CN101712670A - 一种3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物及其制备方法与应用，该化合物的制备方法为：用乙醇热回流浸提红豆杉枝叶粗粉得到总浸膏，经反相正相柱层析和凝胶、重结晶分离得到3’8”-双方芹菜素型双黄酮类化合物。本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物用于制备抑制老年斑的形成或者治疗阿尔茨海默病的药物，可以有效减少β淀粉样蛋白的产生，还可以使聚集状态的β淀粉样蛋白的解聚，对细胞无毒性，浓度高时还可以促进细胞增长；本发明制备方法工艺简单，收得率高。

Description

一种3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及双黄酮类化合物的应用领域，尤其涉及一种3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法及应用。

背景技术

老年性痴呆即阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，是一种原发性脑退行性疾病，是老年人的多发病和常见病，临床上以进行性的记忆和认知功能障碍为特征。老年性痴呆是由多种原因引起，涉及多种病理机制和多种病理表现的神经退行性疾病，其最主要病理表现是在大脑皮层和海马出现由淀粉样蛋白(β-amyloid protein)聚集形成的老年斑(senile plague，SP)，以及神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)和神经细胞缺失。研究普遍认为，老年性痴呆患者脑中β淀粉样蛋白的异常增加与沉积是启动神经元退行性病变的核心事件。1992年，Hardy等人提出了淀粉样蛋白的级联假说，认为脑内异常增多的β淀粉样蛋白和其他危险因素共同作用，启动了阿尔茨海默病的发病过程，并在其发生、发展中起关键作用。β淀粉样蛋白是由膜内淀粉样前体蛋白(amyloidprecursor protein，APP)的异常水解和错误折叠所致。β淀粉样蛋白从可溶状态到不溶状态的转变是阿尔茨海默病发病机制中的关键环节。β淀粉样蛋白在大脑中的过量生成、聚集和沉积可引起神经元钙稳态失衡，自由基大量产生，激活炎性因子，引起脑组织局部炎症等一系列反应，继而出现中枢整合功能异常。进一步研究表明，胆碱能系统的紊乱也源于β淀粉样蛋白的过度生成和聚集。国际上普遍认同，抑制β淀粉样蛋白分泌是预防及治疗老年性痴呆的有效治疗手段。

目前已有的被美国FDA批准用于治疗老年痴呆的药物均为乙酰胆碱酶抑制剂，主要包括他克林、以安理申、艾斯能、石杉碱甲。这些药物均属对症治疗药物，在显著治疗或缓解老年性痴呆的发展方面也未见突破性进展。越来越多的研究结果表明，老年性痴呆与脑内β淀粉样蛋白水平密切相关，因此从天然中草药中筛选治疗老年痴呆的中药提取物或有效成分是近年来国际老年性痴呆研究领域中的热点。

双黄酮是由二分子黄酮衍生物聚合而成的二聚物，常见的是由二分子芹菜素(或其甲醚衍生物)构成。聚合方式有三种类型：

(1)3□，8″-双芹菜素型，如银杏叶中的银杏素等；

(2)8，8″-双芹菜素型，如柏黄酮；

(3)双苯醚型：如扁柏黄酮。

目前，尚未有将3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物在抑制β淀粉样蛋白中的效果研究。

发明内容

本发明目的在于根据现有技术的不足，提供一种来源于红豆杉的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法。

本发明另一个目的在于提供上述3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的结构式如下通式所示：

其中，R₁~R₆为氢、羟基、C₁~C₁₀烷氧基团、C₂~C₁₀酰氧基团、异戊烯基或-OCH₂O，但不包括R₁~R₆同时为氢或同时为羟基的结构。

本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法为：用乙醇热回流浸提红豆杉枝叶粗粉得到总浸膏，经反相正相柱层析和凝胶、重结晶分离得到3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物。

上述制备方法优选如下步骤：

(1)取云南红豆杉枝叶风干，粉碎，过80目筛，用8倍样品量体积95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇得浸膏或浓缩液；

