CN1194985C - 轮叶婆婆纳的二萜类化合物及提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种轮叶婆婆纳的二萜类化合物及提取分离方法,属于从天然植物中提取二萜类化合物的技术。所述的二萜类化合物是分子式C19H20O2和分子式C19H22O2的两个化合物,结构式如下所示:上述的从轮叶婆婆纳中提取的二萜化合物具有免疫抑制活性,可以在制备具有免疫抑制作用的药物中应用,其分离方法工艺过程包括:药材粉碎、浸取、萃取和柱层析分离。本发明的优点在于所提取分离的二萜类化合物具有免疫抑制活性,方法过程简单。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物化学领域,从轮叶婆婆纳中提取的二萜类化合物及方法,属于从天然植物中提取二萜类化合物的技术。
背景技术
轮叶婆婆纳[Veronicastrum sibirica(L.)Pennell.]为玄参科婆婆纳属植物草本威灵仙的全草。玄参科(Scrophulariaceae)植物约200属3000种,广布全球各地,我国有56属(例如:婆婆纳属、来江藤属、毛蕊花属、美丽桐属等)。婆婆纳属(Veronica.)植物广泛分布于全球,主产于欧亚大陆,约250种。我国产61种,各省均有(例如:轮叶婆婆纳、细叶婆婆纳、羽叶婆婆纳、白婆婆纳、大婆婆纳等),大多数种类产于西南山地。经化学成分预试表明,轮叶婆婆纳的地下部分含有环烯醚萜甙类成分,根及根茎可能含有环烯醚萜甙、香豆精甙、黄酮甙、甾类、缩合鞣质、糖类及氨基酸等。
轮叶婆婆纳[Veronicastrum sibirica(L.)Pennell.]的全草(2kg),于2001年9月采自中国东北,由王良信教授鉴定。提取分离技术是95%乙醇提取,提取物用石油醚萃取,在经过各种硅胶柱层析和制备高效液相色谱法分离得到的化学单体。化学单体的结构鉴定是采用各种现代波谱技术特别是二维核磁共振波谱技术对未知天然有机化合物进行结构鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从轮叶婆婆纳中提取具有免疫抑制活性的二萜类化合物及方法,以期寻找免疫抑制活性强的化合物和阐明构造—活性相关基团。
本发明的是通过下述技术方案加以实现的:
从轮叶婆婆纳中提取的二萜类化合物,四个已知化合物的名称和分子式为分别为:丹参酮-I(VSZ2901),C18H12O3;二氢丹参酮-I(VSZ3504),C18H14O3;隐丹参酮(VSZ3505),C19H18O3;丹参酮-II(VSZ3604),C19H20O3;它们的结构式如下所示:
丹参酮I(VSZ2901) 二氢丹参酮I(VSZ3504)
隐丹参酮(VSZ3505) 丹参酮II(VSZ3604)
其特征在于二萜类化合物还有:一个代号为VSZ3705,分子式为C19H20O2,分子量280;另一个代号为VSZ3707,分子式为C19H22O2,分子量282;其结构式如下所示:
上述化合物的结构鉴定是通过各种有机波谱分析(1H-NMR 13C-NMR DEPT2D-NMR 1H-1H COSY,HSQC,HMBC,NOESY)及其类似化合物的波谱数据比较予以确定。
VSZ3705的波谱数据如下:[α]D 25+16.6(c0.2).UVλmax MeOH(logε):225nm(4.25),275nm(3.24),464nm(3.52).IR(KBr)νmax2962,2927,1722,1662,1626,1465,1428,1258,1232,1147,944,755.1H-NMR(CDCl3):δ7.87(1H,d,J=10.2Hz,H-1),7.50(1H,d,J=7.8Hz,H-6),7.12(1H,d,J=7.8Hz,H-7),7.09(1H,s,H-12),6.33(1H,m,H-2),3.02(1H,sept,J=6.9Hz,H-15),2.28(2H,dd,J=4.5,1.8Hz,H-3),1.29(6H,s,H3-16,17),1.17(6H,d,J=6.9Hz,H3-18,19)13C-NMR(CDCl3):δ183.2(C-11),181.5(C-14),148.0(C-5),144.9(C-13),139.9(C-12),139.5(C-9),137.2(C-10),134.4(C-2),134.2(C-8),130.6(C-6),129.2(C-7),124.7(C-1),38.0(C-3),34.0(C-4),28.3(C-16,17),26.9(C-15),21.5(C-18,19).EIMS:m/z 280(5),252(54),237(100),222(12),179(22),149(90),71(12),57(13),41(12).
