CN100415760C - 獐牙菜苦苷单体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了川东獐牙菜(Swertia davida Franch)中有效成分獐牙菜苦苷(Swertiamarin)单体的分离纯化方法。本发明方法以大孔吸附树脂S-8为预分离填料，含水乙醇为洗脱剂；再以硅胶G柱色谱纯化，乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂解析，层析产品经析晶脱色处理，最终冷冻干燥得到98%獐牙菜苦苷纯品。本发明方法与原有传统工艺相比，采用常规廉价填料为分离介质，优化了产品分离纯化、脱色与干燥技术，方法简便，制备周期短，成本低，单体提取率及产品纯度高，可实现工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于中药技术领域。具体涉及川东獐牙菜(Swertia davida Franch)中的有效成分獐牙菜苦苷(Swertiamarin)单体的分离纯化方法。
背景技术：
龙胆科獐牙菜属植物在全世界约有100多种，中国大约有70余种，川东獐牙菜为土家族民间常用的一种民族药。民间称水黄连，青鱼胆，来源于龙胆科獐牙菜属植物川东獐牙菜(Swertia davida Franch)的全草，具有清热解毒、清肝利胆的作用，用于治疗痢疾、肠炎、肝炎、胆囊炎、妇科炎症等疾病，其中以治疗黄胆肝炎和病毒性肝炎疗效尤为显著。由于本属植物药理作用显著，对其研究与开发也越来越受重视。目前，国内外已研究过30多种獐牙菜属植物的化学成分，做了大量的分离、鉴定、药理和临床研究工作，其主要化学成分有口山酮化合物，环烯醚萜化合物，三萜类化合物和黄酮类化合物等。
环烯醚萜类化合物是龙胆科植物的主要药用成分之一，也是本科植物的特征性成分，在化学分类学上具有重大意义。川东獐牙菜中环烯醚萜类化合物主要有獐牙菜苦苷(Swertiamarin)、龙胆苦苷(gentiopicroside)、当药苷(sweroside)等，此类化合物大多单独以葡糖苷的形式存在如，或进一步酸化为酸化的裂环烯醚萜类化合物，具有保肝、利胆、抗炎及解痉止痛等作用，近年来，世界各国积极推进该类化合物的开发，并广泛应用于医药保健、日用化工和食品加工等领域，研究獐牙菜苦苷的提取分离纯化方法和生产工艺具有重要的现实意义。
獐牙菜苦苷为中等极性物质，易溶于水饱和的正丁醇及甲醇，目前对生药材的提取分离一般用MeOH先粗提，回收溶剂后用石油醚(bp30-60℃)和CHCl3脱酯，再用n-BuOH或EtoAc萃取.再减压回收溶剂后得粗提物，再经反复硅胶柱层析分离及TLC检测，洗脱剂一般为CHCl3-CH3OH或CHCl3-CH3OH-H2O以适当比例混合的溶液；显色剂一般为20％H2SO4水溶液，或对二甲氨基苯甲醛。环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物在龙胆科植物中基本上以糖苷形式存在，其以苷元形式的存在几乎没有。
獐牙菜苦苷的精制纯化方法主要有硅胶柱色谱法，凝胶柱色谱分离法，半制备高效液相色谱法和高速逆流色谱法等，近年来，纳滤膜分离在该类植物成分的分离纯化研究上也有应用。与粗品的提取分离工艺相比较，上述精制方法分离速度快捷，产品纯度远远高于粗品。同时能保持产品的天然活性，有机溶剂残留少，品质稳定，是制备高纯獐牙菜苦苷单体的发展方向。然而，目前来说，上述精制方法距工业化应用均存在一定差距。其中硅胶柱色谱法展开的有机溶剂通常采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲酸中的一种或多种配比体系，工艺复杂，有机溶剂价格高且毒性较强，操作安全性低。凝胶柱色谱分离法所采用填充料主要有Toyopear HW-40、Sephadex LH-20、XAD-8和Duolite S587等凝胶及吸附树脂，存在着柱材料昂贵、獐牙菜处理量低等问题而无法工业化生产；半制备型高效液相色谱对仪器依赖性强，制备型色谱柱价格高昂，设备精细，操作复杂，且制备量少；高速逆流色谱法是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，采用GS10AZ高速逆流色谱仪，可以获得较高纯度及收率的獐牙菜苦苷产品，分离效果好且不存在污染，具有一定的发展前景。但目前而言，高速逆流色谱技术在分离多组分混合物时如何确定洗脱溶剂种类与配比，保持柱效率长期稳定及扩大生产能力等方面在理论与实践上均有待完善，研究仅限于实验室少量标准样品的试制，离工业化规模生产还有相当大的距离。纳滤膜分离法是近年来从食品饮料行业衍生到中医药现代化研究领域，发展迅速的一项新型纯化技术，在植物化学成分制备方面应用尚不广泛，是一种正处于工业开发阶段的化学分离工程技术，目前的报道还多见于实验室研究。
