CN115894424B - 新型双黄酮类化合物及其制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双黄酮类化合物及其制备方法、药物组合物和在制备预防和应用，本发明研究了其在制备预防或治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，结果表明，所提供的stelleranoid B和stelleranoid C具有良好的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性，且抑制活性优于阳性药加兰他敏，可用于开发相关的预防或治疗阿尔茨海默症药物。

Description

新型双黄酮类化合物及其制备方法、药物组合物和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及一种新型双黄酮类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。

背景技术

随着我国人口老龄化进程的加快,阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)对社会和家庭的影响日益突出。AD是由多种机制共同影响所致,且发病机制仍未完全阐明,临床的治疗手段大多数采用单一治疗方法,主要以改善症状为主,难以逆转疾病的进程。所以开发出既能改善症状又能逆转疾病进程的药物成为极其迫切的临床需求。

AD进展的病理生理过程涉及神经元和突触变性，主要表现为胆碱能损伤。研究表明乙酰胆碱酯酶（Acetylcholine esterase, AChE）和丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholineesterase, BChE）的抑制剂是有效的治疗药物，可通过抑制体内AChE和BChE活性，减少乙酰胆碱分解，缓解AD对生活能力和认知能力的损害。瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒（ Stellera chamaejasme L.）的干燥根，在我国分布广泛、资源丰富。药理活性研究表明，瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗病毒、抗惊厥、抗癫痫、杀虫和改善免疫系统等作用。发明人从瑞香狼毒中分离得到一种新型双黄酮类化合物，对AChE和BChE具有显著抑制活性，可作为预防和治疗AD的药物应用。

发明内容

针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种双黄酮类化合物及其制备方法、药物组合物和在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种新型双黄酮类化合物，其是具有如下式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：

     Ⅰ

     Ⅱ。

本发明另一方面还提供了上述双黄酮类化合物的制备方法，所述双黄酮类化合物是从瑞香狼毒中提取分离获得。

在上述技术方案中，所述双黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、取干燥的瑞香狼毒根部，加入溶剂回流提取，合并提取液后浓缩，得浸膏；

S2、将浸膏加入到8-15倍质量的水中混悬后，分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，舍弃石油醚萃取物和二氯甲烷萃取物，留存乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇洗脱，收集70-80个馏分后利用硅胶薄层层析检识，根据254nm和365 nm下观察Rf值相同的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

优选地，梯度洗脱时二氯甲烷-甲醇的体积比为100︰0、90︰10、80︰20、70︰30、60︰40、50︰50、40︰60、30︰70、20︰80、10︰90和0︰100；

优选地，选择Rf值分别为0.75-0.79、0.72-0.74、0.66-0.70、0.60-0.63、0.55-0.58、0.48-0.52、0.42-0.46、0.34-0.38的荧光斑点；

S3、利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集到60-70个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E1经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为9个馏分I1~I9；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E5经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到40-50个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分J1~J7；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分J2经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分K1~K7；

优选地，馏分E经ODS柱色谱梯度洗脱时，甲醇-水的体积比为10︰90、20︰80、30︰70、40︰60、50︰50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10和100︰0；

优选地，馏分E1经ODS柱色谱梯度洗脱时，甲醇-水的体积比为30 : 70、40 : 60、50 : 50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0；

优选地，馏分E5经ODS柱色谱梯度洗脱时，甲醇-水的体积比为10︰90、20︰80、30 :70、40 : 60、50 : 50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0；

优选地，馏分J2经ODS柱色谱梯度洗脱时，甲醇-水的体积比为20︰80、30 : 70、40: 60、50 : 50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0；

S4、以乙腈-水为流动相，采用HPLC法，利用C₁₈色谱柱在馏分K3中制备得到如式Ⅰ的双黄酮类化合物；以乙腈-水为流动相，采用HPLC法，利用C₁₈色谱柱在馏分I6中制备得到如式Ⅱ的双黄酮类化合物。其中，流动相乙腈-水的体积比为（38：62）-（43：57），优选为40 :60。

在本发明的具体实施方式中，步骤S4中，

在HPLC法分离馏分K3时所用的流动相中，乙腈和水的体积比为（38：62）-（43：57），且结构如式I所示的双黄酮类化合物的保留时间为25-27 min；

和/或，在HPLC法分离馏分I6时所用的流动相中，乙腈和水的体积比为（38：62）-（42：58），且结构如式II所示的双黄酮类化合物的保留时间为22-24 min。

