CN1228334C - 抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种番荔枝内酯抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，以番荔枝种子为原料，经有机溶剂提取、萃取，制备番荔枝总内酯，并经柱层析和或反相C18填料柱精制分离，获得番荔枝抗肿瘤有效成分番荔辛，含量达到90.0%以上。本发明抗肿瘤有效成分含量高、质量稳定，药理试验表明抗肿瘤活性强，制备工艺合理、可控性强，产品收得率高。
Description
所属技术领域
本发明属植物有效成分得制备方法，主要涉及从番荔枝科(Annonaceae)植物番荔枝(Annona squamosa L.)种子中制备一种番荔枝内酯(Annonaceousacetogenins)番荔辛(squamocin)的制备方法，番荔辛为抗肿瘤有效成分。
背景技术
番荔枝是我国热带、亚热带地区引入栽培的一种果树，原产热带美州，果食用，味甜美。其种子中含有番荔枝内酯。目前从番荔枝植物中已分离到近20个此类化合物。这些天然番荔枝内酯大都有不同程度的抗肿瘤活性。其分子结构中有一个长链酯肪酸基本骨架，末端有一个α、β不饱和γ-内酯环，长链中间有0-3个四氢呋喃环以及数个含氧取代基，有5个以上手性中心，立体化学多变。该类化合物都由35个或37个碳原子组成，四氢呋喃环是抗肿瘤活性的基本骨架，邻双-四氢呋喃环化合物的活性比较强，γ-内酯环是抗肿瘤所必需的活性结构，α、β不饱和的γ-内酯环的双键减少，将降低其抗肿瘤活性；脂肪链的长度及羟基的位置与多少也都影响抗肿瘤活性。番荔枝内酯抗肿瘤作用机理较为独特，作用于细胞内的线粒体，干扰能量代谢，对能量代谢旺盛的肿瘤细胞可表现出一定的选择性。
国内外对番荔枝内酯的研究报道很多，大都停留在分离、结构确定、合成及生物活性等方面的研究，国内已有人申请专利，已有的公开专利如CN1224016A、CN1370530A，获得的产品是有效部位，至少含有二种或二种以上的成分。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种番荔枝内酯抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，不仅可提高了有效成分的质量和得率，也解决了萃取过程中的乳化问题，使生产工艺更适合工业化生产。
本发明方法通过以下技术方案实现：以番荔枝种子为原料，粉碎成粗粉，去种壳，并用水浸提，然后用有机溶剂(如乙醇、甲醇、丙酮、氯仿或乙酸乙酯)分别提取，再用有机溶剂(石油醚、正己烷、氯仿、乙酸乙酯)萃取，获得番荔枝总内酯，用正相填料柱和/或反相填料柱加压设备加压分离，将收集的所需馏分浓缩、干燥，即得本发明的具有抗肿瘤活性的单一有效成分番荔辛。
本发明提出的番荔枝总内酯的制备方法，是以番荔枝种子为原料粉碎成粗粉，在粉碎时尽量除去原料种壳，用制药工艺用水浸提，将药渣离心脱水后，用有机溶剂渗漉提取，浓缩得流浸膏，加10-30％乙醇混悬后用石油醚脱脂，减压回收除去脱脂后的混悬物中的石油醚，再用有机溶剂萃取，回收有机溶剂，加86-94％的乙醇溶解，用石油醚脱脂后，回收乙醇，即得番荔枝总内酯。
本发明提出的番荔辛的制备方法，是将获得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经300-400目的硅胶柱加压分离，用石油醚-乙酸乙酯10∶1-0∶1为洗脱剂梯度洗脱，用UV、TLC和HPLC检查、监控，收集含番荔辛的馏分，回收溶剂，即得含番荔辛的粗品，再用加压设备加压，反相填料柱加压分离，洗脱剂为甲醇一水体积比为73∶27-92∶8洗脱，收集有效成分番荔辛，回收溶剂，进一步冷冻干燥，即为有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％之间。300-400目的硅胶柱所用洗脱剂的溶剂和洗脱方法包括：石油醚(正己烷)-乙酸乙酯10∶1-0∶1洗脱或梯度洗脱，石油醚(正己烷)-氯仿12∶1-0∶1洗脱或梯度洗脱。所用的反相填料柱包括C18填料柱和C8填料柱，填料的粒径为10-80μm，所用洗脱剂和洗脱方法为：甲醇-水∶73∶27-92∶8，洗脱或梯度洗脱，乙腈-水∶74∶26-92∶8，洗脱或梯度洗脱，乙醇-水∶70∶30-90∶10，洗脱或梯度洗脱。
本发明提出的番荔辛的制备方法，是将获得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经300-400目的硅胶柱上柱加压分离，用石油醚-乙酸乙酯体积比15∶1-1∶15为洗脱剂梯度洗脱，用UV、TLC和HPLC检查、监控馏分中含番荔辛的纯度，收集有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％。300-400目的硅胶柱所用洗脱剂的溶剂和洗脱方法包括：石油醚(正己烷)-乙酸乙酯15∶1-1∶15梯度洗脱，石油醚(正己烷)-氯仿14∶1-1∶20梯度洗脱。
本发明提出的番荔辛的制备方法，是将获得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经反相填料柱加压分离，用甲醇-水体积比73∶27-92∶8为洗脱剂洗脱或梯度洗脱，收集有效成分，回收溶剂，得流浸膏，进一步冷冻干燥，即为有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％之间。
本发明提出的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，用加压设备加压，其加压范围为0-50bar(0-725psi)，流速是2.5ml/min-250ml/min，检测器波长为210-245nm。
本发明提出的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，在除去有效成分中的溶剂时，回收、浓缩温度控制在45℃以下，并且有效成分进一步冷冻干燥。
本发明提出的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，用加压设备中的紫外全波长检测器监控馏分中番荔辛的有无出现，用HPLC法测定馏分中番荔辛的纯度，收集流分中固态物番荔辛含量达到90％的馏分。
本发明提出的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，用HPLC测定有效成分番荔辛的含量，是用C18反相柱，流动相为甲醇-水(83∶17)，检测波长220nm；若用乙腈-甲醇-水(60∶28∶12)为流动相，检测波长210nm。
用本发明方法制备的抗肿瘤有效成分番荔辛，既可制成口服制剂，也能制成注射剂。
用本发明方法制备的番荔辛，其分子式C37H66O7，分子量622，为白色结晶，mp49-51℃，结构式为：
本发明的特点有：(1)用本发明方法制备，可获得高纯度的单一活性成分番荔辛。(2)番荔枝种子粗粉先用水浸提后再用乙醇提取，不仅解决了萃取过程中的乳化问题，并且提高了得率和节约了有机溶剂的用量。(3)种壳中活性成分含量极少，因此尽量除去种壳，可极大地优化生产工艺。(4)提高了产品的含量和质量。(5)更适应工业化生产，生产工艺也更加精制、稳定，更好地防止了有效成分的损失和破坏，确保了制备有效成分。
具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
