CN118359670A - 一种多羽凤尾蕨中的新化合物及提取分离纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多羽凤尾蕨(Pteris decrescens)中的新化合物及提取分离纯化方法和应用。所述化合物为：15(8→9)‑迁移‑对映‑贝壳杉‑7,16‑二烯‑19‑酸‑β‑D‑吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β‑羟基‑15‑酮‑对映‑贝壳杉‑19‑酸‑葡萄糖酯(化合物2)、(S)‑6‑羟基‑3‑甲基‑4‑酮‑1,4,5,6‑四氢环戊二烯并[b]吡咯‑2‑羧基(化合物3)、2,4‑双(4‑羟基苯基)‑3‑(甲氧羰基)环丁烷‑1‑羧酸(化合物4)，是通过药材的提取与粗分离、乙酸乙酯部位分离和纯化、正丁醇部位分离和纯化所得。并对分离纯化所得化合物进行抗肿瘤活性筛选实验，结果表明所述4个化合物对白血病HL‑60、肺癌A549、肝癌HepG2和结肠癌SW480的体外肿瘤生长有半数抑制活性，可用于治疗抗肿瘤疾病，为继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及药学领域，尤其涉及一种多羽凤尾蕨中的新化合物及提取分离纯化方法和应用。
背景技术
在贵州苗族地区调研时，发现当地的苗族同胞将多羽凤尾蕨Pteris decrescens同该属其它形态相似的植物混淆使用，用于治疗肠炎，黄疸型肝炎、臃肿疮毒、止血、衄血等疾病。经查阅文献，目前国内外未见有关多羽凤尾蕨活性成分研究的报道，而该属其它种的研究较为成熟，如半边旗、凤尾草等，主要含有二萜、倍半萜、黄酮以及多糖类化合物[1-4]，其中二萜成分大多具有较强的抗肿瘤活性如5F(11α-hydroxy-15-oxo-ent-kaur-16-en-19-oic acid)，而多糖类化合物有可能是该属植物主要的水溶性抗肿瘤活性成分。另外，本课题组前期也对该属其它植物化学成分进行深入研究，如半边旗、蜈蚣草、全缘凤尾蕨等，分离得到了较多具有生物活性的单体化合物，尤其以对映-贝壳杉烷型二萜及其苷为主。根据同属植物具有相似成分的原理，为进一步探明多羽凤尾蕨化学成分组成以及药效物质基础，课题组展开了对多羽凤尾蕨化学成分的研究，通过对其化学成分的预试验研究，发现该植物中可能含有糖苷类、黄酮类、香豆素类以及酚类等化学成分。
本发明课题组对多羽凤尾蕨甲醇浸提物进行化学成分研究，从中分离得到多个二萜类化合物，其中新化合物4个，分别为：15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(4)，均为首次从该植物中分离得到。通过对新化合物进行抗肿瘤活性筛选实验，结果表明该4个化合物对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌HepG2和结肠癌SW480的体外肿瘤生长有半数抑制活性，可用于治疗抗肿瘤疾病，同时为继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究提供参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多羽凤尾蕨中的新化合物。
本发明的另一目的在于提供一种多羽凤尾蕨中的新化合物的提取分离纯化方法。
本发明的另一目的在于提供多羽凤尾蕨中的新化合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：
本发明所述的一种多羽凤尾蕨中的新化合物，所述化合物及结构式分别如下：
(1)化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)的结构式：
(2)化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)的结构式：
(3)化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)的结构式：
(4)化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)的结构式：
本发明所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4在制备治疗抗肿瘤药物方面的应用。
优选的，本发明所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4在制备治疗人白血病、人肺癌、人肝癌、人结肠癌药物中的应用。
本发明所述药物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
本发明所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂。
本发明所述液体制剂为注射制剂、口服液。
本发明所述的多羽凤尾蕨中的化合物的提取分离纯化方法，包括以下步骤：
1)药材的提取与粗分离
多羽凤尾蕨药材经自然阴干，粉碎成粗粉，过80～100目筛，常温下用2倍/次80-98％的甲醇浸泡4-6次，合并浸泡液，减压回收得到稠浸膏；稠浸膏用温水溶解作为水相，采用液-液萃取法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，有机相和水相比例为1∶1，萃取后分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位记为A部分，正丁醇部位记为B部分；
2)乙酸乙酯部位分离和纯化
将乙酸乙酯部位用少量甲醇溶解，取聚酰胺拌样，采用MCI柱层析，以1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1的甲醇-水为洗脱系统，进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，得到A1～A5共5个部分；
A4部分样品分离：A4部分样品，加入适量甲醇使之溶解，取100～200目硅胶拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以二氯甲烷洗脱，再以50∶1，25∶1，10∶1，7∶1，5∶1，2∶1的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，最后用甲醇洗脱；经TLC检测后，合并相近流分得到A4-1～A4-5共5个部分，再将A4-4部分，采用硅胶柱层析，以20∶1的二氯甲烷-甲醇系统洗脱，得到A4-4-1和A4-4-2两个部分，A4-4-2发现有晶体析出，经过反复重结晶得到化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)；
