CN104803836A - 从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺 - Google Patents

Abstract

一种从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，采用如步骤：步骤一：将干燥水翁花蕾粉碎成粗粉，加入体积分数70%乙醇，浸泡，滤过，减压浓缩至干得黄色干粉，回收溶剂再次浸泡，共提取三次，合并三次所得干粉为粗提物；步骤二：将步骤一所得粗提物无需溶解或拌入硅胶，直接上样于硅胶层析柱，用醚和酯的混合体系作为流动相进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，得到橙红色固体，即为查耳酮粗品；步骤三：将步骤二所得查耳酮粗品用无水甲醇在70℃进行重结晶，纯度达到97.8%以上；得到查耳酮精品。本发明部分浓度乙酸乙酯洗脱段的查耳酮的纯度很高，达到97%以上，稳定性很好。

Description

从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺

技术领域

本发明涉及一种从植物中提取活性成分的制备方法，准确的说是一种从水翁花蕾中制备4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的色谱提取工艺。

背景技术

水翁花蕾为桃金娘科植物水翁（ Cleistocalyx operculatus ( Roxb.) Merr. Et Perry）的花蕾。水翁花别名水香，酒翁，土槿皮，分布于广东、海南、广西、云南等地，喜温明湿润的气候，常生水旁。气微香，味苦、性寒，广东民间常用作凉茶，具有清热解毒、消食化滞的功效，在民间使用很广泛，也是“清热凉茶”中成药的主要原料。

现代研究表明花蕾中含有黄酮类、酚类、氨基酸等活性成分。天然活性提取物因其高的安全性及功能活性,已越来越得到广大消费者的认可和青睐，因此基于传统功效开发旧药的新用途的研究也成为了研究的新热点。近年来对于水翁花蕾提取物的抗炎作用、抗病毒、抗氧化作用、抗肿瘤活性、抗糖尿病作用等很多领域开展了较系统的研究。尤其是抗糖尿病的功效，具有促进胰岛素的分泌作用和胰岛损伤修复作用，并且最新研究结果又指出水翁花具有一定的保肝护肝功效，这些结果均预示水翁花提取物有望成为一种新型的治疗糖尿病的中药。而这些功效的研究主要是对水翁花的提取物之一—4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的活性研究，然活性研究的前提是提取并获得高纯度的单体成分，查阅文献却发现相对活性研究而言提取技术相对研究不足。而活性、药理作用的研究内容也仅限于细胞水平，没有完整的动物实验的研究结果报道，这引起了我们的思考：是否提取活性成分的量太少，无法实现完整的动物实验。在一些结构研究的文章中得到的单体的量大部分只有几个毫克至十几个毫克，这样的量能够满足细胞实验但无法进行动物实验。所以，活性成分的量或者说得率将决定了后面的研究手段和方法。

目前黄酮的提取纯化主要运用硅胶柱色谱、大孔树脂、葡聚糖凝胶色谱等多种固液色谱进行反复多次的洗脱分离，反复多次的洗脱分离会造成样品的损失严重，而反复多次分离也难以得到高纯单体或得到的量很少无法满足活性、药效及药理作用的后续相关研究，并且耗时较长、洗脱剂消耗量也较大。因此，植物活性成分的分离纯化技术已经成为生物活性深入研究的关键瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种无毒溶剂提取查耳酮粗品，经过硅胶柱一步分离就可得到查耳酮精品的方法，为水翁花查耳酮的深入开发利用，特别是在抗糖尿病、抗癌药物开发方面的利用提供提取技术支持。

一种从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，采用如下步骤：

步骤一：将干燥水翁花蕾粉碎成粗粉，加入体积分数70%乙醇，浸泡，滤过，减压浓缩至干得黄色干粉，回收溶剂再次浸泡，共提取三次，合并三次所得干粉为粗提物；

步骤二：将步骤一所得粗提物无需溶解或拌入硅胶，直接上样于硅胶层析柱，用醚和酯的混合体系作为流动相进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，得到橙红色固体，即为查耳酮粗品；

步骤三：将步骤二所得查耳酮粗品用无水甲醇在70℃进行重结晶，纯度达到97.8%以上；得到查耳酮精品。

所述层析柱内径为10-20cm，层析柱层径高比为1:5-8。

所述醚和酯的混合体系所用的醚类为石油醚，为60-90℃馏分段；所用的酯类为乙酸乙酯。

所述收集部分洗脱液为在339nm波长下有吸收的部分。

所述层析柱所用填料为柱层析用硅胶，粒径为200-300目。

采用上述技术方案的有益效果是：

1.本发明使用的溶剂为实验室或工业生产常用溶剂，廉价易得，无毒或低毒，安全性好，也符合环保要求。

2.本发明由于使用常压柱，不仅操作简单，更不需要额外能源动力，同时溶剂经回收可以循环使用，不仅节约成本更可减少溶剂消耗，降低废液排放量，有利于环保。

3.本发明所得到的查耳酮不仅纯度很高，大于97.8%，而且产率也很高，达到8.6g/Kg以上，可以为相关的动物实验及水翁花查耳酮活性的深入广泛研究提供足量的高纯度查耳酮精品。

