suco de uva para preparar suco de frutas para promoção de saúde.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, a composição farmacêutica incluindo um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo. [Fórmula 1]

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, em que o extrato de cogumelo Chaga é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em frações de diclorometano ou frações de clorofórmio obtidas por adição de diclorometano ou clorofórmio a um extrato obtido extraindo cogumelo Chaga com 70 por cento (%) de etanol como um solvente, respectivamente.

3. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença alérgica, a composição farmacêutica incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo. [Fórmula 1]

4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a composição farmacêutica suprime a desgranulação de mastócitos.

5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a doença alérgica é induzida por pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pólen, medicamentos, fibras vegetais, bactérias, alimentos, corantes e produtos químicos.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, em que a doença alérgica é induzida por alimentos.

7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a doença alérgica é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em urticária, anafilaxia, rinite alérgica, asma brônquica, e dermatite atópica.

8. Composição de alimento funcional para a saúde para prevenção ou melhora de uma doença alérgica, a composição de alimento funcional para a saúde incluindo um extrato de cogumelo Chaga (Inonotus obliquus) incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo. [Fórmula 1]

9. Composição de alimento funcional para a saúde, de acordo com a reivindicação 8, em que o extrato de cogumelo Chaga é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em frações de diclorometano ou frações de clorofórmio obtidas por adição de diclorometano ou clorofórmio a um extrato obtido extraindo cogumelo Chaga com 70 por cento (%) de etanol como um solvente, respectivamente.

10. Composição de alimento funcional para a saúde para prevenção ou melhora de uma doença alérgica, a composição de alimento funcional para a saúde incluindo um composto de inotodiol representado pela Fórmula 1 como um ingrediente ativo. [Fórmula 1]

11. Composição de alimento funcional para a saúde, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a composição de alimento funcional para a saúde suprime a desgranulação de mastócitos.

12. Composição de alimento funcional para a saúde, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a doença alérgica é induzida por pelo menos um selecionado do grupo que consiste em pólen, medicamentos, fibras vegetais, bactérias, alimentos, corantes e produtos químicos.

13. Composição de alimento funcional para a saúde, de acordo com a reivindicação 12, em que a doença alérgica é induzida por alimentos.

14. Composição de alimento funcional para a saúde, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a doença alérgica é pelo menos uma selecionado do grupo que consiste em urticária, anafilaxia, rinite alérgica, asma brônquica, e dermatite atópica.