3)正丁醇部位分离和纯化
取正丁醇部分浸膏，采用MCI柱层析，以1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1的甲醇-水为洗脱系统进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，流分通过薄层层析检测合并为B1～B4个部分；
B1部分样品分离：将B1以30～60目聚酰胺按1∶1进行拌样，通过C18反相柱，以3∶7，5∶5，7∶3，1∶0的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，通过TLC检测合并得到B1-1～B1-3；将B1-1通过硅胶柱色谱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯10∶1，7∶1，5∶1，1∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B1-1-1～B1-1-4；再将B1-1-4依次通过硅胶柱色谱，以二氯甲烷/乙酸乙酯20∶1为洗脱剂、C18反相柱色谱，以甲醇-水5∶5，7∶3，1∶0为洗脱剂进行分离，得到化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)；
B2部分样品分离：B2部分样品，加入适量甲醇使之溶解，称取100-200目硅胶拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以乙酸乙酯洗脱，再以50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1的乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，最后用甲醇洗脱，经TLC检测后，合并相近流分得到B2-1～B2-4共4个部分；将B2-2部分，采用硅胶柱层析，以30∶1的乙酸乙酯-甲醇系统洗脱，得到B2-2-1和B2-2-2共2个部分，再将B2-2-1经过反复硅胶柱层析得到化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)；
将B-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/甲醇20∶1，10∶1，5∶1，3∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-1～B2-2-2；将B2-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯5∶1，3∶1，1∶1，1∶3进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-2-1～B2-2-2-4；再将Fr.B2-2-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯2∶1，1∶1，1∶3，1∶5进行梯度洗脱得到化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)。
优选的，本发明步骤1)中所述常温下用2倍/次95％的甲醇浸泡5次。
本发明步骤1)中所述浸提提取的时间为：每次浸渍提取4～6天。
优选的，本发明步骤1)中所述浸提提取的时间为：每次浸渍提取5天。
本发明有益效果：
1.本发明从多羽凤尾蕨中提取分离纯化得到4个新化合物，分别为：15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)，其中化合物1～3为新化合物，化合物4为新的天然产物，均为首次从该植物中分离得到。
2.本发明从多羽凤尾蕨中提取分离纯化得到4个新化合物通过抗肿瘤活性筛选研究，结果表明该化合物1、化合物2、化合物3、化合物4对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌HepG2和结肠癌SW480的体外肿瘤生长有半数抑制活性，可用于治疗抗肿瘤疾病，具有潜在的药用价值，为后续可以继续加强对该种植物的化学成分和活性筛选研究以及对该种植物中具有较好活性的化合物进行结构修饰方面的研究。
3.本发明研究了所有化合物对白血病HL-60的抑制活性实验，化合物1～3的IC50分别为5.705±0.646、6.350±0.699、16.370±0.807。
4.本发明研究了所有化合物对人肝癌细胞(HepG2)的的抑制活性实验，化合物1～4的IC50分别为1.366±0.524、1.182±0.594、1.376±0.690、1.677±0.635。
5.本发明研究了所有化合物对人肺癌细胞(A549)的的抑制活性实验，化合物1～2的IC50分别为4.285±0.646、21.890±0.862。
6.本发明研究了所有化合物对人结肠癌细胞SW480的的抑制活性实验，化合物1～2的IC50分别为0.466±0.088、0.448±0.095。
附图说明
图1：化合物1的结构式
图2：化合物1的晶胞图
图3：化合物1的HMBC(→)、1H-1H COSYNOESY相关信号
图4：化合物2的结构式
图5：化合物2的HMBC(→)、1H-1H COSY相关信号
图6：化合物3的结构式
图7：化合物3的HMBC(→)、1H-1H COSY相关信号
图8：化合物3的X-ray晶体结构
图9：化合物4的结构式
图10：化合物4的HMBC(→)、1H-1H COSY相关信号
图11：受试化合物对人白血病细胞(HL-60)的IC50值直观图
图12：受试化合物对人肝癌细胞(HepG2)的IC50值直观图
图13：受试化合物对人肺癌细胞(A549)的IC50值直观图
图14：受试化合物对人结肠癌细胞(SW480)的IC50值直观图
具体实施方式
实施例1：多羽凤尾蕨中化合物的提取分离纯化
1)药材的提取与粗分离
多羽凤尾蕨药材经自然阴干后重54.2kg，粉碎成粗粉(80～100目)，常温下用95％的甲醇浸泡5次，每次6天，合并5次浸泡液，减压回收得到稠浸膏约8.9kg。总浸膏用温水溶解(水相)，采用液-液萃取法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取(有机相和水相比例为1∶1)，萃取后分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位194g记为A部分，正丁醇部位997g记为B部分。
2)乙酸乙酯部位分离和纯化
