CN104478832B - 二萜化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及从昆明山海棠中分离得到的一种二萜类化合物Ⅰ，含其的药物组合物及其制备方法和医药用途。该化合物是一种二萜类化合物，体外试验表明具有显著的免疫抑制的作用，可以用来制备免疫抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及从昆明山海棠中分离得到的一种二萜类化合物Ⅰ，含其的药物组合物及其制备方法和医药用途。
背景技术
昆明山海棠Tripterygiumhypoglaucum(Level.)Hutch系卫矛科雷公藤属植物，生长于向阳山坡、路边或灌木丛中，产于云南、贵州、四川等地，通常以根和皮作为药用。一般花期为7～8月，果期为9～10月，秋、冬季均可采挖，除去泥土及杂质，晒干即可药用。自古中医用于杀虫、舒筋活络、清热解毒、祛风除湿等。临床上主要作为免疫抑制剂，用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、纤维组织炎、脉管炎、麻风反应、白血病和红斑狼疮等多种胶元性疾病及自身免疫性疾病，且效果良好。目前研究认为其有效成分为生物碱、二萜和三萜类化合物。
随着自身免疫性疾病发病率的不断提高以及器官移植技术的不断成熟，寻找高效低毒的免疫抑制剂已成为研究的热点。中药免疫抑制剂对自身免疫性疾病具有独特的治疗作用，但由于其制剂质量难以控制、作用及机制难以明确，限制了其在现代临床中的广泛应用。采用现代提取分离技术，从中药中获得免疫抑制活性单体化合物，将克服这些不足，并有望获得高效低毒的免疫抑制新药。中药免疫抑制剂的免疫抑制机制包括：抑制免疫细胞产生，抑制免疫球蛋白产生，抑制细胞因子产生，抑制补体系统活性。
发明人在对昆明山海棠去皮根部化学成分研究过程中，分离得到了一种二萜化合物Ⅰ，目前并未有文献报道，更未有该化合物的活性报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从昆明山海棠中分离得到的一种二萜类化合物Ⅰ，含其的药物组合物及其制备方法和医药用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的二萜化合物Ⅰ，
药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。
化合物Ⅰ的制备方法：昆明山海棠粉碎，95％乙醇回流提取3次，每次5h，减压浓缩得浸膏；浸膏用水混悬，乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物以硅胶柱色谱法分离，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱梯度依次为20:9:1，20:8:2，20:7:3，20:6:4，20:5:5，20:4:6，得到6个组分；组分5以硅胶柱色谱法分离，二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，梯度依次为10:1，8:1，6:1，4:1，1:1，得到5个组分；组分4经制备HPLC纯化制备，甲醇-水等度洗脱，体积比为2:1，得到纯的化合物Ⅰ。
化合物Ⅰ在制备免疫抑制剂中的应用。
上述药物组合物在制备免疫抑制剂中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物Ⅰ，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。
附图说明
图1：化合物Ⅰ结构示意图
图2：化合物Ⅰ计算ECD和实验ECD图
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都应理解为属于本发明的范围。
甲醇、乙醇、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司；60℃-90℃石油醚、二氯乙烷、乙酸乙酯购自上海苏懿化学试剂有限公司；水为纯净水。
实施例1：
去皮根部的昆明山海棠(10kg)粉碎，95％乙醇回流提取3次(3×30L)，每次5h，减压浓缩得浸膏(575g)。浸膏用水混悬(3L)，乙酸乙酯萃取3次(3×3L)，减压浓缩得乙酸乙酯提取物(230g)。乙酸乙酯提取物以硅胶柱色谱法分离，石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，梯度依次为20:9:1，20:8:2，20:7:3，20:6:4，20:5:5，20:4:6，得到6个组分。组分5(85g)以硅胶柱色谱法分离，二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，梯度依次为10:1，8:1，6:1，4:1，1:1，得到5个组分。组分4(6g)经制备HPLC纯化制备，甲醇-水等度洗脱，体积比为2:1，得到纯的化合物Ⅰ(45mg)。