4.本发明部分浓度乙酸乙酯洗脱段的查耳酮的纯度很高，达到97%以上，稳定性很好。

具体实施方式

下面对本发明作进一步详述：

一种从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，采用如步骤：

步骤一：将水翁花蕾干燥粉碎成粗粉，加入体积分数为70%的乙醇溶液，料液比1：3-6，冷浸提4h，减压浓缩，溶剂重复使用，提取3次，合并3次所得固体物，得到淡黄色粗提物；

步骤二：继续用柱层析法进行分离和纯化，再进行重结晶，得到查耳酮精品；

步骤三：在进行柱层析分离和纯化时，粗提物研成细粉后直接装柱，不需要拌硅胶处理；以醚类和酮类的混合液作为流动相进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，溶剂重复使用，得到橙红色固体，经过醇重结晶，得到橙红色针状晶体，即为查耳酮精品。

本发明内容通过以下的实施例作进一步的阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1

称取水翁花蕾0.5kg，粉碎成粗粉，加入体积分数为70%的乙醇溶液3L，搅拌，超声提取30min，浸泡4h，滤过，滤液减压浓缩至干，收集粗提物干粉，回收溶剂，再次加入药渣中，进行提取，进行3次提取，合并粗提物，在研钵中研成细分，得到黄色粉末50.6g。

称取粒径200-300目的柱层析用硅胶600g，加入石油醚，充分搅拌至无气泡冒出，一次性灌入内径10cm的玻璃柱中，硅胶柱层高度为15cm，柱床总体积为1200mL，使硅胶柱自然沉降1h，要保证硅胶柱顶层水平。打开柱下端旋塞缓慢放出石油醚至距离硅胶柱层上端1.8-2.1cm，把粗提物细分均匀的装在柱顶（无需拌入硅胶，直接上样即可），始终保持石油醚距离柱顶2cm高度，装样时要保持样品层均匀水平。最后再在样品层上端装入约1cm厚的硅胶，对样品层起到保护的作用。加入洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂的极性从石油醚：乙酸乙酯=95:5-55:45逐渐增加，流速约10mL/min，每份收集500mL，收集乙酸乙酯9%-30%含量的馏分，减压浓缩至干，得到橙黄色固体5.2g为查耳酮粗品。

将所得查耳酮粗品用适量甲醇在70℃加热溶解，室温下冷却进行重结晶纯化，得到橙红色针状晶体4.3g。经UPLC测定，其查耳酮相对纯度达到98.1%。查耳酮得率为8.6g/Kg。

实施例2

称取水翁花蕾2kg，粉碎成粗粉，加入体积分数为70%的乙醇溶液6L，搅拌，冷浸提6h，滤过，滤液减压浓缩至干，收集粗提物干粉，回收溶剂，再次加入药渣中，进行提取，进行3次提取，合并粗提物，在研钵中研成细分，得到黄色粉末190.2g。

称取粒径200-300目的柱层析用硅胶3kg，加入石油醚，充分搅拌至无气泡冒出，一次性灌入内径20cm的玻璃柱中，硅胶柱层高度为30cm，柱床总体积为7.5L，使硅胶柱自然沉降1h，要保证硅胶柱顶层水平。打开柱下端旋塞缓慢放出石油醚至距离硅胶柱层上端1.8-2.1cm，把粗提物细分均匀的装在柱顶（无需拌入硅胶，直接上样即可），始终保持石油醚距离柱顶2cm高度，装样时要保持样品层均匀水平。最后再在样品层上端装入约1cm厚的硅胶，对样品层起到保护的作用。加入洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂的极性从石油醚：乙酸乙酯=95:5-55:45逐渐增加，流速约10mL/min，每份收集500mL，收集乙酸乙酯9%-30%含量的馏分，减压浓缩至干，得到橙黄色固体25.2g为查耳酮粗品。

将所得查耳酮粗品用适量甲醇在70℃加热溶解，室温下冷却进行重结晶纯化，得到橙红色针状晶体21.1g。经UPLC测定，其查耳酮相对纯度达到97.8%。查耳酮得率为10.6g/Kg。