将乙酸乙酯部位(A)用少量甲醇溶解，称取150g聚酰胺拌样，采用MCI柱层析，以甲醇-水为洗脱系统(1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，得到A1-A5共5个部分。
A4部分样品分离：A4部分样品34g，加入适量甲醇使之溶解，称取35g硅胶(100～200目)拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以二氯甲烷洗脱，再以二氯甲烷-甲醇系统(50∶1，25∶1，10∶1，7∶1，5∶1，2∶1)梯度洗脱，最后用甲醇洗脱。经TLC检测后，合并相近流分得到A4-1～A4-5共5个部分。A4-4部分，采用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇系统(20∶1)洗脱，得到A4-4-1和A4-4-2两个部分，A4-4-2发现有晶体析出，经过反复重结晶得到化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)。
3)正丁醇部位分离和纯化
取正丁醇部分浸膏997g，采用MCI柱层析，以甲醇-水为洗脱系统(1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，流分通过薄层层析检测合并为B1-B4个部分。
B1(39.0g)的分离：将B1以30～60目聚酰胺进行拌样(1∶1)，通过C18反相柱，以甲醇-水(3∶7，5∶5，7∶3，1∶0)为洗脱剂进行梯度洗脱，通过TLC检测合并得到B1-1～B1-3。B1-1(23.3g)通过硅胶柱色谱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯10∶1，7∶1，5∶1，1∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B1-1-1～B1-1-4。B1-1-4(6.9g)依次通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/乙酸乙酯20∶1)及C18反相柱色谱(甲醇-水5∶5，7∶3，1∶0)分离得到化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)。
B2部分样品分离：B2部分样品212g，加入适量甲醇使之溶解，称取200g硅胶(100～200目)拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以乙酸乙酯洗脱，再以乙酸乙酯-甲醇系统(50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1)梯度洗脱，最后用甲醇洗脱。经TLC检测后，合并相近流分得到B2-1～B2-4共4个部分。B2-2部分，采用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇系统(30∶1)洗脱，得到B2-2-1和B2-2-2共2个部分，B2-2-1经过反复硅胶柱层析得到化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)。
B-2-2(9.6g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/甲醇20∶1，10∶1，5∶1，3∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-1～B2-2-2。B2-2-2(6.7g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯5∶1，3∶1，1∶1，1∶3进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-2-1～B2-2-2-4。Fr.B2-2-2-2(1.6g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯2∶1，1∶1，1∶3，1∶5进行梯度洗脱得到化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)。
实施例2：化合物的结构式
(1)15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)的结构式：
(2)12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)的结构式：
(3)(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)的结构式：
(4)2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)的结构式：
实施例3：15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)的晶体结构：
实施例4：(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)的的晶体结构：
实施例5：15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D吡喃葡萄糖酯(化合物1)的特征
无色透明晶体(甲醇)，二氯甲烷-甲醇(10∶1)，Rf值为0.45，10％硫酸-乙醇溶液显蓝紫色；熔点(mp)：119.6～122.4℃；旋光度：(c 0.1637，甲醇)；质谱(HR-ESI-MS)：[M+Na]+m/z 485.25024(calcd for C26H38O7Na，485.25097)；红外光谱IR(KBr)：Vmax3400.6，2931.9，2873.0，1723.4，1647.2，1383.0，1236.4，1218.1，1167.9，1067.6，1018.4，874.7cm-1；1H-NMR(600MHz，CD3OD)，13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC(ppm)，见表2。
晶体参数：C26H38O7·2(H2O),M＝498.59, α＝90°,β＝91.124(2)°,γ＝90°,T＝150。
实施例6：12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)的特征
无色透明晶体(甲醇)，乙酸乙酯-甲醇(5∶1)，Rf值为0.6，10％硫酸-乙醇溶液显棕黄色；1H-NMR(600MHz，CD3OD)，13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC(ppm)，见表3。