化合物Ⅰ结构确证：无定型黄色粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z319.1734，综合核磁碳谱和氢谱可得分子式为C20H24O2，不饱和度为9；红外IR显示羟基(3429cm-1)、醛基(2736,1685cm-1)和碳碳双键(1654,1613cm-1)存在；1HNMR(CDCl3,δppm,600MHz)和13CNMR(CDCl3,δppm,150MHz)数据见表1。通过上述信息可初步确定化合物Ⅰ平面结构，该结构与二维谱(HSQC和HMBC)吻合；进一步通过ROESY谱确定其相对构型。绝对构型通过ECD确证，见图2。
表11HNMR和13CNMR信号归属
实施例2：
MTT法由于简单、经济、快速、无放射性污染，其检测结果与同位素掺入法有良好的一致性，可有效地应用于淋巴细胞转化。因此本发明采用MTT法，利用Balb/c小鼠脾淋巴细胞，以抑制小鼠T、B淋巴细胞增殖为靶点，对本发明化合物釆用不同浓度进行抑制细胞增殖的活性研究。
1、动物和试剂
(1)实验动物：BALB/C小鼠，购自上海实验动物中心，雄性，18-20g。
(2)实验试剂：台盼蓝溶液，购自美国Invitrogen公司、红细胞裂解液，购于碧云天生物试剂公司、ConA，购自美国Sigma公司、LPS，美国Sigma公司。
2、实验准备
(1)主要试剂制备：
10％FBS-RPMI1640完全培养液的配置：将50ml灭活的胎牛血清加到450ml的RPMI1640中，然后加5ml双抗溶液。
5mg/mlMTT溶液：200mgMTT粉末溶于40mlPBS中，搅拌溶解，在无菌条件下用用无菌滤膜过滤后，-20℃保存备用。
ConA及LPS溶液：称取定量的ConA及LPS粉末，加10％FBS-RPMI1640完全培养液溶解，配成终浓度为1mg/ml的溶液，-20℃保存备用。
(2)药品溶液制备：
化合物Ⅰ溶液制备：精密称取1mg化合物Ⅰ纯品，加入50μlDMSO溶解，然后加入950μl10％FBS-RPMI1640完全培养液，摇匀，过0.2μm无菌滤膜，配成最终浓度为1mg/ml的样品溶液。实验时，用10％FBS-RPMI1640完全培养液稀释至所需浓度。
3、实验部分
(1)化合物Ⅰ对小鼠脾淋巴T、B转化实验影响
将小鼠颈椎脱位处死，放入75％乙醇中浸泡3-5min，取出后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤。无菌取脾，放在盛有Hanks液的培养皿中，剔除脂肪组织和结缔组织。将脾组织剪成3段，用注射器针芯轻轻捻脾组织，过4层滤纸，离心(800r/min，3min)后弃上清。加5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打使细胞混匀，裂解lmin，离心(800r/min，3min)，弃上清液；然后用Hanks液洗漆2次，离心；最后加入10％FBS-RPMI1640培养液l-2ml悬浮脾细胞，加台盼蓝染色计数，制备成2×l06/ml的小鼠脾细胞悬液，细胞活性在90％以上。
于96孔培养板中，每孔加入100μl脾细胞悬液。加不同浓度化合物Ⅰ溶液各50μl，加ConA/LPS50μl，每组分别为3个复孔，同时设置对照组(同等加细胞、加刺激物不加药物)。ConA最终浓度为2.5μg/ml，LPS最终浓度为10μg/ml。培养板置于37℃5％CO2培养箱中44h，取出，加入20μl0.5mg/mlMTT溶液，继续培养4h，离心(3000r/min，10min)，用甩板法弃去上清液，加入150μlDMSO,用酶标仪于570nin读吸收值(OD)。
(2)化合物Ⅰ对小鼠脾淋巴细胞的毒性作用
将小鼠颈椎脱位处死，放入75％乙醇中浸泡3-5min，取出后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤无菌取脾，放在盛有Hanks液的培养皿中，剔除脂肪组织和结缔组织。将脾组织剪成3段，用注射器针芯轻轻捻脾组织，过4层滤纸，离心(800r/min，3min)后弃上清。加5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打使细胞混匀，裂解lmin，离心(800r/min，3min)，弃上清液；然后用Hanks液洗漆2次，离心；最后加入10％FBS-RPMI1640培养液l-2ml悬浮脾细胞，加台盼蓝染色计数，制备成2×l06/ml的小鼠脾细胞悬液，细胞活性在90％以上。
