CN101028343A - 一种岩黄连总生物碱及其纯化方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种岩黄连有效部位总生物碱的纯化方法，其包括将岩黄连总生物碱粗提物用酸水溶解后过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用水进行洗脱，继而用10－45％的乙醇进行洗脱，收集乙醇部分的洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连总生物碱。本发明还公开了该纯化方法纯化制得的岩黄连总生物碱及其防治病毒性肝炎的药物组合物。该岩黄连有效部位不仅具有较好的水溶性，而且其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算大于52％。

Description

一种岩黄连总生物碱及其纯化方法和药物组合物

技术领域

本发明涉及岩黄连总生物碱的制备，特别涉及一种岩黄连总生物碱及其纯化方法和药物组合物。

背景技术

岩黄连(Corydalis saxicola Bunting)对于病毒性肝炎、肝纤维化等具有良好的治疗作用，其有效部位为生物碱，包括脱氢卡维丁(岩黄连碱)、脱氢阿朴卡维丁、右旋四氢巴马汀及原阿片碱等。诸多临床观察结果显示，岩黄连注射液在治疗急慢性肝炎方面显示出很好的临床应用前景，且多数为临床的经验治疗：以10％或5％葡萄糖注射液稀释岩黄连注射液(用Tween 80作增溶剂)后滴注。但同时我们也发现了岩黄连现有提取物或其注射液的一些不足之处，如公开号为CN1453277的中国专利申请“一种岩黄连总碱及其制备方法和应用”虽也公开了用大孔树脂进行岩黄连总碱的纯化，但用其方法制备出来的总碱的水溶性仍不好，1mg提纯物在1ml注射用水中都不能完全溶解(超声10分钟)，又如公开号为CN1460497的专利申请中也揭示了采用大量的增溶剂(如Tween 80)以增加药物的溶解度。

而目前岩黄连总生物碱提取物较普遍的问题在于总碱的含量比较低(原注射液)，水溶性不好，需要加入比较多的增溶剂，这与静脉注射剂对增溶剂的“慎重选择”原则不完全相符。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术中的缺陷，提供一种可提高水溶性但不降低含量的岩黄连总生物碱及其纯化方法。本发明是在现有岩黄连总生物碱粗提物的基础上，对其进一步纯化。

本发明岩黄连总生物碱的纯化方法包括将岩黄连总生物碱粗提物用酸水溶解后过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用水进行洗脱以除去水溶性杂质及过量酸，继而用10-45％(V/V)的乙醇进行洗脱，收集乙醇部分的洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连总生物碱。

上述岩黄连总生物碱粗提物是指现有技术中岩黄连药材的各种未经纯化的提取物，包括其醇提物、酸水提取物或其他有机溶剂提取物，如上述公开号为CN1453277的申请文件所揭示的，或根据现有岩黄连制剂，如原广西东兰制药厂(今广西河丰药业)岩黄连注射液等制备方法中的提取方法提取的粗提物。本发明以醇提物为例，其提取方法包括下列步骤：将岩黄连用8～10倍(W/W)的浓度70％以上的乙醇回流提取，浓缩提取液，得到相对密度为1.1～1.2的浸膏，浸膏用3～5倍(W/W)的浓度0.1-1％(V/V)的稀酸捏溶，过滤得其酸性滤液，用碳酸钠溶液调pH9～10后过滤，碱性滤液用氯仿或乙酸乙酯萃取3-6次，碱性沉淀物用氯仿或乙酸乙酯提取3-6次，合并氯仿或乙酸乙酯液，浓缩干燥得到总碱粗提物。其中的稀酸可采用盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、酒石酸、柠檬酸等。

本发明纯化方法中使用酸水处理，一方面将生物碱类有效成分溶解，另一方面去除不溶的杂质，选用的酸水种类可同上述提取方法中所用的各种酸，即选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、酒石酸、柠檬酸等的水溶液。其浓度优选0.05-5％(V/V)，而所述的酸水用量一般为总碱粗提物的100-800倍(W/W)。如酸水浓度太低、用量太少，则样品溶解不好，损失较大，影响最终总生物碱提取物的转移，反之，浓度太高、用量太大，则不利于杂质及过量酸的去除，从而影响最终总生物碱提取物的水溶性及其酸性。

所说的大孔吸附树脂的类型通常按骨架极性强弱分类：非极性(苯乙烯-二乙烯苯聚合)、中等极性(丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯结构)、极性(含硫氧、酰胺、氮氧等基团)。本发明优选中等极性的树脂如HPD400，DIAIONHP2MG等，纯化后总生物碱含量达55％以上；也可以是非极性的树脂如HPD100、D101、XAD-16等，纯化后的总生物碱含量达52％以上；且上述两种极性类型的树脂纯化后的总生物碱的水溶性均较好。

