CN102033050A - 植物样品中果胶含量的测定方法 - Google Patents

植物样品中果胶含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种植物样品中果胶含量的测定方法，包括如下步骤：1)在植物样品中加入酸性醇溶液，随后在水浴中加热回流，再进行一次过滤；2)将一次过滤得到的滤渣用酸溶液浸泡，并在水浴中加热回流，再进行二次过滤，冷却后定容，得到滤液待用；3)往二次过滤后的滤渣中加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液处理，再加入果胶酶溶液，在水浴中加热振荡，然后进行三次过滤，得到滤液待用；4)将步骤2)中得到的滤液依次加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液、果胶酶溶液，然后在水浴中加热振荡，得到酶解液，在酶解液中加入步骤3)得到的滤液，定溶，得到待测液；5)将待测液吸入到连续流动分析仪中进行检测。本发明具有检测结果准确的优点。

Description

植物样品中果胶含量的测定方法
技术领域
本发明涉及植物组分的提取，尤其涉及一种植物样品中果胶含量的测定方法。
背景技术
在植物中果胶含量的测定中，常需用到显色法检测，但在显色法检测时，由于色素会有一定吸光度，从而对显色法造成干扰，同时糖会与显色剂反应形成有色物质，这也会对显色法造成干扰，所以在测定过程中，通常都需要先进行除糖、除色素的前处理。在植物中果胶含量的测定中，常用的样品前处理方法是：将植物粉末样品用浓度为80％的乙醇溶液加热回流1小时，去除滤液，余下滤渣再做进一步的提取处理，用于其它检测，此种方法一般称为乙醇处理法，但这种乙醇处理法存在的问题是：只能除去小分子水溶性糖，同时对色素的提取也有一定局限性。而在滤渣处理时，有时候需要用酸液提取，这就造成之前来被提取出来的多糖水解而被提取出来，而由于酸的作用破坏了细胞壁，使之前来能溶解出来的色素也被提取出来，从而影响最终检测结果。在进行完前处理后，要对经过前处理的样品进行检测。现有的检测方法有重量法，由于果胶不是单纯半乳糖醛酸的聚合，在采用重量法检测时，支链上的中性糖和α-L-(1→2)鼠李糖，以及甲酯化基团、乙酰化基团同时被沉淀下来，所以其重量必然高于对半乳糖醛酸累计量。因此，重量法检测结果无法反映出样品中的半乳糖醛酸含量情况，即无法反映出样品中表征果胶特性的半乳糖醛酸支链骨架的含量情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种植物样品中果胶含量的测定方法，检测结果更加准确。
本发明提供的一种植物样品中果胶含量的测定方法，包括如下步骤：
1)在植物样品中加入酸性醇溶液，随后在水浴中加热回流，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用酸溶液浸泡，并在水浴中加热回流，再进行二次过滤，冷却后定容，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液处理，再加入果胶酶溶液，在水浴中加热振荡，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液依次加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液、果胶酶溶液，然后在水浴中加热振荡，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，定容，得到待测液；
5)将待测液吸入到连续流动分析仪中，所述待测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490nm～540nm波长下进行检测。
优选地，步骤1)中，以体积百分比计，酸性醇溶液的醇浓度为60％～80％；而氢离子浓度为0.005mol/L～0.02mol/L，酸性醇溶液加入量为：1克样品加入约50～200mL酸性醇溶液。
优选地，步骤1)中，所述水浴中加热回流的温度为：80℃～100℃，时间为10分钟～1小时。
优选地，所述酸溶液是浓度为0.05mol/L～0.1mol/L的盐酸，水浴中加热回流的温度为：80℃～100℃，时间为30分钟～2小时，对于1克植物样品，定容后滤液体积控制在200mL～250mL。
优选地，乙酸/乙酸钠缓冲液和果胶酶溶液加入量为：1克植物样品，加入缓冲液15mL～20mL、加入果胶酶溶液1mL～2mL，其中，每毫升果胶酶溶液的酶活性300个酶活力单位以上；所述水浴中加热振荡的温度为：40℃～60℃，时间为1小时～2小时。
优选地，1mL滤液中加入缓冲液15～20mL、加入果胶酶溶液1～2mL，其中，每毫升果胶酶溶液的酶活性为300个酶活力单位以上，所述水浴中加热振荡的温度为：40℃～60℃，时间为1小时～2小时。
优选地，步骤5)中将待测液与强酸性分解试剂通过螺旋管混合，在待测液与强酸性分解试剂反应过程中加热，而后冷却。
优选地，所述植物样品为粉末状。
优选地，步骤1)中，所述植物样品体积较大时，加入酸性醇溶液后先搅拌成桨，再进行水浴加热回流。
优选地，所述显色剂为对羟基联苯溶液，所述对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg～500mg对羟基联苯及3g～5g氢氧化钠。