在本发明的具体实施方式中，步骤S3中，

将馏分E经ODS柱色谱，使用体积比为（10：90）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱，收集到60-70个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10；

和/或，将馏分E1经ODS柱色谱，使用体积比为（30：70）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为9个馏分I1~I9；

和/或，将馏分E5经ODS柱色谱，使用体积比为（10：90）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱收集到40-50个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分J1~J7；

和/或，将馏分J2经ODS柱色谱，使用体积比为（20：80）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分K1~K7。

在本发明的具体实施方式中，步骤S2中，将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用体积比为（100：0）-（0：100）的二氯甲烷-甲醇洗脱，并收集70-80个馏分后利用硅胶薄层层析检识，根据254 nm和365 nm下观察Rf值相同的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

在本发明的具体实施方式中，步骤S1中，所述溶剂为90-98V%的乙醇水溶液，且其加入质量为瑞香狼毒的8-10倍，回流提取的次数为2-4次，每次提取1-3h。

本发明又一方面还提供了上述双黄酮类化合物的药物组合物。

具体地，在上述技术方案中，所述药物组合物包括增效剂和药效学上可接受的载体或赋形剂。也就是说，含有作为活性成份的本发明的双黄酮类化合物和常规药物赋形剂或辅剂或载体的药物组合物亦包含在本发明内。

具体地，在上述技术方案中，所述增效剂为以下物质中的任一种或多种的组合：

多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、他克林衍生物、亚甲蓝、石杉碱甲、美金刚胺、盐酸金刚烷胺、左旋多巴、卡比多巴、盐酸苄丝肼、盐酸司来吉兰、盐酸苯海索、托卡朋、甲磺酸溴隐亭、甲磺酸培高立特、甲磺酸苯扎托品、罗匹尼罗、普拉克、左旋丁基苯酞和二苯乙烯苷等。

具体地，在上述技术方案中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、冲剂、滴丸或微丸。

本发明再一方面还提供了上述双黄酮类化合物在制备预防或治疗AD药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明提供了一种目前尚未见报道的双黄酮类化合物，并进一步提供了一种操作简单、重现性好、提取纯度高的从瑞香狼毒中提取获得该双黄酮类化合物的方法；

（2）试验结果表明，本发明所提供的双黄酮类化合物对乙酰胆碱酯酶（简称AChE）和丁酰胆碱酯酶（简称BChE）具有良好的抑制活性，且抑制活性优于阳性药加兰他敏，可以作为预防和治疗AD中的药物应用。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的化合物1的HR-ESI-MS谱；

图2为本发明实施例1所制得的化合物1的¹H NMR谱（400 MHz，DMSO- d ₆）；

图3为本发明实施例1所制得的化合物1 的¹³C NMR谱（100 MHz，DMSO- d ₆）；

图4为本发明实施例2所制得的化合物2的HR-ESI-MS谱；

图5为本发明实施例2所制得的化合物2的¹H NMR谱（400 MHz，DMSO- d ₆）；

图6为本发明实施例2所制得的化合物2 的¹³C NMR谱（100 MHz，DMSO- d ₆）。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。

本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种双黄酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、称取瑞香狼毒干燥根59 kg，加入质量为瑞香狼毒10倍量的95 V%的乙醇水溶液作为溶剂回流提取三次，每次提取2 h，合并提取液后浓缩，得到9.2 kg浸膏；

S2、将浸膏（9.2 kg）加入到其10倍质量的水（92 L）中混悬后，分别用混悬液1.5倍量体积的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3次，得到1149 g石油醚萃取物（舍弃）、463 g二氯甲烷萃取物（舍弃）和3781 g乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用体积比为100︰0、90︰10、80︰20、70︰30、60︰40、50︰50、40︰60、30︰70、20︰80、10︰90和0︰100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，每1000 mL体积为1个馏分，共收集到78个馏分，利用硅胶薄层层析检识，根据254 nm和365 nm下观察Rf值分别为0.75-0.79、0.72-0.74、0.66-0.70、0.60-0.63、0.55-0.58、0.48-0.52、0.42-0.46、0.34-0.38的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