Claims (7)

1.一种从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：它采用如下步骤：

步骤一：将干燥水翁花蕾粉碎成粗粉，加入体积分数70%乙醇，浸泡，滤过，减压浓缩至干得黄色干粉，回收溶剂再次浸泡，共提取三次，合并三次所得干粉为粗提物；

步骤二：将步骤一所得粗提物无需溶解或拌入硅胶，直接上样于硅胶层析柱，用醚和酯的混合体系作为流动相进行洗脱，收集部分洗脱液，减压浓缩至干，得到橙红色固体，即为查耳酮粗品；

步骤三：将步骤二所得查耳酮粗品用无水甲醇在70℃进行重结晶，纯度达到97.8%以上；得到查耳酮精品。

2.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：所述层析柱内径为10-20cm，层析柱层径高比为1:5-8。

3.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：所述醚和酯的混合体系所用的醚类为石油醚，为60-90℃馏分段；所用的酯类为乙酸乙酯。

4.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：所述收集部分洗脱液为在339nm波长下有吸收的部分。

5.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：所述层析柱所用填料为柱层析用硅胶，粒径为200-300目。

6.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：它采用如步骤：

步骤一：称取水翁花蕾0.5kg，粉碎成粗粉，加入体积分数为70%的乙醇溶液3L，搅拌，超声提取30min，浸泡4h，滤过，滤液减压浓缩至干，收集粗提物干粉，回收溶剂，再次加入药渣中，进行提取，进行3次提取，合并粗提物，在研钵中研成细分，得到黄色粉末50.6g；

步骤二：称取粒径200-300目的柱层析用硅胶600g，加入石油醚，充分搅拌至无气泡冒出，一次性灌入内径10cm的玻璃柱中，硅胶柱层高度为15cm，柱床总体积为1200mL，使硅胶柱自然沉降1h，要保证硅胶柱顶层水平；打开柱下端旋塞缓慢放出石油醚至距离硅胶柱层上端1.8-2.1cm，把粗提物细分均匀的装在柱顶，无需拌入硅胶，直接上样即可，始终保持石油醚距离柱顶2cm高度，装样时要保持样品层均匀水平；最后再在样品层上端装入约1cm厚的硅胶，对样品层起到保护的作用；加入洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂的极性从石油醚：乙酸乙酯=95:5-55:45逐渐增加，流速约10mL/min，每份收集500mL，收集乙酸乙酯9%-30%含量的馏分，减压浓缩至干，得到橙黄色固体5.2g为查耳酮粗品；

步骤三：将所得查耳酮粗品用适量甲醇在70℃加热溶解，室温下冷却进行重结晶纯化，得到橙红色针状晶体4.3g；经UPLC测定，其查耳酮相对纯度达到98.1%；查耳酮得率为8.6g/Kg。

7.根据权利要求1所述从水翁花蕾中提取4′,6′-二羟基-3′,5′-二甲基-2′-甲氧基查耳酮的工艺，其特征在于：它采用如步骤：

步骤一：称取水翁花蕾2kg，粉碎成粗粉，加入体积分数为70%的乙醇溶液6L，搅拌，冷浸提6h，滤过，滤液减压浓缩至干，收集粗提物干粉，回收溶剂，再次加入药渣中，进行提取，进行3次提取，合并粗提物，在研钵中研成细分，得到黄色粉末190.2g；

步骤二：称取粒径200-300目的柱层析用硅胶3kg，加入石油醚，充分搅拌至无气泡冒出，一次性灌入内径20cm的玻璃柱中，硅胶柱层高度为30cm，柱床总体积为7.5L，使硅胶柱自然沉降1h，要保证硅胶柱顶层水平；打开柱下端旋塞缓慢放出石油醚至距离硅胶柱层上端1.8-2.1cm，把粗提物细分均匀的装在柱顶，无需拌入硅胶，直接上样即可，始终保持石油醚距离柱顶2cm高度，装样时要保持样品层均匀水平；最后再在样品层上端装入约1cm厚的硅胶，对样品层起到保护的作用；加入洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂的极性从石油醚：乙酸乙酯=95:5-55:45逐渐增加，流速约10mL/min，每份收集500mL，收集乙酸乙酯9%-30%含量的馏分，减压浓缩至干，得到橙黄色固体25.2g为查耳酮粗品；

步骤三：将所得查耳酮粗品用适量甲醇在70℃加热溶解，室温下冷却进行重结晶纯化，得到橙红色针状晶体21.1g；经UPLC测定，其查耳酮相对纯度达到97.8%；查耳酮得率为10.6g/Kg。