优选地，所述强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3g～6g的四硼酸钠。
优选地，在待测液与强酸性分解试剂反应过程中加热的温度为90℃～99℃。
优选地，冷却采用匝数为20匝～50匝的冷却管冷却。
优选地，以体积百分比计，步骤3)、步骤4)中的果胶酶溶液的浓度为300u/mL～600u/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
一、由于在步骤1)中，采用酸性醇溶液处理取代现有技术的醇溶液处理，除糖效果更高、处理时间更短，并有利于减少其后步骤2)中酸溶液浸泡、加热回流处理的所需时间。同时，整个处理过程，由于不需要离子色谱法中为适合于低含量样品检测的特点而对样品进行大量稀释处理，所以也减少了多项稀释定容等处理步骤，减少了操作的复杂程度，提高了效率。
二、由于采用连续流动法对经过处理得到的待测液进行检测，将待测液吸入连续流动分析仪中，与强酸性分解试剂反应，对待测液中果胶进行腐化、分解，转化为可以显色的衍生物，从而更便于光度检测，因而使得检测过程更加容易。
附图说明
图1是本发明植物中果胶含量的连续流动测定方法的流程图；
图2是本发明中利用连续流动分析仪的检测流程图；
图3是半乳糖醛酸标准溶液显色后的吸光度扫描谱图；
图4是样品提取液显色后的吸光度扫描谱图；
图5是分析仪吸光度扫描图之一；
图6是标准曲线描图之一；
图7是分析仪吸光度扫描图之二；
图8是标准曲线扫描图之二。
具体实施方式
为使本发明的发明目的、技术方案更加清楚，以下通过实施例进行详细说明。
参见图1，本发明的植物样品中果胶含量的测定方法，包括如下步骤：
S1、在植物样品中加入酸性醇溶液，随后在水浴中加热回流，再进行一次过滤；
S2、将一次过滤得到的滤渣用酸溶液浸泡，并在水浴中加热回流，再进行二次过滤，冷却后定容，得到滤液待用；
经过过滤得到的滤渣，再用酸溶液冲洗多次，可以将滤渣上附着的滤液极大程度地去除；
通过此步骤，将大部分果胶组分提取到滤液中；
S3、往二次过滤后的滤渣中加入一定量的乙酸/乙酸钠缓冲溶液处理，再加入一定量的果胶酶溶液，在水浴中加热振荡，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
通过此步骤，使得滤渣中来被提取的果胶被提取液提取出来，并分解为半乳糖醛酸；
S4、将步骤S2中得到的滤液依次加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液、果胶酶溶液，然后在水浴中加热振荡，得到酶解液，在酶解液中加入步骤S3得到的滤液，定容，得到待测液；
通过此步骤，使得酸液提取液中的果胶充分水解为半乳糖醛酸，并与滤渣中残留的果胶提取液混合，使提取得到的果胶能够充分收集，得到待测液，以使最终检测结果更加准确；
S5、将待测液吸入到连续流动分析仪中，所述待测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490～540nm波长下进行检测。
待测液通过与强酸性分解试剂反应，使得果胶腐化，转化为可以显色的衍生物，从而更便于光度检测；
其中，显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg～500mg(优选400mg)对羟基联苯及3g～5g氢氧化钠(优选4g)。
其中，强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3～6g(优选4.8g)的四硼酸钠。
其中，强酸性分解试剂采用两根泵管或三根泵管并联向连续流动分析仪进样；单泵管流量控制在0.6ml/min～1.2ml/min，总流量控制为1.6ml/min～3.0ml/min，强酸性分解试剂的流量与进样量的比例关系是：13.0∶1～30∶1(优选是16∶1～20∶1)。以此克服，强酸性分解试剂粘度大，在流动分析管路中流动困难的问题。
下面通过具体的实施例对本发明进行进一步描述。
实施例一
1)在植物样品中加入乙醇体积百分比为60％、盐酸浓度为0.01mol/L的酸性醇溶液，随后在90℃水浴中加热回流20分钟，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用0.05mol/L的盐酸溶液浸泡，并在90℃的水浴中加热回流30分钟，再进行二次过滤，冷却后定容到250mL，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入20mL的0.1mol/L、pH 4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液处理，再加入1mL的300u/mL的果胶酶溶液，在55℃的低温水浴中加热振荡1小时，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液移取1mL，依次加入20mL的0.1mol/L、pH4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液，1mL的300u/mL的果胶酶溶液，然后在55℃的低温水浴中加热振荡1小时，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，以质量百分比为0.1％苯甲酸溶液定容到100mL，得到待测液；
