CN103288903B

CN103288903B - 一种从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷的方法

Info

Publication number: CN103288903B
Application number: CN201310240392.4A
Authority: CN
Inventors: 李爱峰; 张永清; 柳仁民; 孙爱玲
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103288903A

Abstract

本发明涉及从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷类成分的方法，是以栝楼茎叶为原料，经过下述步骤：（1）栝楼茎叶粗提物的制备；（2）萃取；（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到高纯度的3种黄酮苷类成分，分别是木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害,综合成本低。

Description

一种从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷的方法

技术领域

本发明属于化工领域，具体是涉及一种从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷（木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷）的方法。

背景技术

葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Marim.）和双边栝楼（Trichosanthes rosthorinii Harms）是中国药典规定的瓜蒌药材的原植物，其果实、果皮、种子和块根分别作瓜蒌、瓜蒌皮、瓜蒌子和天花粉入药。栝楼茎叶味酸、性寒、无毒，归肝、脾经，具有清热解暑的功效，可治疗中热伤暑、外感头热、头痛发热之症，药理实验表明其提取液能杀死体内腹水型癌细胞，具有抗癌作用。

有关栝楼的化学成分研究的报道很多，但是涉及栝楼茎叶的研究报道非常少。据文献报道葫芦科植物的茎叶富含黄酮类成分，该类成分具有广泛的生物活性，对心血管系统、消化系统等有显著的药效，且具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节、抗衰老、镇痛及保肝等多种药理作用。但是目前葫芦科植物的茎叶并没有得到充分的利用，大部分作为废弃物被丢弃，造成资源的极大浪费。为了深入研究栝楼茎叶的化学成分，开发新的药用资源，

本发明提供了一种简单快速的从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速的从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法。

本发明的方案如下：

从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法，其步骤为：

（1）栝楼茎叶粗提物的制备：取粉碎好的栝楼茎叶，用乙醇-水溶液加热回流提取，提取液经减压回收至无醇后得到粗提物；

（2）萃取：将栝楼茎叶粗提物分散于水中，先后用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位；

（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化,色谱柱为C₁₈ SMB 100柱，流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1-3小时，提取次数为2-6次。更加优选的是，提取时间为1.5-2.5小时（优选2小时），提取次数为3-5次（优选4次）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为50%-95%（优选60%-80%，更优选70%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）用甲醇-水洗脱液进行洗脱时，所用甲醇的质量浓度为42%-48%（优选45%）。前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为50%-95%（优选60%-80%，更优选70%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）分离纯化用甲醇-水溶液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱/48%甲醇-水等度洗脱/45%甲醇-水等度洗脱/42%甲醇-水等度洗脱，优选的是，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min）。

本发明涉及从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法,步骤为：（1）栝楼茎叶粗提物的制备：取粉碎好的栝楼茎叶，用乙醇-水溶液加热回流提取，提取液经减压回收至无醇后得到粗提物。（2）萃取：将栝楼茎叶粗提物分散于水中，先后用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位。（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化,色谱柱为C₁₈ SMB 100柱（400 mm×25.4 mm I. D., 10 μm，成都格莱普科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm。

本发明涉及从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷类成分的方法，是以栝楼茎叶为原料，经过下述步骤：（1）栝楼茎叶粗提物的制备：取粉碎好的栝楼茎叶，用乙醇-水溶液加热回流提取，提取液经减压回收至无醇后得到粗提物；（2）萃取：粗提物分散于水中，先后用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位；（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到高纯度的3种黄酮苷类成分，分别是木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

本发明从栝楼茎叶中分离纯化3种黄酮苷类成分的方法，首先采用萃取的方法除去强极性及非极性杂质，再用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图4-图6中看出。除此之外，还具有如下优势：

（1）粗提物经过石油醚萃取后可以除去非极性杂质，再经乙酸乙酯萃取可以使目标组分主要分布在有机相，而强极性杂质主要分布在水相，通过简单的萃取的方法就可以把粗提物中的非极性和强极性杂质除去，使混合物的组成得到简化，可以为后续的分离工作降低难度，并且可以保护半制备型高效液相色谱柱不被污染，有效地延长了色谱柱的使用寿命。

（2）使用半制备型高效液相色谱法一次分离纯化就可以同时得到3种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

（3）纯化过程中不使用对环境和人体危害大的氯仿等有机溶剂，洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。

（4）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。

附图说明

图1是栝楼茎叶粗提物的高效液相色谱图。

图2是栝楼茎叶乙酸乙酯部位的高效液相色谱图。

图3是栝楼茎叶乙酸乙酯部位的半制备型高效液相色谱图。

图4是木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图5是芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图6是柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

在图1-3中，I：木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷；II：芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷；III：柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。