S3、利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E经硅胶柱色谱，使用体积比为10︰90、20︰80、30︰70、40︰60、50︰50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10和100︰0的甲醇-水梯度洗脱，每1000 mL体积为1个馏分，收集到66个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10，利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E5经ODS柱色谱，使用体积比为10︰90、20︰80、30 : 70、40 : 60、50 : 50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0的甲醇-水梯度洗脱，每500 mL体积为1个馏分，收集到45个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分J1~J7；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分J2经ODS柱色谱，使用体积比为20︰80、30 : 70、40 : 60、50 : 50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0甲醇-水梯度洗脱收集到52个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分K1~K7；

S4、利用HPLC法，以体积比为40 : 60的乙腈-水为流动相在馏分K3中制备得到化合物（t_R = 26 min）。本发明提供了实施例1所制得的化合物1的物理性质和检测数据，具体如下：

黄色无定型粉末；根据高分辨质谱（HR-ESI-MS，图1） m/ z 543.1294 [M – H]⁻（计算值543.1291），推测其分子量为544，结合¹H NMR（图2）、¹³C NMR谱（图3），确定其分子式为C₃₀H₂₄O₁₀，计算其不饱和度为19。

¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) 谱（图2）显示，在低场区含有2 组邻位偶合芳香氢信号[ δ _H 6.94 (2H, d,  J = 8.2 Hz)，6.59 (2H, d,  J = 8.2 Hz)，7.18 (2H, d,  J = 8.2Hz)，6.79 (2H, d,  J = 8.2 Hz)]，提示存在2个1,4-二取代苯环片段；3个单独烯烃氢信号[ δ _H5.93 (1H, s)，5.87 (1H, s)，5.79 (1H, s)]； δ _H 3.77 (1H, m)的1个连氧碳上的氢信号，以及2.14 (1H, m和2.80 (1H, m)的亚甲基上的氢信号。

¹³C NMR (100 MHz, DMSO- d ₆) 谱图（图3）显示共有30个碳信号，其中有1个羰基碳信号[ δ _C 198.2 (C-4)]，24个烯烃碳信号[ δ _C162.8 (C-5), 94.8 (C-6), 166.4 (C-7),96.0 (C-8), 154.8 (C-9), 101.4 (C-10), 128.2 (C-1'), 128.9 (C-2', 6'), 114.8(C-3', 5'), 157.4 (C-4'), 153.8 (C-5''), 95.5 (C-6''), 163.6 (C-7''), 99.9(C-8''), 153.8 (C-9), 99.5 (C-10''), 129.5 (C-1'''), 128.9 (C-2''', 6'''),114.4 (C-3''', 5'''), 157.1 (C-4''')]，3个连氧碳信号[ δ _C 81.5 (C-2, 2''), 66.4(C-3'')]。结合¹H NMR谱图，推测其可能为1分子二氢黄酮与1分子黄烷醇相连的双黄酮类化合物。

HMBC谱图中，H-3 ( δ _H 4.47)与C-2 ( δ _C 81.5)、C-1' ( δ _C 128.2)、C-8'' ( δ _C99.9)和C-9'' ( δ _C 153.8)的远程相关，H-4'' ( δ _H 2.14, 2.80)与C-2'' ( δ _C 81.5)、C-3''( δ _C 66.4)、C-9'' ( δ _C 153.8)和C-10'' ( δ _C 99.5)的远程相关，确定二氢黄酮与黄烷醇以C-3/C-8''连接。

NOESY谱图中显示H-2（ δ _H 5.60）和 H-2ʹʹ（ δ _H 5.50），H-3ʹʹ（ δ _H 3.78）相关，说明H-2和 H-2ʹʹ，H-3ʹʹ位于同一平面。化合物1的绝对构型通过ECD谱图来确定。当H-2和H-3是反式构型时，ECD谱图在322.5nm处为正Cotton效应，在284.5nm处为负Cotton效应，由此判断H-2和H-3的绝对构型为2 S，3 R。在248nm处为正Cotton效应，在236nm处为负Cotton效应，由此判断H-2''和H-3''的绝对构型为2'' R，3'' R。由此判定化合物1的绝对构型2 S，3 R，2'' R，3'' R。