VSZ3707的波谱数据如下:[α]D 25+7.8(c0.2).UVλmax MeOH(logε):220nm(4.17),260nm(3.99),450nm(3.22).IR(KBr)νmax2962,2932,1728,1660,1563,1462,1390,1260,1143,938,756.1H-NMR(CDCl3):δ7.59(1H,d,J=7.9Hz,H-7),7.11(1H,d,J=7.9Hz,H-6),7.07(1H,s,H-12),3.17(2H,t,J=6.4Hz,H-1),3.02(1H,sept,J=6.9Hz,H-15),1.80(2H,m,H-2),1.65(2H,m,H-3),1.30(6H,s,H3-16,17),1.16(6H,d,J=6.9Hz,H3-18,19)13C-NMR(CDCl3):δ182.4(C-11),181.5(C-14),149.6(C-5),145.0(C-13),144.5(C-9),139.9(C-12),134.4(C-10),133.7(C-17),133.4(C-8),127.9(C-6),37.8(C-3),34.5(C-4),31.7(C-16,17),29.7(C-2),26.9(C-15),21.5(C-18,19),19.0(C-1).EIMS:m/z 282(13),255(53),239(100),224(14),165(12),115(4),89(4),41(6).
上述的从轮叶婆婆纳中提取的二萜化合物在制备具有免疫抑制作用的药物中的应用,其特征在于,具有免疫功能。
上述的二萜化合物的制备方法,其特征是按如下步骤进行:
(1).将粉碎的轮叶婆婆纳药材,用药材5-7倍重量的95%乙醇在45-55℃温浸5-7小时,过滤,再用5-7倍重量的95%乙醇45-55℃温浸,如此提取三次,合并滤液,减压浓缩至浸膏状物;
(2).将步骤(1)得到的膏状物用3∶2的蒸馏水/石油醚于分液漏斗中进行分配,然后用石油醚萃取3-4次,萃取液减压浓缩得石油醚提取物;
(3).将上述石油醚层萃取浓缩物用硅胶柱层析分离,以7∶1,5∶1,3∶1,1∶1,1∶3的石油醚—乙酸乙酯溶剂系统,然后和100%乙酸乙酯,19∶1,10∶1,100%甲醇的乙酸乙酯—甲醇溶剂系统各2000ml进行梯度洗脱,得组分21个;
(4).对上述柱层析组分再分别经过硅胶柱层析、羟丙基葡聚糖凝胶和制备高效液相色谱法分离得到各单体化合物。
本发明的特点在于:从轮叶婆婆纳中提取分离到二萜类化合物,并经药理试验证明这些二萜类化合物均具有较强的免疫抑制活性。其提取分离方法过程简单,产物纯度高。
具体实施方式如下:
具体实施例:
将粉碎的轮叶婆婆纳药材2kg,用12kg95%乙醇在50℃温浸6小时,过滤,再用10kg95%的乙醇50℃温浸,如此提取三次,合并滤液,减压浓缩至浸膏状物0.5kg。石油醚层萃取浓缩物0.5kg用硅胶柱层析分离(800g硅胶,层析柱:60×1200mm),以石油醚—乙酸乙酯溶剂系统(7∶1,5∶1,3∶1,1∶1,1∶3),然后以乙酸乙酯—甲醇(100%乙酸乙酯,19∶1,10∶1,100%甲醇)各2000ml进行梯度洗脱,得组分21个(以VSZ0201-VSZ0221命名)。
将VSZ0215进行硅胶柱层析(硅胶60g),分别以氯仿∶正己烷(9∶1)→氯仿∶甲醇(98∶2)洗脱,通过薄层层析检测合并类似流分后,得3组分(VSZ2901-VSZ2903),将VSZ2901以甲醇重结晶后,得化学单体VSZ2901(91.6mg)。
将VSZ2902以乙腈溶解并过滤后,将溶解物用制备HPLC(Hibar RT 250-25,LiChrosorb,RP-18,乙腈)进行分离纯化,依据UV、RI检测器进行各色谱峰收集,得化学单体VSZ3504(7.0mg)和VSZ3505(17.3mg)。
将VSZ0211和VSZ0212(1.8g)合并,通过硅胶柱层析(硅胶300g,层析柱:40×800mm,氯仿/甲醇99∶1→95∶5→9∶1)进行洗脱,薄层层析检测合并类似流分后,得6组分(VSZ2201-VSZ2206)。