关于洗脱溶剂的浓度，当乙醇浓度太低，特别是低于10％时洗脱时有效成分洗脱不完全，总碱含量低；反之，当乙醇浓度过高时，特别是高于45％时，杂质洗出也多，同样造成含量较低；当乙醇浓度在10-45％时，纯化后的有效部位总生物碱含量均能在52％以上，且水溶性较好，该乙醇优选浓度范围为25-35％。

当上样液的流速过快时，有效成份吸附可能不完全而造成损失，为更佳地提高总生物碱含量，应尽量降低流速，本发明滤液上柱的流速最少可为0.25柱体积/小时以下，但考虑其生产效率，选择每小时0.25-8个柱体积，更佳流速为0.5-3个柱体积。

本发明的岩黄连总生物碱即由上述纯化方法纯化制得。

本发明的另一目的是提供一种防治病毒性肝炎的药物组合物，其包括本发明的岩黄连总生物碱作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

该药物组合物可为各种剂型，包括注射剂，如水针剂、粉针剂、葡萄糖输液及氯化钠输液等；以及口服剂型，如片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等。

本发明纯化方法设备简单，成本较低，容易操作，所需时间较短。其纯化制得的岩黄连提取物在水中具有较好的溶解性，在常温下每毫升注射用水中可以溶解大于5毫克，较佳的可以达到10毫克以上(轻轻振摇1分钟即可)，使其在临床治疗多种剂型中应用更加方便，尤其是在其注射剂配制过程中无需或尽量少地使用增溶剂，减少了毒副作用的发生；并且不降低生物碱的含量，其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算大于52％，质量更加可控，并经体内外药效学实验证明此有效部位具有良好的抗肝炎病毒作用。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

其中下面实施例中所有的岩黄连总生物碱粗提物是按上述文献制备的。

实施例1

取岩黄连总生物碱粗提物2.0g，用0.05％盐酸水(粗提物重的800倍)处理，溶解后过滤，滤液以每小时2个柱体积通过250ml大孔吸附树脂(Amberlite XAD-16)柱，先用水进行洗脱，继而用40％的乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连有效部位。其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算为53％。

实施例2

取岩黄连总生物碱粗提物2.0g，用2％硫酸水(粗提物重的400倍)处理，溶解后过滤，滤液以每小时0.25个柱体积过200ml大孔吸附树脂(HPD400)柱，先用水进行洗脱，继而用35％的乙醇进行洗脱，收集乙醇的部分洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连有效部位。其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算为55％。

实施例3

取岩黄连总生物碱粗提物2.0g，用5％磷酸水(粗提物重的100倍)处理，溶解后过滤，滤液以每小时5个柱体积过100ml大孔吸附树脂(DiaionHP2MG)柱，先用水进行洗脱，继而用10％的乙醇进行洗脱，收集乙醇的部分洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连有效部位。其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算为52％。

实施例4

取岩黄连总生物碱粗提物2.0g，用3％醋酸水(粗提物重的200倍)处理，溶解后过滤，滤液以每小时8个柱体积过200ml大孔吸附树脂(D101)柱，先用水进行洗脱，继而用25％的乙醇进行洗脱，收集乙醇的部分洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连有效部位。其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算为54％。

实施例5

取岩黄连总生物碱粗提物2.0克，用0.5％酒石酸水(粗提物重的600倍)处理，溶解后过滤，滤液以每小时3个柱体积过150ml大孔吸附树脂(HPD100)柱，先用水进行洗脱，继而用45％的乙醇进行洗脱，收集乙醇的部分洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连有效部位。其总生物碱含量以脱氢卡维丁计算为52.5％。

实施例6冻干粉针剂

取本发明岩黄连总生物碱1份，加入甘露醇5份，加入注射用水适量溶解，加入0.5份活性碳，搅拌半小时，用G6垂镕滤器过滤，注射用水定容至100份(重量份)，灌装2ml/瓶(西林瓶)，冷冻干燥，压盖包装即得。

实施例7水针剂

取本发明岩黄连总生物碱1份，加入甘露醇和葡萄糖5份，硫代硫酸钠适量，加入注射用水100份(重量份)溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封2ml/瓶(安瓿)，灭菌包装即得。

实施例8葡萄糖输液

取本发明岩黄连总生物碱1份，加入葡萄糖和甘氨酸500份，及亚硫酸氢钠0.5份，加注射用水3000份，溶解加入0.5份活性碳，搅拌半小时，用G4垂镕滤器过滤，注射用水定容至5000份(重量份)，灌封250ml/瓶(输液瓶)，灭菌压盖包装即得。