综上所述，确定了新化合物（Stelleranoid B）的结构如下：

。

实施例2

一种双黄酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、称取瑞香狼毒干燥根59 kg，加入质量为瑞香狼毒10倍量的95 V%的乙醇水溶液作为溶剂回流提取三次，每次提取2 h，合并提取液后浓缩，得到9.2 kg浸膏；

S2、将浸膏（9.2 kg）加入到其10倍质量的水（92 L）中混悬后，分别用混悬液1.5倍量体积的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3次，得到1149 g石油醚萃取物（舍弃）、463 g二氯甲烷萃取物（舍弃）和3781 g乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用体积比为100︰0、90︰10、80︰20、70︰30、60︰40、50︰50、40︰60、30︰70、20︰80、10︰90和0︰100的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，每1000 mL体积为1个馏分，共收集到78个馏分，利用硅胶薄层层析检识，根据254 nm和365 nm下观察Rf值分别为0.75-0.79、0.72-0.74、0.66-0.70、0.60-0.63、0.55-0.58、0.48-0.52、0.42-0.46、0.34-0.38的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

S3、利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E经硅胶柱色谱，使用体积比为10︰90、20︰80、30︰70、40︰60、50︰50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10和100︰0的甲醇-水梯度洗脱，每1000 mL体积为1个馏分，收集到66个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10，利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E1经ODS柱色谱，使用体积比为30：70、40：60、50：50、60︰40、70︰30、80︰20、90︰10、100︰0的甲醇-水梯度洗脱，每500 mL体积为1个馏分，收集到52个馏分后，利用薄层色谱检识合并为9个馏分I1~I9；

S4、利用HPLC法，以体积比为40 : 60的乙腈-水为流动相在馏分I6中制备得到化合物（t_R = 23 min）。

本发明提供了实施例2所制得的化合物2的物理性质和检测数据，具体如下：

棕色无定型粉末；根据高分辨质谱（HR-ESI-MS，图4） m/ z 543.1295 [M – H]⁻（计算值543.1291），推测其分子量为544，结合¹H NMR（图5）、¹³C NMR谱（图6），确定其分子式为C₃₀H₂₄O₁₀，计算其不饱和度为19。

¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) 谱（图5）显示，在低场区含有2 组邻位偶合芳香氢信号[ δ _H 7.05 (2H, d,  J = 8.4 Hz)，6.65 (2H, d,  J = 8.4 Hz)，7.05 (2H, d,  J = 8.4Hz)，6.69 (2H, d,  J = 8.4 Hz)]，提示存在2个1,4-二取代苯环片段；3个单独烯烃氢信号[ δ _H 5.90 (1H, s)，5.87 (1H, s)，5.79 (1H, s)]； δ _H 5.79 (1H, d,  J = 1.5 Hz)，5.65(1H, d,  J = 11.7 Hz)和4.54 (1H, m)提示存在3个次甲基信号； δ _H 3.56 (1H, m)的1个连氧碳上的氢信号，以及2.36 (1H, dd,  J = 16.0, 8.9 Hz)和2.71 (1H, dd,  J = 16.0,8.9 Hz)的亚甲基上的氢信号。

¹³C NMR (100 MHz, DMSO- d ₆) 谱图（图6）显示共有30个碳信号，其中有1个羰基碳信号[ δ _C 197.7 (C-4)]，24个烯烃碳信号[ δ _C 162.4 (C-5), 95.5 (C-6), 163.2 (C-7),95.5 (C-8), 154.3 (C-9), 101.3 (C-10), 129.2 (C-1'), 128.2 (C-2', 6'), 114.4(C-3', 5'), 156.9 (C-4'), 162.4 (C-5''), 94.3 (C-6''), 165.5 (C-7''), 100.0(C-8''), 154.3 (C-9), 99.5 (C-10''), 128.3 (C-1'''), 128.1 (C-2''', 6'''),114.2 (C-3''', 5'''), 156.5 (C-4''')]，3个连氧碳信号[ δ _C 81.4 (C-2), 81.0 (C-2''), 66.1 (C-3'')]。结合¹H NMR谱图，推测其可能为1分子二氢黄酮与1分子黄烷醇相连的双黄酮类化合物。