(2)浸膏或浓缩液中加入丙酮，按1∶1的质量比拌硅胶(80~100目)，晾干；

(3)以8倍样品质量的硅胶装柱，石油醚作洗脱剂，先用3个柱体积石油醚洗脱，除去色素等脂溶性物质，然后用5个柱体积石油醚∶丙酮洗脱；

(4)收集洗脱液，减压浓缩得到粗提物。粗提物部分继续过硅胶柱，用体积比分别为7∶3、6∶4、5∶5的石油醚∶乙酸乙酯洗脱剂依次洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，薄层层析检测，合并相同流份，共得到5个流份，将流份中含有黄色沉淀的流份5用甲醇加热溶解，反复重结晶得到3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物。

其中，所述步骤(3)中石油醚与丙酮的体积比优选55∶45。

本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物可用于制备抑制淀粉样蛋白的生成或聚集的药物。该药物除了含有本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物外，还可含有药学上可以接受的载体。

本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物还可用于制备治疗或预防阿尔茨海默病的药物。该药物除了含有本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物外，还可含有药学上可以接受的载体。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋型剂(如水等)；填充剂(如淀粉、蔗糖等)；黏合剂(如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)；湿润剂(如甘油)；崩解剂(如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠)；吸收促进剂(如季铵化合物)；表面活性剂(如十六烷醇)；吸收载体(如高岭土和皂黏土)；润滑剂(如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等)外还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以制备成各种剂型的药物，制备方法为药学领域的常规方法。例如，使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。本发明的化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆等。用于肠胃外给药时候，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊或注射剂。

本发明化合物用于制备药物时，优选含有重量比为0.1％-99.5％的化合物活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的化合物活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日计量可以是0.01-10mg/kg体重，优选0.1-5mg/kg体重。可以一次或多次使用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物用于制备抑制老年斑的形成或者治疗阿尔茨海默病的药物，可以有效减少β淀粉样蛋白的产生，还可以使聚集状态的淀粉样蛋白的解聚，预防或减少老年斑；本发明3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物来源于红豆杉，制备工艺简单易行，收得率高。

附图说明

图1为3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物对β淀粉样蛋白聚集影响示意图；

图2为3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物对β淀粉样蛋白解聚作用示意图；

图3为3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物对SH-SY5Y细胞作用示意图，其中，1为金松双黄酮与β淀粉样蛋白混合组，2为金松双黄酮组。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

从人工栽培云南红豆杉中制备金松双黄酮的方法：

人工栽培云南红豆杉枝叶，风干，粉碎80目，用8倍体积量95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇得浸膏或浓缩液。浸膏以丙酮溶解，按1∶1的质量比拌硅胶(80-100目)，晾干。称取8倍样品质量硅胶(200-300目)，以石油醚作为洗脱剂，湿法装柱，先用3个柱体积石油醚洗脱，除去色素等脂溶性物质，然后用5个柱体积石油醚∶丙酮(体积比为55∶45)洗脱。收集该部分洗脱液，减压浓缩得到粗提物A(Part A)。Part A继续过硅胶柱，用石油醚∶乙酸乙酯(体积比分别7∶3、6∶4、5∶5)作洗脱剂，得到A1-A5，5个流份，流份A5用甲醇加热溶解，反复重结晶得到高纯度的金松双黄酮，纯度可以达到98wt％。

金松双黄酮的结构如下所示：

金松双黄酮(sciadopitysin)。

实施例2

1、金松双黄酮对β淀粉样蛋白聚集以及对聚集状态A β的作用。

1.1实验方法：建立β淀粉样蛋白体外老化模型，采用硫磺素T荧光分析，通过体外孵育方式观察候选药物干预β淀粉样蛋白聚集和纤维形成作用以及对老化纤维的解聚作用。

(1)溶液配制：

硫磺素T溶液：取3mg粉末溶于甘氨酸-NaOH缓冲液(50mM，pH8.5)中，储备液浓度为1mM。工作浓度稀释为5μM；

β淀粉样蛋白溶液：β淀粉样蛋白粉末用磷酸缓冲液PBS(0.1M，pH7.4)配制成25μM的溶液，分装储存于-80℃，用时融化、稀释；

药物溶液：溶于二甲亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)，配成1mg/ml浓度，-20℃低温冰箱保存，临用时按要求(用培养液或PBS)稀释至所需浓度，使DMSO终浓度小于或等于1％(v/v)。