5)将待测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至90℃，待测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在500nm波长下进行检测。
其中，所有过滤处理都不能采用普通滤片，而需要采用玻璃纤维滤片，也可采用其它不含植物纤维的滤片代替。
其中，步骤5)中的检测流程参见图2。
其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解400mg对羟基联苯及4g氢氧化钠。
其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为93％的浓硫酸中溶解3.5g的四硼酸钠。
其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为64匝。
其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为30匝(冷却水入口直接连接到水龙头处，冷却水流量和螺旋管匝数的设置，以使冷却后流程管路温度接近室温为适宜)。
实施例二
1)在植物样品中加入乙醇体积百分比为80％、盐酸浓度0.01mol/L的酸性醇溶液，随后在89℃的水浴中加热回流25分钟，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用0.1mol/L的盐酸溶液浸泡，并在92℃的水浴中加热回流30min，再进行二次过滤，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入20mL的0.1mol/L、pH 4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液清洗，再加入1mL的400u/mL的果胶酶溶液，在50℃的低温水浴中加热振荡1.5h，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液移取1mL，依次加入20mL的0.1mol/L、pH4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液，1mL的400u/mL的果胶酶溶液，然后在55℃低温水浴中加热振荡1h，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，以质量百分比为0.1％苯甲酸溶液定容到250mL，得到待测液；
5)将待测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至95℃，待测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在530nm波长下进行检测。
其中，步骤5)中的检测流程参见图2。
其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300mg对羟基联苯及3g氢氧化钠。
其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％的浓硫酸中溶解3g的四硼酸钠。
其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为35匝。
其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为25匝。
实施例三
1)在植物样品中加入乙醇体积百分比为80％、盐酸浓度0.005mol/L的酸性醇溶液，随后在88℃的水浴中加热回流35分钟，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用0.08mol/L的酸溶液浸泡，并在89℃的水浴中加热回流1h，再进行二次过滤，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入25mL的0.1mol/L、pH 4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液清洗，再加入1mL的400u/mL的果胶酶溶液，在45℃的低温水浴中加热振荡2h，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液移取1mL，依次加入25mL的0.1mol/L、pH4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液，1mL的400u/mL的果胶酶溶液，然后在低温水浴中加热振荡2h，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，以质量百分比为0.1％苯甲酸溶液定容到250mL，得到待测液；
5)将待测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至96℃，待测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在520nm波长下进行检测。
其中，步骤5)中的检测流程参见图2。
其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解360mg对羟基联苯及5g氢氧化钠。
其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为94％的浓硫酸中溶解6g的四硼酸钠。