HMBC谱图中，H-3 ( δ _H 4.54)与C-2 ( δ _C 81.4)，C-1' ( δ _C 129.2)，C-8'' ( δ _C100.0)和C-9'' ( δ _C 154.3)的远程相关，H-4'' ( δ _H 2.36, 2.71)与C-2'' ( δ _C 81.0)，C-3'' ( δ _C 66.1)，C-9'' ( δ _C 154.3)和C-10'' ( δ _C 99.5)的远程相关，确定二氢黄酮与黄烷醇以C-3/C-8''连接。

化合物2的绝对构型通过ECD谱图来确定。当H-2和H-3是反式构型时，ECD谱图在323 nm处为正Cotton效应，在284.5 nm处为负Cotton效应，由此判断H-2和H-3的绝对构型为2 S，3 R，在247.5 nm处为正Cotton效应，在234.5 nm处为负Cotton效应，由此判断H-2和H-3的绝对构型为2'' R，3'' S。由此判定化合物2的绝对构型2 S，3 R，2'' R，3'' S。

综上所述，确定了新化合物（Stelleranoid C）的结构如下：

。

为了更好地理解本发明的实质，下面结合药理试验及结果来说明上述双黄酮类化合物在制药领域中的新应用。

试验例

本试验例公开了上述化合物Stelleranoid B和Stelleranoid C的AChE和BChE抑制活性实验。

（1）实验材料和仪器

HEK-293细胞株购自中国科学院细胞典藏库（上海）；

DMEM培养基、PBS 缓冲液、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；

CCK8细胞活性检测试剂盒（美国MCE公司）；

DMSO（美国Sigma公司）；

96孔板（美国corning公司）；

5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）、AChE、BChE、加兰他敏（Galanthamine）（上海源叶生物科技有限公司）；

二氧化碳细胞培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；

全波长酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；

BIOFUGE STRATOS离心机（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；

IX73倒置电子显微镜（日本Olympus公司）；

移液器（德国Eppendorf公司）；

超净工作台、离心管、吸管等相关耗材。

（2）细胞复苏及培养

取出液氮中标记好的HEK-293细胞冻存管，立即投入37℃水浴锅中，尽量于1 min内完成快速解冻融化；对冻存管进行酒精消毒后，将管中冻存液转入15 mL无菌离心管，并加入相应的培养基，使之混匀，再离心去除上清液；重复上述步骤一次进行洗涤，随后加10mL培养液混匀重悬细胞，再将其转移至10 mL培养皿内，并放于 37℃、 5%CO₂的恒温培养箱中培养。

当细胞密度达到70%-80%时，将其传代；先吸去旧的培养基，加入PBS 洗涤2次，在培养皿中加入含EDTA的胰蛋白酶并放置37 ℃培养箱3min，随后加入培养基终止消化，1000rpm离心5min，吸去消化液后，重新加入含血清的培养基并反复吹打细胞，形成细胞悬液，最后根据细胞数量，将其转移到新的培养皿中，完成细胞传代。

（3）CCK-8法评价细胞活性

将HEK-293细胞分别以1×10⁴细胞/孔铺板于96孔板，每组6个复孔，铺板后培养24小时，将化合物Stelleranoid B和Stelleranoid C溶解后稀释至100 μM处理细胞后再37℃下处理48 h，再加入CCK-8试剂盒10 μL, 2 h后利用酶标仪检测450 nm处吸光度值，并计算细胞存活率。

（4）AChE抑制活性测定

将浓度梯度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.063 μM的Stelleranoid B、Stelleranoid C、PBS、AChE混合于96孔板，在室温反应20 min。然后加入底物和显色剂DTNB在37 ℃孵育20 min形成黄色物质，用酶标仪在412 nm处测定吸光度，以加兰他敏作为阳性对照。计算AChE抑制活性I%公式如下：

I% = [1-(C₁-C₂)/(B₁-B₂)] × 100%

式中：C₁为样品和酶溶液的吸光度值；C₂为样品溶液和缓冲液的吸光度值；B₁为酶溶液和缓冲液的吸光度值；B₂为缓冲液的吸光度值。

（5）BChE抑制活性测定

将浓度梯度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.063 μM的Stelleranoid B、Stelleranoid C、PBS、BChE混合于96孔板，在室温反应20 min。然后加入底物和显色剂DTNB在37 ℃孵育20 min形成黄色物质，用酶标仪在412 nm处测定吸光度，以加兰他敏作为阳性对照。计算BChE抑制活性I%公式如下：