(2)药物对β淀粉样蛋白聚集的影响：取50μM的β淀粉样蛋白蛋白10μl，加入10μl的化合物，混匀(冰上操作)，于37℃中共同孵育48h。孵育结束后，所有样品加入5μM的Th-T磷酸缓冲液180μl，充分混合后，用96孔黑板，立即进行荧光检测。设定激发波长

发射波长

记录5min末的荧光强度(FluorescenceIntensity，FI)，重复测定三次实验所测结果的平均值代表其荧光程度。

(3)药物对已老化纤维的作用：β淀粉样蛋白在上述条件下，先孵育48h，然后加入药物再孵育48h。采用(2)中相同方法测定。

1.2实验结果：随着金松双黄酮浓度增加，对β淀粉样蛋白聚集的抑制逐渐增加，当浓度达到50μM时，抑制率达到47.7％(见图1)。当浓度为12.5μM时，金松双黄酮可以使得老化纤维明显减少，当浓度达到50μM时，可以使得50.78％的老化纤维解聚(见图2)。

2、利用SH-SY5Y细胞模型，应用MTT法评估候选金松双黄酮的细胞毒性。

(1)试验方法：MTT溶液：取125mg MTT粉末用50ml无菌PBS(0.01mmol/L，pH7.4)溶解，配成2.5mg/ml，在超声清洗仪振荡数十秒，滤过除菌，然后于4℃避光保存。两周内使用有效，最好现配现用。

SH-SY5Y细胞培养：SH-SY5Y细胞使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱进行培养。

接种细胞：将生长良好的SH-SY5Y细胞，小心弃去培养皿内的大部分细胞培养液，用0.25％胰酶消化4min后，1000rpm/min离心5min；弃去离心后上清液，重新加入DMEM，用血细胞计数板计数，转移单细胞悬液至培养皿并调整细胞密度为8×10⁴个/ml。用8道加样器吸取单细胞悬液加入96孔板中，100μl/孔，即8000个细胞/孔。

药物干预：在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后吸去上清液，分别用培养基稀释的不同浓度药物处理细胞，设立不加任何处理因素的对照组，空白孔，每个浓度设3个平行复孔，加入10μM的β淀粉样蛋白与化合物混合液100μl，与细胞于37℃，5％CO₂培养箱中作用48h。每孔加入2.5mg/ml的MTT 20μl，于37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。弃去上清，每孔加入100μl的DMSO，振荡15秒，测量490nm处的吸收值(A)。

细胞毒性评价：各组细胞存活率(％)＝(试验组A值/对照组A值)×100％，从而得出各组细胞存活率。

(2)试验结果：金松双黄酮对SH-SY5Y细胞无明显毒性，并且当浓度增加到10μM时，可以促进细胞增长(见图3)。

Claims (6)

1.一种3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物是从红豆杉枝叶中提取得到的。

2.根据权利要求1所述的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述制备方法为：用乙醇热回流浸提红豆杉枝叶粗粉得到总浸膏，经反相正相柱层析和凝胶、重结晶分离得到3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物。

3.根据权利要求2所述的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述制备方法为：

(1)取红豆杉枝叶风干，粉碎，过80目筛，用8倍样品量体积95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇得浸膏或浓缩液；

(2)浸膏或浓缩液中加入丙酮，按1∶1的质量比拌硅胶(80~100目)，晾干；

(3)以8倍样品质量的硅胶装柱，石油醚作洗脱剂，先用3个柱体积石油醚洗脱，除去色素等脂溶性物质，然后用5个柱体积石油醚∶丙酮洗脱；

(4)收集洗脱液，减压浓缩得到粗提物。粗提物部分继续过硅胶柱，用体积比分别为7∶3、6∶4、5∶5的石油醚∶乙酸乙酯作洗脱剂依次洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，薄层层析检测，合并相同流份，共得到5个流份，将流份中含有黄色沉淀的流份5用甲醇加热溶解，反复重结晶得到3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物。

4.根据权利要求3所述的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述石油醚与丙酮的体积比为55∶45。

5.权利要求1至4中任意一条权利要求所述制备方法制得的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的应用，其特征在于所述3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物用于制备抑制β淀粉样蛋白的生成或聚集的药物。

6.权利要求1至4中任意一条权利要求所述制备方法制得的3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物的应用，其特征在于所述3’8”-双芹菜素型双黄酮类化合物用于制备治疗或预防阿尔茨海默病的药物。

Images