獐牙菜苦苷的提取分离纯化以溶剂法为主，存在很多弊端。其一，产品质量低，由于獐牙菜植物化学成分复杂，溶剂的选择性差，所得产品纯度差且色泽深黄，必须经脱色、结晶精制，方可应用于医药与保健品领域；其二、产品的溶剂残留量难以达到FAO/WHO规定的标准，极大地影响了其使用。其三，产品稳定性差，易氧化分解转变成为其他化学成分。其四，色谱柱分离溶剂体系复杂，溶剂消耗大，效率差，成本高。其五、环境污染严重。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种分离纯化操作步骤简单、分离效率高、制备量大的獐牙菜苦苷单体工业化生产方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
獐牙菜苦苷单体的分离纯化方法，包括从獐牙菜原料中提取含獐牙菜苦苷的粗品，其次从粗提物中纯化得到獐牙菜苦苷单体；具体的工艺方法包括：大孔吸附树脂预分离、有机溶媒复提、硅胶柱色谱纯化及脱色、冷冻干燥；
本发明提供了一种獐牙菜苦苷单体的分离纯化方法，该方法包括下列步骤：
(1)大孔吸附树脂预分离：
a.用75％含水乙醇以川东獐牙菜重量的8倍量、7倍量和5倍量分三次从川东獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液除去乙醇后浓缩到含固量为5％的料液待上柱；
b.取大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡过夜充分溶胀后，装入层析柱，用95％乙醇淋洗树脂杂质，以纯水洗涤树脂至无乙醇残留，平衡备用；
c.取步骤a的料液，常温下以8ml/min流速进入层析柱吸附，以6倍量柱床体积纯水同流速洗涤杂质，50％乙醇为解析溶剂，流速10ml/min，收集洗脱液，浓缩回收溶剂后60℃真空干燥得到獐牙菜苦苷分离物；
d.步骤c獐牙菜苦苷分离物用以水饱和的乙酸乙酯70℃回流提取1小时，浓缩提取液，回收溶剂后40℃真空干燥得到獐牙菜苦苷高纯品；
(2)硅胶柱色谱纯化：
a.烘干后的硅胶以乙酸乙酯为溶剂装柱，用乙酸乙酯淋洗平衡；
b.取上述獐牙菜苦苷高纯品；以甲醇溶解，用硅胶拌匀后湿法装柱；
c.常温下将洗脱剂乙酸乙酯∶甲醇7∶3V/V加入柱内，待獐牙菜苷高纯品完全渗入硅胶后，用收集器收集洗脱液，洗脱流速1.5ml/min，以200ml为一个收集部份的馏分，合并第8-15馏分，浓缩除去溶剂后，冷冻干燥得獐牙菜苷单体纯化粗品；
(3)脱色干燥：取步骤(2)纯化的单体粗品，以无水乙醇超声溶解，缓慢加入石油醚，搅拌结晶，冷却4℃放置过夜，过滤除去滤液，晶体在30℃下冷冻干燥得到獐牙菜苦苷纯品。
本发明方法中所述大孔树脂为S-8吸附树脂、XAD-2树脂、NKA-9树脂、D101树脂或HP20。
本发明方法有下列特点：
(1)本项目采用低温自动柱色谱分离、析晶脱色及冷冻升华干燥等现代技术手段，依据川东獐牙菜化学成分的结构特点，能有效实现獐牙菜苦苷有效成分的提取、分离、纯化与干燥，并且分离纯化过程在特定的、自动控制的低温条件下完成，含量与活性水平得以充分保证。
(2)獐牙菜苦苷在树脂预分离、溶媒复提、硅胶柱色谱与析晶脱色各步分离效果及分离效率均较高，纯度增长幅度大，以原料计獐牙菜苦苷回收率可达到41.50％，含量＞98％，特别解决了色素残留问题，提高了产品的外观与化学品质；
(3)所用树脂填料、有机溶剂均廉价易得，洗脱时间短，溶剂回收方便。与报道的Sephadex LH-20分离或半制备HPLC纯化工艺相比较，分离介质与设备价格便宜，只需经过常规的柱层析系统即可完成单体獐牙菜苦苷的分离制备，且实验室一次纯化制备量可以达到克级水平，生产线上一次加工量在1Kg以上，在很大程度上提高生产效率，降低生产成本。