实施例9本发明岩黄连总生物碱胶囊剂的制备

处方：

本发明岩黄连总生物碱         50g

糖粉                         150g

微晶纤维素                   100g

30％乙醇                     适量

制法：将上述药物与辅料分别研细，过80目筛，充分混合固体物质，加30％乙醇适量制得软材，过10目筛得湿颗粒，70℃干燥至水分在8％以下，过12目筛，收集颗粒装入硬胶囊壳中，得1000粒胶囊。

实施例10本发明岩黄连总生物碱片剂的制备

处方：

本发明岩黄连总生物碱           50g

淀粉                           250g

淀粉浆(10％)                   50g

硬脂酸镁                       5g

制法：将本发明岩黄连总生物碱与250g淀粉混匀，加淀粉浆继续搅拌使成软材，用16目尼龙筛制粒，70-80℃通风干燥，干料加入硬脂酸镁，经16目筛整粒，混匀，压片，即得1000粒片。

实施例11本发明岩黄连总生物碱滴丸剂的制备

处方：

本发明岩黄连总生物碱           50g

PEG6000                        500g

将PEG6000在油浴上加热至100-110℃，等全部熔融后加入本发明岩黄连总生物碱，搅拌使溶解，保温90-100℃，用直径约1.5mm的滴管，以每分钟30丸的滴速滴至10℃以下的二甲基硅油中制成丸。

本发明上述实施例中所用各种大孔吸附树脂及其他原料和试剂均为常规市售产品。

应用实施例1本发明岩黄连总生物碱水溶解性测定

在温度25℃条件下，取实施例1～4的本发明岩黄连总生物碱，以公开号为CN1453277的中国专利申请中公开的醇提和大孔吸附树脂纯化方法制得的岩黄连总生物碱为对照，加入一定量的注射用水，振摇或超声直到全部溶解时的浓度即为其溶解量。说明：由于对照物(1mg置于1ml水中)轻摇10分钟后仍有未溶物，振摇后再超声10分钟，但仍有未溶物，结果如下表1。

                                  表1

实施例	1	2	3	4	对照
						溶解量(mg/ml)	8(轻摇1分钟)	10(轻摇1分钟)	10(轻摇1分钟)	12(轻摇1分钟)	＜1(超声10分钟)

应用实施例2体外抗乙肝病毒实验及细胞毒性

用HBV-DNA转染的2.2.15细胞作为模型，放射免疫法分别测定了本发明实施例2岩黄连总生物碱100ug/ml、40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml作用8天后细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的量，计算其对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率，其结果分别为HBsAg抑制率：98.3％、94.8％、85.6％、70.3％；HBeAg抑制率：97.2％、88.5％、77.2％、60.9％。结果表明：本发明岩黄连总生物碱在100-10ug/ml浓度范围内，能有效地减少细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg量。并用MTT法检测细胞毒性。细胞存活率如下：80.26％、100％、100％、100％。

应用实施例3体内抗乙肝病毒实验

采用鸭胫静脉注射0.2ml麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，造成鸭乙型肝炎病毒模型，检测血清DHBV-DNA含量。实验结果表明，注射本发明实施例3岩黄连总碱分高(10mg/kg)、中(5mg/kg)、低(2.5mg/kg)三个剂量组可降低DHBV-DNA感染鸭血清中DHBV-DNA含量。与模型对照组比较，经统计学处理有显著性差异(P＜0.01)；阳性药(拉米夫定)对照组DHBV-DNA亦明显降低。表明本发明岩黄连总生物碱对DHBV-DNA感染鸭有较好的治疗作用。

Claims (10)

1、一种岩黄连总生物碱的纯化方法，其包括将岩黄连总生物碱粗提物用酸水溶解后过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用水进行洗脱，继而用10-45％的乙醇进行洗脱，收集乙醇部分的洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连总生物碱。

2、如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该酸水选自浓度为0.05-5％的盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、酒石酸、柠檬酸的水溶液。

3、如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该大孔吸附树脂选用中等极性或非极性的大孔吸附树脂。

4、如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于该中等极性大孔吸附树脂选用HPD400或DIAION HP2MG型大孔吸附树脂。

5、如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于该非极性大孔吸附树脂选用XAD16、HPD100或D101型大孔吸附树脂。

6、如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该滤液通过大孔吸附树脂柱的流速为0.25-8个柱体积/小时。

7、如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于该流速为0.5-3个柱体积/小时。

8、如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该洗脱液乙醇的浓度为25-35％。

9、如权利要求1～8任一项所述的纯化方法纯化制得的岩黄连总生物碱。

10、一种防治病毒性肝炎的药物组合物，其包括如权利要求9所述的岩黄连总生物碱作为活性成分，以及药学上可接受的载体。