I% = [1-(C₁-C₂)/(B₁-B₂)] × 100%

式中：C₁为样品和酶溶液的吸光度值；C₂为样品溶液和缓冲液的吸光度值；B₁为酶溶液和缓冲液的吸光度值；B₂为缓冲液的吸光度值。

结果

通过CCK-8法检测化合物Stelleranoid B和Stelleranoid C的细胞活性，表明100μM浓度水平下无体外毒性（细胞生存率均大于95 %）。

表1. Stelleranoid B和Stelleranoid C的AChE和BChE抑制活性筛选结果

体外AChE和BChE抑制活性试验结果表明，化合物Stelleranoid B和StelleranoidC对AChE和BChE具有显著的抑制作用，其抑制活性显著优于阳性药加兰他敏（Galanthamine），且抑制强度顺序为Stelleranoid B＞Stelleranoid C＞Galanthamine，表明本发明所述的双黄酮类化合物是天然产物中AChE和BChE抑制活性较强的分子，因此在防治AD的候选前体药物中具有开发前景。

综上，本发明所述的双黄酮类化合物具有优于抗AD一线用药加兰他敏的AChE和BChE抑制活性，可以作为预防和治疗AD的药物前体应用。

对比例1

本发明对比例1提供了一种双黄酮类化合物的制备方法，其步骤与实施例1类似，区别仅在于，步骤S3中，将馏分E1和E5分别经ODS柱色谱时，使用体积比为20：80的甲醇-水进行洗脱。

结果显示，无法制备得到化合物1和2。

对比例2

本发明对比例2提供了一种双黄酮类化合物的制备方法，其步骤与实施例1类似，区别仅在于，步骤S4中，在HPLC法分离馏分I6和K3时所用的流动相中，乙腈和水的体积比为30：70。

结果显示，无法制备得到化合物1和2。

应用例1

本发明应用例公开了一种以Stelleranoid B为原料药的胶囊剂，其组份如下：

Stelleranoid B  18.0 mg

淀粉   6.0 g

焦亚硫酸氢钠  0.2 g

硬脂酸镁  0.2 g

无水乙醇  100 mL

制成  100粒。

具体制备过程如下：

取Stelleranoid B和淀粉、焦亚硫酸氢钠混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。

应用例2

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid C为原料药的颗粒剂，其组份如下：

Stelleranoid C   20.0 mg

淀粉  6.0 g

亚硫酸氢钠  0.2 g

硬脂酸镁  0.2 g

无水乙醇100 mL；

制成  100袋。

具体制备过程如下：

取Stelleranoid C与淀粉、亚硫酸氢钠混匀后，加入无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装袋。

应用例3

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid B为原料药的口服液，其组份如下：

Stelleranoid B   20.0 mg

蔗糖  3.0 g

亚硫酸氢钠  0.2 g

对羟基苯甲酸甲酯  0.2 g

碳酸氢钠  0.1 g

注射用水  1000 mL；

制成  100支。

具体制备过程如下：

上述组分混匀后，采用口服液常规制备方法，分装即可。

应用例4

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid C分别为原料药的注射剂，其组份如下：

Stelleranoid C  22.0 mg

维生素C  0.2 g

氯化钠   6.0 g

碳酸氢钠  0.1 g

注射用水  1000mL；

制成  100支。

具体制备过程如下：

上述组分混匀后，采用注射剂常规制备方法，即可得100支。

应用例5

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid B和加兰他敏为原料药的片剂，其组份如下：

Stelleranoid B  22.0 mg

加兰他敏  4.0 g

羟丙基甲基纤维素  18.0 g

滑石粉  0.4 g

乳糖  0.2 g

硬脂酸镁  0.2 g

无水乙醇  100 mL；

制成  100片。

具体制备过程如下：

取Stelleranoid B、加兰他敏和羟丙基甲基纤维素、滑石粉、乳糖、硬脂酸镁混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，压片。