其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为35匝。
其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为40匝。
实施例四
1)将植物样品加入乙醇体积百分比为80％、盐酸浓度为0.02mol/L酸性的醇溶液，先搅拌成桨，随后在91℃的水浴中加热回流21分钟，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用0.010mol/L的酸溶液浸泡，并在86℃的水浴中加热回流1小时，再进行二次过滤，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入25mL的0.1mol/L、pH 4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液清洗，再加入1mL的300u/mL的果胶酶溶液，在48℃低温水浴中加热振荡1.8小时，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液移取1mL，依次加入25mL的0.1mol/L、pH4.0的乙酸/乙酸钠缓冲溶液，1mL的300u/mL的果胶酶溶液，然后在低温水浴中加热振荡1h，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，以质量百分比为0.1％苯甲酸溶液定容到250mL，得到待测液；
5)将待测液(试样)吸入到连续流动分析仪中，与吸入到连续流动分析仪中的含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液一同经过螺旋管混合，然后加热至93℃，待测液与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液发生反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后冷却，与加入的显色剂通过螺旋管混匀，与显色剂反应显色，在490nm波长下进行检测。
其中，步骤5)中的检测流程参见图2。
其中，步骤5)中的显色剂为对羟基联苯溶液，该对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解400mg对羟基联苯及4.5g氢氧化钠。
其中，含有四硼酸钠的浓硫酸溶液中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为95％的浓硫酸中溶解5g的四硼酸钠。
其中，步骤5)中加热采用的加热器，其内部设置的加热螺旋管匝数为64匝。
其中，步骤5)中采用水浴冷却，冷却管匝数为30匝。
以下通过实验证明本发明植物样品中果胶含量的测定方法的效果。
一、萃取试样基底颜色的干扰
前处理：准确称取0.1g植物粉末样品，用100mL氢离子浓度为0.01mol/L、醇含量80％的盐酸-乙醇溶液，在90℃水浴条件下加热回流20min，过滤除去糖类组分和色素，将滤渣供下一步提取待测组分用。
酸溶液处理方案和酶解提取方案与前述实施例相同，在此不再详细叙述。
实验方案：将待测液(即提取了果胶的提取液)作为试样注入连续流动分析仪中，在不加入显色剂的情况下，用紫外-可见分光光度计对分析仪流出(与除显色剂外的其他溶剂混合后)的溶液进行吸光度扫描，检测结果见表1。
表1：待测试验流经分析仪后的吸光度扫描结果
Figure BDA0000043756310000101
由表2的实验数据可知，待测液中所含色素极少，待测液的本底颜色在果胶检测波长范围附近对显色检测法的干扰很小，不会对拟采用的光度检测法造成干扰。这说明酸性醇溶液除色素效果理想。
二、测定波长的设定
实验方案1：移取1mL半乳糖醛酸标准溶液(半乳糖醛酸浓度为50mg/L)置于20mL具塞试管，加入四硼酸钠-硫酸溶液6mL，待冷却后用移液枪加入1mL间羟基联苯溶液(显色剂)，混匀后超声振摇5min除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用紫外可见分光光度计在350nm～800nm波长范围内扫描。扫描结果如图3所示。
实验方案2：按照前述实施例所述的方法提取果胶，得到待测液。分别取1ml两种不同的待测液，置于20mL具塞试管中。而后分别加入6ml四硼酸钠-硫酸溶液，待其冷却后，加入1ml间羟基联苯溶液，混匀后超声振摇5min除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用紫外可见分光光度计在400-650nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长，扫描结果见图4。
由图3可见：半乳糖醛酸标准溶液显色后最大吸收波长为520.89nm；参见图4，曲线B为采取酸醇溶液除糖的样品扫描结果，曲线C为采取醇溶液除糖的样品扫描结果，由图4可见，不论何种前处理方式，待测液中果胶组分显色后的最大吸收波长约为510nm(分别为507.90nm和508.03nm)。而在490nm～540nm波长范围内，测定波长变动5nm，样品显色出峰值波动小于5％。因此，合适的测定波长范围是490nm～540nm，优选波长范围是510nm～520nm。
三、糖含量对检测结果的干扰
经过试验检测，待测液(即提取了果胶的提取液)中，糖的含量低干2.5％。试验方案与结果如下：