总内酯的制备；取番荔枝种子5kg，粉碎成粗粉，粉碎过程中，尽量除去种壳，种子粗粉用水浸泡24小时，滤去水，用水冲洗，离心脱水后，用无水乙醇渗漉提取，42℃回收乙醇至流浸膏，加15％乙醇1.5升混悬，用石油醚脱脂，每次4000ml，共三次，合并石油醚萃取液，浓缩至3000ml，用80％乙醇1000ml萃取3次，合并80％乙醇萃取液，42℃减压回收至1000ml左右，与前述石油醚萃取后的稀醇液合并，42℃减压除去其中的石油醚，至真空度升至0.09Mpa时，冷却至室温，调得酒精度15％，用氯仿萃取四次，每次4000ml，合并氯仿萃取液，38℃减压浓缩至浸膏，加90％乙醇溶解，用石油醚萃取二次，每次2000ml，进一步脱脂，回收石油醚至800ml，用85％乙醇萃取二次，每次200ml，80％乙醇萃取液与石油醚萃取后的90％乙醇液合并，42℃浓缩至流浸膏状，冷冻干燥，得番荔枝总内酯113.6g。
实施例2
取番荔枝种子壳0.5kg，用无水乙醇渗漉提取，回收乙醇成流浸膏，用15％的乙醇混悬，用石油醚萃取三次，每次200ml，减压回收除去稀醇溶液中的石油醚后，再用氯仿萃取，回收氯仿，得浸膏24.5g，经薄层色谱和高效液相测定，有效成分含量极少。鉴于种子壳中有效成分含量很低，故可去除。
实施例3
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到117.2g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱9000ml，再用石油醚-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.7g，含量96.49％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例4
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到102.4g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8000ml，再用正己烷-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来为止，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.6g，含量95.54％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例5
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到113.1g总内酷提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用石油醚-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.9g，含量97.12％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例6
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到116.2g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用正己烷-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需成分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体4.6g，含量96.04％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例7
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到111.3g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱9000ml，再用石油醚-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需成分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体6.2g，含量91.63％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例8
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到98.94g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8000ml，再用正己烷-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来为止，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体4.9g，含量96.54％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例9
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到109.2g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用石油醚-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.7g，含量95.42％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例10
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到116.6g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用正己烷-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，C18填料粒径40-63μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需成分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.9g，含量97.64％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例11
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到99.6g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-乙酸乙酯(10∶1)溶解，进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径70×920mm，起始用石醚-乙酸乙酯(10∶1)洗脱4000ml，石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脱6000ml，石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8000ml，石油醚-乙酸乙酯(6∶4)洗脱9000ml，石油醚-乙酸乙酯(5∶5)洗脱15000ml，石油醚-乙酸乙酯(4∶6)洗脱15000ml，收集石油醚-乙酸乙酯5∶5-4∶6的流分，每份500ml，高效液相检测各流分，将所需流分合并，浓缩、冷却干燥，得到淡黄白色固体4.2g，含量93.14％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例12