应用例6

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid C和利斯的明为原料药的胶囊剂，其组份如下：

Stelleranoid C  25.0 mg

利斯的明  3.0 g

淀粉  6.0 g

焦亚硫酸氢钠  0.2 g

硬脂酸镁  0.2 g

无水乙醇  100 mL；

制成  100粒。

具体制备过程如下：

取Stelleranoid C、利斯的明和淀粉、焦亚硫酸氢钠混匀后，加入无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。

应用例7

本发明应用例公开了一种以化合物Stelleranoid B和石杉碱甲为原料药的注射剂，其组份如下：

Stelleranoid B  24.0 mg

石杉碱甲  3.0 g

维生素C   0.2 g

氯化钠  6.0 g

碳酸氢钠  0.1 g

注射用水  1000 mL；

制成  100支。

具体制备过程如下：

上述组分混匀后，采用注射剂常规制备方法，即可得100支。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种新型双黄酮类化合物，其特征在于，

其具有如下式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：

Ⅰ

Ⅱ。

2.权利要求1所述的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述双黄酮类化合物是从瑞香狼毒中提取分离而获得；

其包括以下步骤：

S1、取干燥的瑞香狼毒根部，加入溶剂回流提取，合并提取液后浓缩，得浸膏；

S2、将浸膏加入到8-15倍质量的水中混悬后，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，舍弃石油醚萃取物和二氯甲烷萃取物，留存乙酸乙酯萃取物，将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，根据254 nm和365nm下观察Rf值相同的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

S3、利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集到60-70个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E1经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为9个馏分I1~I9；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分E5经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到40-50个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分J1~J7；利用HPLC-UV追踪目标化合物紫外吸收选择馏分J2经ODS柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分K1~K7；

S4、以乙腈-水为流动相，采用HPLC法，利用C₁₈色谱柱在馏分K3中制备得到如式Ⅰ的双黄酮类化合物；以乙腈-水为流动相，采用HPLC法，利用C₁₈色谱柱在馏分I6中制备得到如式Ⅱ的双黄酮类化合物；

步骤S4中，在HPLC法分离馏分K3时所用的流动相中，乙腈和水的体积比为（38：62）-（43：57），且结构如式I所示的双黄酮类化合物的保留时间为25-27 min；

在HPLC法分离馏分I6时所用的流动相中，乙腈和水的体积比为（38：62）-（42：58），且结构如式II所示的双黄酮类化合物的保留时间为22-24 min；

步骤S3中，将馏分E经ODS柱色谱，使用体积比为（10：90）-（100：0）的甲醇-水梯度洗脱，收集到60-70个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并为10个馏分E1~E10；

将馏分E1经ODS柱色谱，使用体积比为（30：70）-（100：0）的甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为9个馏分I1~I9；

将馏分E5经ODS柱色谱，使用体积比为（10：90）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱收集到40-50个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分J1~J7；

将馏分J2经ODS柱色谱，使用体积比为（20：80）-（100： 0）的甲醇-水梯度洗脱收集到50-60个馏分后，利用薄层色谱检识合并为7个馏分K1~K7。

3.根据权利要求2所述的双黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，将乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，使用体积比为（100：0）-（0：100）的二氯甲烷-甲醇洗脱，并收集70-80个馏分后利用硅胶薄层层析检识，根据254nm和365 nm下观察Rf值相同的荧光斑点和10%硫酸香草醛显色为黄色的斑点结果合并相似馏分依次得到8个馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G和H；

和/或，步骤S1中，所述溶剂为90-98V%的乙醇水溶液，且其加入质量为瑞香狼毒的8-10倍，回流提取的次数为2-4次，每次提取1-3h。

4.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的双黄酮类化合物。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，其还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括增效剂；所述增效剂为以下物质中的任一种或多种的组合：多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、他克林衍生物、亚甲蓝、石杉碱甲、美金刚胺、盐酸金刚烷胺、左旋多巴、卡比多巴、盐酸苄丝肼、盐酸司来吉兰、盐酸苯海索、托卡朋、甲磺酸溴隐亭、甲磺酸培高立特、甲磺酸苯扎托品、罗匹尼罗、普拉克、左旋丁基苯酞和二苯乙烯苷。

7.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、冲剂、滴丸或微丸中的任一种。

8.权利要求1所述的双黄酮类化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。

9.权利要求4-7任一项所述的药物组合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。

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