试验方案：采用烤烟(1#)和白肋烟(2#)两个样品，按照本发明的方法进行处理，制得待测液，将待测液采用连续流动分析法测定其中的水溶性总糖含量。
表2：酸解样品的糖含量检测结果
Figure BDA0000043756310000121
由上表数据可以看到，待测液中的糖含量水平较低，其对果胶检测结果的干扰，通过下一步试验检验。
实验方案：为检查糖类组分对本发明连续流动测定法的干扰，制备浓度为20～100mg/L的各类糖(浓度是实际样品含糖量的2～10倍，是果胶含量的0.5～2.5倍)的待测液，按照前述实施例中的方法检测，检测结果见表3。
注：按照样品的前处理方案：称取0.1g烟末样品进行提取，提取液定容到250mL，在果胶含量为10％时，果胶浓度为40mg/L；在总糖含量为2.5％时，总糖浓度为10mg/L。)
表3：采用对羟基联苯显色法时不同糖类组分的检测结果(按半乳糖醛酸计)
Figure BDA0000043756310000122
Figure BDA0000043756310000131
注：由于组分显色后出峰高度很低，远小于最低浓度标液的出峰高度，接近于基线，因此检测结果波动性较大。
由表3的实验数据分析，不论是对于阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等单糖，还是蔗糖、乳糖等二糖，即使把试样中糖的浓度提高到正常情况的2～10倍，被误测定为果胶的值也十分低。因此，在本发明中的前处理方式和显色条件下，连续流动检测步骤中糖类组分对果胶检测结果的干扰很小。(但这也说明了必须进行除糖处理，因为不除糖时，烟草样品糖含量就不是2.33％而是20％其至30％、40％——用了酸水解，所以提取到的糖含量会高于水溶性糖的含量。)
四、本发明的连续流动检测过程中参数的选取
本实验中的基本流程设计条件如下：
1)试样(待测液)流量为1.0mL/min，硫酸总流量为1.8mL/min，即硫酸流量与进样量比为18∶1；
2)加热温度98℃，加热螺旋管数35匝(加热管匝数通常为35匝或64匝，如果是其它匝数的加热管需要特别订制，我们没有)；
3)冷却管匝数30匝。
在以下各单项实验中，只改变所实验项的条件，其余条件不变。
1、流量比例的选取
通过调节硫酸管路的数目和流量及调节进样管流量，来调节硫酸流量与进样量的比值：保持硫酸的总流量为3.0mL/min，调节试样管流量为0.32、0.23、0.10mL/min；保持试样管流量为0.10～0.23mL/min，调节硫酸的总流量为2.0、1.8、1.6mL/min。检测结果见表4，其中流量比为13.0∶1时分析仪的吸光度扫描图和标准曲线图见图5和图6，18.0∶1时的吸光度扫描图和标准曲线图见图7和图8。
表4：不同硫酸流量条件下标准曲线的相关系数R值大小
Figure BDA0000043756310000141
由表4以及图5和图6可以看出，当硫酸的流量与进样量比例关系较小时，低含量果胶出峰高度偏高，高含量果胶出峰高度偏低，造成果胶含量的检测结果偏低。这反映出果胶组分的显色反应来能充分完成，从而影响测定准确性。而当硫酸的流量与进样量比例关系合适时，则标准曲线的相关系数R值可达到0.999以上(参见图7和图8)。因此，合适的流量比为13∶1～30∶1，优选16∶1～20∶1。
2、加热温度的选取
调节加热器温度，并比较果胶含量检测值，结果见表5：
表5：不同加热条件下的果胶检测结果
注：最高设定温度没有达到100℃，是因为此温度下会出现螺旋管内气泡混乱的现象，使吸光度扫描图变得混乱，检测结果不稳定。
由表5数据可以看到，当硫酸与样品的反应温度较低时，检测结果偏低，反应出样品的反应不完全。因此，合适的加热温度是90℃～99℃，优选98℃(因为达到100℃时，管路流程中有时会出现气泡紊乱的现象)。
3、冷却螺旋管数(冷却时间)的选择
表6：不同冷却条件下的果胶检测结果
Figure BDA0000043756310000152
由表6数据看，当冷却管匝数达到30匝时，已经可以把反应后试样温度降低到室温附近，从而避免对光度比色池和废液管的损害。但冷却管匝数不宜太多，因为检测中发现，冷却管匝数达到60匝时，虽然检测结果没有太大变化，但样品的出峰高度出现较明显下降，反映此条件下已超出样品的合适显色反应时间段。所以，合适的冷却管匝数是20～50匝。
五、本发明测定方法的回收率
按照前述实施例的方法对不同果胶含量的植物样品进行处理，得到待测液。待测液被连续流动分析仪吸入，与含有十水四硼酸钠的浓硫酸溶液反应，分解转变为糠醛碱的衍生物，而后与显色剂(对羟基联苯溶液)反应显色，在520nm波长检测。分析仪流程参见图2：
表7：不同硫酸流量条件下标准曲线的R值大小
Figure BDA0000043756310000161
注：表中数据为3次重复测试的结果。
由表7可以看到，本发明的测定方法的回收率为100％～106％，满足定量检测要求。
六、对比实验
实验方案：采用现有技术中的重量法以及本发明的测定法，对同一个烟草样品进行果胶含量的检测，比对检测结果的差异性，结果参见表8。
重量法：准确称取1g(精确到0.0001g)烟末样品，在200mL无水乙醇中回流20min后抽滤，滤渣在100mL 80％的乙醇中回流20min。而后抽滤，将得到的滤渣加入200mL的硫酸溶液(pH＝2)，在90℃下提取1.5h后趁热抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3次提取液经浓缩后在乙醇中沉淀，将沉淀过滤，干燥后称量沉淀质量。