实施例7：(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)的特征
白色粉末/结晶(甲醇)，二氯甲烷-甲醇7∶1，Rf＝0.79，10％硫酸乙醇溶液显淡橙棕色；旋光度：(c 0.211，甲醇)；紫外UV(甲醇)：λmaxnm(logε)：321(3.29)，266(3.46)，207(4.38)；红外光谱IR(KBr v max cm -1)：3259，1647，1519，1475，1300；高分辨质谱(HRESIMS)：测试值为m/z 194.04660[M-H]－(计算值为194.04588，C9H8NO4)；1H-NMR(400MHz，CD3OD)，13C-NMR(100MHz，CD3OD)，见表4。
晶体数据：C9H9NO4，斜方晶系，P212121(No.19)， β＝90°，Z＝4，Rgt(F)＝0.0864，wRref(F2)＝0.1993，T＝273(2)K。
实施例8：2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)的特征
白色粉末，二氯甲烷-甲醇7∶1，Rf＝0.53，10％硫酸乙醇溶液显裸粉色；旋光度： (c 0.246，甲醇)；紫外UV(甲醇)：λmaxnm(logε)：319(2.55)，274(3.62)；红外光谱IR(KBr v max cm -1)：3278，2361，1716，1616，1516，1437，1231，838；高分辨质谱(HRESIMS)：测试值为m/z 365.09920[M+Na]+(计算值为365.09956，C19H18O6Na)；1H-NMR(400MHz，CD3OD)、13C-NMR(100MHz，CD3OD)，见表4。
实施例9
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入20％的微晶纤维素和20％的糖粉制粒，得颗粒剂。
实施例10
15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉和3％硬脂酸镁混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例11
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉和15％的蜂蜜混合均匀，制成丸剂。
实施例12
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入10％的淀粉桨和0.3％的硬脂酸镁，制粒，压片，制成片剂。
实施例13
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入12倍量的注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例14
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入8倍量的注射用水，过滤，冻干，得冻干粉剂。
实施例15
取15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(化合物1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(化合物2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(化合物3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(化合物4)中任意一种化合物作为原料药，加入12倍量纯净水和0.05％苯甲酸钠，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。
为了进一步验证本发明的可行性及有效性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
(一)化合物的分离与鉴定考察
1仪器及试剂、材料
1.1仪器及试剂
见表1。
表1仪器与试剂名称、型号及来源
实验中涉及显色剂有三种，分别为10％硫酸-无水乙醇溶液，5％磷钼酸-无水乙醇溶液和2％碘-硅胶。
1.2材料
实验药材于2018年8月采自贵州省水城县都格乡，经贵州中医药大学赵俊华教授鉴定，确定该植物为凤尾蕨科(Pteridaceae)凤尾厥属(Pteris L)植物多羽凤尾蕨PterisdecrescensChrist，植物凭证标本存放于贵州中医药大学中药民族药重点实验室。
HL-60白血病细胞、A549肺癌细胞、HepG2肝癌细胞、SW480结肠癌细胞均购自美国ATCC公司；胎牛血清(批号：1706126)、RMPI-1640培养基(批号：0023019)、DMEM培养基(批号：0024719)、胰酶(批号：0023518)、双抗(批号：1936917)、磷酸缓冲液PBS(批号：0044818)、二甲基亚砜(批号：B821BA0018)均购自BI公司；顺铂(批号：N1001A)、紫杉醇(批号：D1106A)均购自美仑生物科技公司；MTS试剂盒(批号：0000219904)购自美国Promega公司；凝血质控血浆(批号：093B-J186A)、APTT试液(批号：20002745)、PT试液(批号：10002706)、TT试液(批号：30002697)、CaCl2(批号：031N-J073A)均购买自德国TECO公司；Tris-HCl(美国Amresco公司，批号20160118)。
2提取与分离
1)药材的提取与粗分离
多羽凤尾蕨药材经自然阴干后重54.2kg，粉碎成粗粉(80～100目)，常温下用95％的甲醇浸泡5次，每次6天，合并5次浸泡液，减压回收得到稠浸膏约8.9kg。总浸膏用温水溶解(水相)，采用液-液萃取法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取(有机相和水相比例为1∶1)，萃取后分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位194g记为A部分，正丁醇部位997g记为B部分。
2)乙酸乙酯部位分离和纯化
将乙酸乙酯部位(A)用少量甲醇溶解，称取150g聚酰胺拌样，采用MCI柱层析，以甲醇-水为洗脱系统(1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，得到A1～A5共5个部分。