附图说明：
图1：98％獐牙菜苦苷发明工艺路线图
具体实施方式：
实施例1：
(1)首先用75％含水乙醇分别以川东獐牙菜重量的8倍量、7倍量和5倍量分三次从川东獐牙菜切碎原料中提取獐牙菜苦苷，提取液完全回收至无乙醇残留，浓缩到含固量约5％料液待上柱。
(2)獐牙菜苦苷等环烯醚萜类组分的大孔吸附树脂预分离：
a、大孔吸附树脂预处理：取650克S-8吸附树脂用95％乙醇3000ml浸泡过夜充分溶胀；
b、装柱：将溶胀好的树脂缓慢倒入层析柱，使其均匀沉降，继续用5～10倍柱床体积的95％乙醇淋洗树脂杂质，最后以10倍柱床体积纯水洗涤至流出液无乙醇残留，平衡备用；
c、上样：取獐牙菜提取浓缩液800g常温下以8ml/min的流速缓慢渗入S-8树脂吸附，用6倍量柱床体积纯水同流速洗涤杂质后，50％乙醇为解析溶剂，解析流速10ml/min，洗脱剂用量1500ml，收集液经检测后合并含獐牙菜苦苷的馏分，得到獐牙菜苦苷分离物4.55g，含量为54.68％，料液浓缩回收溶剂后60℃真空干燥。
(3)精确称取上述样品4g，用40ml水饱和的乙酸乙酯70℃回流提取1小时，浓缩回收有机溶剂后低温真空干燥得到含量为75.02％獐牙菜苦苷产品2.4g。
(4)獐牙菜苦苷硅胶柱色谱纯化
a、硅胶柱的预处理：称取300g硅胶G，105℃烘干备用；
b、装柱：以乙酸乙酯为溶剂缓慢装入硅胶，使其均匀沉降，继续用3倍量柱床体积的乙酸乙酯淋洗以平衡柱子；
c、上样：少量甲醇溶解2g待纯化样品，用20g硅胶拌匀后湿法装柱，常温下(25℃)用滴管缓慢将洗脱剂乙酸乙酯∶甲醇(7∶3，V/V)加入柱内，待样品完全渗入硅胶后接上自动部分收集器开始收集，洗脱流速1.5ml/min，以200ml为一个馏分收集解析料液，No.8～No.15馏分合并后(1600ml)浓缩冷冻干燥，得96.85％獐牙菜苦苷产品1.28g。
(5)脱色：精确称量1g样品加入20ml无水乙醇超声溶解，缓慢加入8ml石油醚并不停搅拌，有白色结晶析出时停止搅拌放置到冰箱中(4℃)冷置过夜，过滤，少量无水乙醇洗涤晶体。
(6)冷冻干燥：晶体在30℃下冷冻干燥后，得到含量98.76％的獐牙菜苦苷纯品0.72g，色泽浅白泛亮。
Claims (2)
1. 一种獐牙菜苦苷单体的分离纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)大孔吸附树脂预分离：
a.用75％含水乙醇以川东獐牙菜重量的8倍量、7倍量和5倍量分三次从川东獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液除去乙醇后浓缩到含固量为5％的料液待上柱；
b.取大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡过夜充分溶胀后，装入层析柱，用95％乙醇淋洗树脂杂质，以纯水洗涤树脂至无乙醇残留，平衡备用；
c.取步骤a的料液，常温下以8ml/min流速进入层析柱吸附，以6倍量柱床体积纯水同流速洗涤杂质，50％乙醇为解析溶剂，流速10ml/min，收集洗脱液，浓缩回收溶剂后60℃真空干燥得到獐牙菜苦苷分离物；
d.步骤c獐牙菜苦苷分离物用以水饱和的乙酸乙酯70℃回流提取1小时，浓缩提取液，回收溶剂后40℃真空干燥得到獐牙菜苦苷高纯品；
(2)硅胶柱色谱纯化：
a.烘干后的硅胶以乙酸乙酯为溶剂装柱，用乙酸乙酯淋洗平衡；
b.取上述獐牙菜苦苷高纯品；以甲醇溶解，用硅胶拌匀后湿法装柱；
c.常温下将洗脱剂乙酸乙酯∶甲醇7∶3 V/V加入柱内，待獐牙菜苷高纯品完全渗入硅胶后，用收集器收集洗脱液，洗脱流速1.5ml/min，以200ml为一个收集部份的馏分，合并第8-15馏分，浓缩除去溶剂后，冷冻干燥得獐牙菜苷单体纯化粗品；
(3)脱色干燥：取步骤(2)纯化的单体粗品，以无水乙醇超声溶解，缓慢加入石油醚，搅拌结晶，冷却4℃放置过夜，过滤除去滤液，晶体在30℃下冷冻干燥得到獐牙菜苦苷纯品。
2. 根据权利要求1所述的一种獐牙菜苦苷单体的分离纯化方法，其特征在于其中步骤(1)所述的大孔树脂为S-8吸附树脂、XAD-2树脂、NKA-9树脂、D101树脂或HP20。
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