于96孔培养板中，每孔加入100μl脾细胞悬液，加不同浓度化合物Ⅰ溶液各50μl，每孔再加50μl10％FBS-RPMI1640完全培养液，每组分别为3个复孔，同时设置对照组(同等加细胞)，置于37℃5％CO2培养箱中48h。从每组3复孔中各取100μl细胞悬液，混匀，最后从混匀的细胞悬液中取出100μl加入台盼蓝染液染色，Invitrogen细胞自动计数器计数活淋巴细胞数，计算细胞存活率。
4、实验结果
(1)化合物Ⅰ对小鼠脾淋巴T、B转化实验影响
MTT检测化合物Ⅰ对ConA、LPS诱导下T、B淋巴细胞转化影响。见表2。
表2不同浓度化合物Ⅰ对ConA及LPS刺激下细胞的抑制率
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01(n＝3)
在0.1ng/ml以下不引起明显的抑制淋巴细胞增殖作用，但浓度为达到1ng/ml及以上则产生明显的抑制作用，且这种抑制作用呈现浓度依赖性。对ConA及LPS刺激的IC50分别为2.34ng/ml和1.24ng/ml。
(2)化合物Ⅰ对小鼠脾淋巴细胞的毒性作用
细胞活性存活率结果表明，在上述药物作用范围内，小鼠脾淋巴细胞的存活率与没有加药的小鼠脾淋巴细胞相当。所以，化合物Ⅰ对淋巴细胞活性的抑制作用不是由于它的毒性引起的，而是化合物Ⅰ本身的药物作用所致。
(3)倒置显微镜下观察细胞生长形态
正常的小鼠脾淋巴细胞分散均匀，个头小，不贴壁生长；而经过ConA或LPS刺激后的小鼠脾淋巴细胞会分裂出细胞，簇团生长；细胞在经过低浓度药物作用后，簇团生长细胞减少；在高浓度药物作用下，视野里几乎看不到簇团细胞。
综上表明：化合物Ⅰ在作用浓度范围内对诱导后的小鼠脾淋巴细胞表现明显的不同的抑制作用，具有免疫抑制活性。
实施例3：
注射液制剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用酒石酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例4：
粉针剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用柠檬酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例5：
粉剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用盐酸制成的盐，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例6：
片剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用乙二酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5～1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例7：
口服液制剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用硫酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例8：
胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备：
按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
Claims (5)
1.具有下述结构式的二萜化合物Ⅰ，
2.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于：昆明山海棠粉碎，95％乙醇回流提取3次，每次5h，减压浓缩得浸膏；浸膏用水混悬，乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得乙酸乙酯提取物；乙酸乙酯提取物以硅胶柱色谱法分离，60℃-90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，梯度依次为20:9:1，20:8:2，20:7:3，20:6:4，20:5:5，20:4:6，得到6个组分；组分5以硅胶柱色谱法分离，二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，梯度依次为10:1，8:1，6:1，4:1，1:1，得到5个组分；组分4经制备HPLC纯化制备，甲醇-水等度洗脱，体积比为2:1，得到纯的化合物Ⅰ。
4.权利要求1所述的化合物Ⅰ在制备免疫抑制剂中的应用。
5.权利要求2所述的药物组合物在制备免疫抑制剂中的应用。
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