实施例：从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法，其步骤为：

（1）栝楼茎叶粗提物的制备：栝楼茎叶经粉碎后，以70%乙醇为溶剂加热回流提取4次，合并提取液，减压浓缩得粗提物。

（2）萃取：将栝楼茎叶粗提物分散于水中,先后用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取, 石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位。

（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将栝楼茎叶乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化,色谱柱为C₁₈ SMB 100柱（400 mm×25.4 mm I. D., 10 μm，成都格莱普科技有限公司），流动相为甲醇-水，柱后流出液由紫外检测器在254 nm检测，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30 mL/min（优选25 mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一半制备型高效液相色谱洗脱条件

	洗脱液条件
		实施例1	48%甲醇-水等度洗脱
实施例2	45%甲醇-水等度洗脱
		实施例3	42%甲醇-水等度洗脱
实施例4	甲醇-水梯度洗脱

在实施例1中，采用48%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例2中采用45%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中采用42%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，各成分分离良好，分离时间也可以，但洗脱液由于浓度变化导致回收再利用存在较大困难。

图3是当选用实施例2体系时的色谱图，由图3可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，实施例2所得到的各个组分的纯度很高，均在98%以上，这一点可从图4-图6中看出。根据核磁共振氢谱和碳谱的测试，对所得峰组分进行鉴定，得到了3种黄酮苷类化合物。

经现代波谱数据证实所提取纯化得到的3种黄酮苷类化合物的化学结构式如下：

3个化合物的鉴定结果如下：

化合物I（木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷）：¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 13.01 (1H, s, 5-OH), 7.45 (2H, m, 6’-H, 2’-H), 6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, 5’-H), 6.79 (1H, d, J=2.0 Hz, 8-H), 6.75 (1H, s, 3-H), 6.44 (1H, d, J=2.0 Hz, 6-H), 5.08 (1H, d, J=7.2 Hz, 1’’-H )；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 181.8 (4-C), 164.4 (2-C), 162.9 (7-C), 161.0 (5-C), 156.9 (9-C), 150.0 (4’-C), 145.8 (3’-C), 121.2 (1’-C), 119.1 (6’-C), 115.9 (5’-C), 113.5 (2’-C), 105.3 (10-C), 103.0 (3-C), 99.9 (6-C), 99.5 (1’’-C) , 94.5 (8-C), 77.1 (5’’-C), 76.4 (3’’-C), 73.1 (2’’-C), 69.6 (4’’-C), 60.6 (6’’-C)。

化合物II（芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷）：¹H-NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：12.76（1H，s，5-OH），7.94（1H，d，J=8.4 Hz，2’-H，6’-H），6.93（2H，d，J=8.4 Hz，3’-H，5’-H），6.85（1H，s，3-H），6.74（1H，s，8-H），6.43（1H，s，6-H），5.06（1H，d，J=6.8 Hz，1’’-H）。¹³C-NMR（100 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：181.4（4-C），164.4（7-C），163.8（2-C），161.4（5-C），157.2（9-C），149.8（4’-C），145.7（3’-C），121.2（1’-C），118.8（6’-C），115.9（5’-C），113.2（2’-C），103.5（10-C），102.7（3-C），98.8（6 -C），93.8（8-C）。

化合物III（柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷）：¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.97 (1H, s, 5-OH), 10.01 (1H, br s, 4’-OH), 7.60 (2H, m, 6’-H, 2’-H), 6.99 (1H, s, 3-H), 6.95 (1H, d, J=8.8 Hz, 5’-H), 6.87 (1H, d, J=1.6 Hz, 8-H), 6.45 (1H, d, J=2.0 Hz, 6-H), 5.41 (1H, d, J=7.5 Hz, 1’’-H ), 3.90 (3H, s, 4’-OCH₃)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 181.9 (4-C), 164.1 (2-C), 162.9 (7-C), 161.0 (5-C), 156.8 (9-C), 150.9 (4’-C), 148.0 (3’-C), 121.3 (1’-C), 120.4 (6’-C), 115.7 (5’-C), 110.3 (2’-C), 105.3 (10-C), 103.4 (3-C), 100.0 (1’’-C), 99.5 (6-C), 95.0 (8-C), 77.2 (3’’-C) , 76.4 (5’’-C) , 73.1 (2’’-C) , 69.6 (4’’-C) , 60.6 (6’’-C) , 55.9 (-OCH₃)。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims

1.从栝楼茎叶中分离纯化黄酮苷类成分的方法，其特征是，步骤为：

（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位用半制备型高效液相色谱进行分离纯化,色谱柱为C₁₈ SMB 100柱，流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）加热回流提取时间为1-3小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1.5-2.5小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为2-6次。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为3-5次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为50%-95%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（4）分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱/48%甲醇-水等度洗脱/45%甲醇-水等度洗脱/42%甲醇-水等度洗脱。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30 mL/min。