A4部分样品分离：A4部分样品34g，加入适量甲醇使之溶解，称取35g硅胶(100～200目)拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以二氯甲烷洗脱，再以二氯甲烷-甲醇系统(50∶1，25∶1，10∶1，7∶1，5∶1，2∶1)梯度洗脱，最后用甲醇洗脱。经TLC检测后，合并相近流分得到A4-1～A4-5共5个部分。A4-4部分，采用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇系统(20∶1)洗脱，得到A4-4-1、A4-4-2两个部分，A4-4-2发现有晶体析出，经过反复重结晶得到化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)。
3)正丁醇部位分离和纯化
取正丁醇部分浸膏997g，采用MCI柱层析，以甲醇-水为洗脱系统(1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，流分通过薄层层析检测合并为B1-B4个部分。
B1(39.0g)的分离：将B1以30～60目聚酰胺进行拌样(1∶1)，通过C18反相柱，以甲醇-水(3∶7，5∶5，7∶3，1∶0)为洗脱剂进行梯度洗脱，通过TLC检测合并得到B1-1～B1-3。B1-1(23.3g)通过硅胶柱色谱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯10∶1，7∶1，5∶1，1∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B1-1-1～B1-1-4。B1-1-4(6.9g)依次通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/乙酸乙酯20∶1)及C18反相柱色谱(甲醇-水5∶5，7∶3，1∶0)分离得到化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)。
B2部分样品分离：B2部分样品212g，加入适量甲醇使之溶解，称取200g硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以乙酸乙酯洗脱，再以乙酸乙酯-甲醇系统(50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1)梯度洗脱，最后用甲醇洗脱。经TLC检测后，合并相近流分得到B2-1～B2-4共4个部分。B2-2部分，采用硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇系统(30∶1)洗脱，得到B2-2-1、B2-2-2共2个部分，B2-2-1经过反复硅胶柱层析得到化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)。
B-2-2(9.6g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/甲醇20∶1，10∶1，5∶1，3∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-1～B2-2-2。B2-2-2(6.7g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯5∶1，3∶1，1∶1，1∶3进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-2-1～B2-2-2-4。Fr.B2-2-2-2(1.6g)通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯2∶1，1∶1，1∶3，1∶5进行梯度洗脱得到化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)。
3多羽凤尾蕨中4个化学成分的结构鉴定
化合物1：无色透明晶体(甲醇)；熔点(mp)：119.6～122.4℃；旋光度：(c 0.1637，甲醇)；易溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，不溶于石油醚。TLC检测：展开系统为二氯甲烷：甲醇10﹕1，Rf值为0.45，在254nm紫外光下有微弱荧光；以10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，加热(105℃)显蓝紫色斑点。
根据质谱(HR-ESI-MS)显示，[M+Na]+m/z 485.25024(calcd for C26H38O7Na，485.25097)，从而确定该化合物的分子式为C26H38O7，不饱和度为8。红外光谱(IR)显示，在1647.2cm-1处有吸收提示可能含有双键。由1H-NMR显示：δH 1.26(3H，s)、0.79(3H，s)提示该化合物可能含有2个甲基。根据13C-NMR与DEPT的信号显示，该化合物有26个碳，其中2个甲基[δC 29.7、16.7]，10个亚甲基[δC 105.4、62.4、39.6、39.4、37.4、33.5、26.5、25.2、23.7、20.5]，8个次甲基[δC 120.3、95.6、78.8、78.5、74.0、71.1、47.6、37.9]，以及6个季碳[δC178.1、153.7、139.6、45.4、44.1、38.5]。其中δC 178.0推测可能含有1个酯羰基，δC 153.7、139.6、120.3、105.4推测可能含有2对双键，δC 95.6、78.8、78.5、74.0、71.1、62.4推测含有1个糖基。查阅文献发现，该化合物与villanovane I[5]较为相似，较文献多了2个(δC153.7、105.4)低场的碳，且δC 153.7为季碳，δC 105.4为亚甲基，所以推测为1组双键的碳信号，再结合HMBC、1H-1H COSY谱等数据，推测出该双键连接在C-15上。
在HMBC谱中，H-13与C-12、C-14、C-15相关，H-11与C-16有相关信号，H-12与C-15、C-16、C-17相关，H-16与C-8、C-9、C-11、C-15、C-17相关，H-17与C-12、C-15、C-16相关；因此推测C-15与C-9相连，C-16与C-13相连，且C-17是连接在C-16上。
结合NOESY确定氢的构型。在NOESY谱图中，H-5与H-3β、H-18有相关信号，故H-5为β构型；H-18与H-5相关，故H-18为β构型；H-12与H-11β、H-14β相关，故H-12为β构型，H-20与H-1α、H-3α相关，故H-20为α构型。将化合物溶于少量甲醇溶剂中于室温下进行晶体培养，并用X-ray单晶衍射仪对该晶体的结构进行了研究，晶胞图见图2，进一步佐证了化合物的结构，综上确定化合物1的结构式如图1，通过SciFinder数据库检索并查阅文献，确定该化合物为新化合物，命名为：15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯。该化合物HMBC、1H-1H COSY、NOESY谱相关信号见图3，1H-NMR、13C-NMR谱数据见表2。