将VSZ2203(250mg),进行羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20,MeOH)柱层析,得5组分(VSZ2301-VSZ2305),其中VSZ2305以HPLC反相色谱(Hibar RT 250-25,LiChrosorb,RP-18,乙腈)进行进一步分离,依据UV、RI检测器进行各色谱峰收集,得化学单体VSZ3604(27mg)。
将VSZ0209(0.7g)溶于甲醇,进行Sephadex LH-20(MeOH)柱层析,得4组分(VSZ0901-VSZ0904),将其中的VSZ0903(392mg)以硅胶柱层析(硅胶60g)进一步分离纯化,以氯仿/正己烷(9∶1)洗脱,得7组分(VSZ1001-VSZ1007),VSZ1006以HPLC反相色谱(Hibar RT 250-25,LiChrosorb,RP-18,乙腈)进行进一步分离,依据RI检测器进行各色谱峰收集,得新化合物VSZ3705(63mg)和3707(8mg)。
各单体化合物的淋巴细胞转化实验如下:
淋巴细胞受ConA刺激后发生淋巴母细胞转化,OD值由0.203至0.261。各给药组与Con+cell对照组比较均显示有较强的抑制淋巴细胞转化的作用。其中药物1#(Vsz3604)、3#(Vsz3504)、4#(Vsz4806)的五个剂量组OD值随剂量的增大而降低,显示有明显的剂量依赖性,而2#(Vsz3705)、5#(Vsz3505)、6#(Vsz2901)各组OD值较Con+cell对照组OD值亦有明显的降低,但量效关系的变化梯度较不明显(结果见表)。阳性药物地塞米松组50μg/ml,OD值为0.075较Con+cell对照组OD值明显降低。以上结果说明六个二萜类化合物具有较强的免疫抑制活性。
NumberofTrial | Number ofcompound | Values of OD | ||||
81μg/ml | 40.5μg/ml | 20μg/ml | 13.5μg/ml | 4.5μg/ml | ||
1# | Vsz3604 | 0.109±0.0064 | 0.122±0.0036 | 0.132±0.0020 | 0.134±0.0042 | 0.251±0.0042 |
2# | Vsz3705 | 0.119±0.0036 | 0.128±0.0037 | 0.138±0.0049 | 0.187±0.0043 | 0.227±0.0180 |
3# | Vsz3504 | 0.104±0.0055 | 0.132±0.0038 | 0.147±0.0036 | 0.185±0.0061 | 0.259±0.0125 |
4# | Vsz4806 | 0.098±0.0053 | 0.116±0.0040 | 0.132±0.0039 | 0.166±0.0121 | 0.178±0.0074 |
5# | Vsz3505 | 0.118±0.0037 | 0.125±0.0025 | 0.129±0.0026 | 0.143±0.0041 | 0.169±0.0054 |
6# | Vsz2901 | 0.128±0.0025 | 0.137±0.0043 | 0.159±0.0028 | 0.167±0.0052 | 0.190±0.0081 |
ODdecacortin=0.075,ODcon+Cell=0.203,ODBlank=0.017,n=12
Claims (3)
2、权利要求1所述的二萜化合物在制备具有免疫抑制作用的药物中的应用。
3、一种制备权利要求1所述的二萜化合物的方法,其特征是按如下步骤进行:
(1).将粉碎的轮叶婆婆纳药材,用药材5-7倍重量的95%乙醇在45-55℃温浸5-7小时,过滤,再用5-7倍重量的95%乙醇45-55℃温浸,如此提取三次,合并滤液,减压浓缩至浸膏状物;
(2).将步骤(1)得到的膏状物用3∶2的蒸馏水/石油醚于分液漏斗中进行分配,然后用石油醚萃取3-4次,萃取液减压浓缩得石油醚提取物;
(3).将上述石油醚层萃取浓缩物用硅胶柱层析分离,以7∶1,5∶1,3∶1,1∶1,1∶3的石油醚-乙酸乙酯溶剂系统,然后和100%乙酸乙酯,19∶1,10∶1,100%甲醇的乙酸乙酯-甲醇溶剂系统各2000ml进行梯度洗脱,得组分21个;
(4).对上述柱层析组分再分别经过硅胶柱层析、羟丙基葡聚糖凝胶和制备高效液相色谱法分离得到各单体化合物。
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