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到109.4g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用甲醇-水(76∶24)750ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，填料粒径40-63μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.1g，含量93.61％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例13
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到105.1g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用乙醇-水(72∶28)750ml溶解，用C18填料柱加压分离，C18填料柱内径×长度为70×920mm，填料粒径40-63μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.7g，含量91.54％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例14
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到102.5g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用甲醇-水(76∶24)750ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，填料粒径10-70μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.1g，含量92.04％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例15
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到100.6g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用乙醇-水(72∶28)750ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，填料粒径10-70μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体4.9g，含量94.38％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例16
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到110.5g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱9000ml，再用石油醚-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.3g，含量92.97％，即为番荔枝内酯抗肿瘤有效成分。
实施例17
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到117.2g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8000ml，再用正己烷-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来为止，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.5g，含量94.46％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例18
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到116.1g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用石油醚-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.2g，含量94.35％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例19
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到104.8g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用正己烷-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用甲醇-水(76∶24)洗脱，检测波长210nm，收集所需成分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体4.7g，含量97.51％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例20
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到115.6g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-乙酸乙酯(7∶3)洗脱9000ml，再用石油醚-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用甲醇-水(76∶24)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需成分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.3g，含量92.35％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例21
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到115.0g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-乙酸乙酯(7∶3)洗脱8000ml，再用正己烷-乙酸乙酯(3∶7)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来为止，浓缩3∶7的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.4g，含量97.21％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例22