表2化合物1的1H-NMR、13C-NMR数据(δin ppm)
注：样品溶于氘代甲醇溶剂中，分别在600兆和150兆下测得核磁共振氢谱和碳谱数据
化合物2：白色粉末，易溶于甲醇。TLC检测：展开系统为二氯甲烷-甲醇7∶1，Rf＝0.49，在254nm紫外光下无荧光斑点，以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，加热(105℃)显紫红色斑点。高分辨质谱(HRESIMS)测试值为m/z 519.25620[M+Na]+(计算值为519.25645，C26H40O9Na)，从而确定分子式为C26H40O9。IR显示有羟基(3384cm-1)、碳基(1723cm-1)的存在。13C-NMR(CD3OD，100MHz)和DEPT谱确定该化合物有26个碳信号，且该化合物含有3个甲基δC11.7，16.4，28.9，8个亚甲基，10个次甲基和5个季碳，低场的两个季碳信号δC 226.5和δC178.0显示分别有一个酮羰基和一个羧基，δC 95.6显示为一个糖端基碳信号。1H-NMR(CD3OD，400MHz)显示有3个甲基信号δH 1.26(3H)，1.25(3H)，0.99(3H)，1个糖端基氢信号δH5.42(1H，d，J＝7.9Hz)。该化合物的碳信号与对映贝壳杉烷型二萜相似[6]。
根据H-1'(J＝7.9Hz)建立了葡萄糖的β构型，通过酸水解后HPLC分析确定糖单位为D-葡萄糖(tR＝22.424min)。根据HMBC，δH 5.42(H-1')与δC 178.0(C-19)的相关性表明，葡萄糖位于C-19，δH 4.10与δC 49.5(C-16)相关，δH 2.41、1.93、1.44、1.13与δC 71.9相关，表明羟基位于C-12，且根据NOESY，δH 4.1与δH 0.99(H-20)的相关性确立了C-12羟基的β构型。根据以上数据确定化合物2的结构式如图4，通过Scifinder数据库检索发现该化合物为新化合物，命名为12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯。该化合物HMBC、1H-1HCOSY谱相关信号见图5，13C-NMR、1H-NMR数据见表3。
表3化合物2的1H-NMR、13C-NMR数据(δin ppm)
样品溶于氘代甲醇溶剂中，分别在500兆和100兆下测得核磁共振氢谱和碳谱数据
化合物3：白色粉末/结晶，易溶于甲醇。TLC检测：展开系统为二氯甲烷-甲醇7∶1，Rf＝0.79，在254nm紫外光下有荧光斑点，以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，加热(105℃)显淡橙棕色斑点。高分辨质谱(HRESIMS)测试值为m/z 194.04660[M-H]－(计算值为194.04588，C9H8NO4)，从而确定分子式为C9H9NO4。IR显示有羟基(3359cm-1)、碳基(1647cm-1)的存在。13C-NMR(CD3OD，100MHz)和DEPT谱确定该化合物有9个碳信号，且该化合物含有1个甲基δC 10.9，1个亚甲基δC 53.3，1个次甲基δC 63.8和6个季碳，低场的两个季碳信号δC 198.1和δC164.5显示分别有一个酮羰基和一个羧基，δC 160.9，128.7，128.3，124.2四个信号推测该化合物有两对双键。1H-NMR(CD3OD，400MHz)显示有1个甲基信号δH 2.42(3H，s)。
根据HMBC显示，δH 5.20(H-6)与δC 128.7(C-8)，160.9(C-7)，198.1(C-4)相关，δH3.22(H-5)与δC 63.8(C-6)，160.9，198.1相关，δH 2.64(H-5)与δC 63.8，128.3(C-3)，128.7，160.9，198.1相关，δH 2.42(H-10)与δC 124.2(C-2)，128.3，128.7，164.5(C-9)相关。根据以上数据确定该化合物的结构如图6。此外，将化合物溶于少量甲醇中于室温下进行晶体培养，并用单晶衍射仪对该晶体的结构进行了研究，晶胞图见图8，进一步佐证了化合物的结构，通过Scifinder数据库检索发现该化合物为新化合物，被鉴定为(S)-6-hydroxy-3-met hyl-4-oxo-1,4,5,6-tetrahydrocyclopenta[b]pyrrole-2-carboxylic acid，命名为(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基。该化合物HMBC、1H-1HCOSY谱相关信号见图7，该化合物相关1H-NMR，13C-NMR数据见表4。
表4化合物3的1H-NMR、13C-NMR数据(δin ppm)
样品溶于氘代甲醇溶剂中，分别在500兆和100兆下测得核磁共振氢谱和碳谱数据
化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，微溶于乙酸乙酯。TLC检测：展开系统为二氯甲烷-甲醇7∶1，Rf＝0.53，在254nm紫外光下有微弱荧光斑点，以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，加热(105℃)显裸粉紫色斑点。高分辨质谱(HRESIMS)测试值为m/z 365.09920[M+Na]+(计算值为365.09956，C19H18O6Na)，从而确定分子式为C19H18O6。IR显示有羟基(3278cm-1)、碳基(1716cm-1)的存在。1H-NMR(400MHz，CD3OD)显示有1个甲氧基信号δH 3.33(3H，s)，δH 7.15(4H，m)，δH 6.74(4H，m)推测为芳香区氢信号。13C-NMR(100MHz，CD3OD)显示该化合物有15个碳信号，但在δC 129.8，129.7，116.1处的峰高高于其他碳信号，推测为碳信号的重叠，δC175.7，174.5显示有2个羰基。
以上数据与2,4-二(4-羟基苯基)-1,3-环丁烷-二羧酸[7]数据相似，与文献对比只多了一个碳信号δC 51.9。根据HMBC显示，δH 3.33与δC 174.5(C-10)相关，可推测一个羧基氢被甲基所取代，化合物的立体构型由NOESY确定，H-1/H-4的相关信号表明H-1与H-4有相同的空间取向；H-2/H-3的相关信号表明H-2与H-3有相同的空间取向。根据以上数据确定该化合物结构式如图9，通过Scifinder数据库检索发现该化合物为新的天然产物，命名为2,4-二(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸。该化合物HMBC、1H-1H COSY谱相关信号见图10，13C-NMR、1H-NMR数据见表5。