本发明的测定方法：准确称取1g(精确到0.0001g)烟末样品，按照前述实施例的方法进行测定。
表8：不同测定方法果胶的检测结果
  样品   重量法，％   本发明的测定方法，％
  1#   12.60   8.74
  2#   12.54   8.39
由表8的数据可以得出：
重量法检测结果高于本发明测定方法的检测结果。这是由于果胶不是单纯半乳糖醛酸的聚合，在采用重量法检测时，支链上的中性糖和α-L-(1→2)鼠李糖，以及甲酯化基团、乙酰化基团同时被沉淀下来，所以其重量必然高于对半乳糖醛酸累计量。因此，重量法的检测结果要高于连续流动法的测定值，重量法检测结果无法反映出样品中果胶含量的半乳糖醛酸情况。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在植物样品中加入酸性醇溶液，随后在水浴中加热回流，再进行一次过滤；
2)将一次过滤得到的滤渣用酸溶液浸泡，并在水浴中加热回流，再进行二次过滤，冷却后定容，得到滤液待用；
3)往二次过滤后的滤渣加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液处理，再加入果胶酶溶液，在水浴中加热振荡，然后进行三次过滤，得到滤液待用；
4)将步骤2)中得到的滤液依次加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液、果胶酶溶液，然后在水浴中加热振荡，得到酶解液，在酶解液中合并步骤3)得到的滤液，定容，得到待测液；
5)将待测液吸入到连续流动分析仪中，所述待测液与吸入到连续流动分析仪中的强酸性分解试剂反应，分解成糠醛碱的衍生物，而后与加入的显色剂反应显色，在490nm～540nm波长下进行检测。
2.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤1)中，以体积百分比计，酸性醇溶液的醇浓度为60％～80％；而氢离子浓度为0.005mol/L～0.02mol/L，酸性醇溶液加入量为：1克样品加入约50mL～200mL酸性醇溶液。
3.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述水浴中加热回流的温度为：80℃～100℃，时间为10分钟～1小时。
4.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述酸溶液是浓度为0.05mol/L～0.1mol/L的盐酸，水浴中加热回流的温度为：80℃～100℃，时间为30分钟～2小时，对于1克植物样品，定容后滤液体积控制在200mL～250mL。
5.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤3)中，乙酸/乙酸钠缓冲液和果胶酶溶液加入量为：1克植物样品，加入缓冲液15mL～20mL、加入果胶酶溶液1mL～2mL，其中，每毫升果胶酶溶液的酶活性300个酶活力单位以上；所述水浴中加热振荡的温度为：40℃～60℃，时间为1小时～2小时。
6.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤4)中，1mL滤液中加入缓冲液15～20mL、加入果胶酶溶液1～2mL，其中，每毫升果胶酶溶液的酶活性为300个酶活力单位以上，所述水浴中加热振荡的温度为：40℃～60℃，时间为1小时～2小时。
7.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤5)中将待测液与强酸性分解试剂通过螺旋管混合，在待测液与强酸性分解试剂反应过程中加热，而后冷却。
8.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，所述植物样品为粉末状。
9.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述植物样品体积较大时，加入酸性醇溶液后先搅拌成桨，再进行水浴加热回流。
10.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，所述显色剂为对羟基联苯溶液，所述对羟基联苯溶液中的各组分配比为：1000mL蒸馏水中溶解300～500mg对羟基联苯及3g～5g氢氧化钠。
11.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，所述强酸性分解试剂为含有四硼酸钠的浓硫酸溶液，其中，四硼酸钠与浓硫酸的配比为：1000mL浓度为92％～99％的浓硫酸中溶解3g～6g的四硼酸钠。
12.根据权利要求7所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，在待测液与强酸性分解试剂反应过程中加热的温度为90℃～99℃。
13.根据权利要求7所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，冷却采用匝数为20匝～50匝的冷却管冷却。
14.根据权利要求1所述的植物样品中果胶含量的测定方法，其特征在于，以体积百分比计，步骤3)、步骤4)中的果胶酶溶液的浓度为300u/mL～600u/mL。
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