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到116.4g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用石油醚-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用石油醚-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用石油醚-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体4.4g，含量92.83％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例23
按实施案例2制备总内酯，从5kg原料得到105.3g总内酯提取物，取30g总内酯样品，用正己烷-氯仿(6∶4)200ml溶解进样，经300-400目的硅胶柱加压分离，硅胶柱内径×长度为70×460mm，起始用正己烷-氯仿(6∶4)洗脱9000ml，再用正己烷-氯仿(1∶15)洗脱，至洗脱液色淡并无所需成份洗脱下来时结束，浓缩1∶15的洗脱液至干浸膏，用乙醇-水(72∶28)500ml溶解，用C8填料柱加压分离，C8填料柱内径×长度为70×920mm，C8填料粒径10-70μm，用乙醇-水(72∶28)洗脱，检测波长220nm，收集所需流分，42℃以下除去溶剂，进一步冷冻干燥，得到白色固体5.2g，含量91.86％，即为抗肿瘤有效成分番荔辛。
实施例24
本发明番荔枝抗肿瘤有效成分进行下述药理试验。
(1)急性毒性试验
小鼠急性毒性试验，ICR小鼠，以Bliss法计算LD50和95％可信限为：
肌内注射。LD50＝0.6832(0.6174-0.7449)mg/kg
灌胃：LD50＝57.6852(47.3975-67.6183)mg/kg
(2)细胞株体外抑制作用
本发明番荔枝内酯抗肿瘤有效成分，体外对人的鼻咽癌细胞(KB)、人肺癌细胞(A540)、结肠癌细胞(HT-29)、乳腺癌多药抗药性细胞株MCF-7/ADR及敏感细胞株MCF-7、肝癌细胞Bel进行了抑制作用试验，与阿霉素比较，结果见表1。
表1 对6种人癌细胞株的体外抑制作用
| 细胞株 | 番荔辛IC50(μg/ml) | 阿霉素IC50(μg/ml) |
| KBA549HT-29MCF-7/ADRMCF-7Bel | 1.7×10-45.7×10-43.6×10-44.2×10-33.0×10-31.6×10-4 | 7.5×10-26.9×10-31.3×10-3＞102.44.3×10-2 |
结果表明本发明的有效成分对人癌细胞株的体外抑制作用比阿霉素强。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (12)
1.一种抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，以番荔枝种子为原料，粉碎成粗粉，用有机溶剂提取和萃取，获得番荔枝总内酯，再经柱层析洗脱、收集，其特征是：在用有机溶剂提取前，先去种壳，并用水浸提，获得的番荔枝总内酯，用正相填料柱和/或反相填料柱加压设备加压分离，将收集的所需馏分浓缩、干燥，即得本发明的具有抗肿瘤活性的单一有效成分番荔辛。
2.根据权利要求1所述的番荔枝总内酯的制备方法，其特征是：以番荔枝种子为原料粉碎成粗粉，在粉碎时尽量除去原料种壳，用用水浸提，将药渣离心脱水后，用有机溶剂渗漉提取，浓缩得流浸膏，加10-30％乙醇混悬后用石油醚脱脂，减压回收除去脱脂后的混悬物中的石油醚，再用有机溶剂萃取，回收有机溶剂，加86-94％的乙醇溶解，用石油醚脱脂后，回收乙醇，即得番荔枝总内酯。
3.根据权利要求1和2所述的番荔辛的制备方法，其特征是：制得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经300-400目的硅胶柱加压分离，用石油醚-乙酸乙酯10∶1-0∶1为洗脱剂梯度洗脱，用UV、TLC和HPLC检查、监控，收集含番荔辛的馏分，回收溶剂，即得含番荔辛的粗品，再用加压设备加压，反相填料柱加压分离，洗脱剂为甲醇-水体积比为73∶27-92∶8洗脱，收集权利要求1所述的有效成分番荔辛，回收溶剂，进一步冷冻干燥，即为权利要求1中的有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％之间。
4、根据权利要求1和2所述的番荔辛的制备方法，其特征是：制得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经300-400目的硅胶柱上柱加压分离，用石油醚-乙酸乙酯体积比15∶1-1∶15为洗脱剂梯度洗脱，用UV、TLC和HPLC检查、监控馏分中含番荔辛的纯度，收集权利要求1中的有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％。
5、根据权利要求1和2所述的番荔辛的制备方法，其特征是：制得的番荔枝总内酯，用加压设备加压，经反相填料柱加压分离，用甲醇-水体积比73∶27-92∶8为洗脱剂洗脱或梯度洗脱，收集权利要求1所述的有效成分，回收溶剂，得流浸膏，进一步冷冻干燥，即为权利要求1中的有效成分番荔辛，含量在90.0-99.8％之间。
6、根据权利要求1所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：所用的加压设备加压，其加压范围为0-50bar，流速是2.5ml/min-250ml/min，检测器波长为210-245nm。
7、根据权利要求1所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：除去有效成分中的溶剂时，回收、浓缩温度控制在45℃以下，并且有效成分进一步冷冻干燥。
8、根据权利要求1所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：用加压设备中的紫外全波长检测器监控馏分中番荔辛的有无出现，用HPLC法测定馏分中番荔辛的纯度，收集流分中固态物番荔辛含量达到90％的馏分。
9、根据权利要求3所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：300-400目的硅胶柱所用洗脱剂的溶剂和洗脱方法包括：
石油醚或正己烷-乙酸乙酯10∶1-0∶1洗脱或梯度洗脱石油醚或正己烷-氯仿12∶1-0∶1洗脱或梯度洗脱。
10、根据权利要求3或5所述的任一抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：所用反相填料柱包括C18填料柱和C8填料柱，填料的粒径为10-80μm，所用洗脱剂和洗脱方法为
甲醇-水：73∶27-92∶8，洗脱或梯度洗脱
乙腈-水：74∶26-92∶8，洗脱或梯度洗脱
乙醇-水：70∶30-90∶10，洗脱或梯度洗脱。
11、根据权利要求4所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：300-400目的硅胶柱所用洗脱剂的溶剂和洗脱方法包括：
石油醚或正己烷-乙酸乙酯15∶1-1∶15梯度洗脱
石油醚或正己烷-氯仿14∶1-1∶20梯度洗脱。
12、根据权利要求1和2所述的抗肿瘤有效成分番荔辛的制备方法，其特征是：用HPLC测定有效成分番荔辛的含量，是用C18反相柱，流动相为83∶17甲醇∶水，检测波长220nm；或用60∶28∶12乙腈-甲醇-水为流动相，检测波长210nm。
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