表5化合物4的1H-NMR、13C-NMR数据(δin ppm)
样品溶于氘代甲醇溶剂中，分别在500兆和100兆下测得核磁共振氢谱和碳谱数据
(二)抗肿瘤活性筛选
经查阅文献，发现该属其它种植物的二萜类化合物具有较好的抗肿瘤活性，尤其是母核为对映-贝壳杉烷型的二萜，如5F能有效抑制K562白血病细胞[8]，geopyxin B和geopyxin E对HepG2及Bel-7402两种肝癌肿瘤细胞具有较好抑制作用[9]。故对分离得到的化合物1～4作抗肿瘤活性筛选。
本实验采用CCK-8法对Hela宫颈癌细胞、HepG2肝癌细胞、A549肺癌细胞、SMMC-7721肝癌细胞及SW480结肠癌细胞进行筛选，每次实验均设索拉非尼作为阳性对照。
1实验原理
CCK-8法是一种基于WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，原理为在电子耦合试剂1-Methoxy PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)的作用下WST-8试剂能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物。
2实验方法
取对数生长期细胞，用0.15％胰蛋白酶消化后，加入含血清的培养液终止消化。用培养液制备密度为3×103cells/mL单细胞混悬液，以100μL/孔接种于96孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中静置培养24h后以化合物浓度为100μM给药初筛，将抑制率大于70％的化合物以50，20，10，5，2.5，1.25μM为给药浓度，培养72h后移去上清液，加入100μL 10％CCK-8工作液，继续培养2h后弃去上清液，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定光密度值(OD)。以无细胞的培养液作为空白对照，以只加DMSO的培养液孔作为阴性对照，以索拉非尼为阳性对照，每种处理均设3个复孔。利用GraphPad Prism软件分析IC50值。
3实验结果与讨论
采用CCK-8法对化合物1～4进行了抗肿瘤活性筛选。实验数据显示，化合物1～3对Hela宫颈癌细胞有一定抑制作用，其中化合物1的IC50值达到了5.705±0.646μM，化合物4对Hela细胞抑制作用较弱或无抑制作用，其IC50值均大于10μM；化合物1～4对HepG2肝癌细胞有较好的抑制作用，其IC50值在1.182～2.646μM之间；化合物1对A549肺癌细胞有一定的抑制作用，其IC50值为4.285μM，其余3个化合物对该细胞系抑制作用较弱或无抑制作用；化合物1～2对SW480结肠癌细胞有较强的抑制作用，其IC50值在0.448-0.997μM之间，其余2个化合物对该细胞系则无抑制作用。综上，化合物1～2对SW480的抑制作用与阳性对照品索拉非尼相当，其IC50值处于同一个数量级，有深入研究的价值。具体实验数据见表6。见图11至图14。
表6化合物对4种肿瘤细胞的体外细胞毒性活性研究
(三)结果
多羽凤尾蕨的甲醇常温浸提物化学成分，应用1H-NMR，13C-NMR，2D-NMR等相关波谱数据进行解析鉴定，从刺齿凤尾蕨植物中分离得到4个化合物，化合物分别为15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯(1)、12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯(2)、(S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基(3)、2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸(4)。并对4个化合物进行抗肿瘤活性筛选，化合物1～3对Hela宫颈癌细胞有一定抑制作用，其中化合物1的IC50值达到了5.705±0.646μM，化合物4对Hela细胞抑制作用较弱或无抑制作用，其IC50值均大于10μM；化合物1～4对HepG2肝癌细胞有较好的抑制作用，其IC50值在1.182～2.646μM之间；化合物1对A549肺癌细胞有一定的抑制作用，其IC50值为4.285μM，其余3个化合物对该细胞系抑制作用较弱或无抑制作用；化合物1～2对SW480结肠癌细胞有较强的抑制作用，其IC50值在0.448-0.997μM之间，其余2个化合物对该细胞系则无抑制作用。综上，化合物1～2对SW480的抑制作用与阳性对照品索拉非尼相当，其IC50值处于同一个数量级，有深入研究的价值。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献：
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[2]高燕萍,吴强,张亚梅,等.凤尾草化学成分及药理活性研究进展[J].安徽农业科学,2017,45(29):126-130.
[3]张娜,邹娟,叶江海,等.半边旗化学成分及药理活性研究进展[J].贵阳中医学院学报,2019,41(6):95-98.
[4]张超,吴繁花,唐改娟,等.半边旗的研究进展及其保护利用[J].中国农学通报,2008,24(12):485-489.
[5]Shu Yi,Liu Jie Qing,Peng Xing Rong,et al.Characterization ofditerpenoid glucosides in Roasted Puer Coffffee Beans[J].Agricultural angFood Chemistry,24,62:2631-2637.
[6]Sheng-Hong Li,Jia Wang,Xue-Mei Niu,et al.Maoecrystal V,CytotoxicDiterpenoid with a Novel C19Skeleton from Isodon eriocalyx(Dunn.)Hara[J].Org.Lett.,2004,6(23),4327-4330.
[7]李荣涛,李晋玉,孙汉董,等.金叶子的化学成分[J].云南植物研究,2005,27(5):565-571.
[8]王京滨,梁念慈,莫丽儿.半边旗中二萜类化合物5F对K562细胞MAPK活性、表达的影响[J].中国药理学通报,2002(3):294-297.
[9]王佳娜,张艳,宋丽艳,等.刺齿凤尾蕨化学成分及其体外抗肿瘤活性研究[J].中国中药杂志,2017,42(21):4159-4164.
Claims (10)
1.一种多羽凤尾蕨中的新化合物，其特征在于，所述化合物及结构式分别如下：
(1)化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)的结构式：
(2)化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)的结构式：
(3)化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)的结构式：
(4)化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)的结构式：
2.根据权利要求1所述的多羽凤尾蕨中的新化合物，其特征在于，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4在制备治疗抗肿瘤药物方面的应用。
3.根据权利要求2所述的多羽凤尾蕨中的化合物，其特征在于，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4在制备治疗人白血病、人肺癌、人肝癌、人结肠癌药物中的应用。
4.根据权利要求2或3任一项所述的多羽凤尾蕨中的新化合物，其特征在于，所述药物可加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
5.根据权利要求4所述的多羽凤尾蕨中的新化合物，其特征在于，所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂。
6.根据权利要求4所述的多羽凤尾蕨中的新化合物，其特征在于，所述液体制剂为注射制剂、口服液。
7.一种如权利要求1所述的多羽凤尾蕨中的新化合物的提取分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)药材的提取与粗分离
多羽凤尾蕨药材经自然阴干，粉碎成粗粉，过80～100目筛，常温下用2倍/次80-98％的甲醇浸泡4-6次，合并浸泡液，减压回收得到稠浸膏；稠浸膏用温水溶解作为水相，采用液-液萃取法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，有机相和水相比例为1∶1，萃取后分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部位记为A部分，正丁醇部位记为B部分；
2)乙酸乙酯部位分离和纯化
将乙酸乙酯部位用少量甲醇溶解，取聚酰胺拌样，采用MCI柱层析，以1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1的甲醇-水为洗脱系统，进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，得到A1-A5共5个部分；
A4部分样品分离：A4部分样品，加入适量甲醇使之溶解，取100～200目硅胶拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以二氯甲烷洗脱，再以50∶1，25∶1，10∶1，7∶1，5∶1，2∶1的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，最后用甲醇洗脱；经TLC检测后，合并相近流分得到A4-1～A4-5共5个部分，再将A4-4部分，采用硅胶柱层析，以20∶1的二氯甲烷-甲醇系统洗脱，得到A4-4-1、A4-4-2两个部分，A4-4-2发现有晶体析出，经过反复重结晶得到化合物1(15(8→9)-迁移-对映-贝壳杉-7,16-二烯-19-酸-β-D-吡喃葡萄糖酯)；
3)正丁醇部位分离和纯化
取正丁醇部分浸膏，采用MCI柱层析，以1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1的甲醇-水为洗脱系统进行梯度洗脱，最后以纯甲醇洗脱，流分通过薄层层析检测合并为B1～B4个部分；
B1部分样品分离：将B1以30～60目聚酰胺按1∶1进行拌样，通过C18反相柱，以3∶7，5∶5，7∶3，1∶0的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，通过TLC检测合并得到B1-1～B1-3；将B1-1通过硅胶柱色谱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯10∶1，7∶1，5∶1，1∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B1-1-1～B1-1-4；再将B1-1-4依次通过硅胶柱色谱，以二氯甲烷/乙酸乙酯20∶1为洗脱剂、C18反相柱色谱，以甲醇-水5∶5，7∶3，1∶0为洗脱剂进行分离，得到化合物4(2,4-双(4-羟基苯基)-3-(甲氧羰基)环丁烷-1-羧酸)；
B2部分样品分离：B2部分样品，加入适量甲醇使之溶解，称取100-200目硅胶拌样，采用硅胶柱色谱进行分离；先以乙酸乙酯洗脱，再以50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，1∶1的乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，最后用甲醇洗脱，经TLC检测后，合并相近流分得到B2-1～B2-4共4个部分；将B2-2部分，采用硅胶柱层析，以30∶1的乙酸乙酯-甲醇系统洗脱，得到B2-2-1、B2-2-2共2个部分，再将B2-2-1经过反复硅胶柱层析得到化合物2(12β-羟基-15-酮-对映-贝壳杉-19-酸-葡萄糖酯)；
将B-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/甲醇20∶1，10∶1，5∶1，3∶1进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-1～B2-2-2；将B2-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯5∶1，3∶1，1∶1，1∶3进行梯度洗脱，TLC检测合并得到B2-2-2-1～B2-2-2-4；再将Fr.B2-2-2-2通过硅胶柱色谱进行分离，以二氯甲烷/乙酸乙酯2∶1，1∶1，1∶3，1∶5进行梯度洗脱得到化合物3((S)-6-羟基-3-甲基-4-酮-1,4,5,6-四氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧基)。
8.根据权利要求7所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述常温下用2倍/次95％的甲醇浸泡5次。
9.根据权利要求7所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述浸提提取的时间为：每次浸渍提取4～6天。
10.根据权利要求9所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述浸提提取的时间为：每次浸渍提取5天。
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